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Biochemistry

रैपिड एक कदम एंजाइमी संश्लेषण और Trehalose analogues के सभी जलीय शोधन

Published: February 17, 2017 doi: 10.3791/54485
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, Central Michigan University, 2Department of Chemistry, University of Southern Maine

Abstract

रासायनिक संशोधित trehalose, या trehalose analogues के संस्करणों, अन्य क्षेत्रों के बीच जीव विज्ञान, जैव प्रौद्योगिकी, दवा और विज्ञान के क्षेत्र में अनुप्रयोगों, है। उदाहरण के लिए, detectable टैग असर trehalose analogues माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है और तपेदिक नैदानिक इमेजिंग एजेंट के रूप में आवेदन कर सकते हैं। trehalose की hydrolytically स्थिर संस्करण भी गैर-गरमी मिठास और bioprotective एजेंट के रूप में उपयोग के लिए अपनी क्षमता के कारण अपनाई जा रही है। विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए यौगिकों के इस वर्ग की अपील के बावजूद, अपनी क्षमता से उनके उत्पादन के लिए एक मजबूत मार्ग की कमी के कारण अधूरी बनी हुई है। यहाँ, हम तेजी से और कुशल एक कदम trehalose analogues के biocatalytic संश्लेषण है कि रासायनिक संश्लेषण से संबंधित समस्याओं को नजरअंदाज करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट। Thermoproteus Tenax से थर्मास्टाइबल trehalose synthase (Tret) एंजाइम का उपयोग करके, trehalose analogues generat हो सकता हैएड (मात्रात्मक रूपांतरण करने के लिए) 15-60 मिनट में ग्लूकोज analogues और उच्च उपज में uridine diphosphate ग्लूकोज से एक भी कदम में। एक सरल और तेजी गैर chromatographic शुद्धि प्रोटोकॉल, स्पिन डायलिसिस और आयन एक्सचेंज के होते हैं जो, के रूप में छोटा रूप में 45 मिनट में जलीय घोल में जाना जाता एकाग्रता के कई trehalose analogues वितरित कर सकते हैं। मामलों में जहां unreacted ग्लूकोज एनालॉग अभी भी बनी हुई है, trehalose अनुरूप उत्पाद की chromatographic शुद्धि प्रदर्शन किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस विधि में तेजी लाई संश्लेषण और trehalose analogues की शुद्धि के कुशल और गैर दवा की दुकानों के लिए सुलभ है उस के लिए एक "हरी" biocatalytic मंच प्रदान करता है। इस पद्धति के प्रयोग का उदाहरण देना करने के लिए, हम सब जलीय शुद्धि संश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और माइक्रोबैक्टीरिया की एक trehalose आधारित रसायन शास्त्र क्लिक जांच, जो सभी के लिए कम से कम 1 घंटा लग गया और सक्षम माइक्रोबैक्टीरिया की प्रतिदीप्ति का पता लगाने के प्रशासन। भविष्य में, हम है कि कल्पना, अन्य संगठनों के बीचएर अनुप्रयोगों, इस प्रोटोकॉल तपेदिक के निदान के लिए trehalose आधारित जांच का तेजी से संश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अल्पकालिक radionuclide संशोधित trehalose ऐसे पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी-गणना टोमोग्राफी (पीईटी-सीटी) के रूप में analogues (जैसे, 18 एफ संशोधित trehalose) उन्नत नैदानिक इमेजिंग तौर तरीकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

Trehalose एक सममित गैर को कम करने के लिए दो ग्लूकोज moieties कि एक 1,1-α, α-glycosidic बांड (चित्रा 1 ए) से जुड़े हुए हैं से मिलकर disaccharide है। जबकि trehalose मानव और अन्य स्तनधारियों से अनुपस्थित है, यह बैक्टीरिया, कवक, पौधे, और अकशेरुकी 1 में आमतौर पर पाया जाता है। सबसे जीवों में trehalose की प्राथमिक भूमिका ऐसी सुखाना 1 के रूप में पर्यावरण तनाव, के खिलाफ की रक्षा करने के लिए है। इसके अलावा, कुछ मानव रोगजनकों डाह के लिए trehalose की आवश्यकता होती है, तपेदिक के कारण माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग, जो सेल लिफाफा biosynthesis की एक मध्यस्थ के रूप में और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी glycolipids 2 के निर्माण के लिए एक इमारत ब्लॉक के रूप में trehalose का इस्तेमाल भी शामिल है।

आकृति 1
चित्रा 1: Trehalose और trehalose analogues। (ए) प्राकृतिक trehalose और एक अप्राकृतिक trehalose एनालॉग, जहां एक्स एक संरचनात्मक संशोधन है की संरचनाएं। (बी) साहित्य है कि biopreservation और bioimaging में संभावित अनुप्रयोगों में सूचना दी trehalose analogues के उदाहरण हैं।

अपनी अनूठी संरचना और शारीरिक कार्यों के कारण, trehalose और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों 3 जैव (तकनीकी) में उपयोग तार्किक के लिए महत्वपूर्ण ध्यान आकर्षित किया है। Nature- जैसे में मनाया trehalose की रक्षात्मक गुण, अपने हड़ताली क्षमता "पुनरुत्थान" पौधों है कि चरम निर्जलीकरण आया है 4 -have biopreservation अनुप्रयोगों में इसके व्यापक इस्तेमाल को प्रेरित में जीवन को बनाए रखने में मदद करने के लिए। Trehalose ऐसे न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन, कोशिकाओं और ऊतकों 3 के रूप में जैविक नमूने, की एक विस्तृत सरणी संरक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए, trehalose फार्मास्यूटिकल्स टी की संख्या में एक स्थिर additive के रूप में प्रयोग किया जाता हैटोपी बाजार पर हैं, कई विरोधी कैंसर मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 3 भी शामिल है। साथ ही, trehalose खाद्य उद्योग में एक स्वीटनर के रूप में प्रयोग किया जाता है, और यह बड़े पैमाने पर दोनों भोजन और सौंदर्य प्रसाधन उद्योग में उत्पाद संरक्षण के लिए प्रयोग किया जाता है। व्यावसायिक अनुप्रयोगों के इन प्रकार के लिए trehalose के गोद लेने शुरू में असमर्थता प्राकृतिक स्रोतों से या संश्लेषण के माध्यम से शुद्ध trehalose के थोक मात्रा में प्राप्त करने के लिए द्वारा सीमित था। हालांकि, स्टार्च से trehalose के आर्थिक उत्पादन के लिए एक कुशल enzymatic प्रक्रिया हाल ही में विकसित किया गया है, जो अपने बड़े पैमाने पर वाणिज्यिक उपयोग को प्रेरित किया है 5।

रासायनिक संशोधित trehalose के डेरिवेटिव, trehalose analogues के रूप में इस के साथ साथ के लिए भेजा (सामान्य संरचना चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, चित्रा 1 बी में दिखाया trehalose analogues के विशिष्ट उदाहरण) विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए बढ़ती ध्यान प्राप्त की है 6। उदाहरण के लिए, लैक्टो-trehalose, अपने ग्लूकोज इकाइयों में से एक गैलेक्टोज के साथ प्रतिस्थापित के साथ एक trehalose अनुरूप है इस प्रकार अपने 4 स्थिति हाइड्रॉक्सिल समूह एक औंधा stereochemical विन्यास है। लैक्टो-trehalose trehalose रूप में एक ही स्थिर गुण है लेकिन, आंतों एंजाइमों से गिरावट के लिए प्रतिरोधी है यह एक गैर-गरमी खाद्य additive 6, 7 के रूप में आकर्षक बना रही है।

trehalose analogues में हमारे समूह के हित में मुख्य रूप से माइक्रोबैक्टीरिया विशेष जांच और अवरोधकों के रूप में उनके मूल्य से संबंधित है। बैरी और डेविस समूहों को एक fluorescein संयुग्मित कीटो-trehalose एनालॉग, FITC-कीटो-trehalose का नाम है, जो दिखाया गया था पाचन लाइव एम तपेदिक के सेल की दीवार लेबल करने के लिए विकसित की है, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 8 से अपनी पहचान सक्षम करने से। Bertozzi प्रयोगशाला छोटे azido-trehalose (TreAz) analogues कि पाचन कोशिका दीवार लेबल और बाद में Det हो सकता है विकसितected क्लिक रसायन शास्त्र और प्रतिदीप्ति विश्लेषण 9 का उपयोग। इन अग्रिमों तपेदिक के लिए नैदानिक ​​इमेजिंग एजेंट के रूप में trehalose आधारित जांच उपयोग करने की संभावना को इंगित करें। Trehalose analogues भी जीवाणु कि व्यवहार्यता और डाह 10, 11, 12 के लिए आवश्यक हैं में रास्ते को बाधित करने के लिए अपनी क्षमता की वजह से एम तपेदिक के अवरोधकों के रूप में अपनाई गई है।

