Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Utarbeidelse og innlevering av Protein microcrystals i lipidic Cubic fase for Serial femtosecond Krystallografi

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54463
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3
1The Bridge Institute, University of Southern California, 2Department of Chemistry, University of Southern California, 3School of Molecular Sciences, Center for Applied Structural Discovery at the Biodesign Institute, Arizona State University

Abstract

Membran proteiner (MPS) er viktige komponenter i cellemembraner og primær narkotika mål. Rasjonell drug design er avhengig av nøyaktig strukturell informasjon, vanligvis oppnås ved krystallografi; imidlertid MP'er er vanskelig å krystallisere. Framskritt i MP strukturbestemmelse har hatt stor nytte av utviklingen av lipidic kubikk fase (LCP) krystallisering metoder, som gir vanligvis godt diffraksjon, men ofte små krystaller som lider av stråleskader i løpet av tradisjonell krystallografiske datainnsamling på synkrotron kilder. Utvikling av ny generasjon X-ray fritt elektron laser (XFEL) kilder som produserer ekstremt lyse femtosecond pulser har aktivert romtemperatur datainnsamling fra mikrokrystaller med ingen eller ubetydelig stråleskader. Våre siste innsats i å kombinere LCP teknologi med serie femtosecond krystallografi (LCP-SFX) har resultert i høy oppløsning strukturer av flere menneskerettighets G protein-koblede reseptorer, wjør representerer en notorisk vanskelig mål for strukturbestemmelse. I LCP-SFX teknikk blir LCP rekruttert som en matriks for både vekst og levering av MP mikrokrystaller til krysset av injeksjonsstrømmen med en XFEL stråle for krystallografiske datainnsamling. Det har blitt demonstrert at LCP-SFX kan vesentlig forbedre diffraksjon oppløsning når bare under 10 um krystaller er tilgjengelige, eller når bruk av mindre krystaller ved værelsestemperatur kan overvinne forskjellige problemer i forbindelse med større cryocooled krystaller, som opphopning av defekter høy mosaicity og cryocooling gjenstander. Fremtidige fremskritt i røntgenkilder og detektorteknologi bør gjøre serie krystallografi svært attraktivt og praktisk for gjennomføring, ikke bare på XFELs, men også på mer tilgjengelige synkrotron beamlines. Her presenterer vi detaljerte visuelle protokoller for utarbeidelse, karakterisering og levering av mikrokrystaller i LCP for serie krystallografi-eksperimenter.Disse protokollene omfatter metoder for å gjennomføre krystallisering eksperimenter i sprøyter, oppdage og karakterisere det krystall prøvene, optimalisere krystalltettheten, lasting micro laden LCP inn i injeksjonsutstyr og levere prøven til bjelken for datainnsamling.

Introduction

Røntgenkrystallografi er den mest vellykkede teknikken til dags dato for å løse atom oppløsning strukturer av membranproteiner (MPS). Krystallisering fra lipidic mesofaser, også kjent som lipidic kubikk fase (LCP), eller i meso krystallisering, representerer en av de store utbygginger i MP krystallografi som har aktivert den høyoppløselige strukturbestemmelse av utfordrende mål som G protein-koblede reseptorer (GPCR ) 1. Nye fremskritt i LCP verktøy og teknologier har gjort denne teknikken tilgjengelig for et stort fellesskap av strukturelle biologer verden rundt to. Men i mange tilfeller MP-krystallene som dannes i LCP er for små til å bli brukt selv ved de fleste avanserte mikrofokus synkrotron beamlines, hvor prøvene lider av den alvorlige stråleskader og forringelse før tilstrekkelig signal med høy oppløsning som kan oppnås tre.

En ny tilnærming til krystallografiske datainnsamlingble aktivert med igangkjøring av den første X-ray fritt elektron laser (XFEL). Metoden er basert på prinsippet om "diffraksjon før ødeleggelse", først introdusert teoretisk 4 og deretter bekreftet eksperimentelt på biologiske prøver ved Linac Coherent Light Source (LCLer) 3, verdens pioner i harde XFELs. En XFEL genererer høy lysstyrke røntgen pulser i løpet av få titalls femtosekundområdet varighet som diffract fra et perfekt krystall før proteinatomene kan bevege seg som reaksjon på stråleskader. I de innledende eksperimenter ble mikrokrystaller kontinuerlig tilført til skjæringspunktet med den XFEL bjelke i en vandig strøm som produseres av en væske injektor 5. Dette eksperimentelle oppsettet er kjent som serie femtosecond krystallografi (SFX). Den største ulempen med å bruke flytende injektorer for SFX er deres høye strømningshastighet, som dermed krever flere titalls til hundrevis av milligram renset protein for samling av en komplett datasett. ved employing en spesiell injektor som kan håndtere de gel-lignende LCP prøver (LCP microextrusion injektor) 6, vi levert microcrystals av flere forskjellige menneskelige GPCR dyrket i et LCP matrise og fått sine høyoppløselige strukturer 6-9, med en betydelig redusert protein forbruket til under 0,3 mg per datasett. Injektoren består av et reservoar som kan holde opp til 20, 40 eller 100 ul krystall-laden LCP og en smal kapillær (10-50 mikrometer i diameter) gjennom som utvalget er ekstrudert ved anvendelse av høyt trykk (opp til 10 000 psi) fra en hydraulisk plunger med et trykk amplifisert trinn, drevet av en væske fra en HPLC (høy ytelse væskekromatografi) pumpe. Strømmen av LCP kommer ut av kapillaren dysen er stabilisert ved hjelp av en parallell strøm av ikke-reaktiv gass (typisk helium eller nitrogen).

