Abstract
Kjemisk modifisert versjon av trehalose, eller trehalose analoger, ha programmer i biologi, bioteknologi og farmasøytisk vitenskap, blant andre felt. For eksempel har trehalose analoger som detekterbare koder blitt anvendt for å detektere Mycobacterium tuberculosis og kan ha applikasjoner som tuberkulose diagnostiske avbildningsmidler. Hydrolytisk stabile versjoner av trehalose blir også forfulgt på grunn av sitt potensial for bruk som ikke-kalori søtstoffer og bio agenter. Til tross for den appell av denne klassen av forbindelser for forskjellige anvendelser, forblir deres potensial ikke oppfylt på grunn av mangel på en robust rute for deres produksjon. Her rapporterer vi et detaljert protokoll for rask og effektiv ett-trinns biokatalytisk syntese av trehalose analoger som omgår problemene knyttet til kjemisk syntese. Ved å benytte den termo trehalose syntase (tret) enzym fra Thermoproteus Tenax, kan trehalose analoger være generated i et enkelt trinn fra glukose analoger og uridindifosfat glukose i høyt utbytte (opp til kvantitativ omdannelse) i 15-60 min. En enkel og hurtig ikke-kromatografisk renseprotokoll, som består av spinndialyse og ionebytting, kan levere mange trehalose analoger av kjent konsentrasjon i vandig oppløsning i så lite som 45 minutter. I de tilfeller hvor ikke-omsatt glukoseanalogenen fremdeles kan kromatografisk rensing av trehalose analoge produkt utføres. Samlet sett gir denne metoden en "grønn" biokatalytisk plattform for rask syntese og rensing av trehalose analoger som er effektiv og tilgjengelig for ikke-kjemikere. For å eksemplifisere anvendelsen av denne metoden, beskriver vi en protokoll for syntese, all-vandig rensing og administrering av en trehalose-baserte klikk-kjemi sonde til mykobakterier, alle som tok mindre enn en time og aktivert fluorescens deteksjon av mykobakterier. I fremtiden vi ser for oss at blant otheh anvendelser kan denne protokoll anvendes for hurtig syntese av trehalose-baserte prober for tuberkulose diagnostikk. For eksempel, kortvarige radionuklide-modifisert trehalose analoger (f.eks 18 F-modifisert trehalose) kan brukes for avanserte kliniske bildediagnostikk som positronemisjonstomografi-computertomografi (PET-CT).
Introduction
Trehalose er en symmetrisk ikke-reduserende disakkarid som består av to glukosedelene som er forbundet med en 1,1-α, α-glykosidisk binding (figur 1A). Mens trehalose er fraværende fra mennesker og andre pattedyr, er det funnet vanligvis i bakterier, sopp, planter og virvelløse dyr 1. Den primære rolle av trehalose i de fleste organismer, er å beskytte mot ytre påvirkninger, slik som uttørking 1. I tillegg er noen humane patogener krever trehalose for virulens, inkludert tuberkulose-forårsaker Mycobacterium tuberculosis, som benytter trehalose som en formidler av celle konvolutt biosyntese og som en byggestein for bygging av immunmoduler glykolipider 2.
Figur 1: Trehalose og trehalose analoger. (En) Strukturer av naturlig trehalose og en unaturlig trehalose-analog, hvor X er en strukturell modifikasjon. (B) Eksempler på trehalose analoger rapportert i litteraturen som har potensielle anvendelser i biopreservation og Bioimaging.
På grunn av sin unike struktur og fysiologiske funksjoner, har trehalose trukket betydelig oppmerksomhet for bruk i bio (techno) logisk og biomedisinske applikasjoner 3. Den beskyttende egenskaper trehalose observert i natur- f.eks til sin slående evne hjelpe opprettholde livet i "oppstandelse" planter som har gjennomgått ekstrem dehydrering 4 -har ansporet sin omfattende bruk i biopreservation applikasjoner. Trehalose har blitt brukt for å bevare et bredt spekter av biologiske prøver, slik som nukleinsyrer, proteiner, celler og vev 3. For eksempel er trehalose anvendt som et stabiliserende tilsetningsmiddel i en rekke farmasøytiske produkter thatten er på markedet, blant annet en rekke anti-kreft-3 monoklonale antistoffer. I tillegg er trehalose brukt som søtningsmiddel i næringsmiddelindustrien, og det er mye brukt for produktet bevaring i både mat og kosmetikk industri. Fastsettelsen av trehalose for disse typer kommersielle programmer var i utgangspunktet begrenset av manglende evne til å få bulk mengder ren trehalose fra naturlige kilder eller gjennom syntese. Imidlertid har en effektiv enzymatisk prosess for økonomisk produksjon av trehalose fra stivelse nylig blitt utviklet, noe som har påvirket sin utbredt kommersiell anvendelse 5.
Kjemisk modifiserte derivater av trehalose, her betegnet som trehalose analoger, har fått økende oppmerksomhet for forskjellige anvendelser (generisk struktur er vist på figur 1A; spesielle eksempler på trehalose analoger er vist i figur 1B) 6. For eksempel, er lakto-trehalose en trehalose analog med en av sine glukoseenheter erstattet med galaktose, og dermed dens 4-stilling hydroksylgruppen har en invertert stereokjemiske konfigurasjon. Lakto-trehalose har samme stabiliserende egenskaper som trehalose, men er motstandsdyktig mot nedbrytning ved tarmenzymer, noe som gjør den attraktiv som en ikke-kalori tilsetningsstoff 6, 7.
Vår gruppe interesse i trehalose analoger er hovedsakelig knyttet til deres verdi som mykobakterier spesifikke prober og hemmere. Barry og Davis grupper utviklet en fluorescens-konjugert keto-trehalose analog, oppkalt FITC-keto-trehalose, som ble vist til metabolsk merke celleveggen av levende M. tuberculosis, slik at dens deteksjon av fluorescens mikroskopi 8. Den Bertozzi lab utviklet mindre azido-trehalose (TreAz) analoger som kunne metabolsk merke celleveggen og deretter være Fondetected bruker klikk kjemi og fluorescens analyse ni. Disse fremskrittene peker til muligheten for å bruke trehalose-baserte prober som diagnostiske avbildningsmidler for tuberkulose. Trehalose-analoger har også blitt ivaretatt som inhibitorer av M. tuberculosis på grunn av deres evne til å forstyrre baner i bakterien som er essensielle for levedyktigheten og virulens 10, 11, 12.