अब तक, जैव (तकनीकी) तार्किक और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए trehalose analogues के विकास के लिए मुख्य बाधा कुशल कृत्रिम तरीकों की कमी है। Trehalose analogues के उत्पादन के लिए दो परंपरागत मार्गों (चित्रा 2) रासायनिक संश्लेषण पर भरोसा करते हैं। एक मार्ग, प्राकृतिक trehalose की desymmetrization / संशोधन शामिल है, जबकि अन्य को ठीक से क्रियाशील मोनोसैकराइड इमारत ब्लॉकों के साथ शुरू करने के लिए और रासायनिक ग्लाइकोसिलेशन प्रदर्शन शामिल1,1-α, α-glycosidic बंधन बना। इन तरीकों, जो हाल ही में समीक्षा लेख 13, 14 में चर्चा की गई है, एम तपेदिक 15 से जैसे sulfolipid -1 जटिल trehalose युक्त प्राकृतिक उत्पादों, की छोटी मात्रा के multistep संश्लेषण को पूरा करने के लिए उपयोगी साबित किया है। हालांकि, दोनों तरीकों आम तौर पर अक्षम, समय लेने वाली है, गैर दवा की दुकानों के लिए दुर्गम हैं, और, इसके अतिरिक्त, पर्यावरण के अनुकूल नहीं माना जाता है। इस प्रकार, trehalose analogues के कुछ प्रकार के synthesizing के लिए, इन रणनीतियों नहीं आदर्श होते हैं।

चित्र 2
चित्रा 2: trehalose एनालॉग संश्लेषण के लिए दृष्टिकोण। केमिकल, trehalose एनालॉग संश्लेषण के लिए दृष्टिकोण छोड़ दिया पर दिखाया गया है, multistep प्रक्रियाओं है कि मुश्किल संरक्षण शामिल है का उपयोगtion / deprotection, desymmetrization, और / या ग्लाइकोसिलेशन कदम। Enzymatic संश्लेषण, सही पर दिखाया गया है, एंजाइम (ओं) stereoselectively जलीय घोल में analogues trehalose करने के लिए सरल, असुरक्षित substrates परिवर्तित करने के लिए उपयोग करता है। एंजाइमी प्रोटोकॉल के साथ साथ सूचना एक trehalose synthase (Tret) एंजाइम एक भी कदम में trehalose analogues में ग्लूकोज analogues और यूडीपी ग्लूकोज में परिवर्तित करने के लिए उपयोग करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

trehalose analogues के लिए एक कुशल biocatalytic मार्ग उत्पादन, मूल्यांकन, और अणुओं के इस होनहार वर्ग के आवेदन की सुविधा होगी। जबकि trehalose उत्पादन 5 के लिए वाणिज्यिक enzymatic प्रक्रिया analogues synthesizing क्योंकि यह एक सब्सट्रेट के रूप में स्टार्च का इस्तेमाल करने के लिए अनुकूल नहीं है, वहाँ अन्य biosynthetic पथ कर रहे हैंप्रकृति में है कि मायनों trehalose एनालॉग संश्लेषण के लिए शोषण किया जा सकता है। हालांकि, इस क्षेत्र है, जो हाल ही में 6 की समीक्षा की गई शोध में, सीमित कर दिया गया है। एक रिपोर्ट इसी फ्लोरो ग्लूकोज से एक भी फ्लोरो trehalose एनालॉग का उपयोग करने की एक विधि कोलाई trehalose biosynthetic मार्ग से प्रेरित किया करते थे। हालांकि, इस दृष्टिकोण एक तीन एंजाइम प्रणाली है कि क्षमता और व्यापकता 8 सीमित है की आवश्यकता है। एक और दृष्टिकोण है कि पता लगाया गया है रिवर्स दिशा है, जो सिद्धांत रूप में ग्लूकोज और ग्लूकोज analogues-1-फॉस्फेट 6, 16, 17 से trehalose analogues के एक कदम संश्लेषण परमिट में trehalose phosphorylase (Trep) का उपयोग करने के लिए है। हालांकि इस दृष्टिकोण भविष्य वादा हो सकता है, दोनों inverting और बनाए रखने TrePs वर्तमान एनालॉग संश्लेषण के लिए कमियां हैं। उदाहरण के लिए, inverting TrePs एक बेहद अनुभव हैnsive दाता अणु (β-डी ग्लूकोज 1-फॉस्फेट) और बनाए रखने TrePs गरीब एंजाइम अभिव्यक्ति की पैदावार / स्थिरता और सीमित सब्सट्रेट संकीर्णता है। महत्वपूर्ण सुधार (जैसे, एंजाइम इंजीनियरिंग के माध्यम से) से पहले Trep की मध्यस्थता एनालॉग संश्लेषण की जरूरत होगी व्यावहारिक है।

वर्तमान में, trehalose analogues के enzymatic संश्लेषण के लिए सबसे अधिक व्यावहारिक दृष्टिकोण एक trehalose synthase (Tret) एंजाइम, जो धर्मान्तरित ग्लूकोज और uridine diphosphate (यूडीपी) एक एकल चरण 6 में trehalose में -glucose का उपयोग करने के लिए है। हमने हाल ही में Thermoproteus Tenax Tret-एक थर्मास्टाइबल और दिशाहीन एंजाइम 18 का उपयोग करने वाली ग्लूकोज analogues और यूडीपी ग्लूकोज (चित्रा 3) 19 से trehalose analogues synthesize की सूचना दी। इस एंजाइम केवल सिंथेटिक दिशा में चल रही है और Trep प्रणाली में पाया trehalose गिरावट की समस्या से बचा जाता है। यह एक कदम प्रतिक्रिया Coul1 घंटे में पूरा किया जा डी, और trehalose analogues की एक व्यापक विविधता आसानी से उपलब्ध ग्लूकोज एनालॉग substrates (प्रतिनिधि परिणाम में 1 टेबल देखें से (> 99% तक के रूप में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा निर्धारित) उच्च उपज में पहुँचा रहे थे अनुभाग)।

चित्र तीन
चित्रा 3: trehalose analogues के Tret उत्प्रेरित एक कदम संश्लेषण। टी Tenax से Tret एंजाइम stereoselectively आसानी से उपलब्ध ग्लूकोज analogues और यूडीपी ग्लूकोज में शामिल होने के लिए एक कदम में trehalose analogues फार्म कर सकते हैं। आर आर 1 4 = चर संरचनात्मक संशोधन, उदाहरण के azido-, fluoro-, deoxy-, thio-, stereochemical, या समस्थानिक लेबल संशोधन के लिए; Y चर heteroatom, उदाहरण के ऑक्सीजन या सल्फर, या isotopically लेबल heteroatom के लिए =।

यहाँ, हम विज्ञापन प्रदानTret संश्लेषण की प्रक्रिया के लिए etailed प्रोटोकॉल, अभिव्यक्ति और ई कोलाई से Tret की शुद्धि सहित अनुकूलित Tret प्रतिक्रिया की स्थिति, और एक बेहतर तरीका है कि शुद्धि जलीय चरण में पूरी तरह से किया जाता है। इस संशोधित प्रोटोकॉल समीचीन और कुशल संश्लेषण और एक अर्द्ध प्रारंभिक पैमाने (10-100 मिलीग्राम) पर विविध trehalose analogues की शुद्धि के लिए सक्षम बनाता है। हम भी तैयार करने और कम से कम 1 घंटे की है, जो माइक्रोबैक्टीरियल कोशिकाओं का तेजी से प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए सक्षम में माइक्रोबैक्टीरिया की एक trehalose आधारित जांच के प्रशासन के लिए इस प्रोटोकॉल के उपयोग के प्रदर्शन।