Her gir vi visuelle demonstrasjoner av trinnene som er nødvendig for å forberede og karakterisere prøverfor en LCP-SFX eksperiment. Flere detaljer finner du i de publiserte protokoller 10. Som et eksempel, vil vi bruke adenosin A2A-reseptoren 11 og fremstille krystaller av dette proteinet i LCP for X-ray innsamling av data ved bruk av SFX tilnærming. Mens våre protokoller er kompatible med alle injektor stand til streaming LCP for datainnsamling ved serie krystallografi ved XFEL og synkrotron kilder, for illustrasjonsformål, vil vi bruke LCP injektoren beskrevet i Ref. 6. Optimalisert fellings forhold som produserer høy tetthet mikrokrystaller i LCP bør identifiseres med høy gjennomstrømming krystallisering screening 12,13 før du fortsetter til denne protokollen. Et typisk flytskjema for denne protokollen er vist i figur 1.

Protocol

1. Filtrering Solutions og lipider

Merk: Alle reagenser og verktøy som benyttes i denne protokollen bør være så ren som mulig for å unngå innføring av partikkelformede forurensninger i prøvene, som kan tette LCP injektoren.

  1. Filtrere alle fellings løsninger og smeltet fett gjennom fem mikrometer spin-down filtre. Rene sprøyter grundig og påfør komprimert luft for å tørke. Eventuelt bruke en bærbar clean-room panseret for å hindre fanger støvpartikler eller fiber under tillagingen prosedyrer.

2. Tilberedning av MP i LCP

Merk: valg av den beste LCP vert lipid for krystallisering, avhenger av målet MP, og blir vanligvis identifisert under vert lipid screening krystallisering forsøk 14. Monoacylglyceroler (mags) representerer den vanligste klasse av lipider brukes for LCP krystallisering 15. Protokollene er basert på bruk av 9,9 MAG (monoolein) somvert lipid, siden dette er den mest vellykkede lipid for in meso krystallisering hittil 16. 9.9 MAG kan erstattes av andre LCP verts lipider eller lipid blandinger etter å ha tatt hensyn til forskjeller i deres faseoppførsel. For eksempel, i tilfelle av GPCR, monoolein er typisk dopet med kolesterol for reseptoren stabilisering. Her bruker 9: 1 (w / w) 9,9 MAG: kolesterol blanding som vert lipid.

  1. Mix målrette MP, som renses i vaskemiddel micelle-løsning, med det passende LCP vert lipid ved hjelp av to sprøyter (# 1 og # 2) og en skjøteanordning som beskrevet tidligere 13.
  2. Kort, last sprøyte # 1 med den smeltede lipid og sprøyte # 2 med MP oppløsning. Bruker et forhold mellom lipid og vandige MP oppløsning svarende til det nivå som er like under den maksimale hydratisering kapasiteten av den tilsvarende LCP vert lipid, for eksempel 3: 2 volum / volum lipid / MP løsning for 9,9 MAG, 1: 1 v / v lipid / MP løsning for de fleste andre kortere kjede mags (7,9 MAG, 9.7 MAG, etc.).
  3. Koble sammen de sprøyter gjennom en sprøyte kobling og begynner å blande stoffene ved å trykke stemplene for å bevege blandingen frem og tilbake mellom sprøytene, inntil prøven blir homogent og gjennomsiktig. Forbered ca 50 mL av LCP utvalget for samling av en komplett datasett av LCP-SFX. Det endelige prøvevolum vil typisk øke med omtrent en faktor på to (til ~ 100 ul) etter prøven konsolidering og lipid titrering (del 5).