Så langt det største hinderet for å utvikle trehalose analoger for bio (techno) logiske og biomedisinske applikasjoner er mangel på effektive syntesemetoder. De to tradisjonelle ruter til fremstilling av trehalose-analoger er avhengige av kjemisk syntese (figur 2). Én rute omfatter desymmetrization / modifisering av naturlig trehalose, mens den andre involverer starter med riktig funksjonaliserte monosakkarid byggesteiner og å utføre kjemiske glykosylering tilsmi 1,1-α, α-glykosidbinding. Disse fremgangsmåtene, som nylig er blitt diskutert i oversiktsartikler 13, 14, har vist seg nyttig for å oppnå flertrinns syntese av små mengder av komplekse trehalose-inneholdende naturlige produkter, slik som sulfolipid-1 fra M. tuberculosis 15. Men begge fremgangsmåter er vanligvis ineffektive, tidkrevende, utilgjengelig for ikke-kjemikere, og, i tillegg, ikke anses å være miljøvennlig. Således, for å syntetisere visse typer av trehalose analoger, disse strategiene er ikke ideelt.
Figur 2: Approaches to trehalose analog syntese. Kjemisk tilnærminger til trehalose analog syntese, vises til venstre, kan du bruke flertrinnsprosedyrer som involverer vanskelig protecsjon / avbeskyttelsestrinn, desymmetrization, og / eller glykosylering trinn. Enzymatisk syntese, som vises til høyre, bruker enzym (er) for å stereoselektivt konvertere enkle, ubeskyttet underlag til trehalose analoger i vandig løsning. Den enzymatiske protokollen angitt heri anvender en trehalose-syntase (tret) enzym for å omdanne glukose analoger og UDP-glukose til trehalose analoger i et enkelt trinn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En effektiv biokatalytisk rute til trehalose analoger ville lette produksjon, evaluering og anvendelse av denne lovende klasse av molekyler. Mens den kommersielle enzymatisk prosess for produksjon av trehalose 5 er ikke tilpasses for å syntetisere analoger fordi den utnytter stivelse som et substrat, er det andre biosyntetisk banemåter i naturen som kan utnyttes for trehalose analog syntese. Men forskning på dette området, som nylig ble anmeldt 6, har vært begrenset. En rapport brukt en metode inspirert av Escherichia coli trehalose biosyntetiske vei for å få tilgang til en enkelt fluor-trehalose analogt fra de tilsvarende fluor-glukose. Imidlertid krever denne tilnærmingen en tre-enzymsystem som har begrenset effektivitet og generalitet 8. En annen tilnærming som har vært utforsket, er å bruke trehalose fosforylase (Trep) i motsatt retning, som i prinsippet tillater en-trinns syntese av trehalose analoger fra glukose analoger og glukose-1-fosfat 6, 16, 17. Selv om denne tilnærmingen kan ha fremtiden løfte, både inverterende og beholde TrePs har for tiden ulemper for analog syntese. For eksempel inverteringsmidler TrePs har en uoverkommelig erfansive donor molekyl (β-D-glukose-1-fosfat) og holde TrePs har dårlig enzym ekspresjonssystemer utbytter / stabilitet og begrenset substrat promiscuity. Betydelige forbedringer (f.eks, via enzym engineering) vil være nødvendig før Trep-mediert analog syntese er praktisk.
I dag er den mest praktiske tilnærmingen for den enzymatiske syntese av trehalose analoger for å bruke en trehalose-syntase (tret) som omdanner glukose og uridin-difosfat (UDP) -glukose i trehalose i et enkelt trinn 6. Vi har nylig rapportert bruk av Thermoproteus Tenax tret-en termo og ensrettet enzym 18 -til syntetisere trehalose analoger fra glukose analoger og UDP-glukose (figur 3) 19. Dette enzym virker kun i den syntetiske retning og unngår problemet med trehalose nedbrytning funnet i Trep systemet. Dette ett-trinns reaksjon could være avsluttet i en time, og et bredt spekter av trehalose analoger ble tilgjengelige i høyt utbytte (opp til> 99% som bestemt ved høy-ytelses væskekromatografi (HPLC)) fra lett tilgjengelige glukose analoge substrater (se Tabell 1 i det Representative Resultater seksjon).
Figur 3: tret-katalysert ett-trinns syntese av trehalose analoger. Den tret enzym fra T. tenax kan stereoselektivt bli lett tilgjengelig glukose analoger og UDP-glukose for å danne trehalose analoger i ett trinn. R 1 -R 4 = Variable strukturell endring, for eksempel azido-, fluor-, deoxy-, tio, stereo, eller isotoper label modifikasjoner; Y = variabel heteroatom, for eksempel oksygen eller svovel, eller isotopisk merket heteroatom.
Her gir vi annonsenetailed protokoll for tret synteseprosessen, inkludert ekspresjon og rensing av tret fra E. coli, optimalisert tret reaksjonsbetingelser, og en forbedret rensemetode som utføres i sin helhet i den vandige fase. Denne modifiserte protokollen muliggjør hensiktsmessig og effektiv syntese og rensing av forskjellige trehalose analoger på en semi-preparativ skala (10-100 mg). Vi viser også bruk av denne protokollen for fremstilling og administrering av et trehalose-baserte sonde til mykobakterier i løpet av mindre enn 1 time, noe som muliggjorde hurtig fluorescens påvisning av mykobakterielle celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uttrykk og rensing av tret fra Top10 E. coli
MERK: Ta kontakt med forfatterne til å be om tret-uttrykke E. coli-stamme (pBAD tret plasmid, som inneholder T. tenax tret genet under kontroll av AraC protein, forvandlet til Top10 E. coli-19) og tilhørende materiell overføringsavtalen . Følgende protokoll gir typisk et proteinutbytte på omtrent 4 mg / l.
- Forbered en 3 ml over natten kultur av tret-uttrykke E. coli.
- Strek 10 på topp E. coli transformert med pBAD-tret ekspresjonsvektor på en lysogeni buljong (LB) agar plate inneholdende 100 ug / ml ampicillin.
- Inkuber platen ved 37 ° C i ca. 48 timer.
- Plukke en enkelt koloni fra platen og inokuler 3 ml LB-væskemedium inneholdende 100 ug / ml ampicillin i en kultur rør.
- Plasser røret på en risteinkubator ved 37 & #176 C x 175 rpm over natten.
- Fremkall protein uttrykk i tret-uttrykke E. coli.
- Legg 750 ml Terrific Broth supplementert med 100 ug / ml ampicillin til en 2800 ml Fernbach-kolbe kultur. Overføre 1 ml buljong fra kolben til en kyvette for senere anvendelse som en blank.
