Abstract
Membraaneiwitten (MPS) zijn essentiële onderdelen van celmembranen en primaire drug targets. Rationele drug design is gebaseerd op een nauwkeurige structurele informatie, meestal verkregen door kristallografie; MPs echter moeilijk te kristalliseren. Recente vooruitgang in MP structurele bepaling heeft sterk geprofiteerd van de ontwikkeling van de lipide kubieke fase (LCP) kristallisatie methoden, die levert doorgaans goed voor buigen, maar vaak kleine kristallen die last hebben van straling schade tijdens de traditionele kristallografische het verzamelen van gegevens bij synchrotron bronnen. De ontwikkeling van de nieuwe generatie X-ray vrije-electron laser (XFEL) bronnen die extreem heldere femtoseconde pulsen heeft ingeschakeld verzameling kamertemperatuur gegevens van microkristallen met geen of verwaarloosbare stralingsschade. Onze recente inspanningen combineren LCP technologie seriële femtoseconde kristallografie (LCP-SFX) hebben geleid tot hoge resolutie structuren van verschillende menselijke G-eiwit gekoppelde receptoren, which vertegenwoordigen een notoir moeilijk doelwit voor structuur bepalen. In de LCP-SFX techniek wordt LCP aangeworven als matrix voor zowel de groei en levering van MP microkristallen naar het snijpunt van de injector stroom met een XFEL balk kristallografische gegevensverzameling. Er is aangetoond dat LCP-SFX hoofdzaak diffractie resolutie kan verbeteren wanneer slechts sub- 10 urn kristallen beschikbaar zijn, of wanneer het gebruik van kleinere kristallen bij kamertemperatuur diverse problemen van grotere cryocooled kristallen, zoals de accumulatie van defecten te overwinnen, hoge mosaicity en cryocooling artefacten. Toekomstige ontwikkelingen in de X-ray bronnen en de detector technologieën moeten seriële kristallografie zeer aantrekkelijk en bruikbaar is voor de uitvoering niet alleen op XFELs, maar ook op toegankelijker synchrotron faciliteiten te maken. Hier presenteren wij gedetailleerde visuele protocollen voor de voorbereiding, de karakterisering en de levering van microkristallen in LCP voor seriële kristallografie experimenten.Deze protocollen omvatten werkwijzen voor het uitvoeren van kristallisatie-experimenten in injectiespuiten, detecteren en karakteriseren van het kristal monsters optimaliseren kristaldichtheid, loading microkristallijne beladen LCP in de injector en het leveren van het monster op de balk gegevensverzameling.
Introduction
Röntgenkristallografie is de meest succesvolle techniek tot nu toe voor het oplossen atomaire resolutie structuren van membraaneiwitten (MPs). Kristallisatie uit lipide mesofasen, ook bekend als lipide kubische fase (LCP), of meso kristallisatie, is een van de belangrijke ontwikkelingen MP kristallografie dat de hoge-resolutie structuurbepaling van uitdagende doelen is mogelijk zoals G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs ) 1. Recente ontwikkelingen in LCP instrumenten en technologieën hebben deze techniek beschikbaar is voor een grote gemeenschap van structurele biologen over de hele wereld 2 gemaakt. In veel gevallen MP kristallen die zich in LCP te klein om te worden gebruikt zelfs bij geavanceerde microfocus synchrotron faciliteiten, waarbij de monsters met ernstige stralingsschade en achteruitgang voor voldoende signaal met een hoge resolutie kunnen worden verkregen 3.
Een nieuwe benadering van kristallografische dataverzamelingwerd ingeschakeld met de ingebruikname van de eerste X-ray vrije-electron laser (XFEL). De methode is gebaseerd op het principe van "diffractie voor vernietiging", voor het eerst geïntroduceerd in theorie 4 en vervolgens bevestigd experimenteel op biologische monsters op de Linac Coherent Light Source (LCL) 3, 's werelds pionier in hard XFELs. Een XFEL genereert hoge helderheid X-ray pulsen binnen enkele tientallen femtoseconde duur dat buigen van een ongerepte kristallen voordat het eiwit atomen kan bewegen in reactie op stralingsschade. In de eerste experimenten werden microkristallen continu toegevoerd aan de kruising met de XFEL balk in een waterige stroom door een vloeistof injector 5. Deze experimentele opstelling staat bekend als seriële femtoseconde kristallografie (SFX). Het belangrijkste nadeel van vloeibare injectoren voor SFX is hun hoge flux die dientengevolge vereist tientallen tot honderden mg gezuiverd eiwit voor het verzamelen van een volledige dataset. door employing een speciale injector die kan omgaan met de gel-achtige LCP monsters (LCP microextrusion injector) 6, hebben we met succes opgeleverd microkristallen van een aantal verschillende menselijke GPCR's geteeld in een LCP matrix en verkregen hun high-resolution structuren 6-9, met een aanzienlijk verminderd eiwit consumptie onder 0,3 mg per dataset. De injector bestaat uit een reservoir dat kan vasthouden tot 20, 40 of 100 pl kristal beladen LCP en een smal capillair (10-50 pm in diameter) waardoor het monster wordt geëxtrudeerd door toepassing van een hoge druk (tot 10.000 psi) van een hydraulische plunjer met een druk geamplificeerd fase aangedreven door een vloeistof uit een HPLC (high-performance Liquid Chromatography) pomp. De stroom verlaat de LCP capillairmondstuk wordt gestabiliseerd door een parallelle stroom reactief gas (meestal helium of stikstof).