3. Sette opp krystallisering i Sprøyter

  1. Etter en transparent og homogen LCP er dannet, flytte hele prøven i sprøyte # 2. Løsne sprøyte # 1, samtidig som den kopler koplet til sprøyten # 2.
  2. Koble en fjernbar nål (måleren 26s) til en annen 100 pl ren sprøyte (sprøyte # 3) og aspirer ca. 70 mL av fellingsmiddeloppløsningen inn i den. Sammensetningen av fellingsmiddeloppløsningen som utløser formasjon av mikrokrystaller høy tetthet er unik for hvert mål MP og bør bestemmes før du går videre til disse protokollene. Her bruker en optimalisert fellings løsning sammensetning som gir dusjer av mikrokrystaller av A2A reseptor (40 mM natrium thiocyanate, 100 mM natriumsitrat pH 5, 26-28% PEG400).
  3. Koble kanylen fra sprøyten # 3 samtidig som Teflon hylse inne i sprøyten.
  4. Koble sprøyter # 2 og # 3 gjennom coupler, noe som gjør at Teflon endehylser er riktig på plass i begge sprøyter. Skru forsiktig Coupler tett på plass.
  5. Orient de koblede sprøytene vertikalt med sprøyte # 2 på bunnen og injisere proteinet-laden LCP prøve fra sprøyte # 2 inn sprøyte # 3 sakte og jevnt til LCP strengen berører stempelet på sprøyten # 3. Den injiserte LCP volum beløper seg til omtrent 1/10 av det opprinnelige volum fellingsmiddel i sprøyten # 3 (~ 7 ul). Kontroller volumet av skalaen-lesing på begge Syringes (begge stemplene skal flyttes ca 7 ul).
  6. Koble sprøyten # 2. Kopleren nå bare er koblet til sprøyten # 3 som inneholder prøven nedsenket i fellingsmiddeloppløsningen.
  7. Bruk Parafilm for fullstendig å forsegle sprøyten # 3, inkludert stempelet sprøyten grensesnittet, åpningen enden av kopleren og nålen mutteren. Ufullstendig forsegling i dette trinnet kan føre til at fellings forhold til endring og prøven til tørke.
  8. Gjenta trinn 3.3 til 3.7 for å sette opp krystallisering i ytterligere 6 sprøyter (# 4- # 9) ved anvendelse av et totalt ~ 50 pl av prøven LCP (~ 7 mL av LCP for hver sprøyte).
  9. Lagres forseglet sprøyter i en plastlukkbare pose med én eller to fiberfrie rengjørings vev pre-fuktet med vann for å beskytte mot prøven dehydrering. Forsegle posen og lagre sprøyter i en 20 ° C inkubator under krystallvekst.

4. Crystal Detection

  1. Fjern sprøytene fra inkubatoren til bilde LCP prøvene direkte på innsiden av sprøytene (# 3- # 9) hvert 12-24 timer under et stereomikroskop med krysspolarisert lys. Identifisere krystaller som tettpakkede blanke partikler eller, i tilfelle av mindre krystallstørrelse som en enhetlig glød fra LCP filament.
  2. Returnere de forseglede sprøytene til posen, og oppbevar ved 20 ° C for fremtidig bruk.

5. Eksempel på konsolidering og Titrering med 7,9 MAG

Merk: lipid titreringstrinn beskrevet her tjener to formål: a) å absorbere det overskytende fellingsmiddeloppløsningen og b) for å hindre lipid iskaldt ved injeksjon i XFEL strålen. Når en LCP prøve bestående av 9,9 MAG injiseres inn i et vakuumkammer for datainnsamling, kan intensiv fordampning kjøle prøven ned til temperaturer under likevektsfaseovergangstemperaturen (~ 18 ° C), å omdanne deler av prøven inn i en lamellær krystallinsk fase (Lc). Disse flekker av Lc fase, da truffet av strålen, produserer intense pulver diffrhandling ringer som kan skade en følsom detektor 6, slik som SLAC Cornell-bildeelement seriedetektor (CSPAD). Titrering av 9,9 MAG prøve med en kortere kjede lipid (9,7 MAG eller 7,9 MAG) lindrer dette problemet, da slike blandinger har lavere faseovergangstemperaturer. Her beskriver vi titrering av en LCP består av 9,9 MAG med en 7,9 MAG. Når kortere kjede mags (9,7 MAG, 7,9 MAG, etc.) brukes for krystallisering eller når serie krystallografi data er samlet inn ved omgivelsestrykk titreringen i trinn 5.11 er fortsatt nødvendig, men det kan gjøres ved hjelp av originale LCP verten lipid ansatt for krystallisasjon.