- Tilsett 3 ml natten kultur generert i trinn 1.1.4 til kultur kolbe, deretter plassere flasken i en inkubator og rist ved 37 ° C x 200 rpm. Periodisk kontrollere absorbansen av kulturen ved 600 nm versus emnet oppsamlet i trinn 1.2.1.
- Når absorbansen ved 600 nm griper mellom 0,5-1,0, indusere ekspresjon tret ved tilsetning av 750 ul av 1 M arabinose-løsning (1 mM endelig konsentrasjon) til kulturen. Returner kolben til inkubatoren og rister over natten ved 37 ° C x 200 rpm.
- Pellet og lysere tret-uttrykkende E. coli-celler.
- Overfør kultur til en polypropylen bottle og sentrifuger i 15 minutter ved 4000 xg ved 4 ° C.
- Kast supernatanten og re-suspendere pelleten i 15 ml fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Overfør cellesuspensjonen til en 50 ml konisk rør og sentrifuger i 15 minutter ved 4000 xg ved 4 ° C. Kast supernatanten og går videre til cellelyse (trinn 1.3.4) eller lagre pellet på ubestemt tid ved -80 ° C.
- Oppløs en proteasehemmer mini tablett i 20 ml vaskebuffer (50 mM NaH 2PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0) i et 50 ml konisk rør.
- Overfør den protease-inhibitor-inneholdende vaskebuffer til den koniske rør som inneholdt pelleten. Vortex inntil pelleten resuspendert.
- Overfør resuspenderes cellene i et 100 ml begerglass og lysere cellene ved sonikering (pulssekvens på 45 sekunder på, 45 sekunder med en driftstid på 2 minutter og 15 sekunder ved en amplitude på 75 prosent).
- Overfør lysatet til en 50 ml konisk rør metallog sentrifuger i 60 min ved 15.000 xg ved 4 ° C.
- Klargjøre lysatet ved passasje gjennom en 0,2 til 0,45 um sprøytefilter inn i en 50 ml konisk rør.
NB: Den typiske konsentrasjon av lysat som oppnås, er 100 mg / ml.
- Rens tret fra E. coli-cellelysat ved hjelp av hurtig protein-væskekromatografi (FPLC).
- Sett opp FPLC med en nikkel-affinitetskolonne (5 ml sjiktvolum). Vask kolonnen med 10 ml deionisert vann, eller inntil kolonnen er ren for eventuelle forurensninger. Ekvilibrer kolonnen med 20 ml vaskebuffer (50 mM NaH 2PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0) ved en strømningshastighet på 1 ml / min.
- Laste oppnådd fra trinn 1.3.8 på kolonnen lysatet (20 ml) og eluer umerkede proteiner med vaskebuffer ved en strømningshastighet på 1 ml / min inntil absorbansen når bakgrunnsnivåer (typisk 80-100 ml vaskebuffer er nødvendig) .
- Eluere His-tagget tret ved hjelp av en lineær gradient av elueringsbuffer (50 mM NaH 2PO 4, 500 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0) 1-100% over 60 min ved en strømningshastighet på 1 ml / min. Samle 4 ml fraksjoner inntil tret har eluert og absorbansen når basalnivået.
MERK: Vanligvis 60 ml av elueringsbufferen er nødvendig for å eluere proteinet, og proteinet elueres i 60-100% elueringsbuffer rekkevidde. Omtrent 10-15 ml ren tret i elueringsbufferen blir oppnådd. - Bestemme konsentrasjonen av tret ved å måle absorbansen ved 280 nm mot en elueringsbuffer blank.
- Utveksling tret til tris (hydroksymetyl) aminometan (Tris) buffer ved dialyse.
- Etter fremstilling av dialyserøret i henhold til produsentens instruksjoner, prime det ved skylling med deionisert vann og deretter Tris-buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
- Laste tret prøven inn i dialyserøret ved hjelp av en sprøyte og butt nål. Dialyser over natten engainst 2 liter Tris-buffer.
- Bestemme konsentrasjonen av tret ved å måle absorbansen ved 280 nm mot en blind oppsamlet fra dialyse vask.
- Overfør tret oppløsning til en 50 ml konisk rør og videre til trehalose analog syntese (trinn 2) eller oppbevare enzymet ved 4 ° C.
MERK: tret er en termo protein. Den tret ble lagret i Tris-buffer ved 4 ° C i flere måneder uten å observere betydelig tap av aktivitet.
2. Ett-trinns syntese av Trehalose analoger Bruke tret Enzyme
MERK: Protokollen under beskriver en reaksjon skala basert på 4 ml volum, som kan levere ca. 15-30 mg av trehalose analog avhengig av reaksjonseffektivitet og molekylvekten av produktet. Reaksjonskomponentene kan skaleres for å oppnå mer eller mindre trehalose analog hvis ønskelig.
- Legg glukoseanalogenen (0,080 mmol, massen vil avhenge av molekylvekten), UDP-glukose (0.160 mmol, 97,6 mg) og MgCl2 (0,080 mmol, 16,3 mg) til et 15 ml konisk rør. De endelige konsentrasjoner av disse komponentene vil være 20 mM, 40 mM og 20 mM, respektivt.
- Legg tret i Tris-buffer (oppnådd fra trinn 1.5.4) og, om nødvendig, et egnet volum av Tris-buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0) for å oppnå en endelig enzymkonsentrasjon på 300 pg / ml og en endelig volum på 4 ml. Pipette av blandingen opp og ned eller invertere forsiktig røret for å oppløse de faste stoffene.
- Inkuber reaksjonsblandingen ved 70 ° C med rysting ved 300 rpm i en time, deretter plassere røret på is avkjøles.
3. Rensing av Trehalose analoger fra Crude enzymatisk reaksjon Blanding
- Pre-skylle en sentrifugal filterenhet (nominell molekylvektgrense (NWML) 10 kDa) for å fjerne spor av glyserol i membranen ved å tilsette 3 ml deionisert vann for å sentrifugal filterenheten og sentrifugering ved 3000 x g inntil all væsken passerer gjennom filterinn i røret (ca. 20 min). Gjenta ytterligere to ganger. Fullføre dette trinn umiddelbart før eller under reaksjonen (trinn 2.3).
- Etter avkjøling av den enzymatiske reaksjonsblanding (oppnådd i trinn 2.3), overfører den til den pre-renset sentrifugale filterenhet. Skyll reaksjonsrøret med 1 ml avionisert vann og overføring til sentrifugal filterenheten. Gjenta skylling av reaksjonsrøret for maksimal utvinning av produkt.