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Protocol

1. अभिव्यक्ति और Tret की शुद्धि सर्वश्रेष्ठ 10 ई कोलाई से

नोट: लेखकों Tret व्यक्त ई कोलाई तनाव अनुरोध करने के लिए संपर्क करें (pBAD Tret प्लाज्मिड, Arac प्रोटीन का नियंत्रण, सर्वश्रेष्ठ 10 ई में तब्दील तहत टी Tenax Tret जीन युक्त कोलाई 19) और साथ सामग्री हस्तांतरण समझौते । निम्नलिखित प्रोटोकॉल आम तौर पर लगभग 4 मिलीग्राम / एल की एक प्रोटीन उपज देता है।

  1. Tret व्यक्त ई कोलाई के एक 3 एमएल रातोंरात संस्कृति तैयार करें।
    1. स्ट्रीक सर्वश्रेष्ठ 10 ई कोलाई एक Lysogeny शोरबा (पौंड) अगर प्लेट 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त पर pBAD-Tret अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ बदल दिया।
    2. लगभग 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
    3. थाली से एक भी कॉलोनी उठाओ और लेग तरल एक संस्कृति ट्यूब में 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त मध्यम के 3 एमएल टीका लगाना।
    4. 37 & # पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में ट्यूब रखें176, सी रात भर x 175 आरपीएम।
  2. Tret व्यक्त ई कोलाई में प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित।
    1. 750 एमएल भयानक शोरबा जोड़ें 100 माइक्रोग्राम / एमएल एक 2800 एमएल Fernbach संस्कृति फ्लास्क एम्पीसिलीन के साथ पूरक। एक खाली के रूप में बाद में उपयोग के लिए कुप्पी से स्थानांतरण 1 एमएल शोरबा एक क्युवेट करने के लिए।
    2. 3 एमएल रातोंरात संस्कृति कुप्पी के लिए कदम 1.1.4 में उत्पन्न संस्कृति जोड़ें, तो एक मशीन में कुप्पी जगह है और 37 डिग्री सेल्सियस x 200 आरपीएम हिला। समय समय पर खाली कदम 1.2.1 में एकत्र बनाम 600 एनएम पर संस्कृति के absorbance की जाँच करें।
    3. एक बार 600 एनएम पर absorbance 0.5-1.0 के बीच तक पहुँच जाता है, संस्कृति के लिए 1 एम arabinose समाधान (1 मिमी अंतिम एकाग्रता) के 750 μL जोड़कर Tret अभिव्यक्ति प्रेरित। इनक्यूबेटर कुप्पी लौटें और 37 डिग्री सेल्सियस x 200 rpm पर रात भर हिला।
  3. गोली और Tret व्यक्त ई कोलाई कोशिकाओं lyse।
    1. एक polypropylene बी करने के लिए संस्कृति स्थानांतरणottle और 4 डिग्री सेल्सियस पर 4000 XG पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और फॉस्फेट बफर खारा के 15 एमएल (पीबीएस) में गोली फिर से निलंबित।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4000 XG पर 15 मिनट के लिए एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र सेल निलंबन स्थानांतरण। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और या तो सेल (कदम 1.3.4) सेल करने के लिए या -80 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए गोली स्टोर आगे बढ़ें।
    4. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में धो बफर (50 मिमी नः 2 पीओ 4, 500 मिमी NaCl, 20 मिमी imidazole, 8.0 पीएच) के 20 एमएल में 1 protease अवरोध मिनी गोली भंग।
    5. गोली युक्त शंक्वाकार ट्यूब protease अवरोध युक्त धो बफर स्थानांतरण। गोली तक भंवर फिर से निलंबित कर दिया है।
    6. फिर से निलंबित कोशिकाओं को एक 100 एमएल बीकर (75 प्रतिशत के एक आयाम पर 2 मिनट और 15 सेकंड के एक चलाते समय के साथ बंद 45 सेकंड पर 45 सेकंड की पल्स अनुक्रम,) स्थानांतरण और कोशिकाओं sonication द्वारा lyse।
    7. 50 एमएल धातु शंक्वाकार ट्यूब lysate हस्तांतरणऔर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,000 XG पर 60 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    8. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एक 0.2-0.45 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से स्पष्ट बीतने के द्वारा lysate।
      नोट: प्राप्त lysate के ठेठ एकाग्रता 100 मिलीग्राम एमएल है /।
  4. तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) का उपयोग कर ई कोलाई सेल lysate से Tret शुद्ध।
    1. एक निकल आत्मीयता के स्तंभ (5 एमएल बिस्तर मात्रा) के साथ FPLC सेट करें। विआयनीकृत पानी के 10 एमएल के साथ या जब तक किसी भी स्तंभ प्रदूषणों से साफ है स्तंभ धो लें। स्तंभ धो बफर के 20 एमएल का उपयोग कर संतुलित करना (50 मिमी नः 2 पीओ 4, 500 मिमी NaCl, 20 मिमी imidazole, पीएच 8.0) 1 एमएल / मिनट की एक प्रवाह दर पर।
    2. lysate (20 एमएल) स्तंभ पर कदम 1.3.8 से प्राप्त लोड और 1 एमएल / मिनट की एक प्रवाह दर पर धो बफर के साथ untagged प्रोटीन elute तक absorbance पृष्ठभूमि के स्तर तक पहुँच जाता है (धो बफर के लिए आम तौर पर 80-100 एमएल आवश्यक हैं) ।
    3. टैग उनकी Elute Tret एक रेखीय जी का उपयोग करके1 एमएल / मिनट की एक प्रवाह दर पर क्षालन बफर (50 मिमी नः 2 पीओ 4, 500 मिमी NaCl, 250 मिमी imidazole, पीएच 8.0) 1-100% से 60 मिनट से अधिक का radient। 4 एमएल अंशों लीजिए जब तक Tret eluted गया है और absorbance के आधारभूत स्तर तक पहुँचता है।
      नोट: आमतौर पर, क्षालन बफर के 60 एमएल प्रोटीन elute के लिए आवश्यक हैं, और प्रोटीन 60-100% क्षालन बफर सीमा में elutes। लगभग क्षालन बफर में शुद्ध Tret के 10-15 एमएल प्राप्त कर रहे हैं।
    4. एक क्षालन बफर खाली खिलाफ 280 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा Tret की एकाग्रता का निर्धारण।
  5. Tris में एक्सचेंज Tret (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) डायलिसिस द्वारा बफर।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार डायलिसिस ट्यूबिंग तैयार करने के बाद, प्रधानमंत्री यह विआयनीकृत पानी और फिर Tris बफर (50 मिमी Tris, 300 मिमी NaCl, पीएच 8.0) के साथ rinsing द्वारा।
    2. एक सिरिंज और कुंद सुई का उपयोग डायलिसिस ट्यूबिंग में Tret नमूना लोड। रात भर एक DialyzeTris बफर के 2 एल gainst।
    3. एक खाली डायलिसिस धोने से एकत्र के खिलाफ 280 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा Tret की एकाग्रता का निर्धारण।
    4. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब Tret समाधान स्थानांतरण और trehalose एनालॉग संश्लेषण (चरण 2) के लिए आगे बढ़ना या 4 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम की दुकान।
      नोट: Tret एक थर्मास्टाइबल प्रोटीन होता है। Tret गतिविधि के महत्वपूर्ण नुकसान देख के बिना कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर Tris बफर में जमा हो गया था।

2. Trehalose analogues के एक कदम संश्लेषण Tret एंजाइम का उपयोग

नोट: नीचे प्रोटोकॉल एक प्रतिक्रिया 4 एमएल मात्रा के आधार पर पैमाने पर, जो प्रतिक्रिया क्षमता और उत्पाद की आणविक वजन पर निर्भर करता है trehalose एनालॉग के लगभग 15-30 मिलीग्राम वितरित कर सकते हैं वर्णन करता है। प्रतिक्रिया घटक लगभग trehalose एनालॉग प्राप्त करने के लिए अगर वांछित बढ़ाया जा सकता है।

  1. ग्लूकोज एनालॉग जोड़ें (0.080 mmol, बड़े पैमाने पर आणविक वजन पर निर्भर करेगा), यूडीपी ग्लूकोज (0।160 mmol, 97.6 मिलीग्राम), और 2 MgCl (0.080 mmol, 16.3 मिलीग्राम) एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब। इन घटकों के अंतिम सांद्रता 20 मिमी, 40 मिमी, और 20 मिमी, क्रमशः होगा।
  2. Tris बफर (कदम 1.5.4 से प्राप्त) में Tret जोड़ें और यदि आवश्यक हो, Tris बफर का एक उचित मात्रा (50 मिमी Tris, 300 मिमी NaCl, पीएच 8.0) 300 माइक्रोग्राम / एमएल और एक अंतिम के अंतिम एंजाइम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए 4 एमएल की मात्रा। Pipet मिश्रण के ऊपर और नीचे धीरे या ट्यूब ठोस भंग करने के लिए पलटना।
  3. 1 घंटे के लिए 300 rpm पर झटकों के साथ 70 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं, तो शांत करने के लिए बर्फ पर ट्यूब जगह है।

3. कच्चे enzymatic प्रतिक्रिया मिश्रण से Trehalose analogues की शुद्धि

  1. एक केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट (नाममात्र आणविक वजन सीमा (NWML) 10 केडीए) पूर्व कुल्ला केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट के लिए विआयनीकृत पानी की 3 एमएल जोड़ने और 3000 XG पर centrifuging द्वारा झिल्ली में ग्लिसरॉल ट्रेस दूर करने के लिए जब तक सभी तरल फिल्टर के माध्यम से गुजरता हैट्यूब में (लगभग 20 मिनट)। दो अतिरिक्त बार दोहराएँ। करने के लिए या प्रतिक्रिया (2.3 कदम) के दौरान तुरंत पहले इस कदम को पूरा करें।
  2. enzymatic प्रतिक्रिया मिश्रण (2.3 कदम से प्राप्त) ठंडा करने के बाद, पूर्व rinsed केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट को हस्तांतरण। केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट के लिए विआयनीकृत पानी और हस्तांतरण के 1 एमएल के साथ प्रतिक्रिया ट्यूब कुल्ला। उत्पाद की अधिकतम वसूली के लिए प्रतिक्रिया ट्यूब के दोहराएँ rinsing।
  3. 3,000 XG पर केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट अपकेंद्रित्र जब तक सभी तरल ट्यूब (लगभग 20 मिनट) में फिल्टर के माध्यम से गुजरता है। 3,000 XG पर विआयनीकृत पानी और सेंट्रीफ्यूज के 3 एमएल के साथ केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट के ऊपरी सदन कुल्ला जब तक सभी तरल ट्यूब (लगभग 20 मिनट) में फिल्टर के माध्यम से गुजरता है। उत्पाद की अधिकतम वसूली के लिए rinsing दोहराएँ।
  4. केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट के ऊपरी सदन त्यागें। ट्यूब (ठेठ छानना खंड के तल पर छानना करने के लिए मिश्रित बिस्तर आयन एक्सचेंज राल (3 जी) जोड़ेंUme rinses की संख्या के आधार पर 8-15 एमएल) है। गति समाधान में निलंबित राल मोती रखने के लिए पर्याप्त पर एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हिलाओ।
  5. सतह पर तैरनेवाला छानना और यह फिल्टर राल हटा दें। विआयनीकृत पानी की 5 एमएल शेष राल कुल्ला करने के लिए जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला छानना और यह फिल्टर, पहली निस्तारण से उत्पाद समाधान के साथ संयोजन। उत्पाद की अधिकतम वसूली के लिए राल के दोहराएँ rinsing।
  6. पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) या एचपीएलसी द्वारा प्रतिक्रिया का विश्लेषण लिए तय है कि ग्लूकोज एनालॉग trehalose अनुरूप उत्पाद के लिए सामग्री शुरू करने की पूरी रूपांतरण प्राप्त किया गया था। टीएलसी विश्लेषण के लिए 4.1 कदम देखें और एचपीएलसी विश्लेषण के लिए 4.2 कदम।
  7. lyophilization या रोटरी वाष्पीकरण द्वारा पानी निकालने के सूखे उत्पाद देने के लिए। कोई unreacted ग्लूकोज एनालॉग टीएलसी या HPLC विश्लेषण के दौरान देखा गया था, क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्धि अनावश्यक है। उत्पाद प्रतिक्रिया Yie प्राप्त करने के लिए वजनएलडी और परमाणु चुंबकीय अनुनाद प्रदर्शन (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण (4.3 चरण) उत्पाद संरचना और पवित्रता पुष्टि करने के लिए।
  8. unreacted ग्लूकोज एनालॉग टीएलसी विश्लेषण के दौरान देखा गया था, trehalose अनुरूप एक आकार अपवर्जन स्तंभ का उपयोग करने से यह अलग है।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार विआयनीकृत पानी संतृप्त, अतिरिक्त ठीक p2 के polyacrylamide मनका आकार अपवर्जन मीडिया वाले एक 1 एक्स 100 सेमी स्तंभ तैयार करें।
      नोट: आकार अपवर्जन स्तंभ विआयनीकृत पानी से धोने के बाद पुन: उपयोग किया जा सकता है।
    2. फिर से भंग सूखे enzymatic प्रतिक्रिया उत्पाद विआयनीकृत पानी की 0.5 एमएल में (3.7 चरण से प्राप्त)। आकार अपवर्जन स्तंभ मैन्युअल करने के लिए या एक स्तंभ प्रवाह अनुकूलक का उपयोग करके उत्पाद समाधान को लागू करें। शीशी है कि एक और 0.5 एमएल विआयनीकृत पानी के साथ कच्चे तेल उत्पाद निहित कुल्ला, और आकार अपवर्जन स्तंभ में लोड।
    3. गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से विआयनीकृत पानी के साथ उत्पाद Elute और लगभग 2 मीटर के भागों को इकट्ठाएल मात्रा।
    4. टीएलसी (4.1 कदम) से अंशों का विश्लेषण। शुद्ध trehalose एनालॉग युक्त भिन्न पूल।
    5. lyophilization या रोटरी वाष्पीकरण द्वारा पानी निकालने के सूखे उत्पाद देने के लिए। उत्पाद प्रतिक्रिया उपज प्राप्त करने और एनएमआर विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ने के लिए वजन (4.3 चरण देखें)।

4. Trehalose एनालॉग उत्पादों के विश्लेषण

  1. पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) Tret प्रतिक्रिया का विश्लेषण करते हैं।
    नोट: इस प्रक्रिया का भी आकार अपवर्जन स्तंभ अंशों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह टीएलसी विश्लेषण करने से पहले टीएलसी थाली पर यौगिक धुंधला निरीक्षण करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण या स्तंभ अंशों ध्यान केंद्रित करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
    1. मार्क एक पेंसिल के साथ टीएलसी थाली सतह पर गलियों और ग्लूकोज अनुरूप मानक, trehalose अनुरूप मानक (यदि उपलब्ध हो), प्रतिक्रिया मिश्रण सहित उचित गलियों, (या अंशों से एकत्र करने के लिए analyte (एस) और प्रासंगिक मानक (एस) लागू आकार Exclusion स्तंभ शुद्धि), और एक सह-हाजिर। टीएलसी थाली करने के लिए प्रत्येक नमूना आवेदन करने के बाद, थाली सूखे के लिए अनुमति देते हैं।
      नोट: प्रतिक्रिया विश्लेषण के लिए, आम तौर पर नमूने के 2 μL टीएलसी थाली करने के लिए लागू किया जाता है।
    2. N -butanol / इथेनॉल / विआयनीकृत पानी का उपयोग कर टीएलसी प्लेट का विकास (5: 3: 2)।
    3. विकसित टीएलसी थाली सूखी है, तो उच्च सेटिंग पर एक गर्म थाली पर इथेनॉल (चीनी दाग) और गर्मी में 5% एच 2 में डुबकी अतः 4 जब तक चीनी युक्त धब्बे देखे जा सकते हैं (आमतौर पर 5 मिनट)।
  2. Tret प्रतिक्रिया किसी भी एचपीएलसी प्रणाली को अलग करने और कार्बोहाइड्रेट पता लगाने में सक्षम का उपयोग कर मिश्रण के एचपीएलसी विश्लेषण करते हैं। इस प्रोटोकॉल कार्बोहाइड्रेट जुदाई एक aminopropyl एचपीएलसी स्तंभ और पता लगाने का उपयोग अपवर्तनांक का उपयोग शामिल है।
    1. aminopropyl स्तंभ (4.6 x 250 मिमी) एचपीएलसी करने के लिए एक पूर्व स्तंभ गार्ड युक्त संलग्न।
    2. 0.4 की एक प्रवाह दर पर विआयनीकृत पानी में 80% acetonitrile साथ aminopropyl स्तंभ संतुलित करनाएमएल / मिनट।
    3. aminopropyl स्तंभ पर प्रतिक्रिया उत्पाद (या मानक) का समाधान लोड।
    4. 0.4 एमएल / मिनट की एक प्रवाह दर और 50 डिग्री सेल्सियस के एक स्तंभ के तापमान पर विआयनीकृत पानी में 80% acetonitrile के साथ उत्पाद (या मानक) Elute। आमतौर पर, रन इस्तेमाल किया समय 40 मिनट है।
      नोट: ग्लूकोज एनालॉग शुरू सामग्री और trehalose अनुरूप उत्पाद दोनों, अपवर्तनांक से पता लगाया जा सकता है, हालांकि इस तरह के बाष्पीकरणीय प्रकाश बिखरने का पता लगाने (eLSD) के रूप में अन्य तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है। शर्तों में वर्णित का उपयोग करना, ग्लूकोज analogues आम तौर पर elute मिनट और trehalose analogues 10-15 के बीच 15-25 मिनट के बीच elute।
  3. शुद्ध trehalose analogues के एनएमआर विश्लेषण।
    1. डी 2 ओ (700 μL) में शुद्ध trehalose एनालॉग भंग और एक एनएमआर ट्यूब का हल हस्तांतरण।
    2. 1 एच और उचित एनएमआर सुविधा प्रोटोकॉल के अनुसार 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रा मोल।

  1. Synthesize, शुद्ध, और प्रशासन एम smegmatis करने के लिए 6-TreAz (Msmeg)।
    1. 6-azido-6-डिओक्सी glucopyranose (6-GlcAz, 0.020 mmol, 4.1 मिलीग्राम), यूडीपी ग्लूकोज (0.040 mmol, 24.4 मिलीग्राम), और 2 MgCl (0.020 mmol, 4.1 मिलीग्राम) एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जोड़े।
    2. 300 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एंजाइम एकाग्रता और 1 एमएल के अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए Tris बफर (कदम 1.5.4 से प्राप्त) में Tret जोड़ें। Pipet मिश्रण के ऊपर और नीचे धीरे या ट्यूब ठोस भंग करने के लिए पलटना।
    3. 15 मिनट के लिए झटकों के साथ 70 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं।
    4. विआयनीकृत पानी की 3 एमएल के साथ enzymatic प्रतिक्रिया मिश्रण पतला और एक पूर्व धोया केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट (NMWL 10 केडीए) को हस्तांतरण। 3,000 XG पर फिल्टर यूनिट अपकेंद्रित्र जब तक तरल के अधिकांश, ट्यूब में फिल्टर के माध्यम से गुजरता लगभग 10 मिनट।
    5. त्यागें वेंई केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट के ऊपरी सदन। 25 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब और हलचल / शेक करने के लिए मिश्रित बिस्तर आयन एक्सचेंज राल (0.75 छ) जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला छानना और यह फिल्टर राल हटा दें।
      नोट: कदम 5.1.1-5.1.5 कम से कम 1 घंटे में लगभग 5 मिमी एकाग्रता में 6 azido-trehalose (6-TreAz) की एक जलीय समाधान प्रदान करते हैं। 5 मिमी एकाग्रता उत्पाद के लिए सब्सट्रेट के मात्रात्मक रूपांतरण और कमजोर पड़ने कि शुद्धि चरणों के दौरान जगह लेता है, इन चरणों के दौरान उत्पाद का कम से कम नुकसान संभालने के आधार पर अनुमान लगाया गया है। समाधान बाँझ फ़िल्टर अगर वांछित एक जैविक नमूने के अलावा पहले हो सकता है।
    6. एक अंतिम संस्कृति और ~ 25 माइक्रोन की अंतिम 6-TreAz एकाग्रता 100-1,000 μL की मात्रा प्राप्त करने के लिए एम smegmatis का एक लॉग चरण संस्कृति (Msmeg) के लिए 6-TreAz उत्पाद समाधान का उचित मात्रा में जोड़ें, आम तौर पर। समय के वांछित राशि, आम तौर पर 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. रसायन शास्त्र क्लिक azide लेबल की कोशिकाओं के लिए एक fluorophore एकत्रित करने के लिए प्रदर्शन करना। इस प्रोटोकॉल में, घन उत्प्रेरित azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) का उपयोग Msmeg में सेल सतह azides करने के लिए एक fluorophore देने के लिए।
    1. 5 मिनट के लिए 3900 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, और फिर पीबीएस 0.5% गोजातीय सीरम albumin युक्त कोशिकाओं धो लें। दो बार दोहराएँ।
    2. उन्हें ठीक करने के लिए पीबीएस में 4% पैरा-formaldehyde में pelleted कोशिकाओं को फिर से निलंबित। 10 मिनट के लिए incubating के बाद, कदम 5.2.1 दोहराने की कोशिकाओं को धोने के लिए।
    3. 138 μL पीबीएस में pelleted कोशिकाओं फिर से निलंबित।
    4. DMSO में alkyne-carboxyrhodamine 110 (alkyne-488) के एक 1 मिमी स्टॉक समाधान के 3 μL जोड़ें।
    5. विआयनीकृत पानी में सोडियम एस्कॉर्बेट की एक हौसले से तैयार 60 मिमी शेयर समाधान के 3 μL जोड़ें।
    6. Tert -butanol / dimethylsulfoxide में Tris [(1-लोबान-1H-1,2,3-triazol-4-YL) मिथाइल] अमाइन (TBTA) के एक 6.4 मिमी शेयर समाधान (DMSO) के 3 μL जोड़े 4: 1।
    7. 3 & # जोड़े956; विआयनीकृत पानी में CuSO 4 के एक 50 मिमी शेयर समाधान के एल।
    8. Pipet सेल निलंबन ऊपर और नीचे, फिर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में सेते हैं।
    9. दोहराएँ कदम 5.2.1 कोशिकाओं को धोने के लिए। 150 μL पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
  3. सेलुलर प्रतिदीप्ति विश्लेषण करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, लेबल Msmeg के सेलुलर प्रतिदीप्ति कल्पना करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें।
    1. एक खुर्दबीन स्लाइड पीबीएस में निलंबित कर दिया बैक्टीरियल कोशिकाओं के 10 μL जोड़ें और हल्के से एक पतली परत के एक coverslip के किनारे का उपयोग करने में तरल फैल गया। अंधेरे में शुष्क हवा की अनुमति दें।
    2. सूखे नमूना भर में बढ़ते मध्यम के 10 μL जोड़ें, तो जगह कवर नमूना पर फिसल जाता है और चिपकने वाला लागू होते हैं (जैसे, नेल पॉलिश) स्थिर करने के लिए।
    3. छवि 100X बढ़ाई पर एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर स्लाइड।

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Representative Results

टी Tenax Tret लगभग 4 मिलीग्राम / एल मानक प्रोटीन अभिव्यक्ति और शोधन तकनीक का उपयोग करने का एक उपज में ई कोलाई से प्राप्त हुई थी। एक एकल निकल आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कदम ई कोलाई lysate से Tret को शुद्ध करने के लिए पर्याप्त था (एक प्रतिनिधि FPLC ट्रेस चित्रा 4 में दिखाया गया है)। जैसा कि Tret संश्लेषण की प्रक्रिया पर हमारे प्रारंभिक प्रकाशन में स्थापित किया गया, पुनः संयोजक टी Tenax Tret किस्म ग्लूकोज analogues-जिनमें से कई की एक व्यापक परिवर्तित करने में सक्षम है व्यावसायिक रूप से उच्च दक्षता 19 के साथ उपलब्ध करने के लिए इसी trehalose analogues हैं। तालिका 1 है, जो हमारे शुरू में सूचना प्रोटोकॉल का उपयोग ग्लूकोज analogues शुरू करने के एक नंबर के लिए एचपीएलसी निर्धारित प्रतिक्रिया पैदावार देता है, Tret के सब्सट्रेट संकीर्णता और संश्लेषण के लिए अपनी उपयुक्तता के दायरे को दिखाता है। विविध संरचनात्मक संशोधनों, fluoro-, deoxy-, azido- सहित,thio-, और जंगली प्रकार एंजाइम द्वारा अच्छी तरह से सहन चीनी अंगूठी के आसपास विभिन्न पदों पर stereochemical संशोधन कर रहे हैं, मुख्य अपवाद 4 स्थिति में संशोधनों के साथ किया जा रहा।

चित्रा 4
चित्रा 4: FPLC द्वारा Tret शुद्धि के लिए प्रतिनिधि परिणाम है। ई कोलाई lysate से पुनः संयोजक टी Tenax Tret की शुद्धि निकल आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी चरणों में वर्णित के रूप में 1.4.1-1.4.4 का उपयोग किया जाता था। ब्लू, पराबैंगनी (यूवी) absorbance का पता लगाने; हल्के हरे रंग, क्षालन बफर की एकाग्रता; गहरे हरे रंग की, दबाव। शिखर Tret को इसी एक तीर के साथ संकेत दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


तालिका 1: Tret प्रतिक्रिया के लिए प्रतिनिधि पैदावार। एचपीएलसी निर्धारित है और कई trehalose analogues के लिए Tret प्रतिक्रिया के अलग पैदावार। एन डी, पता नहीं। - यह बताता है प्रतिक्रिया अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक अर्द्ध प्रारंभिक पैमाने पर प्रदर्शन नहीं कर रहा था। * इंगित करता है कि आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी कदम आवश्यक था। क्षैतिज विभाजित लाइनों trehalose चीनी अंगूठी पर संशोधन की स्थिति अलग है। अनुमति के साथ संदर्भ 19 से अनुकूलित तालिका; इस काम से अलग पैदावार शामिल करने के लिए अद्यतन किया गया। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

इस के साथ साथ, हम अपने प्रारंभिक प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलन है कि समग्र दक्षता और Tret संश्लेषण की प्रक्रिया की गति में सुधार की रिपोर्ट। मूल प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया, जबकि 10 मिमी ग्लूकोज एकalogue और 40 मिमी यूडीपी ग्लूकोज, यह निर्धारित किया गया था कि तुलनीय रूपांतरण 20 मिमी ग्लूकोज और 40 मिमी यूडीपी ग्लूकोज का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, प्रभावी ढंग से प्रतिक्रिया प्रति उत्पन्न उत्पाद की राशि को दोगुना करने और यूडीपी ग्लूकोज की बेकार है, जो अपेक्षाकृत महंगी है सीमित । ग्लूकोज एनालॉग और यूडीपी ग्लूकोज की equimolar मात्रा का उपयोग कम रूपांतरण में हुई। अगर वांछित, प्रतिक्रिया बार भी शुरू में सूचना 60 मिनट से भी कम समय के लिए छोटा हो सकता है, जबकि अभी भी (कई analogues है, जो 70 डिग्री सेल्सियस पर केवल 15 मिनट में 6 TreAz करने के लिए 6-GlcAz की मात्रात्मक रूपांतरण के द्वारा प्रदर्शन किया गया था के लिए तुलनीय रूपांतरण को बनाए रखना है आंकड़े 5 और 6)।

शुद्धि प्रोटोकॉल के साथ साथ सूचना काफी हद तक सुधार हुआ है, एक गैर chromatographic स्पिन डायलिसिस / आयन एक्सचेंज विधि के साथ मूल एंजाइम वर्षा / सिलिका जेल क्रोमैटोग्राफी विधि की जगह ले। इस संशोधन के लिए तर्क यह है कि Tret r हैeaction मिश्रण तटस्थ trehalose अनुरूप उत्पाद के अलावा ईओण प्रजातियों की पूरी तरह से होते हैं। इसलिए, मिश्रण स्पिन dialyzed एंजाइम को दूर करने के लिए और फिर मिश्रित बिस्तर आयन एक्सचेंज राल के साथ इलाज किया ईओण प्रजातियों में से सभी को दूर करने के लिए, के रूप में छोटा रूप में 45 मिनट में जलीय घोल में शुद्ध trehalose एनालॉग पहुंचाने हो सकता है। यह सब जलीय शोधन विधि पर्यावरण की दृष्टि से हानिकारक कार्बनिक सॉल्वैंट्स, समय लेने वाली वाष्पीकरण और निस्पंदन कदम है, और सूखी लोड सिलिका जेल क्रोमैटोग्राफी, जो एक धीमी और बोझिल प्रक्रिया है, विशेष रूप से गैर-दवा की दुकानों के लिए बचा जाता है। Tret प्रतिक्रियाओं है कि मात्रात्मक रूपांतरण प्रदर्शनी के रूप में वर्णित टीएलसी या एचपीएलसी विश्लेषण का उपयोग निर्धारित के लिए, यह शोधन विधि लगभग 60-80% के अलग पैदावार सूचना दी प्रतिक्रिया पैमाने पर उत्पाद हानि के साथ होने की संभावना के कारण आयन एक्सचेंज के लिए कुछ चीनी के बंधन को प्रदान करता है राल (प्रतिनिधि पृथक पैदावार के लिए 1 टेबल देखें)। मामलों में जहां unreacted ग्लूकोज एनालॉग रहता में,यह वांछित trehalose अनुरूप एक polyacrylamide मनका-आधारित आकार अपवर्जन स्तंभ का उपयोग उत्पाद से अलग किया जा सकता है, पानी के साथ एल्यूटिंग। अगर पसंद है, यह भी एक aminopropyl स्तंभ के साथ प्रारंभिक पैमाने एचपीएलसी का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है। उत्पाद पवित्रता टीएलसी, एचपीएलसी, और / या एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। चित्रा 5 6 TreAz, जो वर्णित प्रोटोकॉल के माध्यम से संश्लेषित किया गया था के लिए प्रतिनिधि विश्लेषणात्मक डेटा से पता चलता है। टीएलसी और एचपीएलसी डेटा इस प्रतिक्रिया के लिए 6-TreAz उत्पाद के लिए 6-GlcAz सब्सट्रेट की मात्रात्मक रूपांतरण संकेत दिया है, और स्पिन डायलिसिस / आयन एक्सचेंज शुद्धि कदम के बाद अलग-थलग उपज 58% थी। 1 एच और 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण सबसे विशेष रूप से α, नवगठित glycosidic बांड की α-त्रिविम, साथ ही इसकी शुद्धता सहित 6-TreAz उत्पाद की संरचना की पुष्टि की।

चित्रा 5 चित्रा 5: Tret प्रतिक्रिया के लिए प्रतिनिधि विश्लेषणात्मक डेटा। (ए) टीएलसी और (बी) 6-TreAz करने के लिए 6-GlcAz की Tret उत्प्रेरित रूपांतरण का एचपीएलसी विश्लेषण। (सी) 1 एच एनएमआर और (डी) 13 सी एनएमआर 6-TreAz स्पिन डायलिसिस / आयन एक्सचेंज शुद्धि के बाद प्राप्त उत्पाद के स्पेक्ट्रा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एम तपेदिक की विशिष्ट पहचान के लिए trehalose analogues के ऊपर उल्लिखित मूल्य को देखते हुए, Tret प्रक्रिया तपेदिक अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए विकास और trehalose आधारित जांच के उपयोग की सुविधा चाहिए। आवेदन के इस प्रकार प्रदर्शित करने के लिए, हम अनुकूलित Tret इस्तेमाल कियाप्रक्रिया तेजी से तैयार करने को शुद्ध, और प्रशासन के 6 TreAz-एक trehalose आधारित रसायन शास्त्र क्लिक जांच प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए सक्षम करने के लिए 9 -to माइक्रोबैक्टीरिया करने के लिए (कार्यप्रवाह और प्रतिनिधि डेटा 6 चित्र में दिखाया जाता है)। संक्षेप में, Tret मात्रात्मक 15 मिनट में 6 TreAz के लिए वाणिज्यिक 6-GlcAz परिवर्तित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और फिर प्रतिक्रिया मिश्रण स्पिन डायलिसिस / आयन एक्सचेंज शोधन विधि है, जो केवल 45 मिनट में ले लिया गया था अधीन (एकाधिक कुल्ला कदम बढ़ाने के लिए छोड़े गए थे गति)। इस प्रकार, ज्ञात एकाग्रता का शुद्ध 6-TreAz (~ 5 मिमी) का एक जलीय शेयर समाधान केवल 1 घंटे में तैयार की गई थी। 6-TreAz शेयर तुरंत कोशिका की सतह, जिसके लिए क्लिक रसायन विज्ञान की मध्यस्थता बंधाव 20, 21 के एक संभाल एम्बेडेड की azide लेबलिंग पूरा करने के लिए मॉडल जीवाणु Msmeg (अंतिम 6-TreAz एकाग्रता ~ 25 माइक्रोन) के के एक बढ़ती संस्कृति को दिलाई एक फ्लोरोसेंट जांच। बाद में,लेबल की कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, जो 6-TreAz इलाज कोशिकाओं के लिए मजबूत प्रतिदीप्ति दिखाया द्वारा विश्लेषण किया गया। जैसी कि उम्मीद थी, नियंत्रण के नमूने है कि 6-TreAz या उस के साथ इलाज नहीं किया गया एक कार्यात्मक trehalose ट्रांसपोर्टर 22 है, जो 6-TreAz तेज और चयापचय समावेश 9 के लिए आवश्यक है याद कर रहे थे, कोई प्रतिदीप्ति दिखाया।

चित्रा 6
चित्रा 6: एक Tret संश्लेषित trehalose एनालॉग का उपयोग कर माइक्रोबैक्टीरिया की तेजी से पता लगाने के लिए प्रतिनिधि परिणाम है। (ए) तेजी से संश्लेषण, शुद्धि, और 6-Tre के उपयोग के लिए कार्यप्रवाहMsmeg के प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए आज़। कदम प्रोटोकॉल का 5.1.1-5.1.6 Msmeg रहने के लिए azides साथ कोशिका की सतह के चयापचय लेबलिंग पूरा करने के लिए, synthesize और शुद्ध 6-TreAz (एक ~ 5 मिमी 1 घंटे में जलीय घोल दे रही है) का इस्तेमाल किया गया है तो यह प्रशासन। अगले, कदम 5.2.1-5.2.9 में वर्णित के रूप में, क्लिक करें रसायन शास्त्र (CuAAC) एक alkyne संशोधित fluorophore, alkyne-488 के साथ सेल सतह azides प्रतिक्रिया करने के लिए प्रदर्शन किया था। (बी) 6-TreAz इलाज Msmeg की प्रतिदीप्ति इमेजिंग एक कार्यात्मक trehalose ट्रांसपोर्टर (जंगली प्रकार और Δ sugC :: sugC), मजबूत प्रतिदीप्ति से पता चला है, जबकि Msmeg के नियंत्रण के नमूने अनुपचारित या trehalose ट्रांसपोर्टर (Δ sugC) की कमी नहीं छोड़ा किया युक्त । अनुमति के साथ संदर्भ 19 से अनुकूलित चित्रा; सुधार किया Tret प्रोटोकॉल से कार्यप्रवाह और इमेजिंग डेटा के साथ अद्यतन। स्केल सलाखों, 5 माइक्रोन। कृप्यायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Trehalose analogues संभावित भोजन और दवाइयों के संरक्षण से निदान और सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण 6 के उपचार के लिए विभिन्न क्षेत्रों को प्रभावित किया है। मौजूदा multistep रासायनिक संश्लेषण तरीकों (स्वाभाविक रूप से जटिल माइक्रोबैक्टीरियल glycolipids होने वाली है, उदाहरण के लिए) संशोधन की कई साइटों के साथ जटिल trehalose analogues के उत्पादन के लिए उपयोगी होते हैं। हालांकि, इन तरीकों सदा ही लंबा और अक्षम हैं, तब भी जब अपेक्षाकृत सरल monosubstituted trehalose analogues 9, 13, 14 के संश्लेषण के लिए आवेदन किया। वैकल्पिक सिंथेटिक दृष्टिकोण तेजी से और कुशलता trehalose analogues ऊपर उल्लिखित क्षेत्रों में मूल्य हो सकता है कि विभिन्न प्रकार के उत्पादन के लिए आवश्यक हैं। Biocatalytic दृष्टिकोण है कि शोषण प्रकृति से trehalose-synthesizing एंजाइमों सबसे वादा पकड़। हालांकि कई trehalose-synthesizing रास्तेप्रकृति में मौजूद है, हम कई कारणों के लिए trehalose एनालॉग संश्लेषण के लिए आदर्श एंजाइम होने की टी Tenax 18 से Tret पर विचार करें।

टी Tenax से Tret की इजाजत दी प्रतिक्रियाओं में सुधार की गति के लिए और बड़े पैमाने पर उत्पादन सेटिंग्स में सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण की रोकथाम के लिए गर्म करने के लिए, थर्मास्टाइबल है। टी Tenax से Tret एक दिशाहीन एंजाइम है कि trehalose अपमानजनक करने में सक्षम नहीं है। टी Tenax से Tret अभिव्यक्ति और ई कोलाई से शुद्धि के लिए उत्तरदायी है, और इसकी शिपमेंट और भंडारण सतही है। Tret प्रतिक्रिया एक भी कदम है और यह सरल substrates ग्लूकोज और यूडीपी ग्लूकोज शामिल है। संरचनात्मक रूप / कार्यात्मक विविध ग्लूकोज analogues की एक बड़ी संख्या में कई वाणिज्यिक विक्रेताओं से उपलब्ध हैं। यूडीपी ग्लूकोज एक अपेक्षाकृत सस्ती ग्लूकोज दाता, विशेष रूप से Trep दाता β-डी ग्लूकोज 1-फॉस्फेट की तुलना में है। टी Tenax से Tret उच्च पीआर हैग्लूकोज सब्सट्रेट संरचना के लिए omiscuity, ताकि विभिन्न trehalose analogues पहुंच रहे हैं। Tret प्रतिक्रिया मिश्रण से उत्पाद शुद्धि तेजी से और सीधा है।

इस के साथ साथ, हम उस Tret एंजाइम के ऊपर सकारात्मक विशेषताओं पर capitalizes trehalose एनालॉग संश्लेषण के लिए एक विस्तृत अनुकूलित प्रोटोकॉल की सूचना दी। Tret प्रक्रिया एक अर्द्ध प्रारंभिक पैमाने (10-100 मिलीग्राम) पर शुद्ध trehalose analogues के एक किस्म का उपयोग करने के लिए है, हालांकि अतिरिक्त पैमाने अप संभव होना चाहिए अगर वांछित इस्तेमाल किया जा सकता है। Analogues के कई प्रकार हमारे पूर्व और वर्तमान कार्य, azido-, deoxy-, fluoro-, और thio-trehaloses, साथ ही trehalose स्टीरियोआइसोमर सहित पहुँचा रहे थे, लेकिन अन्य संशोधनों भी संभव हो सकता है (जैसे, स्थिर आइसोटोप लेबल और radiolabeled trehaloses विशेष रुचि के हैं)। Tret प्रक्रिया के संश्लेषण और शुद्धि चरणों सक्रिय सरल कर रहे हैं और आसानी से कर्मियों जो सिंथेटिक चे में प्रशिक्षित नहीं हैं से बाहर किया जा सकतामिस्त्री। यदि आकार अपवर्जन स्तंभ: Tret प्रक्रिया का सबसे आकर्षक सुविधाओं में से एक है कि दोनों संश्लेषण और शुद्धि कदम वांछित (नोट धोने कदम की संख्या के आधार पर 1-4 घंटे से लेकर समय की एक बहुत ही कम अवधि में क्रियान्वित किया जा सकता है, शुद्धि unreacted ग्लूकोज एनालॉग से trehalose अनुरूप उत्पाद को अलग करने की जरूरत है, इस बारे में 2 दिन, जो अभी भी काफी तेजी से trehalose एनालॉग संश्लेषण के लिए मौजूदा तरीकों) की तुलना में है के लिए कुल समय बढ़ जाती है।

हालांकि Tret प्रक्रिया trehalose analogues अभी तक रिपोर्ट तक पहुँचने के लिए सबसे कारगर एंजाइमी मार्ग है, यह कुछ कमियां है कि भविष्य में सुधार के लिए अवसर प्रदान किया है। सबसे पहले, हालांकि यूडीपी ग्लूकोज अन्य चीनी दाताओं की तुलना में अपेक्षाकृत सस्ती है, Tret प्रक्रिया की दक्षता आगे एक सस्ता स्रोत से यूडीपी ग्लूकोज की एक enzymatic संश्लेषण, जैसे, α-डी ग्लूकोज 1- साथ यह युग्मन द्वारा सुधार किया जा सकता फॉस्फेट, या identifyi द्वारायूडीपी ग्लूकोज के लिए एक सस्ती किराए की एनजी। इस पद्धति का एक दूसरा संभावित सीमा यह है कि प्रतिक्रिया गुंजाइश अंततः Tret की सब्सट्रेट सहिष्णुता द्वारा नियंत्रित किया जाता है। जबकि जंगली प्रकार Tret की सहनशीलता काफी उच्च (1 टेबल देखें) है, कुछ analogues इस विधि (जैसे, 4 स्थिति संशोधित analogues) का उपयोग कर संश्लेषित नहीं किया जा सकता। इसलिए, वृद्धि हुई सब्सट्रेट सहिष्णुता के साथ Tret के इंजीनियर संस्करणों मूल्यवान होगा। तीसरा, जबकि कई Tret उत्प्रेरित प्रतिक्रियाओं मात्रात्मक रूपांतरण के साथ आगे बढ़ना है, कम रूपांतरण एक chromatographic शुद्धि कदम जरूरी है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक अपेक्षाकृत धीमी गति से आकार अपवर्जन प्रक्रिया का उपयोग कर के बाद से यह सस्ती है, किसी भी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है पर ध्यान केंद्रित किया है, और पानी क्षालन के साथ पूरी तरह से प्रदर्शन किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एचपीएलसी शुद्धि एक प्रारंभिक पैमाने aminopropyl स्तंभ रोजगार उत्पाद शुद्धि के लिए एक तेजी से विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इन सीमाओं से कुछ के बावजूद, Tret प्रक्रिया प्रदान करता हैtrehalose analogues के तेजी से और कुशल तैयारी के लिए एक शक्तिशाली मंच, और जैव (तकनीकी) में उनके मूल्यांकन और आवेदन तार्किक और जैव चिकित्सा के क्षेत्र में तेजी लाने चाहिए। Tret प्रक्रिया के लिए भविष्य में सुधार, ऊपर चर्चा की, और अधिक अनुसंधान और trehalose और उसके डेरिवेटिव से संबंधित आवेदन पत्र को मजबूत करेगा।

Trehalose analogues विभिन्न क्षेत्रों में संभावित मूल्य है। के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, प्राकृतिक trehalose biopreservation और खाद्य मीठा अनुप्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है, इसलिए इस तरह के trehalose गिरावट प्रतिरोध के रूप में गुणों के साथ analogues आकर्षक हो सकता है। इसके अलावा, प्राकृतिक trehalose के स्थिर आइसोटोप लेबल और radiolabeled संस्करणों की एक किस्म अनुसंधान प्रयोजनों के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और Tret प्रक्रिया निश्चित रूप से इन अणुओं को तेज और कुशल पहुँच प्रदान कर सकते हैं। Trehalose analogues को निशाना जांच और अवरोधकों के साथ रोगजनकों के बाद से trehalose स्तनधारियों से अनुपस्थित है के लिए ब्याज की भी कर रहे हैं। एक एपीइस क्षेत्र की विशेष रुचि का है कि में तह माइक्रोबैक्टीरिया का पता लगाने के लिए है। एम टीबी, तपेदिक की प्रेरणा का एजेंट है, जो प्रति वर्ष 15 लाख लोगों को मारता है, अद्वितीय trehalose प्रसंस्करण मार्ग है कि स्तनधारियों से अनुपस्थित रहे होते हैं। उदाहरण के लिए, trehalose-रीसाइक्लिंग ट्रांसपोर्टर और नीचे की ओर एंजाइमों कि बाहरी झिल्ली निवासी glycolipids में trehalose शामिल स्तनधारियों 22 में मौजूद नहीं हैं। Detectable trehalose analogues के साथ इस माइक्रोबैक्टीरिया विशेष मशीनरी लक्ष्य निर्धारण मॉडल प्रणाली और संभवतः मानव रोगियों में एम तपेदिक संक्रमण के vivo इमेजिंग के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। दरअसल, FITC-कीटो-trehalose और TreAz (चित्रा 1 बी) के उपरोक्त उदाहरण ऐसी घटनाओं 8, 9 के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। अनुसंधान समुदाय के लिए इन उपकरणों के उपयोग की सुविधा के लिए, हम इस के साथ साथ तेजी से करने के लिए एक प्रोटोकॉल सूचना synthesizआईएनजी और क्लिक रसायन विज्ञान के साथ संयोजन में छवि माइक्रोबैक्टीरिया से 6 TreAz का उपयोग कर।

इस प्रोटोकॉल अन्य पहचाने जाने trehalose analogues कि तपेदिक नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है के विकास के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, बैरी डेविस और पहली बार एक पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण 8 के vivo इमेजिंग के लिए जांच के रूप में 18 एफ-फ्लोरो trehalose के संभावित उपयोग का प्रस्ताव रखा। Tret प्रक्रिया इस लक्ष्य को साकार करने के लिए आदर्श हो सकता है। Tret तेजी से और मात्रात्मक 2-फ्लोरो ग्लूकोज से 2-फ्लोरो trehalose पैदा करने में सक्षम है, जो महत्वपूर्ण है (1 टेबल देखें) क्योंकि 18 एफ-2-फ्लोरो ग्लूकोज अल्पकालिक (18 एफ आधा जीवन = 110 मिनट है ), बहुत तेजी से रसायन शास्त्र की जरूरत महसूस। इसके अलावा, 18 एफ-2-फ्लोरो ग्लूकोज आसानी से उपलब्ध है, क्योंकि यह पहले से ही ट्यूमर के पीईटी इमेजिंग के लिए क्लिनिक में प्रयोग किया जाता है। देव के लिए वर्णित Tret प्रक्रिया का उपयोग18 एफ-फ्लोरो trehalose की elopment और विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए अन्य trehalose analogues वर्तमान में हमारी प्रयोगशालाओं में चल रहा है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB agar Research Products International L24021
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518
Luria broth Research Products International L24045
Terrific Broth Research Products International T15050
L-(+)-Arabinose Sigma Aldrich A3256
Phosphate-buffered Saline GE Healthcare SH30256
Imidazole Sigma Aldrich I5513
Sodium chloride BDH BDH9286
Sodium phosphate, monobasic Fisher Scientific S374
Syringe filter, 0.45 µm Fisher Scientific 09719D
Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free Thermo Scientific 88666
HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL GE Healthcare 17-5248-02
TRIS base ultrapure Research Products International T60040
Dialysis tubing, MWCO 12–14,000 Fisher Scientific 21-152-16
Glucose analogues CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals Examples of vendors that offer numerous glucose analogues
6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz) CarboSynth MA02620
UDP-Glucose abcam Biochemicals ab120384
Magnesium chloride hexahydrate  Fisher Scientific M33
Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit EMD Millipore UFC901008
Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin Bio-Rad 444-9999
Extra-Fine Bio-Gel P2 media Bio-Rad 150-4118
Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates EMD Millipore 1056280001
n-Butanol Fisher Scientific A399
Ethanol Fisher Scientific S25310A
Sulfuric acid Fisher Scientific A300
Acetonitrile EMD Millipore AX0145
Deuterium oxide, 99.8% Acros Organics 351430075
Aminopropyl HPLC column Sigma Aldrich 58338
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 5470
Para-formaldehyde Ted Pella 18505
Alkyne-488 Sigma Aldrich 761621
Sodium ascorbate Sigma Aldrich A7631
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Click Chemistry Tools 1061
tert-Butanol Sigma Aldrich 360538
Dimethylsulfoxide Sigma Aldrich W387520
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotechnology 10001

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जैव रसायन अंक 120 trehalose एनालॉग enzymatic संश्लेषण trehalose synthase Tret माइक्रोबैक्टीरिया तपेदिक क्लिक करें रसायन विज्ञान प्रतिदीप्ति
रैपिड एक कदम एंजाइमी संश्लेषण और Trehalose analogues के सभी जलीय शोधन
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Meints, L. M., Poston, A. W., Piligian, B. F., Olson, C. D., Badger, K. S., Woodruff, P. J., Swarts, B. M. Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues. J. Vis. Exp. (120), e54485, doi:10.3791/54485 (2017).

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