  1. Om en time før begynnelsen av datainnsamling, fjerne sprøyter med prøver fra 20 ° C inkubator.
  2. Velge 2-4 sprøyter for prøve konsolidering basert på lignende krystall utseende og likheten av krystallisasjonsbetingelsene.
  3. Fjern forsiktig Parafilm tetting fra de valgte sprøyter.
  4. Fjernesprøyten kobling og legge ved en ren flyttbar nål (måleren 26s) til den første valgte sprøyte. Forsiktig og sakte presse stempelet frem til å presse fellings ut gjennom nålen inn i en mikro tube. Vær forsiktig ved dette trinnet fordi påføring av et høyt trykk på stemplet i dette trinn kunne ta ut noe av det krystall nedtynget LCP sammen med fellingsmiddeloppløsningen, som fører til en delvis eller fullstendig tap av prøven.
  5. Stoppe stempelet da de fleste av fellingsmiddel er fjernet og LCP er akkumulert ved at nålen inngangen.
  6. Gjenta trinn 5.4 til 5.5 med andre utvalgte sprøyter.
  7. Å konsolidere de resulterende LCP prøvene, koble to sprøyter sammen gjennom en ren kobler.
  8. Stemplet trykkes på en sprøyte for å overføre hele prøven fra en av sprøytene til en annen.
  9. Koble den tomme sprøyten.
  10. Gjenta trinn 5,7-5,9 å konsolidere alle krystall laden LCP materiale fra 03:58 pre-selected sprøyter i en sprøyte. Fjerne så mye fellingsmiddel som mulig.
  11. Legg ~ 5 mL av 7,9 MAG eller den opprinnelige kortere kjede MAG vert lipid til en tom sprøyte. Koble denne sprøyte til sprøyten med den konsoliderte prøven gjennom en sprøyte kobling og bland ved alternativt å trykke sprøytestempler. Gjenta inntil alt gjenværende oppløsningen blir absorbert, og et homogent og gjennomsiktig LCP er dannet. Den endelige mengde av LCP etter titrering kan variere 20-35 ul avhengig av volumet av det overskytende fellingsmiddel og dets sammensetning.
  12. Flytt hele blandet LCP prøven i en sprøyte og koble den tomme sprøyten.

6. Karakterisering av mikrokrystaller

  1. Fest en LCP-injektor lasting nål (punkt stil tre, måler 22, en tomme i lengde) til sprøyten med konsoliderte prøven.
  2. mate nøye ~ 1 mL av LCP prøven på en glassplate og dekke den med et glass dekkglass. Trykk forsiktig pådekkglass til sandwich-prøven.
  3. Ta bilder av LCP prøven under et stereomikroskop ved høyest mulig forstørrelse (typisk 100X) ved hjelp av en lys-felt belysning og krysspolarisatorer. Hvis mulig, ta flere bilder ved hjelp av en UV-fluorescens mikroskop og en SONICC (Second Order-lineær avbildning av kirale krystaller) 17 imager for å bekrefte eksistensen av proteinmikrokrystaller i utvalget.
  4. Beregn krystall størrelse og tetthet 10. Den ideelle krystalltettheten for en datainnsamlings eksperiment vil avhenge av krystallstørrelsen, diameteren av røntgenstrålen og diameteren av LCP strømmen, og bør resultere i en krystall treffhastighet på omtrent 10-40%.

7. Justering av Crystal Tetthet

Merk: Hvis det krystalltettheten funnet i trinn 6,4 er for høy, noe som resulterer i en stor prosentandel av flere krystall hits, bør krystallene fortynnes følge instruksjonene nedenfor for å optimalisereutvalget for datainnsamling. Dersom krystalltettheten er for lav for effektiv datainnsamling Alle fremstilte prøver, da krystallvekstbetingelser bør re-optimalisert, ettersom det ikke er noen pålitelig metode for konsentrering MP krystaller i LCP.

  1. Fremstille den nødvendige mengden av ren LCP som skal brukes for fortynning ved å etterligne LCP sammensetning (samme lipid og utfellingsmiddel) av den opprinnelige prøven med krystaller som må fortynnes.
  2. Flytt alt ryddig LCP i en sprøyte. Løsne tom sprøyte men la kobler tilkoblet.
  3. Fjern kanylen fra sprøyten som inneholder LCP prøven med mikrokrystaller. Koble prøven sprøyten til den sprøyte som inneholder ryddig LCP gjennom kobleren.
  4. Bland innholdet i sprøytene ved å skyve den frem og tilbake gjennom kopleren inntil homogenitet er oppnådd.
  5. Gjenta pkt 6 for å re-evaluere microtettheten i den justerte prøven.

8. LCP Injector Loading ennd LCP-SFX datainnsamling

  1. Koble coupler fra sprøyten med prøven og legge ved en en "loading nålen til sprøyten.
  2. Overfør 20-40 pl av prøven inn i reservoaret av et LCP injektor.
  3. Sett LCP injektoren inn i prøvekammeret 18, starter injektoren, å justere strømningshastigheten og samle LCP-SFX data.