- Sentrifuger den sentrifugale filterenheten ved 3000 xg inntil all væsken passerer gjennom filteret inn i røret (ca. 20 min). Skyll det øvre kammer av sentrifugal filterenheten med 3 ml avionisert vann og sentrifuger ved 3000 xg inntil all væsken passerer gjennom filteret inn i røret (ca. 20 min). Gjenta skylling for maksimal utvinning av produktet.
- Kast det øvre kammer av sentrifugal filterenheten. Legg mixed bed ionebytter-harpiks (3 g) til filtratet ved bunnen av røret (typisk filtrat volume er 8-15 ml, avhengig av antallet av skyllinger). Omrør ved romtemperatur i 1 time med en magnetisk rørestav med en hastighet tilstrekkelig til å holde harpikskulene suspendert i oppløsningen.
- Dekanter supernatanten og filtrere det for å fjerne harpiksen. Tilsett 5 ml deionisert vann for å skylle det resterende harpiks. Dekanter supernatanten og filtrerer den, og kombinerer det med produktoppløsningen fra den første dekantering. Gjenta skylling av harpiksen for maksimal utvinning av produkt.
- Analyser av reaksjonen ved tynnsjiktskromatografi (TLC) eller HPLC for å bestemme hvorvidt fullstendig omdannelse av glukose analoge utgangsmaterialet til den trehalose analoge produkt ble oppnådd. Se trinn 4.1 for TLC analyse og steg 4,2 for HPLC-analyse.
- Fjerne vann ved frysetørking eller rotasjonsfordampning til å gi det tørkede produkt. Dersom ble det ikke observert noen ureagert glukoseanalogenen i løpet av TLC eller HPLC-analyse, er rensing ved kromatografi unødvendig. Veie produktet for å oppnå reaksjons yieLD og utføre kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopianalyse (trinn 4.3) for å bekrefte at produktet struktur og renhet.
- Hvis ble observert uomsatt glukoseanalogenen i løpet av TLC-analyse, skiller den fra trehalose analoge ved hjelp av en størrelseseksklusjonskolonne.
- Forbered en 1 x 100 cm kolonne som inneholder ionisert vann-mettet, ekstra-fine P2 polyakrylamid perle størrelse eksklusjons media i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Størrelsen eksklusjonskolonne kan gjenbrukes etter vask med avionisert vann. - Re-oppløse det tørkede enzymatiske reaksjonsprodukt (oppnådd fra trinn 3.7) i 0,5 ml deionisert vann. Påfør produktet løsningen på størrelseseksklusjonskolonne manuelt eller ved hjelp av en kolonne strømningsadapter. Skyll ampullen som inneholdt det urene produkt med ytterligere 0,5 ml deionisert vann, og laste det inn i størrelseseksklusjonskolonne.
- Eluer produktet med deionisert vann ved tyngdekraftstrøm og samler fraksjoner på ca 2 mL volum.
- Analyser fraksjonene ved TLC (trinn 4.1). Benytte de fraksjonene inneholdende ren trehalose analog.
- Fjerne vann ved frysetørking eller rotasjonsfordampning til å gi det tørkede produkt. Veie produktet for å oppnå reaksjonsutbytte og videre til NMR-analyse (se trinn 4.3).
- Forbered en 1 x 100 cm kolonne som inneholder ionisert vann-mettet, ekstra-fine P2 polyakrylamid perle størrelse eksklusjons media i henhold til produsentens instruksjoner.
4. Analyse av Trehalose Analoge produkter
- Utføre tynnsjiktskromatografi (TLC) analyse av tret reaksjon.
MERK: Denne fremgangsmåten kan også brukes til å analysere størrelseseksklusjonskolonne fraksjoner. Det kan være nødvendig å konsentrere reaksjonsblandingen eller kolonnefraksjoner før TLC-analyse for å observere forbindelsen flekker på TLC-platen.- Mark baner på TLC-platen overflaten med en blyant og anvende analytt (er) og relevante standard (e) til de rette baner, deriblant glukose analoge standard, trehalose analoge standard (hvis tilgjengelig), ble reaksjonsblandingen (eller fraksjoner oppsamlet fra størrelse exclusion kolonne rensing), og en co-spot. Etter påføring av hver prøve til TLC-platen, la maskinen tørke.
NB: For reaksjonen analyse, blir typisk 2 ul prøve påført på TLC-platen. - Utvikle TLC-plate ved anvendelse av n-butanol / etanol / deionisert vann (5: 3: 2).
- Tørk det utviklet TLC-plate, så dyppe den i 5% H 2 SO 4 i etanol (sukker flekk) og varme på en varm plate med høy innstilling inntil sukkerholdige flekker kan visualiseres (typisk 5 minutter).
- Mark baner på TLC-platen overflaten med en blyant og anvende analytt (er) og relevante standard (e) til de rette baner, deriblant glukose analoge standard, trehalose analoge standard (hvis tilgjengelig), ble reaksjonsblandingen (eller fraksjoner oppsamlet fra størrelse exclusion kolonne rensing), og en co-spot. Etter påføring av hver prøve til TLC-platen, la maskinen tørke.
- Utføre HPLC-analyse av tret reaksjonsblandinger ved hjelp av en hvilken som helst HPLC-system er i stand til å separere og å detektere karbohydrater. Denne protokollen innebærer karbohydrat separasjon ved hjelp av en aminopropyl HPLC-kolonne og deteksjon ved hjelp av brytningsindeks.
- Fest aminopropyl-kolonne (4,6 x 250 mm) inneholdende en pre-kolonne vakt til HPLC.
- Ekvilibrere aminopropyl kolonne med 80% acetonitril i deionisert vann ved en strømningshastighet på 0,4ml / min.
- Laste løsning av reaksjonsproduktet (eller standard) på aminopropyl-kolonnen.
- Eluere produktet (eller standard) med 80% acetonitril i deionisert vann ved en strømningshastighet på 0,4 ml / min og kolonnetemperaturen til 50 ° C en. Vanligvis er driftstiden som brukes er 40 min.
MERK: Både glukose analoge utgangsmaterialet og trehalose analoge produkt kan påvises ved brytningsindeks, selv om andre metoder som evaporativ lysspredning deteksjon (ELSD) kan benyttes. Ved hjelp av forholdene beskrevet, glukose analoger vanligvis elueres mellom 10-15 min og trehalose analoger elueres mellom 15-25 min.
- NMR analyse av renset trehalose analoger.
- Oppløs renset trehalose analog i D2O (700 ul) og overføre oppløsningen til et NMR-rør.
- Erverve en H og 13C NMR spektra i henhold til hensiktsmessige NMR anlegget protokoller.
- Syntetisere, rense og administrere 6-TreAz til M. smegmatis (Msmeg).
- Tilsett 6-azido-6-deoksy glukopyranose (6-GlcAz, 0,020 mmol, 4,1 mg), UDP-glukose (0,040 mmol, 24,4 mg) og MgCl2 (0,020 mmol, 4,1 mg) til et 15 ml konisk rør.
- Legg tret i Tris-buffer (oppnådd fra trinn 1.5.4) for å oppnå en endelig enzymkonsentrasjon på 300 ug / mL og et sluttvolum på 1 ml. Pipette av blandingen opp og ned eller invertere forsiktig røret for å oppløse de faste stoffene.
- Inkuber reaksjonsblandingen ved 70 ° C med risting i 15 min.
- Fortynn den enzymatiske reaksjonsblandingen med 3 ml deionisert vann og overføre den til en forvasket sentrifugale filterenhet (NMWL 10 kDa). Sentrifuger filterenheten ved 3000 xg inntil det meste av væsken som passerer gjennom filteret inn i røret, ca. 10 min.
- Forkast the øvre kammer av sentrifugal filterenheten. Legg mixed bed ionebytter-resin (0,75 g) til røret og rør / rist ved romtemperatur i 25 min. Dekanter supernatanten og filtrere det for å fjerne harpiksen.
MERK: Fremgangsmåte 5.1.1-5.1.5 tilveiebringe en vandig oppløsning av 6-azido-trehalose (6-TreAz) ved omtrent 5 mM konsentrasjon i løpet av mindre enn en time. Den 5 mM konsentrasjon er estimert basert på kvantitative omdannelse av substrat til produkt og fortynning som finner sted i løpet av de rensetrinn, forutsatt minimalt tap av produktet under disse trinnene. Løsningen kan være sterilfiltrert før tilsetning til en biologisk prøve hvis ønskelig. - Tilsett passende mengde av 6-TreAz produktoppløsningen til en log-fase-kultur av M. smegmatis (Msmeg), typisk for å oppnå en endelig kulturvolum på 100-1000 pl og en avsluttende 6-TreAz konsentrasjon på ~ 25 uM. Inkuber cellene ved 37 ° C i den ønskede tid, typisk 60 min.
- Utfør klikk kjemi å bøye en fluorofor til azid-merkede celler. I denne protokollen, bruker Cu-katalysert azid-alkyn cykloaddisjon (CuAAC) for å levere en fluorofor til celle-overflate azider i Msmeg.
- Sentrifuger cellene ved 3900 xg i 5 min, og deretter vaske cellene med PBS inneholdende 0,5% bovint serumalbumin. Gjenta to ganger.
- Re-suspendere pelle cellene i 4% para-formaldehyd i PBS for å fikse dem. Etter inkubering i 10 minutter, gjenta trinn 5.2.1 for å vaske cellene.
- Re-suspendere pelle celler i 138 mL PBS.
- Tilsett 3 mL av en 1 mM stamløsning av alkyn-carboxyrhodamine 110 (alkyn-488) i DMSO.
- Tilsett 3 mL av en nyfremstilt 60 mM stamløsning av natriumaskorbat i avionisert vann.
- Tilsett 3 ul av en 6,4 mM forrådsoppløsning av tris [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) metyl] amin (TBTA) i tert-butanol / dimetylsulfoksyd (DMSO) 4: 1.
- Legg tre & #956 L av en 50 mM stamløsning av CuSO4 i avionisert vann.
- Pipette cellesuspensjonen opp og ned, og deretter inkuberes i mørke ved romtemperatur i 30 min.
- Gjenta trinn 5.2.1 for å vaske cellene. Re-suspendere cellene i 150 mL PBS.
- Utfør cellular fluorescens analyse. I denne protokollen, bruker fluorescens mikroskopi for å visualisere mobil fluorescens av merket Msmeg.
- Tilsett 10 mL av bakterieceller suspendert i PBS til et objektglass og lett sprer væsken inn i et tynt lag ved hjelp av kanten på et dekkglass. La det lufttørke i mørket.
- Tilsett 10 mL av monteringsmedium over tørkede prøve, og sett dekselet glir over prøven og påfør lim (f.eks neglelakk) for å immobilisere.
- Bilde lysbilder ved hjelp av en fluorescens mikroskop ved 100X forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
T. Tenax tret ble oppnådd fra E. coli i et utbytte på omtrent 4 mg / l ved anvendelse av standard protein expression og renseteknikker. En enkelt nikkel affinitetskromatografitrinn var tilstrekkelig til å rense tret fra E. coli lysat (en representativ FPLC kontur er vist i figur 4). Som etablert i vår første publikasjon på tret synteseprosessen, er rekombinant T. tenax tret stand til å omdanne et bredt spekter av glukose-analoger hvorav mange er kommersielt tilgjengelige til de tilsvarende trehalose analoger med høy effektivitet 19. Tabell 1, som gir HPLC-bestemt Reaksjonsutbyttene for et antall av utgangsglukose analoger ved bruk av vår opprinnelig rapportert protokollen, illustrerer omfanget av tret substrat promiscuity og dens egnethet for syntese. Diverse strukturelle endringer, inkludert fluor-, deoxy-, azido-,thio, og stereokjemiske modifikasjoner på forskjellige posisjoner rundt sukkerringen er godt tolerert av villtype-enzym, med de viktigste unntak blir modifikasjoner på 4-stillingen.
Figur 4: Representative resultater for tret rensing ved hjelp av FPLC. Rensing av rekombinant T. Tenax tret fra E. coli-lysat ble utført ved anvendelse av nikkel-affinitetskromatografi, som beskrevet i trinn 1.4.1-1.4.4. Blå, ultrafiolett (UV) absorbans spor; lys grønn, konsentrering av elueringsbuffer; mørk grønn, trykk. Toppen som tilsvarer tret er indikert med en pil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Representative utbytter for tret reaksjonen. HPLC-bestemt og isolerte utbytter av tret reaksjonen i flere trehalose-analoger. ND, ikke oppdages. - Indikerer at reaksjonen ble ikke utført på en semipreparativ målestokk ved bruk av optimaliserte protokollen. * Indikerer at en størrelse utelukkelse kromatografi skritt var nødvendig. Horisontale skillelinjer skille stilling av modifikasjonen på trehalose sukkerringen. Tabell tilpasset fra referanse 19 med tillatelse; oppdatert med isolerte utbytter fra dette arbeidet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Heri, rapporterer vi optimaliseringer til vår første protokoll som forbedrer den generelle effektiviteten og hastigheten på tret synteseprosessen. Mens den opprinnelige protokollen som brukes 10 mM glukose enalogue og 40 mM UDP-glukose, ble det fastslått at tilsvarende omdannelse kan oppnås ved anvendelse av 20 mM glukose og 40 mM UDP-glukose, effektivt dobler mengden av produkt som genereres pr reaksjon og begrense avfalls av UDP-glukose, som er relativt dyrt . Ved hjelp av ekvimolare mengder glukose analoge og UDP-glukose resulterte i lavere konverteringer. Om ønsket, kan reaksjonstiden forkortes til mindre enn den opprinnelig rapportert 60 min og samtidig beholde sammenlign konvertering for de mange analoger, noe som ble demonstrert ved den kvantitative omdannelse av 6-GlcAz til 6-TreAz i bare 15 minutter ved 70 ° C ( Figurene 5 og 6).
Rensingen protokollen angitt her, er vesentlig forbedret og erstatte den opprinnelige enzym utfelling / silikagel-kromatografi-metoden med en ikke-kromatografisk spinndialyse / ionebytter-metoden. Begrunnelsen for denne endringen er at tret reaction blanding består utelukkende av ioner med unntak av den nøytrale trehalose analoge produkt. Derfor kan blandingen være spin-dialysert for å fjerne enzymet, og deretter behandlet med mixed bed ionevekslerharpiks for å fjerne alle de ionearter, som leverer renset trehalose analog i vandig oppløsning i så lite som 45 minutter. Denne alt-vandige rensemetode unngår miljømessig skadelige organiske løsningsmidler, tidkrevende fordampning og filtreringstrinn, og tørr-load silikagel-kromatografi, som er en langsom og tungvint prosess, spesielt for ikke-kjemikere. For tret reaksjoner som oppviser kvantitativ omdannelse som bestemt ved anvendelse av den beskrevne TLC eller HPLC-analyser, gir denne rensemetode isolerte utbytter på omtrent 60-80% ved rapporterte reaksjons målestokk, med produktet tap sannsynligvis på grunn av binding av noe sukker for å ionebytter harpiks (se tabell 1 for representative isolerte avkastning). I tilfeller der ureagert glukoseanalogenen gjenstår,det kan skilles fra det ønskede produkt ved hjelp av trehalose analoge et polyakrylamid kulebasert størrelseseksklusjonskolonne, under eluering med vann. Hvis foretrukket, kan dette også oppnås ved anvendelse av preparativ skala HPLC med en aminopropyl-kolonne. Produktrenhet kan bli vurdert ved hjelp av TLC, HPLC, og / eller NMR-spektroskopi. Figur 5 viser representative analysedata for 6-TreAz, som ble syntetisert via den beskrevne protokoll. TLC og HPLC-data indikerte kvantitativ omdannelse av 6-GlcAz substrat for 6-TreAz produkt for denne reaksjonen, og det isolerte utbytte etter spinndialyse / ion-exchange rensetrinn var 58%. 1H og 13C NMR spektroskopi bekreftet strukturen av 6-TreAz produkt, spesielt inkludert α, α-stereokjemi av den nydannede glykosidiske binding, så vel som dets renhet.
Figur 5: Representative analytiske data for tret reaksjonen. (A) TLC og (B) HPLC-analyse av tret-katalysert omdannelse av 6-GlcAz til 6-TreAz. (C) 1H-NMR og (D) 13C-NMR-spektra av de seks-TreAz produkt oppnådd etter sentrifuge dialyse / ionebytting rensing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Gitt den nevnte verdi av trehalose analoger for den spesifikke deteksjon av M. tuberculosis, bør tret prosessen rette for utvikling og anvendelse av trehalose-baserte prober for tuberkulose forskning og diagnostiske anvendelser. For å demonstrere denne type program, brukte vi den optimaliserte tretFremgangsmåte til hurtig fremstille, rense og administrere 6-TreAz-en trehalose-baserte klikk-kjemi sonde 9 -til mykobakterier for å muliggjøre fluorescensdeteksjon (arbeidsflyt og representative data er vist i figur 6). I korthet tret ble benyttet for å omdanne kommersielle 6-GlcAz til 6-TreAz kvantitativt i 15 min, og deretter ble reaksjonsblandingen underkastet sentrifugedialyse / ionebytter-rensemetode, noe som tok bare 45 minutter (flere skylletrinn ble utelatt for å øke hastighet). Således ble en vandig lageroppløsning av ren 6-TreAz av kjent konsentrasjon (~ 5 mM) ble generert på bare 1 time. Den 6-TreAz masse ble umiddelbart administrert til en voksende kultur av modellen bakterien Msmeg (slutt 6-TreAz konsentrasjon ~ 25 uM) for å oppnå azid merking av celleoverflaten, hvor det innleiret et håndtak for klikk kjemi-mediert ligering 20, 21 av en fluorescerende probe. I ettertid,merkede celler ble analysert ved fluorescens mikroskopi, som viste sterk fluorescens i 6-TreAz-behandlede celler. Som forventet, ble kontrollprøver som ikke ble behandlet med 6-TreAz eller som mangler en funksjonell trehalose transportør 22, som er nødvendig for 6-TreAz opptak og metabolsk inkorporering 9, viste ingen fluorescens.