Hier bieden we visuele demonstraties van de stappen die nodig zijn om voor te bereiden en te karakteriseren monsterseen LCP-SFX experiment. Verdere details zijn te vinden in de gepubliceerde protocollen 10. Als voorbeeld zullen we adenosine A2A receptor 11 kan worden en bereid kristallen van dit eiwit in LCP voor de röntgenbron gegevensverzameling via SFX benadering. Terwijl onze protocollen compatibel met elk injector die in staat van streaming LCP voor het verzamelen van gegevens door de seriële kristallografie aan XFEL en synchrotron bronnen, ter illustratie, zullen we de LCP injector in Ref beschreven gebruiken. 6. Geoptimaliseerde neerslag voorwaarden die high-density microkristallen in LCP produceren moeten worden geïdentificeerd door high-throughput screening kristallisatie 12,13 alvorens tot dit protocol. Een typische stroomdiagram van dit protocol wordt weergegeven in figuur 1.
Protocol
1. Filtering Solutions en Lipids
Opmerking: Alle reagentia en instrumenten die in dit protocol moet zo schoon mogelijk om de invoering van deeltjesvormige verontreinigingen in de monsters die het LCP injector kunnen verstoppen te voorkomen.
- Filter alle neerslag oplossingen en gesmolten lipiden tot en met 5 micrometer spin-neer filters. Schone spuiten grondig en breng perslucht te drogen. Optioneel gebruik maken van een draagbare clean-room kap om te voorkomen dat het vangen stofdeeltjes of vezels tijdens de voorbehandeling procedures.
2. Reconstitutie van MP in LCP
Opmerking: De keuze van de beste LCP gastheer lipiden Kristallisatieoplosmiddel afhankelijk van de doelgroep MP en wordt meestal geïdentificeerd tijdens gastheer lipide screening kristallisatie proeven 14. Monoacylglycerolen (MAG) vertegenwoordigen de meest voorkomende klasse van lipiden gebruikt voor LCP kristallisatie 15. De protocollen zijn gebaseerd op het gebruik van 9,9 MAG (oleïne) alsgastheer lipide, aangezien dit de meest succesvolle lipide in meso kristallisatie date 16. 9.9 MAG kan worden vervangen door andere LCP gastheer lipiden of lipide mengsels na rekening houdend met verschillen in hun fasegedrag. Bijvoorbeeld in het geval van GPCRs, monooleïne typisch gedoteerd met cholesterol receptor voor stabilisatie. Hier, Gebruik 9: 1 (w / w) 9,9 MAG: cholesterol mengsel als gastheer lipide.
- Mix richten MP, die wordt gezuiverd in detergens miceloplossing, de juiste LCP gastheer lipiden met twee spuiten (# 1 en # 2) en een koppelaar, zoals hiervoor 13 beschreven.
- In het kort, load spuit # 1 met het gesmolten lipide en spuit # 2 met de MP-oplossing. Gebruik een verhouding tussen lipide en waterige MP die overeenkomt met het niveau dat net onder de maximale hydratatie capaciteit van de overeenkomstige LCP gastheer lipiden, bijvoorbeeld 3: v / v lipide / MP oplossing 9,9 MAG, 2 1: 1 v / v lipide / MP voor de meeste andere kortere keten MAGs (7,9 MAG, 9,7 MAG, etc.).
- Sluit de spuiten met een injectiespuit en start weer mengen van de stoffen door op de plunjers aan het mengsel heen en weer tussen de spuiten te verplaatsen, totdat het monster homogeen en transparant wordt. Bereid ongeveer 50 gl van het monster LCP voor het verzamelen van een volledige dataset van LCP-SFX. De uiteindelijke steekproef volume zal doorgaans te verhogen met ongeveer een factor twee (tot ~ 100 pi) na het monster consolidatie en lipide titratie (hoofdstuk 5).
3. Het opzetten van kristallisatie in Spuiten
- Na een transparante en homogene LCP wordt gevormd, beweegt het gehele monster in de injectiespuit # 2. Los spuit # 1, terwijl de koppelaar verbonden injectiespuit # 2.