9. innlemmelse av løselig protein Krystaller i LCP

Merk: Ved hjelp av svært viskøse medier, for eksempel LCP, for levering av krystaller av løselige proteiner gjør det mulig å dramatisk redusere protein forbruk i en serie krystallografi eksperiment. I disse trinnene beskriver vi hvordan å innlemme krystaller av løselige proteiner i LCP. Krystaller kan oppnås ved hvilken som helst teknikk, konsolidert sammen i form av en krystallsuspensjon og filtreres om nødvendig.

  1. Juster krystalltettheten i suspensjon for å sikre krystall hit priser på ca 10-40%.
  2. Test kompatibiliteten for fellingsmiddeloppløsningen med LCP ved bruk av 7,9 MAG, 9,7 MAG eller en 1: 1 blanding av 7,9 MAG og 9,9 MAG som vert lipid.
  3. Bland ~ 25 ul av krystallsuspensjonen med ~ 25 ul av verten lipid ved anvendelse av en sprøyte-blander inntil en homogen LCP former.
  4. Evaluere krystall størrelse og tetthet som beskrevet i kapittel 6. Legg prøven i LCP injektoren og samle inn data som beskrevet i punkt 8.

Representative Results

Nedenfor beskriver vi representative resultater oppnådd med prøver fremstilt ved å følge de ovennevnte protokollene, som tillot oss å samle SFX data og løse høyoppløselige strukturer av fem menneskelige GPCRs: serotonin reseptor 5-HT 2B i kompleks med en agonist ergotamin 8 (PDB ID 4NC3 ), glattet reseptor (SMO) i kompleks med en antagonist cyclopamine 6 (PDB ID 4O9R), δ-opioid reseptor i kompleks med en bi-funksjonell peptid ligand DIPP-NH2 7 (PDB ID 4RWD), angiotensin receptor i kompleks med en blocker ZD7155 9 (PDB ID 4YAY), og et kompleks mellom rhodopsin og arrestin 19 (PDB ID 4ZWJ); og to test løselige proteiner: lysozym (PDB ID 4ZIX) og phycocyanin (PDB ID 4ZIZ).

5-HT 2B medierer forskjellige sentrale og perifere fysiologiske funksjoner av nevrotransmitteren serotonin. denne reseptorble brukt til å etablere og validere LCP-SFX metode, ved å sammenligne romtemperatur struktur erholdt ved LCLer med cryocooled struktur løst ved tradisjonelle microcrystallography ved Advanced Photon Source (APS). Totalt ~ 100 ul LCP prøve med proteinmikrokrystaller (gjennomsnittlig størrelse ca. 5 pm) ble fremstilt og anvendt for SFX datainnsamling, og LCP-SFX struktur av 5-HT 2B ble med hell løst på 2,8 Å (figur 2) 8. Andre nyttige detaljer om prøveopparbeidelse og datainnsamling er gitt i tabell 1.

Glattet reseptor (SMO) er et medlem av klasse F GPCR og molekylære målet for teratogen cyclopamine, med godt demonstrert funksjoner i embryoutvikling og tumorvekst. Opprinnelig ble forholdsvis store krystaller av SMO / cyclopamine med en gjennomsnittlig størrelse på 120 x 10 x 5 um oppnådd og deretter brukt for data collectipå at en synkrotron kilde ved bruk av konvensjonell goniometer baserte krystallografi. Men disse store krystaller produsert dårlig diffraksjon ved en mikro-fokus beamline (10 pm i diameter) som lider av store mosaicity (over 2-3 grader), sannsynligvis på grunn av opphopning av krystallvekst-defekter, eller fra effekter relatert til cryocooling. LCP-SFX har imidlertid gjort det mulig å samle inn kvalitet diffraksjonsdata ved LCLer fra 5 um-størrelse krystaller ved værelsestemperatur. Strukturen ble løst ved molekylær utskiftning ved en anisotropisk 3,4, 3,2 og 4,0 Å-oppløsning langs de tre hovedakser, klart å identifisere plasseringen av cyclopamine i bindingslommen 6 (figur 3).

Alkaloid opiater, som morfin, målretting μ-opioid reseptor (μ-OR) er mye brukt for sterke smerter ledelse. Imidlertid fører sin omfattende bruk til ervervet toleranse og avhengighet. Samtidig administrering av morphinesmed δ-opioid reseptor (δ-OR) antagonister er blitt vist å forebygge de ovennevnte bivirkninger, og dermed fremme søk etter forbindelser med en blandet δ-ELLER-antagonist og μ-ELLER-agonist-funksjon. Vi har oppnådd den innledende diffraksjonsdata på δ-OR i et kompleks med en bi-funksjonell tetra-peptid DIPP-NH2 ved hjelp av cryocooled krystaller som diffraktert til 3,3 Å ved en synkrotron røntgenkilde ved anvendelse av konvensjonelle goniometer-baserte datainnsamling strategi. Disse data viste en delvis tvetydig elektrontettheten for peptid ligand. Deretter ble XFEL diffraksjonsdata ved værelsestemperatur oppnås og strukturen ble bestemt ved 2,7 Å-oppløsning viser en klar tetthet for liganden og reseptoren 7. Denne strukturen tilbudt en mulighet for videre forståelse opioid reseptor funksjon og selektivitet og gitt verdifull innsikt for utvikling av nye analgetika.