Figur 6: Representative resultater for rask deteksjon av mykobakterier ved hjelp av en tret-syntetisert analog trehalose. (A) arbeidsflyt for rask syntese, rensing, og bruk av 6-TreAz for fluorescens deteksjon av Msmeg. Trinn 5.1.1-5.1.6 av protokollen som ble brukt til å syntetisere og rense 6-TreAz (noe som gir et ~ 5 mM vandig løsning i en time), og deretter administrere det å leve Msmeg å oppnå metabolsk merking av celleoverflaten med azider. Deretter som beskrevet i trinn 5.2.1-5.2.9, klikker kjemi (CuAAC) ble utført for å reagere celleoverflate azider med et alkyn-modifisert fluorofor, alkyn-488. (B) Fluorescens avbildning av 6-TreAz behandlet Msmeg inneholder en funksjonell trehalose transporter (villtype og Δ sugC :: sugC) viste sterk fluorescens, mens kontrollprøver av Msmeg ubehandlet eller mangler trehalose transporter (Δ sugC) gjorde ikke . Figur tilpasset fra referanse 19 med tillatelse; oppdatert med arbeidsflyt og bildedata fra forbedret tret protokollen. Skala barer, fem mikrometer. Vær så snillKlikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trehalose analoger har potensial til å påvirke ulike felt, fra bevaring av mat og legemidler til diagnostisering og behandling av mikrobielle infeksjoner 6. Eksisterende flertrinns kjemiske syntesemetoder er nyttige for fremstilling av komplekse trehalose-analoger med flere områder av modifikasjon (f.eks, naturlig forekommende komplekse mykobakterielle glykolipider). Men disse fremgangsmåter er alltid lang og ineffektiv, selv når den brukes til syntese av forholdsvis enkle monosubstituerte trehalose analoger 9, 13, 14. Alternative syntetiske tilnærminger er nødvendig for å hurtig og effektivt produsere ulike typer av trehalose-analoger som kan ha verdi i de nevnte områdene. Biokatalytiske tilnærminger som utnytter trehalose-syntetisere enzymer fra naturen holder de mest lovende. Selv om flere trehalose-syntetisere traséfinnes i naturen, betrakter vi tret fra T. tenax 18 for å være den ideelle enzym for trehalose-analog syntese av flere grunner.
Tret fra T. Tenax er termostabile, slik at reaksjoner som skal varmes opp for økt hastighet og for forebygging av mikrobiell forurensning i produksjons innstillinger store. Tret fra T. Tenax er en enveis enzym som ikke er i stand til å nedbryte trehalose. Tret fra T. Tenax er mottagelig for uttrykk og rensing fra E. coli, og dens transport og lagring er lettvinte. Den tret reaksjonen er et enkelt trinn, og det innebærer enkle underlag glukose og UDP-glukose. Et stort antall strukturelt / funksjonelt forskjellige glukose analoger er tilgjengelige fra mange kommersielle leverandører. UDP-glukose er et relativt billig glukosedonor, spesielt i forhold til den Trep donor β-D-glukose-1-fosfat. Tret fra T. tenax har høy promiscuity for glukose underlaget struktur, slik at ulike trehalose analoger er tilgjengelige. Produkt rensing fra tret reaksjonsblandingen er rask og grei.
Heri rapporterte vi en detaljert optimalisert protokoll for trehalose analog syntese som kapitaliserer på de ovennevnte positive attributtene til tret enzymet. Den tret prosessen kan brukes for å få tilgang til en rekke rene trehalose analoger på en semi-preparativ skala (10-100 mg), selv om ytterligere oppskalering bør være mulig hvis ønskelig. Tallrike typer av analoger ble vist i vårt tidligere og foreliggende arbeid, blant annet azido-, deoxy-, fluor-, og tio-trehaloses, så vel som trehalose stereoisomerer, men andre modifikasjoner vil også være mulig (f.eks stabile isotop-merkede og radiomerket trehaloses er av særlig interesse). Syntese og rensing av tret fremgangsmåten er driftsmessig enkel og kan lett utføres av personell som ikke er trenet i syntetisk cheMistry. En av de mest attraktive trekk ved tret fremgangsmåte er at både syntese og rensing kan bli utført i et meget kort tidsrom, som varierer fra 1-4 timer, avhengig av antallet vasketrinn ønskede (Merk: Hvis størrelseseksklusjonskolonne rensing er nødvendig for å separere det trehalose analoge produkt fra ikke-omsatt analogt glukose, dette øker den totale tiden til ca 2 dager, som fortsatt er vesentlig hurtigere enn de eksisterende fremgangsmåter for trehalose-analog syntese).
Selv om tret prosessen er den mest effektive enzymatiske vei for å få tilgang til trehalose analoger rapportert ennå, har det noen ulemper som gir mulighet for fremtidige forbedringer. Først, selv om UDP-glukose er relativt billig i forhold til andre sukker givere, effektiviteten av tret prosessen kan bli ytterligere forbedret ved å koble det med en enzymatisk syntese av UDP-glukose fra en billigere kilde, f.eks α-D-glukose 1- fosfat, eller ved identifying en billig surrogat for UDP-glukose. En annen potensiell begrensning ved denne metode er at reaksjonen omfanget til slutt blir styrt av substratet toleranse av tret. Mens toleransen av villtype tret er ganske høy (se tabell 1), kan noen analoger ikke bli syntetisert ved hjelp av denne fremgangsmåten (for eksempel 4-stilling modifiserte analoger). Derfor vil konstruerte versjoner av tret med økt toleranse substratet være verdifull. For det tredje, mens mange tret-katalyserte reaksjoner forløper med kvantitativ omdannelse, nødvendiggjør lavere omdanning et kromatografisk rensetrinn. I denne protokoll har vi fokusert på å bruke en forholdsvis langsom størrelseseksklusjons-prosess fordi det er billig, krever ikke noe spesialutstyr, og kan utføres utelukkende med vann eluering. Alternativt kan HPLC-rensing ved anvendelse av en preparativ skala-aminopropyl søyle brukes som en raskere metode for produktrensing. Til tross for noen av disse begrensningene, gir tret prosessenen kraftig plattform for rask og effektiv utarbeidelse av trehalose analoger, og bør fremskynde sin evaluering og anvendelse i bio (techno) logiske og biomedisinske felt. Fremtidige forbedringer i tret prosessen, omtalt ovenfor, vil ytterligere styrke forskning og programmer knyttet til trehalose og dets derivater.
Trehalose analoger har potensiell verdi på ulike områder. Som nevnt i innledningen, er naturlig trehalose benyttes for biopreservation og mat søtnings- anvendelser, så trehalose analoger med egenskaper som degradering resistens kan være attraktive. I tillegg er en rekke stabile isotop-merkede og radioaktivt merkede versjoner av naturlig trehalose er kommersielt tilgjengelig for forskningsformål, og den tret prosessen kan sikkert gi rask og effektiv tilgang til disse molekylene. Trehalose analoger er også av interesse for målretting patogener med sonder og hemmere siden trehalose er fraværende fra pattedyr. en apgrammet i dette området som er av spesiell interesse er påvisning av mykobakterier. M. tuberculosis, den utløsende agent av tuberkulose, som dreper 1,5 millioner mennesker per år, inneholder unike trehalose-prosessering trasé som er fraværende fra pattedyr. For eksempel, trehalose-resirkulering transporter og nedstrøms enzymer som inneholder trehalose i ytre membran bosatt glycolipids ikke er til stede hos pattedyr 22. Målrette dette mykobakterier spesifikke maskiner med påvisbare trehalose analoger representerer en attraktiv tilnærming til in vivo avbildning av M. tuberculosis infeksjon i modellsystemer og muligens menneskelige pasienter. Faktisk har de ovennevnte eksempler på FITC-keto-trehalose og TreAz (figur 1B) banet vei for en slik utvikling 8, 9. For å lette tilgangen av disse verktøyene til forskersamfunnet, rapporterte vi her en protokoll for raskt synthesizing og bruk av 6-TreAz til bilde mykobakterier i kombinasjon med klikk kjemi.
Denne protokollen kan tilpasses for utvikling av andre påvisbare trehalose analoger som kan være nyttig for tuberkulose diagnostiske applikasjoner. For eksempel, Barry og Davis først foreslått en mulig bruk av 18 F-fluor-trehalose som en positronemisjonstomografi (PET) probe for in vivo avbildning av mykobakteriell infeksjon 8. Den tret prosessen kan være ideelt for å realisere dette målet. Tret er i stand til raskt og kvantitativt generering av 2-fluor-trehalose fra 2-fluor-glukose (se tabell 1), noe som er viktig, fordi 18 F-2-fluor-glukose er kortvarig (18 F halveringstid = 110 min ), nødvendig ekstremt rask kjemi. Videre er 18 F-2-fluor-glukose lett tilgjengelig fordi det er allerede brukt i klinikken for PET avbildning av svulster. Bruk av den beskrevne tret prosess for development av 18 F-fluor-trehalose og andre trehalose analoger for ulike bruksområder er for tiden i gang i våre laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB agar | Research Products International | L24021 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| Luria broth | Research Products International | L24045 | |
| Terrific Broth | Research Products International | T15050 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A3256 | |
| Phosphate-buffered Saline | GE Healthcare | SH30256 | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | I5513 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | S374 | |
| Syringe filter, 0.45 µm | Fisher Scientific | 09719D | |
| Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free | Thermo Scientific | 88666 | |
| HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| TRIS base ultrapure | Research Products International | T60040 | |
| Dialysis tubing, MWCO 12–14,000 | Fisher Scientific | 21-152-16 | |
| Glucose analogues | CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals | Examples of vendors that offer numerous glucose analogues | |
| 6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz) | CarboSynth | MA02620 | |
| UDP-Glucose | abcam Biochemicals | ab120384 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher Scientific | M33 | |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit | EMD Millipore | UFC901008 | |
| Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin | Bio-Rad | 444-9999 | |
| Extra-Fine Bio-Gel P2 media | Bio-Rad | 150-4118 | |
| Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates | EMD Millipore | 1056280001 | |
| n-Butanol | Fisher Scientific | A399 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | S25310A | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145 | |
| Deuterium oxide, 99.8% | Acros Organics | 351430075 | |
| Aminopropyl HPLC column | Sigma Aldrich | 58338 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Para-formaldehyde | Ted Pella | 18505 | |
| Alkyne-488 | Sigma Aldrich | 761621 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Click Chemistry Tools | 1061 | |
| tert-Butanol | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | W387520 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotechnology | 10001 |
References
- Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology. 13, 17-27 (2003).
- Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions. PLoS Pathog. 9, 1003447 (2013).
- Ohtake, S., Wang, Y. J. Trehalose: Current use and future applications. J. Pharm. Sci. 100, 2020-2053 (2011).
- Adams, R. P., Kendall, E., Kartha, K. K. Comparison of free sugars in growing and desiccated plants of Selaginella lepidophylla. Biochem. Syst. Ecol. 18, 107-110 (1990).
- Kubota, M. Glycoenzymes. Ohnishi, M. , Japan Scientific Societies Press. (2000).
- Walmagh, M., Zhao, R., Desmet, T. Trehalose analogues: latest insights in properties and biocatalytic production. Int. J. Mol. Sci. 16, 13729-13745 (2015).
- Kim, H. -M., Chang, Y. -K., Ryu, S. -I., Moon, S. -G., Lee, S. -B. Enzymatic synthesis of a galactose-containing trehalose analogue disaccharide by Pyrococcus horikoshii trehalose-synthesizing glycosyltransferase: Inhibitory effects on several disaccharidase activities. J. Mol. Catal. B: Enzym. 49, 98-103 (2007).
- Backus, K. M., et al. Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis. Nat. Chem. Biol. 7, 228-235 (2011).
- Swarts, B. M., et al. Probing the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry. J. Am. Chem. Soc. 134, 16123-16126 (2012).
- Rose, J. D., et al. Synthesis and biological evaluation of trehalose analogs as potential inhibitors of mycobacterial cell wall biosynthesis. Carbohydr. Res. 337, 105-120 (2002).
- Wang, J., et al. Synthesis of trehalose-based compounds and their inhibitory activities against Mycobacterium smegmatis. Bioorg. Med. Chem. 12, 6397-6413 (2004).
- Gobec, S., et al. Design, synthesis, biochemical evaluation and antimycobacterial action of phosphonate inhibitors of antigen 85C, a crucial enzyme involved in biosynthesis of the mycobacterial cell wall. Eur. J. Med. Chem. 42, 54-63 (2007).
- Sarpe, V. A., Kulkarni, S. S. Regioselective protection and functionalization of trehalose. Trends in Carbohydr. Res. 5, 8-33 (2013).
- Chaube, M. A., Kulkarni, S. S. Stereoselective construction of 1,1-alpha,alpha-glycosidic bonds. Trends in Carbohydr. Res. 4, 1-19 (2013).
- Leigh, C. D., Bertozzi, C. R. Synthetic studies toward Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-I. J. Org. Chem. 73, 1008-1017 (2008).
- Chaen, H., et al. Efficient enzymatic synthesis of disaccharide, alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside, by trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii. J. Appl. Glycosci. 48, 135-137 (2001).
- Vander Borght, J., Soetaert, W., Desmet, T. Engineering the acceptor specificity of trehalose phosphorylase for the production of trehalose analogs. Biotechnol. Progr. 28, 1257-1262 (2012).
- Kouril, T., Zaparty, M., Marrero, J., Brinkmann, H., Siebers, B. A novel trehalose synthesizing pathway in the hyperthermophilic Crenarchaeon Thermoproteus tenax: the unidirectional TreT pathway. Arch. Microbiol. 190, 355-369 (2008).
- Urbanek, B. L., et al. Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria. ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).