- Sluit een verwisselbare naald (gauge 26s) naar een andere 100 ui schoon spuit (spuit # 3) en zuig ongeveer 70 ul van de neerslag oplossing erin. De samenstelling van het neerslagmiddel oplossing f triggersormatie van high-density microkristallen is uniek voor elk doel MP en moet worden bepaald alvorens tot deze protocollen. Hier gebruikt een geoptimaliseerde precipitatiemiddel oplossingssamenstelling die stromen van microkristallen van de A2A receptor (40 mM natrium- thiocyanaat, 100 mM natriumcitraat pH 5, 26-28% PEG400) oplevert.
- Koppel de naald van de spuit # 3 terwijl de Teflon ferrule binnen de spuit.
- Sluit spuiten # 2 en # 3 door middel van de koppeling, om ervoor te zorgen dat de Teflon ferrules zijn correct op hun plaats in beide spuiten. Schroef de koppeling stevig in positie.
- Richt de gekoppelde spuiten verticaal met spuit # 2 op de bodem en injecteer de eiwit-beladen LCP monster uit spuit # 2 in de spuit # 3 langzaam en gestaag totdat de LCP reeks de plunjer van de spuit # 3 raakt. De geïnjecteerde LCP volume bedraagt ongeveer 1/10 van het oorspronkelijke volume neerslag in spuit # 3 (~ 7 pl). Controleer of het volume van de schaal-lezing over beide Syringe (beide zuigers moeten bewegen met ongeveer 7 ui).
- Koppel spuit # 2. De koppeling is nu alleen verbonden met spuit # 3 dat het monster ondergedompeld in de neerslag oplossing bevat.
- Gebruik Parafilm volledig afdichten spuit # 3, inclusief de plunjer injectiespuit, het openingseind van de koppeling en de naald moer. Onvolledige verzegeling tijdens deze stap kan de neerslag voorwaarden te veranderen en het monster te dehydrateren veroorzaken.
- Herhaal stap 3,3-3,7 voor het opzetten van kristallisatie in 6 extra spuiten (# 4 # 9) met behulp van een totaal van ~ 50 ul van de LCP monster (~ 7 pi van LCP per elke spuit).
- WINKEL verzegeld spuiten in een afsluitbare kunststof zak met één of twee pluisvrije reinigingsdoekjes vooraf geweekt met water te beschermen tegen uitdroging monster. Sluit de zak en bewaar spuiten in een 20 ° C incubator gedurende kristalgroei.
4. Crystal Detection
- Verwijder de spuiten uit de incubator het imago van de LCP monsters direct in de spuiten (# 3 # 9) om de 12-24 uur onder een stereomicroscoop met cross-gepolariseerd licht. Identificeren kristallen als opeengepakte glanzende deeltjes of, bij kleinere kristalgrootte als eenvormig gloed van de LCP filament.
- Zet de verzegelde spuiten om de zak en bewaren bij 20 ° C voor toekomstig gebruik.
5. Sample Consolidatie en titratie met 7,9 MAG
Opmerking: De lipide titratiestap beschreven dient twee doelen: a) de overmaat precipiterende oplossing te absorberen en b) lipide voorkomen bevriezing bij injectie in de XFEL bundel. Wanneer een LCP monster uit 9,9 MAG in een vacuümkamer voor gegevensverzameling wordt geïnjecteerd, kan intensieve verdamping het monster afkoelen tot temperaturen onder de evenwichtstemperatuur faseovergangstemperatuur (~ 18 ° C), het omzetten van delen van het monster in een lamellaire kristallijne fase (Lc). Deze patches van Lc fase, toen geraakt door de bundel, produceren intense poeder diffractie ringen die een detector 6 kunnen beschadigen, zoals de Cornell-SLAC pixel array detector (CSPAD). Titratie van 9,9 MAG monster met een kortere keten lipide (9.7 MAG of 7.9 MAG) vermindert dit probleem, omdat dergelijke mengsels hebben een lagere faseovergang temperaturen. We beschrijven titratie van een LCP bestaande uit 9,9 MAG met 7,9 MAG. Bij kortere keten MAGs (MAG 9,7, 7,9 MAG, etc.) worden gebruikt voor kristallisatie of als seriële kristallografie gegevens worden verzameld bij omgevingsdruk de titratie stap 5,11 wordt nog steeds vereist, maar kan worden uitgevoerd met de oorspronkelijke LCP gastheer lipiden toegepast voor kristallisatie.
- Ongeveer 1 uur voor het begin van de gegevensverzameling, verwijder spuiten met monsters uit de 20 ° C incubator.
- Selecteer 2-4 spuiten voor steekproef consolidatie gebaseerd op een soortgelijk kristal uiterlijk en de gelijkenis van kristallisatie omstandigheden.
- Haal de Parafilm de sluiting van de geselecteerde spuiten.