1 R) er en GPCR som tjener som en primær regulator av blodtrykket. Vi krystallisert AT en R i kompleks med en antagonist ZD7155 i LCP. Optimalisert krystaller nådde en maksimal størrelse på 40 × 4 × 4 mikrometer tre med de beste diffraksjon nå bare ~ 4 Å på en synkrotron kilde. Ved å endre krystalliseringsbetingelser, vi oppnådd dusj av små krystaller (10 x 2 x 2 um 3), som ble brukt for å oppnå romtemperatur strukturen på 2,9 Å-oppløsning ved hjelp av XFEL stråling. Totalt 2,764,739 detektor bilder ble samlet for å lage en komplett datasett fra ca 65 mL av krystall-laden LCP tilsvarer omtrent 0,29 mg protein 9. Av det totale antall bilder, 457 275 ble identifisert som krystall hits, tilsvarende en hit rate på 17%, hvorav 73,130 rammer (16% treff) var vellykket indeksert og integrert.

GPCR signal gjennom to hovedveier mediert av enten G proteiner eller arrestins. Strukturen av β 2-adrenerge reseptor bundet til en heterotrimeric G-s-protein ble løst for noen år siden 20, mens strukturen til en GPCR i kompleks med arrestin hadde forblitt ukjent. Vi fikk små krystaller av en rhodopsin-arrestin fusjonsprotein i LCP som nådde 25-30 mikrometer i den lengste dimensjon, men til tross for omfattende optimalisering, diffracted bare til ~ 7 vedtak på synkrotron kilder. Ved hjelp av LCP-SFX metode, innen 12 timer XFEL beamtime, samlet vi 22,262 krystall treff, hvorav 18,874 mønstre ble vellykket indeksert og integrert i anisotrope oppløsning grensene for 3,8 Å / 3.8 Å / 3,3 A 19. Rhodopsin-arrestin er en svært utfordrende proteinkompleks som motsto strukturbestemmelse ved hjelp av tradisjonelle metoder. Den vellykkede bestemmelse av denne strukturen har vist stort potensial forLCP-SFX metode for å takle vanskelige problemer og gitt en unik mulighet til å undersøke mekanismen for arrestin-partisk signalisering i GPCR.

Til slutt, i tillegg til membranprotein krystaller som dyrkes på den lipide fase, vår prøvepreparering og leveringsmåten var vellykket tilpasset for løselige proteinkrystaller, hvor LCP brukes som et bæremedium for levering av krystaller, tillater oss å dramatisk redusere protein forbruket nødvendig for strukturbestemmelse. Strukturer av to modell proteiner, lysozym og fycocyanin, ble løst ved 1,89 Å og 1,75 Å oppløsning henholdsvis ved denne metode, ved bruk av mindre enn 0,1 mg av hvert protein 21.

Serotonin receptor 2B glattet reseptor Angiotensin II reseptor type 1 Rhodopsin-arrestin lysozyme phycocyanin
PDB ID 4NC3 4O9R 4RWD 4YAY 4ZWJ 4ZIX 4ZIZ
Utvalget brukes *, ul 100 83 50 65 75 10 10
Total protein som brukes, ug 300 500 300 290 340 100 100
Gjennomsnittlig krystall størrelse, mikrometer 5 × 5 × 5 <5 5 × 2 × 2 10 × 2 × 2 5-10 5 × 2 × 2 10 × 10 × 5
Treffsrate, % 3.6 7.8 5.9 17 0,45 40 6.5
Total datainnsamling tid, hr 10 8 4.6 6.4 12 0,75 0,67
Antall indekserte mønstre 32819 61964 36083 73130 18874 54544 6629
Space Group C 2 2 2 1 P 2 1 C 2 C 2 P 2 1 2 1 2 1 P 4 3 2 1 2 H 3 to
Oppløsning, 2.8 3.2 / 3.4 / 4.0 2.7 2.9 3.3 / 3.8 / 3.8 1,89 1,75

Tabell 1. Oppsummering av prøveopparbeidelse og datainnsamling statistikk for representative strukturer løses ved bruk av LCP-SFX metoden.

Mengden av prøve som kreves for en LCP-SFX eksperiment, avhenger av krystall diffraksjon kvalitet, krystalltettheten, diameteren av injeksjonsdyse, samt XFEL bjelke størrelse, intensitet og pulsrepetisjonsfrekvens.

