रैपिड एक कदम एंजाइमी संश्लेषण और Trehalose analogues के सभी जलीय शोधन
Summary
Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.
Abstract
रासायनिक संशोधित trehalose, या trehalose analogues के संस्करणों, अन्य क्षेत्रों के बीच जीव विज्ञान, जैव प्रौद्योगिकी, दवा और विज्ञान के क्षेत्र में अनुप्रयोगों, है। उदाहरण के लिए, detectable टैग असर trehalose analogues माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है और तपेदिक नैदानिक इमेजिंग एजेंट के रूप में आवेदन कर सकते हैं। trehalose की hydrolytically स्थिर संस्करण भी गैर-गरमी मिठास और bioprotective एजेंट के रूप में उपयोग के लिए अपनी क्षमता के कारण अपनाई जा रही है। विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए यौगिकों के इस वर्ग की अपील के बावजूद, अपनी क्षमता से उनके उत्पादन के लिए एक मजबूत मार्ग की कमी के कारण अधूरी बनी हुई है। यहाँ, हम तेजी से और कुशल एक कदम trehalose analogues के biocatalytic संश्लेषण है कि रासायनिक संश्लेषण से संबंधित समस्याओं को नजरअंदाज करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट। Thermoproteus Tenax से थर्मास्टाइबल trehalose synthase (Tret) एंजाइम का उपयोग करके, trehalose analogues generat हो सकता हैएड (मात्रात्मक रूपांतरण करने के लिए) 15-60 मिनट में ग्लूकोज analogues और उच्च उपज में uridine diphosphate ग्लूकोज से एक भी कदम में। एक सरल और तेजी गैर chromatographic शुद्धि प्रोटोकॉल, स्पिन डायलिसिस और आयन एक्सचेंज के होते हैं जो, के रूप में छोटा रूप में 45 मिनट में जलीय घोल में जाना जाता एकाग्रता के कई trehalose analogues वितरित कर सकते हैं। मामलों में जहां unreacted ग्लूकोज एनालॉग अभी भी बनी हुई है, trehalose अनुरूप उत्पाद की chromatographic शुद्धि प्रदर्शन किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस विधि में तेजी लाई संश्लेषण और trehalose analogues की शुद्धि के कुशल और गैर दवा की दुकानों के लिए सुलभ है उस के लिए एक "हरी" biocatalytic मंच प्रदान करता है। इस पद्धति के प्रयोग का उदाहरण देना करने के लिए, हम सब जलीय शुद्धि संश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और माइक्रोबैक्टीरिया की एक trehalose आधारित रसायन शास्त्र क्लिक जांच, जो सभी के लिए कम से कम 1 घंटा लग गया और सक्षम माइक्रोबैक्टीरिया की प्रतिदीप्ति का पता लगाने के प्रशासन। भविष्य में, हम है कि कल्पना, अन्य संगठनों के बीचएर अनुप्रयोगों, इस प्रोटोकॉल तपेदिक के निदान के लिए trehalose आधारित जांच का तेजी से संश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अल्पकालिक radionuclide संशोधित trehalose ऐसे पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी-गणना टोमोग्राफी (पीईटी-सीटी) के रूप में analogues (जैसे, 18 एफ संशोधित trehalose) उन्नत नैदानिक इमेजिंग तौर तरीकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
Trehalose एक सममित गैर को कम करने के लिए दो ग्लूकोज moieties कि एक 1,1-α, α-glycosidic बांड (चित्रा 1 ए) से जुड़े हुए हैं से मिलकर disaccharide है। जबकि trehalose मानव और अन्य स्तनधारियों से अनुपस्थित है, यह बैक्टीरिया, कवक, पौधे, और अकशेरुकी 1 में आमतौर पर पाया जाता है। सबसे जीवों में trehalose की प्राथमिक भूमिका ऐसी सुखाना 1 के रूप में पर्यावरण तनाव, के खिलाफ की रक्षा करने के लिए है। इसके अलावा, कुछ मानव रोगजनकों डाह के लिए trehalose की आवश्यकता होती है, तपेदिक के कारण माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग, जो सेल लिफाफा biosynthesis की एक मध्यस्थ के रूप में और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी glycolipids 2 के निर्माण के लिए एक इमारत ब्लॉक के रूप में trehalose का इस्तेमाल भी शामिल है।
चित्रा 1: Trehalose और trehalose analogues। (ए) प्राकृतिक trehalose और एक अप्राकृतिक trehalose एनालॉग, जहां एक्स एक संरचनात्मक संशोधन है की संरचनाएं। (बी) साहित्य है कि biopreservation और bioimaging में संभावित अनुप्रयोगों में सूचना दी trehalose analogues के उदाहरण हैं।
अपनी अनूठी संरचना और शारीरिक कार्यों के कारण, trehalose और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों 3 जैव (तकनीकी) में उपयोग तार्किक के लिए महत्वपूर्ण ध्यान आकर्षित किया है। Nature- जैसे में मनाया trehalose की रक्षात्मक गुण, अपने हड़ताली क्षमता "पुनरुत्थान" पौधों है कि चरम निर्जलीकरण आया है 4 -have biopreservation अनुप्रयोगों में इसके व्यापक इस्तेमाल को प्रेरित में जीवन को बनाए रखने में मदद करने के लिए। Trehalose ऐसे न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन, कोशिकाओं और ऊतकों 3 के रूप में जैविक नमूने, की एक विस्तृत सरणी संरक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए, trehalose फार्मास्यूटिकल्स टी की संख्या में एक स्थिर additive के रूप में प्रयोग किया जाता हैटोपी बाजार पर हैं, कई विरोधी कैंसर मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 3 भी शामिल है। साथ ही, trehalose खाद्य उद्योग में एक स्वीटनर के रूप में प्रयोग किया जाता है, और यह बड़े पैमाने पर दोनों भोजन और सौंदर्य प्रसाधन उद्योग में उत्पाद संरक्षण के लिए प्रयोग किया जाता है। व्यावसायिक अनुप्रयोगों के इन प्रकार के लिए trehalose के गोद लेने शुरू में असमर्थता प्राकृतिक स्रोतों से या संश्लेषण के माध्यम से शुद्ध trehalose के थोक मात्रा में प्राप्त करने के लिए द्वारा सीमित था। हालांकि, स्टार्च से trehalose के आर्थिक उत्पादन के लिए एक कुशल enzymatic प्रक्रिया हाल ही में विकसित किया गया है, जो अपने बड़े पैमाने पर वाणिज्यिक उपयोग को प्रेरित किया है 5।
रासायनिक संशोधित trehalose के डेरिवेटिव, trehalose analogues के रूप में इस के साथ साथ के लिए भेजा (सामान्य संरचना चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, चित्रा 1 बी में दिखाया trehalose analogues के विशिष्ट उदाहरण) विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए बढ़ती ध्यान प्राप्त की है 6। उदाहरण के लिए, लैक्टो-trehalose, अपने ग्लूकोज इकाइयों में से एक गैलेक्टोज के साथ प्रतिस्थापित के साथ एक trehalose अनुरूप है इस प्रकार अपने 4 स्थिति हाइड्रॉक्सिल समूह एक औंधा stereochemical विन्यास है। लैक्टो-trehalose trehalose रूप में एक ही स्थिर गुण है लेकिन, आंतों एंजाइमों से गिरावट के लिए प्रतिरोधी है यह एक गैर-गरमी खाद्य additive 6, 7 के रूप में आकर्षक बना रही है।
trehalose analogues में हमारे समूह के हित में मुख्य रूप से माइक्रोबैक्टीरिया विशेष जांच और अवरोधकों के रूप में उनके मूल्य से संबंधित है। बैरी और डेविस समूहों को एक fluorescein संयुग्मित कीटो-trehalose एनालॉग, FITC-कीटो-trehalose का नाम है, जो दिखाया गया था पाचन लाइव एम तपेदिक के सेल की दीवार लेबल करने के लिए विकसित की है, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 8 से अपनी पहचान सक्षम करने से। Bertozzi प्रयोगशाला छोटे azido-trehalose (TreAz) analogues कि पाचन कोशिका दीवार लेबल और बाद में Det हो सकता है विकसितected क्लिक रसायन शास्त्र और प्रतिदीप्ति विश्लेषण 9 का उपयोग। इन अग्रिमों तपेदिक के लिए नैदानिक इमेजिंग एजेंट के रूप में trehalose आधारित जांच उपयोग करने की संभावना को इंगित करें। Trehalose analogues भी जीवाणु कि व्यवहार्यता और डाह 10, 11, 12 के लिए आवश्यक हैं में रास्ते को बाधित करने के लिए अपनी क्षमता की वजह से एम तपेदिक के अवरोधकों के रूप में अपनाई गई है।
अब तक, जैव (तकनीकी) तार्किक और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए trehalose analogues के विकास के लिए मुख्य बाधा कुशल कृत्रिम तरीकों की कमी है। Trehalose analogues के उत्पादन के लिए दो परंपरागत मार्गों (चित्रा 2) रासायनिक संश्लेषण पर भरोसा करते हैं। एक मार्ग, प्राकृतिक trehalose की desymmetrization / संशोधन शामिल है, जबकि अन्य को ठीक से क्रियाशील मोनोसैकराइड इमारत ब्लॉकों के साथ शुरू करने के लिए और रासायनिक ग्लाइकोसिलेशन प्रदर्शन शामिल1,1-α, α-glycosidic बंधन बना। इन तरीकों, जो हाल ही में समीक्षा लेख 13, 14 में चर्चा की गई है, एम तपेदिक 15 से जैसे sulfolipid -1 जटिल trehalose युक्त प्राकृतिक उत्पादों, की छोटी मात्रा के multistep संश्लेषण को पूरा करने के लिए उपयोगी साबित किया है। हालांकि, दोनों तरीकों आम तौर पर अक्षम, समय लेने वाली है, गैर दवा की दुकानों के लिए दुर्गम हैं, और, इसके अतिरिक्त, पर्यावरण के अनुकूल नहीं माना जाता है। इस प्रकार, trehalose analogues के कुछ प्रकार के synthesizing के लिए, इन रणनीतियों नहीं आदर्श होते हैं।
चित्रा 2: trehalose एनालॉग संश्लेषण के लिए दृष्टिकोण। केमिकल, trehalose एनालॉग संश्लेषण के लिए दृष्टिकोण छोड़ दिया पर दिखाया गया है, multistep प्रक्रियाओं है कि मुश्किल संरक्षण शामिल है का उपयोगtion / deprotection, desymmetrization, और / या ग्लाइकोसिलेशन कदम। Enzymatic संश्लेषण, सही पर दिखाया गया है, एंजाइम (ओं) stereoselectively जलीय घोल में analogues trehalose करने के लिए सरल, असुरक्षित substrates परिवर्तित करने के लिए उपयोग करता है। एंजाइमी प्रोटोकॉल के साथ साथ सूचना एक trehalose synthase (Tret) एंजाइम एक भी कदम में trehalose analogues में ग्लूकोज analogues और यूडीपी ग्लूकोज में परिवर्तित करने के लिए उपयोग करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
trehalose analogues के लिए एक कुशल biocatalytic मार्ग उत्पादन, मूल्यांकन, और अणुओं के इस होनहार वर्ग के आवेदन की सुविधा होगी। जबकि trehalose उत्पादन 5 के लिए वाणिज्यिक enzymatic प्रक्रिया analogues synthesizing क्योंकि यह एक सब्सट्रेट के रूप में स्टार्च का इस्तेमाल करने के लिए अनुकूल नहीं है, वहाँ अन्य biosynthetic पथ कर रहे हैंप्रकृति में है कि मायनों trehalose एनालॉग संश्लेषण के लिए शोषण किया जा सकता है। हालांकि, इस क्षेत्र है, जो हाल ही में 6 की समीक्षा की गई शोध में, सीमित कर दिया गया है। एक रिपोर्ट इसी फ्लोरो ग्लूकोज से एक भी फ्लोरो trehalose एनालॉग का उपयोग करने की एक विधि कोलाई trehalose biosynthetic मार्ग से प्रेरित किया करते थे। हालांकि, इस दृष्टिकोण एक तीन एंजाइम प्रणाली है कि क्षमता और व्यापकता 8 सीमित है की आवश्यकता है। एक और दृष्टिकोण है कि पता लगाया गया है रिवर्स दिशा है, जो सिद्धांत रूप में ग्लूकोज और ग्लूकोज analogues-1-फॉस्फेट 6, 16, 17 से trehalose analogues के एक कदम संश्लेषण परमिट में trehalose phosphorylase (Trep) का उपयोग करने के लिए है। हालांकि इस दृष्टिकोण भविष्य वादा हो सकता है, दोनों inverting और बनाए रखने TrePs वर्तमान एनालॉग संश्लेषण के लिए कमियां हैं। उदाहरण के लिए, inverting TrePs एक बेहद अनुभव हैnsive दाता अणु (β-डी ग्लूकोज 1-फॉस्फेट) और बनाए रखने TrePs गरीब एंजाइम अभिव्यक्ति की पैदावार / स्थिरता और सीमित सब्सट्रेट संकीर्णता है। महत्वपूर्ण सुधार (जैसे, एंजाइम इंजीनियरिंग के माध्यम से) से पहले Trep की मध्यस्थता एनालॉग संश्लेषण की जरूरत होगी व्यावहारिक है।
वर्तमान में, trehalose analogues के enzymatic संश्लेषण के लिए सबसे अधिक व्यावहारिक दृष्टिकोण एक trehalose synthase (Tret) एंजाइम, जो धर्मान्तरित ग्लूकोज और uridine diphosphate (यूडीपी) एक एकल चरण 6 में trehalose में -glucose का उपयोग करने के लिए है। हमने हाल ही में Thermoproteus Tenax Tret-एक थर्मास्टाइबल और दिशाहीन एंजाइम 18 का उपयोग करने वाली ग्लूकोज analogues और यूडीपी ग्लूकोज (चित्रा 3) 19 से trehalose analogues synthesize की सूचना दी। इस एंजाइम केवल सिंथेटिक दिशा में चल रही है और Trep प्रणाली में पाया trehalose गिरावट की समस्या से बचा जाता है। यह एक कदम प्रतिक्रिया Coul1 घंटे में पूरा किया जा डी, और trehalose analogues की एक व्यापक विविधता आसानी से उपलब्ध ग्लूकोज एनालॉग substrates (प्रतिनिधि परिणाम में 1 टेबल देखें से (> 99% तक के रूप में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा निर्धारित) उच्च उपज में पहुँचा रहे थे अनुभाग)।
चित्रा 3: trehalose analogues के Tret उत्प्रेरित एक कदम संश्लेषण। टी Tenax से Tret एंजाइम stereoselectively आसानी से उपलब्ध ग्लूकोज analogues और यूडीपी ग्लूकोज में शामिल होने के लिए एक कदम में trehalose analogues फार्म कर सकते हैं। आर आर 1 4 = चर संरचनात्मक संशोधन, उदाहरण के azido-, fluoro-, deoxy-, thio-, stereochemical, या समस्थानिक लेबल संशोधन के लिए; Y चर heteroatom, उदाहरण के ऑक्सीजन या सल्फर, या isotopically लेबल heteroatom के लिए =।
यहाँ, हम विज्ञापन प्रदानTret संश्लेषण की प्रक्रिया के लिए etailed प्रोटोकॉल, अभिव्यक्ति और ई कोलाई से Tret की शुद्धि सहित अनुकूलित Tret प्रतिक्रिया की स्थिति, और एक बेहतर तरीका है कि शुद्धि जलीय चरण में पूरी तरह से किया जाता है। इस संशोधित प्रोटोकॉल समीचीन और कुशल संश्लेषण और एक अर्द्ध प्रारंभिक पैमाने (10-100 मिलीग्राम) पर विविध trehalose analogues की शुद्धि के लिए सक्षम बनाता है। हम भी तैयार करने और कम से कम 1 घंटे की है, जो माइक्रोबैक्टीरियल कोशिकाओं का तेजी से प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए सक्षम में माइक्रोबैक्टीरिया की एक trehalose आधारित जांच के प्रशासन के लिए इस प्रोटोकॉल के उपयोग के प्रदर्शन।
Protocol
Representative Results
Discussion
Trehalose analogues संभावित भोजन और दवाइयों के संरक्षण से निदान और सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण 6 के उपचार के लिए विभिन्न क्षेत्रों को प्रभावित किया है। मौजूदा multistep रासायनिक संश्लेषण तरीकों (स्वाभाविक रूप से ज?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Institutes of Health (R15 AI117670) to B.M.S and P.J.W, as well as a Cottrell College Scholar Award from the Research Corporation (20185) to P.J.W. L.M.M. was supported by a Provost’s Fellowship from CMU.
Materials
| LB agar | Research Products International | L24021 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| Luria broth | Research Products International | L24045 | |
| Terrific Broth | Research Products International | T15050 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A3256 | |
| Phosphate-buffered Saline | GE Healthcare | SH30256 | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | I5513 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | |
| Sodium phosphate, | Fisher Scientific | S374 | |
| monobasic | |||
| Syringe filter, 0.45 µm | Fisher Scientific | 09719D | |
| Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free | Thermo Scientific | 88666 | |
| HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| TRIS base ultrapure | Research Products International | T60040 | |
| Dialysis tubing, MWCO 12–14,000 | Fisher Scientific | 21-152-16 | |
| Glucose analogues | CarboSynth, | Examples of vendors that offer numerous glucose analogues | |
| Sigma Aldrich, | |||
| Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals | |||
| 6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz) | CarboSynth | MA02620 | |
| UDP-Glucose | abcam Biochemicals | ab120384 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher Scientific | M33 | |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit | EMD Millipore | UFC901008 | |
| Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin | Bio-Rad | 444-9999 | |
| Extra-Fine Bio-Gel P2 media | Bio-Rad | 150-4118 | |
| Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates | EMD Millipore | 1056280001 | |
| n-Butanol | Fisher Scientific | A399 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | S25310A | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145 | |
| Deuterium oxide, 99.8% | Acros Organics | 351430075 | |
| Aminopropyl HPLC column | Sigma Aldrich | 58338 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Para-formaldehyde | Ted Pella | 18505 | |
| Alkyne-488 | Sigma Aldrich | 761621 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Click Chemistry Tools | 1061 | |
| tert-Butanol | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | W387520 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotechnology | 10001 |
References
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