- Verwijderende spuit koppeling en bevestig een schone verwisselbare naald (gauge 26s) naar de eerste geselecteerde spuit. Voorzichtig en langzaam duw de zuiger uit naar de neerslag uit te persen door middel van de naald in een microcentrifugebuis. Wees voorzichtig bij deze stap, omdat het aanbrengen van een hoge druk op de plunjer in deze stap kunnen enkele kristal beladen LCP uitgeworpen samen met het precipiterende oplossing, wat leidt tot een gedeeltelijk of volledig verlies van het monster.
- Stop de plunjer wanneer de meeste neerslag is verwijderd en de LCP heeft opgelopen bij de naald ingang.
- Herhaal stap 5,4-5,5 met andere geselecteerde spuiten.
- Aan de verkregen LCP monsters te consolideren, verbinden twee injectiespuiten met elkaar door middel van een schone koppeling.
- Druk de zuiger op een spuit om het gehele monster van het ene van de spuiten naar de andere.
- Koppel de lege spuit.
- Herhaal stap 5,7-5,9 om alle kristallen beladen LCP-materiaal te consolideren van 3:58 pre-Selected spuiten in een spuit. Verwijder zoveel mogelijk neerslagmiddelen.
- Voeg ~ 5 ul van 7,9 MAG of de oorspronkelijke kortere keten MAG gastheer lipide naar een lege injectiespuit. Sluit deze spuit om de spuit met de geconsolideerde monster door een spuit koppeling en meng door afwisselend indrukken spuit plunjers. Herhaal dit tot alle overblijvende oplossing wordt opgenomen en een homogene transparante LCP wordt gevormd. De uiteindelijke hoeveelheid LCP na titratie variëren 20-35 gl afhankelijk van het volume van de overmaat precipitatiemiddel en de samenstelling.
- Verplaats het gehele gemengde LCP monster in een spuit en verwijder de lege spuit.
6. Karakterisering van Microcrystals
- Sluit een LCP-injector loading naald (punt 3 stijl, maat 22, een centimeter in lengte) aan de spuit met een geconsolideerde monster.
- uitwerpen zorgvuldig ~ 1 ui van het LCP monster op een glasplaatje en bedek het met een glazen afdekplaat slip. Druk voorzichtig op dedekglas naar sandwich het monster.
- Neem beelden van de LCP monster onder een stereomicroscoop met de hoogst mogelijke vergroting (100X gewoonlijk) met een bright-field verlichting en cross-polarisatoren. Neem indien mogelijk extra beelden met UV-fluorescentie microscoop en een SonicC (tweede orde niet-lineaire beeldvorming van chirale kristallen) 17 imager het bestaan van microkristallen eiwit in het monster te bevestigen.
- Schatting kristal grootte en dichtheid 10. De ideale kristaldichtheid voor een gegevensverzameling experiment zal afhangen van de kristalgrootte, de diameter van de röntgenbundel en de diameter van de LCP stroom, en moet resulteren in een kristal hit van ongeveer 10-40%.
7. Aanpassing van Crystal Density
Opmerking: Als het kristal dichtheid in stap 6,4 te hoog, wat resulteert in een groot percentage van meerdere kristallen hits, moet de kristallen worden verdund volgens de hieronder beschreven stappen voor het optimaliserenmonster voor het verzamelen van gegevens. Als het kristal dichtheid te laag is voor een efficiënte gegevensverzameling in alle bereide monsters, dan is de kristalgroei voorwaarden moeten opnieuw worden geoptimaliseerd, aangezien er geen betrouwbare methode voor het concentreren MP kristallen LCP.
- Bereid de benodigde hoeveelheid LCP netjes worden gebruikt voor het verdunnen door het nabootsen van de LCP samenstelling (dezelfde lipiden en neerslagmiddel) van het oorspronkelijke monster met kristallen die moet worden verdund.
- Verplaats alle nette LCP in een spuit. Maak lege spuit maar laat de koppeling aangesloten.
- Verwijder de naald van de spuit die de LCP monster met microkristallen bevat. Sluit het monster spuit om de spuit met nette LCP door de koppeling.
- Meng de inhoud van de spuiten door heen en weer te duwen door het koppelstuk totdat homogeniteit is bereikt.
- Herhaal Hoofdstuk 6 opnieuw te evalueren de microkristallijne dichtheid in de aangepaste monster.
8. LCP Injector Laden eennd LCP-SFX Data Collection
- Koppel de koppeling van de spuit met het monster en bevestig een 1 "loading naald op de spuit.
- Transfer 20-40 gl van het monster in het reservoir van een LCP injector.
- Plaats de LCP injector in de monsterkamer 18, start de injector, past het debiet en het verzamelen van LCP-SFX data.
9. Het opnemen van oplosbare proteïne Kristallen in LCP
Opmerking: Met behulp van zeer visceuze zoals LCP, voor levering van kristallen van oplosbare eiwitten kan men aanzienlijk korter eiwitinname op seriële kristallografie experiment. In deze stappen beschrijven we hoe u kristallen van oplosbare eiwitten te nemen in LCP. Kristallen kan worden verkregen door elke techniek, tezamen geconsolideerd in de vorm van een kristalsuspensie en gefilterd indien nodig.