Figur 1
Figur 1. Flytskjema for en typisk prøve forberedelse fremgangsmåte for LCP-SFX. Prøvepreparering starter med LCP krystallisering av målproteinet i gasstett glassprøyter. Etter at krystallene er erholdt, er den krystall laden LCP konsolidert i en sprøyte og titrert med ekstra lipid, til absorb overskuddet av fellingsmiddeloppløsningen. Krystaller blir så preget ved hjelp av ulike mikroskopi metoder før XFEL datainnsamling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Et representativt resultat, oppbygging av 5-HT 2B i kompleks med ergotamin. (a) mikrokrystaller av 5-HT 2B / ergotamin avbildes med en lys-feltet mikroskop-modus 8. Dette tallet har blitt gjenbrukt fra referanse 8 med copyright tillatelse fra Science. (B) mikrokrystaller av 5-HT 2B / ergotamin avbildes ved hjelp av en krysspolarisert mikroskop-modus 8. Dette tallet har blitt gjenbrukt fra referanse 8 med opphavsretttillatelse fra Science. (c) En tegneserie fremstilling av 5-HT 2B / ergotamin struktur oppnådd ved LCP-SFX tilnærming. Lipider som ble bygget i modellen er vist i stick representasjon. Liganden ergotamin er vist i sfærer representasjon. Solid linjene indikerer den omtrentlige membran grenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. En representant resultat, oppbygging av SMO i kompleks med cyclopamine. Venstre panel, mikrokrystaller av SMO / cyclopamine avbildes ved hjelp av en krysspolarisert mikroskop-modus 6. Dette tallet har blitt gjenbrukt fra referanse 6 med copyright tillatelse fra Nature Communications Høyre panel, en tegneserie representati.på fra SMO / cyclopamine struktur oppnådd ved LCP-SFX tilnærming. Ligand cyclopamine er vist i sfærer representasjon. Solid linjene indikerer den omtrentlige membran grenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Protokollene er beskrevet her gi en generell oversikt over prøveopparbeidelse prosedyren for en standard LCP-SFX eksperiment med en LCP injektor. Basert på vår erfaring, den totale mengden av den endelige micro-laden LCP prøven som kreves for å samle en hel datasettet er vanligvis 50-100 pl (tabell 1; 25-50 mL av opprinnelig protein-laden LCP prøve), avhengig av micro størrelse , kvalitet og tetthet. Siden hver 100 ul gasstett glassprøyte kan romme omkring 7 ul av LCP i form av en fullt utstrakt streng for å sikre tilfredsstillende og til og med diffusjon av fellingsmiddeloppløsningen til LCP, bør i det minste fire til syv prøver i sprøyter fremstilles etter hver LCP-SFX eksperiment.

Ettersom prøven blir ekstrudert gjennom en smal 20-50 pm i diameter kapillar, er det avgjørende for å unngå eventuelle fremmedpartikkelformet materiale i prøven. Støv og fibre som kan tidvis introdusert i LCPprøve eller utfellingsmiddel oppløsninger kan tette injektoren kapillær og øke den ned-tiden i løpet av eksperimentet. Derfor er det viktig å filtrere lipid og alle løsninger gjennom et 5 um pore-filter før preparering av prøvene. Eventuelt kan et rent rom eller en bærbar clean room hetten brukes for prøveopparbeidelse.

Disse protokollene er basert på bruk av 9,9 MAG (monoolein) som vert lipid for MP krystallisering. De er imidlertid ikke begrenset til 9,9 MAG og kan enkelt tilpasses til andre LCP verts lipider eller lipid-blandinger etter å ha tatt hensyn til forskjellene i lipidfasen oppførsel. De fleste av de strukturer av parlamentsmedlemmer krystallisert i LCP ble oppnådd ved hjelp av en av magasiner, med 9,9 MAG å være den mest vellykkede representant så langt 15. Den største ulempen med å bruke 9,9 MAG for SFX er dens overgang til lamellær krystallfase ved avkjøling under 18 ° C, noe som ofte oppstår når datainnsamlingen blir utført i vakuum. den titratipå med 7.9 MAG beskrevet i kapittel 5 i denne protokollen gir en god løsning på dette problemet. I vår erfaring, krystaller tåle en slik titrering uten bivirkninger. Hvis det imidlertid ikke er ønskelig tilsetning av 7,9 MAG eller en annen kortkjedet MAG, kan titreringen utføres med 9,9 MAG. I dette tilfellet bør den gass som stabiliserer strømmen av LCP under injisering inn i vakuum slås fra helium til nitrogen, noe som kan hindre dannelsen av en krystallinsk lipidfase i de fleste prøver, på bekostning av å ha en mindre stabil prøvestrøm.