- Pas kristaldichtheid in suspensie om ervoor te zorgen kristal hit percentages van ongeveer 10-40%.
- Test de verenigbaarheid van het neerslagmiddel oplossing LCP gebruikt MAG 7,9, 9,7 MAG of een 1: 1 mengsel van 7,9 en 9,9 MAG MAG als gastheer lipide.
- Meng ~ 25 ul van de kristalsuspensie met ~ 25 ul van de gastheer lipide met een injectiespuit mixer tot een homogene LCP vormen.
- Evalueer kristal grootte en dichtheid zoals beschreven in hoofdstuk 6. Plaats het monster in de LCP injector en het verzamelen van gegevens, zoals beschreven in hoofdstuk 8.
Representative Results
Hieronder geven we representatieve resultaten verkregen met monsters bereid door het volgen van de bovenstaande protocollen, wat ons toeliet om SFX-gegevens te verzamelen en op te lossen met een hoge resolutie structuren van vijf menselijke GPCR's te beschrijven: serotonine receptor 5-HT 2B in complex met een agonist ergotamine 8 (VOB ID 4NC3 ), smoothened receptor (SMO) in complex met een antagonist cyclopamine 6 (VOB ID 4O9R), δ-opioïdereceptor in complex met een bifunctionele peptideligand DIPP-NH2 7 (VOB ID 4RWD), angiotensine receptor in complex met een blocker ZD7155 9 (VOB ID 4YAY), en een complex tussen rhodopsine en arrestin 19 (VOB ID 4ZWJ); en twee test-oplosbare eiwitten: lysozym (VOB ID 4ZIX) en fycocyanine (VOB ID 4ZIZ).
5-HT 2B bemiddelt diverse centrale en perifere fysiologische functies van de neurotransmitter serotonine. deze receptorwerd gebruikt om vast te stellen en valideren van de LCP-SFX-methode, door het vergelijken van de kamertemperatuur structuur verkregen bij LCL met de cryocooled structuur opgelost door traditionele microcrystallography op de Advanced Photon Bron (APS). Een totaal van 100 pi ~ LCP monster met eiwit microkristallen (gemiddelde grootte ongeveer 5 pm) werd bereid en gebruikt voor SFX gegevensverzameling en de LCP-SFX structuur van 5HT 2B werd met succes opgelost 2,8 A (figuur 2) 8. Aanvullende nuttige informatie over de bereiding van de monsters en het verzamelen van gegevens zijn te vinden in tabel 1.
Smoothened receptor (SMO) is een lid van de klasse F GPCRs en het moleculaire doelwit van de teratogeen cyclopamine, met goed aangetoond functies in embryonale ontwikkeling en tumorgroei. Aanvankelijk relatief grote kristallen van SMO / cyclopamine met een gemiddelde grootte van 120 x 10 x 5 urn werden verkregen en gebruikt voor data collectiop een synchrotron bron met conventionele goniometer gebaseerde kristallografie. Echter, deze grote kristallen geproduceerd poor diffractie op micro-focus bundellijn (10 urn in diameter) die lijden aan grote mosaicity (hierboven 2-3 graden), waarschijnlijk door de accumulatie van kristalgroei defecten of van effecten die samenhangen met cryocooling. LCP-SFX, echter, stelde ons in staat om de kwaliteit van diffractie gegevens te verzamelen bij LCL van 5 micrometer-sized kristallen bij kamertemperatuur. De structuur werd opgelost door moleculaire vervanging door een anisotrope 3,4, 3,2 en 4,0 A resolutie langs de drie hoofdassen, duidelijk de locatie van cyclopamine in de bindingsplaats 6 (figuur 3).
Alkaloïde opiaten, zoals morfine, gericht μ-opioid receptor (μ-OR) worden veel gebruikt bij ernstige pijn. Echter, hun uitgebreide gebruik leidt tot verworven tolerantie en verslaving. Gelijktijdige toediening van morfinesmet δ-opioïdereceptor (δ-OR) antagonisten is aangetoond dat de bovengenoemde bijwerkingen voorkomen, waardoor het zoeken naar verbindingen met een gemengde δ-OR-antagonist en μ-OR-agonist functie bevorderen. We kregen de eerste diffractie gegevens δ-OR in een complex met een bifunctionele tetra-peptide DIPP-NH2 behulp cryocooled kristallen die afgebogen tot 3,3 A bij een synchrotron röntgenbron toepassing van gebruikelijke goniometer-gebaseerde gegevensverzameling strategie. Volgens deze gegevens een gedeeltelijk dubbelzinnige elektronendichtheid voor de peptide ligand. Vervolgens XFEL diffractie gegevens werden bij kamertemperatuur verkregen en de structuur werd bepaald bij 2,7 A resolutie toont een duidelijke densiteit voor het ligand en de receptor 7. Deze structuur biedt een gelegenheid voor een beter begrip opioïdereceptorfunctie en selectiviteit en waardevolle inzichten voor de ontwikkeling van nieuwe analgetica.
1 R) is een GPCR die als primaire regulator van de bloeddruk. We gekristalliseerd AT 1 R in complex met een antagonist ZD7155 in LCP. Geoptimaliseerde kristallen bereikte een maximale grootte van 40 x 4 x 4 micrometer 3 met alle diffractie namelijk met niet ~ 4 A een synchrotronbron. Door het veranderen kristallisatieomstandigheden, verkregen we douches kleinere kristallen (10 x 2 x 2 pm 3), die werden gebruikt om de kamertemperatuur structuur te verkrijgen bij 2,9 A resolutie met behulp XFEL straling. Een totaal van 2.764.739 detector beelden werden verzameld om een complete dataset van ongeveer 65 ul van kristal beladen LCP overeenkomt met ongeveer 0,29 mg eiwit 9 te maken. Van het totale aantal frames, 457.275 geïdentificeerd als treffers kristal, corresponderend met een treffer percentage van 17%, waarvan 73.130 frames (16% van de hits) met succes geïndexeerd en geïntegreerd.
GPCR-signaal via twee belangrijke wegen bemiddeld door ofwel G-eiwitten of arrestins. De structuur van de β 2 adrenerge receptor gebonden aan een heterotrimeer Gs-eiwit werd enkele jaren geleden 20 opgelost, terwijl de structuur van een GPCR in complex met arrestin ongrijpbaar gebleven. We verkregen kleine kristallen van een rhodopsine-arrestin fusie-eiwit in LCP dat 25-30 urn in de langste dimensie bereikt, maar ondanks uitgebreide optimalisatie, afgebogen alleen ~ 7 Resolutie A bij synchrotron bronnen. Met behulp van de LCP-SFX-methode, binnen 12 uur na XFEL beamtime, we verzamelde 22.262 kristal hits, waarvan 18.874 patronen werden met succes geïndexeerd en geïntegreerd om de resolutie grenzen van 3,8 A / 3,8 A / 3,3 A 19 anisotrope. Rhodopsine-arrestine is een zeer uitdagende eiwitcomplex dat structuurbepaling weerstaan met behulp van traditionele benaderingen. De succesvolle bepaling van deze structuur heeft het enorme potentieel van bewezende LCP-SFX methode voor het aanpakken van moeilijke problemen en voorzien van een unieke kans om het mechanisme van arrestin-biased signalering in GPCRs te onderzoeken.
Tenslotte naast eiwitkristallen gekweekt in de lipide fase membraan, onze monstervoorbereiding en levering methode is succesvol aangepast voor oplosbare eiwitten kristallen, waarbij LCP wordt toegepast als dragermedium voor het afleveren van kristallen, zodat we drastisch verminderen de eiwitconsumptie vereist voor structuurbepaling. Structuren van twee model eiwitten, lysozym en fycocyanine, respectievelijk opgelost 1,89 A en 1,75 A resolutie van deze werkwijze, met minder dan 0,1 mg van elk eiwit 21.
| Serotonine receptor 2B | smoothened receptor | | Angiotensine II receptor type 1 | Rhodopsine-arrestin | lysozym | Phycocyanin | | |
| VOB ID | 4NC3 | 4O9R | 4RWD | 4YAY | 4ZWJ | 4ZIX | 4ZIZ |
| Totale steekproef gebruikt *, ui | 100 | 83 | 50 | 65 | 75 | 10 | 10 |
| Totaal eiwit gebruikt, ug | 300 | 500 | 300 | 290 | 340 | 100 | 100 |
| Gemiddelde kristalgrootte, um | 5 × 5 × 5 | <5 | 5 x 2 x 2 | 10 x 2 x 2 | 5-10 | 5 x 2 x 2 | 10 × 10 × 5 |
| Hit rate,% | 3.6 | 7.8 | 5.9 | 17 | 0.45 | 40 | 6.5 |
| Totaal dataverzameling tijd, hr | 10 | 8 | 4.6 | 6.4 | 12 | 0.75 | 0.67 |
| Aantal geïndexeerde patronen | 32.819 | 61.964 | 36.083 | 73.130 | 18.874 | 54.544 | 6629 |
| Space groep | C 2 2 2 1 | P 2 1 | C 2 | C 2 | P 2 1 2 1 2 1 | P 4 3 2 1 2 | H 3 2 |
| Resolutie, Å | 2.8 | 3.2 / 3.4 / 4.0 | 2.7 | 2.9 | 3,3 / 3,8 / 3,8 | 1.89 | 1.75 |
Tabel 1. Samenvatting van het monster voorbereiding en het verzamelen van gegevens statistieken voor representatieve structuren opgelost met behulp van de LCP-SFX-methode.
De hoeveelheid monster dat nodig is voor een LCP-SFX experiment afhankelijk van de kristaldiffractie kwaliteit, kristaldichtheid, de diameter van de inspuitopening, en de XFEL bundelgrootte, intensiteit en pulsherhalingsfrequentie.
Figuur 1. Stroomschema van een typische monstervoorbereiding procedure voor LCP-SFX. Voorbereiding van het monster begint met LCP kristallisatie van het doelwit eiwit in gasdichte glazen spuiten. Na kristallen worden verkregen, wordt het kristal beladen LCP geconsolideerd in één spuit en getitreerd met extra lipide, om Opname inb de overtollige neerslag oplossing. Kristallen worden vervolgens gekarakteriseerd met behulp van verschillende microscopie methoden voorafgaand aan XFEL het verzamelen van gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Een representatief resultaat is de structuur van 5-HT 2B in complex met ergotamine. (a) Microcrystals van 5-HT 2B / ergotamine afgebeeld met behulp van een helder-veld microscoopmodus 8. Dit cijfer is hergebruikt uit referentie 8 met het auteursrecht toestemming van Science. (B) Microcrystals van 5-HT 2B / ergotamine afgebeeld met behulp van een cross-gepolariseerde microscoop modus 8. Dit cijfer is hergebruikt uit referentie 8 met het auteursrechttoestemming Science. (c) Een cartoonvertegenwoordiging van de 5-HT 2B / ergotamine structuur verkregen door de LCP-SFX benadering. Lipiden die werden gebouwd in het model worden weergegeven in stok vertegenwoordiging. De ligand ergotamine wordt getoond in sferen representatie. Solid lijnen geven de geschatte membraan heen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Een representatief resultaat is de structuur van SMO in complex met cyclopamine. Linkerpaneel, microkristallen van SMO / cyclopamine afgebeeld met een kruis-gepolariseerd microscoopmodus 6. Dit cijfer is hergebruikt uit referentie 6 met het auteursrecht toestemming van Nature Communications. Rechts paneel, een cartoon representatieen van de WIM / cyclopamine structuur verkregen door de LCP-SFX benadering. Ligand cyclopamine is te zien in sferen representatie. Solid lijnen geven de geschatte membraan heen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De hier beschreven protocollen geven een algemeen overzicht van het monster voorbereiding procedure voor een standaard LCP-SFX experimenteren met een LCP injector. Gebaseerd op onze ervaring, het totale bedrag van de definitieve microkristallijne beladen LCP monster dat nodig is voor het verzamelen van een volledige dataset typisch 50-100 gl (Tabel 1, 25-50 pl oorspronkelijke proteïne beladen LCP sample), afhankelijk van de microkristallijne maat , en -dichtheid. Aangezien elk 100 pi gasdichte glazen spuit kan ongeveer 7 ui van LCP in de vorm van een volledig uitgestrekte string goede en zelfs diffusie van het precipitatiemiddel oplossing in de LCP waarborgen, moet ten minste 6:56 monsters injectiespuiten worden voorbereid elke LCP-SFX experiment.
Aangezien het monster wordt geëxtrudeerd door een smalle 20-50 micrometer diameter capillair, is het cruciaal om op ongerechtigheden materiaal in het monster te voorkomen. Stof en vezels die soms in het LCP kan worden geïntroduceerdmonster of precipitatiemiddel oplossingen kan de injector capillaire verstoppen en verhoging van de down-time tijdens het experiment. Daarom is het belangrijk om de lipide en alle oplossingen door een 5 um poriegrootte filter filteren voordat monstervoorbereiding. Eventueel kan een clean room of een draagbare clean room kap worden gebruikt voor de monstervoorbereiding.
Deze protocollen zijn gebaseerd op het gebruik van 9,9 MAG (oleïne) als de gastheer lipide voor MP kristallisatie. Zij zijn echter niet beperkt tot 9,9 MAG en kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere LCP gastheer lipiden en lipide mengsels rekening houdend met de verschillen in de lipidefase gedrag. De meeste van de structuur van MPs gekristalliseerd in LCP werden verkregen via een van de tijdschriften, met 9,9 MAG de meest succesvolle representatieve dusver 15. Het belangrijkste nadeel van het gebruik van 9,9 MAG SFX is de overgang naar lamellaire kristalfase na afkoelen onder 18 ° C, die vaak optreedt wanneer de metingen worden uitgevoerd onder vacuüm. de titratiop 7,9 MAG beschreven in paragraaf 5 van dit protocol biedt een goede oplossing voor dit probleem. In onze ervaring, kristallen weerstaan zo'n titratie zonder nadelige effecten. Indien echter de toevoeging van 7,9 MAG of een korte keten MAG is niet wenselijk, kan de titratie uitgevoerd met 9,9 MAG. In dit geval moet het gas dat de stroom van LCP bij injectie in het vacuüm stabiliseert omschakelbaar van helium stikstof, die de vorming van een kristallijne lipidefase in de meeste monsters kunnen voorkomen ten koste van een minder stabiel monsterstroom.
De gelachtige consistentie van LCP heeft een groot voordeel voor gebruik als een kristal dragermedium, aangezien het aanpassen van de stroomsnelheid kristal in een breed assortiment, geschikt voor seriële kristallografie gegevensverzameling op moderne XFEL en synchrotron bronnen. Passend bij de kristallen stroom met de XFEL pulsherhalingsfrequentie resulteert in een drastische vermindering van kristal verbruik van ordes van grootte compared te vloeistofinjectie. LCP is een geschikt dragermedium voor afgifte niet alleen MP kristallen gegroeid, maar ook om kristallen van oplosbare eiwitten 21. Verschillende alternatieve viskeuze kristal carrier media zijn onlangs geïntroduceerd 22-24, de uitbreiding van het arsenaal aan instrumenten en reagentia voor het uitvoeren van seriële kristallografie experimenten. Bovendien heeft seriële kristallografie met LCP als een kristal aflevermedium aangetoond bij conventionele synchrotron bronnen, althans voor goed buigen van kristallen 24,25. Toekomstige upgrades van synchrotron bronnen die boost X-ray intensiteit door ordes van grootte, evenals verbeteringen in de detector technologieën, zal seriële kristallografie een nog toegankelijker en aantrekkelijker methode om de structuur te bepalen.
LCP-SFX heeft de potentie voor MP structurele bepaling aangetoond. Voor uitdagende biologische systemen (zoals GPCR's of macromoleculaire complexen) waarbij large, diffractie kwaliteit kristallen zijn moeilijk om te groeien, kan LCP-SFX een aantrekkelijk bieden, zo niet de enige, haalbare optie om een atomaire resolutie structuur op te lossen. Met al zijn voordelen, dat wil zeggen, met behulp van LCP als de matrix voor MP kristallisatie en kristal levering, lage eiwitconsumptie, de afwezigheid van stralingsschade, kamertemperatuur verzamelen van gegevens, de mogelijkheden van tijdsopgeloste studies 26,27 en geen kristal oogsten vereiste, LCP- SFX moeten een belangrijke rol spelen in de toekomst van de structurele biologie spelen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidies R01 GM108635 en U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Collaborative Seed Grant Award en NSF STC award 1231306. Wij danken A. Walker voor hulp bij het manuscript voorbereiding.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Nu Chek Prep | M239 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Sigma | M7765 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) | Nu Chek Prep | M219 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids | 850534 | Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection |
| Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/ml | Target protein | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | Used to dissolve lipids |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-500ML | Used to wash syringes |
| Eleven 100 μl Hamilton gas-tight syringes without needles | Hamilton | 7656-01 | For LCP preparation |
| Eight syringe couplers | Formulatrix | SKU 209526 | For LCP preparation |
| LCP-injector loading needle | Hamilton | 7804-01 point style 3, length 1 inch | For LCP dispensing and injector loading |
| Removable needle | Hamilton | 7768-01 | For removing precipitant solution |
| Parafilm M | Parafilm | PM992 | Used for syringe sealing |
| Lint free lens cleaning tissues | Fisher | NC9592151 | |
| Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 ml, Durapore 5 µm | Millipore | UFC3 0SV 00 | Used for filtering of precipitant solutions and lipids |
| Microscope slides, 1 inch x 3 inch | GoldSeal | 3010 | |
| Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol | VWR | 89094-640 | These are used to clean the syringes, needles and coupler. Methanol is used first, then water. |
| Gloves | Microflex | XC-310-L | For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers |
| Safety glasses | |||
| Pressurized air cans | Office Depot (Dust-Off) | 527494 | For syringe cleaning |
| Dry block heater with a digital temperature controller | Fisher | 11-720-10BQ | Used for thawing lipids |
| Benchtop Centrifuge | Fisher | 05-413-340 | Spinning down solutions |
| Clean Room Mini - 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter | Sentry Air Systems, Inc. | SS-112-PCR | Cleaning sample preparation |
| Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer | Nikon | SMZ1500 | Crystal density check |
| UV microscope | JAN Scientific | UVEX-P | Optional, for crystal imaging purposes |
| SHG imager | Formulatrix | SONICC | Optional, for crystal imaging purposes |
References
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505 (2008).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat Commun. 5, 3309 (2014).
- Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).
- Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).
- Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Liu, W., et al. Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions. Science. 337 (6091), 232-236 (2012).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J Vis Exp. (49), (2011).
- Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase. Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, Elsevier. (2009).
- Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. Monoolein: a magic lipid? Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).
- James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , Arizona State University. 1-126 (2015).
- Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
- Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2, 168-176 (2015).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. 513, 261-265 (2014).