Den gel-lignende konsistens av LCP er en stor fordel for anvendelse som et krystall bærermedium, siden den tillater justering av krystallen strømningshastigheten over et bredt spekter, egnet for serie krystallografi datainnsamling ved moderne XFEL og synkrotron kilder. Matchende krystall strømningshastighet med XFEL puls etter hverandre fører til dramatisk reduksjon i krystall forbruk av størrelsesordener compared til flytende injeksjon. LCP er et egnet bæremedium for levering, ikke bare av MP-krystaller som dyrkes i den, men også for krystaller av oppløselige proteiner 21. Flere alternative viskøse krystall bære medier har nylig blitt introdusert 22-24, utvide arsenal av verktøy og reagenser for å gjennomføre serie krystallografi-eksperimenter. Videre har serie krystallografi med LCP som en krystall leveringsmedium blitt demonstrert ved konvensjonelle synkrotron kilder, i det minste for brønn-diffraksjon krystaller 24,25. Fremtidige oppgraderinger av synkrotron kilder som øker X-ray intensitet av størrelsesordener, samt forbedringer i detektorteknologi, vil gjøre serie krystallografi en enda mer tilgjengelig og attraktiv metode for strukturbestemmelse.

LCP-SFX har vist sin styrke for MP strukturbestemmelse. For utfordrende biologiske systemer (for eksempel GPCRs eller makromolekylære komplekser) hvor Large, diffraksjon kvalitet krystaller er vanskelig å vokse, kan LCP-SFX gi en attraktiv, om ikke den eneste, levedyktig alternativ for å løse en atom oppløsning struktur. Med alle sine fordeler, dvs. ved hjelp av LCP som matrise for MP krystallisering og krystall levering, lav protein forbruk, fravær av stråleskader, romtemperatur datainnsamling, muligheter for tids løst studier 26,27 og ingen krystall høsting krav, LCP- SFX bør spille en viktig rolle i fremtiden av strukturell biologi.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir R01 GM108635 og U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Collaborative Seed Grant Award og NSF STC pris 1231306. Vi takker A. Walker for å få hjelp med manuskriptet forberedelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) Nu Chek Prep M239 Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) Sigma M7765  Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) Nu Chek Prep M219 Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid 7.9 MAG Avanti Polar Lipids 850534 Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection
Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/ml Target protein
Chloroform Fisher Scientific C606-1 Used to dissolve lipids
Methanol Sigma-Aldrich 179337-500ML Used to wash syringes
Eleven 100 μl Hamilton gas-tight syringes without needles Hamilton 7656-01 For LCP preparation
Eight syringe couplers Formulatrix SKU 209526 For LCP preparation
LCP-injector loading needle Hamilton 7804-01 point style 3, length 1 inch For LCP dispensing and injector loading
Removable needle Hamilton 7768-01 For removing precipitant solution
Parafilm M Parafilm PM992 Used for syringe sealing
Lint free lens cleaning tissues Fisher NC9592151
Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 ml, Durapore 5 µm Millipore UFC3 0SV 00 Used for filtering of precipitant solutions and lipids
Microscope slides, 1 inch x 3 inch  GoldSeal 3010
Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol VWR 89094-640 These are used to clean the syringes, needles and coupler.  Methanol is used first, then water.
Gloves Microflex XC-310-L For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers
Safety glasses
Pressurized air cans Office Depot (Dust-Off) 527494 For syringe cleaning
Dry block heater with a digital temperature controller Fisher 11-720-10BQ  Used for thawing lipids
Benchtop Centrifuge Fisher 05-413-340 Spinning down solutions
Clean Room Mini - 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter Sentry Air Systems, Inc. SS-112-PCR Cleaning sample preparation
Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer  Nikon SMZ1500 Crystal density check
UV microscope JAN Scientific UVEX-P Optional, for crystal imaging purposes
SHG imager Formulatrix SONICC Optional, for crystal imaging purposes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
  2. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
  3. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  4. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  5. DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505 (2008).
  6. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat Commun. 5, 3309 (2014).
  7. Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).
  8. Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).
  9. Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
  10. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  11. Liu, W., et al. Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions. Science. 337 (6091), 232-236 (2012).
  12. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
  13. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J Vis Exp. (49), (2011).
  14. Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase. Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).
  15. Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, Elsevier. (2009).
  16. Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. Monoolein: a magic lipid? Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).
  17. Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).
  18. James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , Arizona State University. 1-126 (2015).
  19. Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
  20. Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
  21. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).
  22. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).
  23. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
  24. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
  25. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2, 168-176 (2015).
  26. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  27. Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. 513, 261-265 (2014).

Tags

Biokjemi biokjemi serie femtosecond krystallografi X-ray fritt elektron laser lipidic kubikk fase strukturbiologi membranprotein sample levering G-protein-koblet reseptor
Utarbeidelse og innlevering av Protein microcrystals i lipidic Cubic fase for Serial femtosecond Krystallografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. … More

Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J. Vis. Exp. (115), e54463, doi:10.3791/54463 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter