Abstract
화학적으로 트레 할로 오스 또는 트레 할로 오스 유사체의 버전을 수정, 다른 분야들 사이 생물학, 생명 공학, 제약 과학에서 응용 프로그램을 보유하고 있습니다. 예를 들어, 검출 가능한 태그 담 트레할로스 유사체는 결핵균을 검출하기 위해 사용 된 결핵 진단 조영제로서 응용을 가질 수있다. 트레 할로 오스의 가수 분해 안정 버전 인해 비 칼로리 감미료 및 바이오 보호용 에이전트로 사용하기 위해 자신의 잠재력을 추구하고있다. 다양한 애플리케이션에 대한 이러한 부류의 화합물의 호소력에도 불구하고, 이들 전위는 그들의 제조를위한 강력한 경로의 부족으로 이루어지지 남아있다. 여기서는 화학 합성과 관련된 문제를 우회 트레할로스 유사체의 신속하고 효율적인 원스텝 생 촉매 합성 상세한 프로토콜을보고한다. 테르 모 프로테우스 속에서 TENAX에서 열 안정성 트레할로스 합성 효소 (TreT) 효소를 이용하여, 트레 할로 오스 유사체는 generat라는 될 수 있습니다에드 포도당 유사체 및 높은 수율 딘 인산 포도당에서 하나의 단계 (정량 전환까지) 15-60 분입니다. 스핀 투석 및 이온 교환 이루어져 간단하고 신속하게 비 - 크로마토 그래피 정제 프로토콜은 적은 45 분에 수용액에서 알려진 농도의 다양한 트레할로스 유사체를 제공 할 수있다. 반응 글루코오스 유사체가 남아 경우, 트레할로스 아날로그 생성물의 크로마토 그래피 정제가 수행 될 수있다. 전반적으로,이 방법은 비 화학자 효율적이고 신속한 접근 할 수있는 합성 및 트레할로스 유사체 정화용 "녹색"생 촉매 플랫폼을 제공한다. 이 방법의 적용 성을 예시하기 위해서, 합성 모든 수성 정제 프로토콜을 기술하고, 마이코 박테리아의 형광 검출을 1 시간 미만을 가져다 사용할 모두 결핵균에 트레 할로 오스 계 클릭 화학 프로브의 투여. 미래에, 우리는 OTH들 것을 구상애플리케이션 ER,이 프로토콜은 결핵 진단 트레할로스 기반 프로브의 신속한 합성을 적용 할 수있다. 같은 양전자 방출 단층 촬영 - 컴퓨터 단층 촬영 (PET-CT) 등 (예를 들면, 18 F 변성 트레할로스) 고급 임상 이미징을 위해 사용될 수있는 예를 들어, 단기 핵종 변성 트레할로스 유사체.
Introduction
트레할로스는 1,1-α, α-글리코 시드 결합 (도 1a)에 의해 결합 된 두 개의 글루코스 잔기로 구성된 대칭 비 환원성 이당이다. 트레할로스는 인간 및 다른 포유 동물에서 존재하지 않는 반면, 박테리아, 곰팡이, 식물, 무척추 동물 (1)에 일반적으로 발견된다. 대부분의 유기체 트레할로스의 주요 역할은 탈수 한 환경 적 스트레스로부터 보호하는 것이다. 또한, 일부 인간 병원체 셀 봉투 생합성 중재자와 면역 당지질 2의 구성에 대한 빌딩 블록으로서 트레할로스를 이용하여 결핵을 유발 결핵균 포함한 독성에 대한 트레 할로 오스를 필요로한다.
그림 1 : 트레 할로 오스 트레 할로 오스 유사체. (AX는 구조적인 변경 천연 트레 할로 오스와 부 자연스러운 트레 할로 오스 아날로그의) 구조. biopreservation 및 bioimaging 응용 가능성이 문헌에보고 트레할로스 유사체의 (B) 예.
그것의 독특한 구조와 생리 기능에, 트레 할로 오스는 논리 바이오 (테크노)의 사용 및 생물 의학 응용 프로그램 3 상당한 관심을 받고있다. 자연 - 예에서 관찰 트레 할로 오스의 보호 특성은 눈에 띄는 기능은 4 봤어이 biopreservation 애플리케이션에 광범위한 사용을 가했다 극도의 탈수를받은 "부활"식물에서 생명을 유지하는 데 도움. 트레할로스는 핵산, 단백질, 세포 및 조직과 같은 생물학적 시료 (3)의 다양한 배열을 유지하기 위해 사용되었다. 예를 들면, 트레 할로 오스는 제약 t 다수의 안정화 첨가제로서 사용모자 여러 항암 모노클로 날 항체 (3)를 포함하여 시판된다. 뿐만 아니라, 트레 할로 오스는 식품 산업에서 감미료로 사용되며, 광범위 모두 식품 및 화장품 산업에서의 제품의 보존에 사용된다. 상용 애플리케이션의 이러한 유형에 대한 트레 할로 오스의 채용은 처음 천연 공급원 또는 합성을 통해 순수 트레할로스 벌크 수량을 얻을 수 없다는 의해 제한되었다. 그러나, 전분 트레할로스의 경제적 생산을위한 효율적인 효소 처리는 최근 널리 상업적 이용을 가했다하는 개발 된 5.
(6) 화학적으로 트레 할로 오스 유도체, 변성 (도 1b에 도시 트레할로스 유사체의 특정 예를 일반적인 구조는도 1a에 도시 된) 다양한 애플리케이션에 대한 관심 증가를 얻고, 트레할로스 유사체로 지칭. 예를 들어, 락토 트레할로스, 따라서 그것의 4 위치 수산기가 반전 된 입체 구조를 갖는다 갈락토스 치환의 글루코오스 단위 중 하나로 트레 유사체이다. 락토 트레 할로 오스 트레 할로 오스와 같은 안정화 특성을 가지고 있지만, 비 칼로리 식품 첨가물 6,7대로 매력적 장내 효소 분해에 내성이다.
트레 할로 오스 유사체에 우리 그룹의 관심은 주로 결핵균 특이 프로브 및 억제제로서 자신의 가치에 관한 것이다. 배리 데이비스 그룹은 형광 현미경 (8)의 검출을 가능하게 대사 라이브 결핵균의 세포벽을 라벨에 표시 된 FITC 케토 트레 할로 오스라는 이름의 형광 접합 케토 트레 할로 오스 아날로그를 개발. Bertozzi 연구소는 대사 탐지 할 수 이후 세포벽 레이블 및 수있는 작은 아지 트레 할로 오스 (TreAz) 유사체를 개발반사된다 클릭 화학 형광 분석 (9)를 사용. 이러한 발전은 결핵 진단 조영제로 트레할로스 기반 프로브를 사용할 수있는 가능성을 지적한다. 트레할로스 유사체는 생존하고 독성도 10,도 11,도 12에 필수적인 세균의 경로를 방해하기 때문에 그 전위에 결핵균의 억제제로 진행되고있다.
지금까지 생체 (테크노) 논리 및 생의학 애플리케이션을 위해 트레할로스 유사체를 개발하는 주요 장애물은 효율적인 합성 방법의 부족이다. 트레 할로 오스 유사체를 생산하는 두 개의 전통적인 노선들은 화학 합성에 (그림 2) 의존한다. 다른 제대로 작용 단당류 빌딩 블록으로 시작하고 화학 글리코 실화를 수행하는 동안 수반 한 경로는 자연 트레할로스 desymmetrization / 수정을 포함1,1-α, α-글리코 시드 결합을 위조. 최근 리뷰 기사 13, 14에서 논의 된 이러한 접근은 결핵균 (15)로부터 같은 sulfolipid-1과 같은 복잡한 트레 할로 오스 함유 천연 제품, 소량의 다단계 합성을 수행하기위한 유용한 입증했다. 그러나, 두 방식이 아닌 화학자 일반적으로, 시간 - 소모적 액세스 비효율적이며, 또한 환경 친화적 인 것으로 간주되지 않는다. 따라서, 트레 할로 오스 유사체의 특정 유형을 합성, 이러한 전략은 적합하지 않다.
그림 2 : 트레 할로 오스 아날로그 합성에 접근. 화학 왼쪽 그림, 트레 할로 오스 아날로그 합성에 접근, 어려운 PROTEC을 포함 다단계 절차를 사용하여기 / 탈 보호, desymmetrization 및 / 또는 당화 단계. 오른쪽 그림과 효소 합성, 입체 수용액에서 유사체를 트레 할로 오스 간단, 보호되지 않은 기판을 변환 효소 (들)를 사용합니다. 본원에보고 된 효소 프로토콜은 단일 단계로 오스 글루코오스 유사체로 유사체 및 UDP 글루코스로 변환하는 트레할로스 합성 효소 (TreT) 효소를 사용한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
트레할로스 유사체하는 효율적인 생 촉매 경로 분자 유망한 클래스의 제조, 평가하고, 프로그램을 촉진한다. 트레할로스 생산 5 상업적 효소 프로세스가 기재로서 전분을 이용하기 때문에 유사체의 합성에 적용 할 수는 없지만, 다른 생합성 경로에 존재트레 할로 오스 아날로그 합성에 이용 될 수있다 자연의 방법. 그러나, 최근 6을 검토하고이 지역에있는 연구는 제한적이었다. 한 보고서는 해당 플루오로 포도당에서 하나의 플루오로 트레 할로 오스 아날로그에 액세스 할 수 대장균 트레 할로 오스 생합성 경로에서 영감을하는 방법을 사용했다. 그러나,이 방법은 효율성과 보편성 8 제한적 세 효소 시스템을 필요로한다. 탐색 된 다른 방법은 원칙적으로 당 유사체 및 글루코스 -1- 인산 6, 16, 17에서 트레 할로 오스 유사체의 한 단계 합성을 허용 역방향에서 오스 포스 (TreP)를 사용하는 것이다. 이 접근 방식은 미래의 약속을 가질 수 있지만, 모두 반전 및 유지 이윤이 쏠쏠 히 남는는 현재 아날로그 합성 단점이있다. 예를 들어, 반전 이윤이 쏠쏠 히 남는는 엄청나게 expe의이nsive 기증자 분자 (β-D- 글루코오스 -1- 인산) 및 유지 이윤이 쏠쏠 히 남는 가난한 효소 발현 수율 / 안정성 및 제한 기판 성행위 있습니다. (효소 공학을 통해 예) 상당한 개선이 TreP 매개 아날로그 합성하기 전에 필요한 것은 실용적입니다.
현재, 트레할로스 유사체의 효소 적 합성을위한 가장 실용적인 방법은 포도당, 우리 딘 디 포스페이트 (UDP)이 단일 단계 6에서 트레 할로 오스 변환 글루코스 신타 제 (TreT) 효소를 사용하는 것이다. 최근 글루코오스 유사체 및 UDP 글루코스 (도 3) (19)로부터 트레할로스 유사체를 합성 -to 테르 모 프로테우스 속 TENAX-TreT 내열성 단방향 효소 (18)의 사용을보고 하였다. 이 효소는 합성 방향으로 동작하며 TreP 시스템에서 발견 트레할로스 열화의 문제를 피할 수있다. 이것은 단계 반응 coul1 시간 내에 완료 D 및 쉽게 사용할 글루코오스 유사체 기판 (대표 결과 표 1 참조에서 (고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)에 의해 측정> 99 %까지) 트레할로스 유사체의 광범위한 다양한 고 수율로 액세스 된 섹션).
도 3 : 트레 할로 오스 유사체 TreT 촉매 작용 한 단계 합성. T.의 TENAX에서 TreT 효소는 입체 한 번에 트레 할로 오스 유사체를 형성하기 위해 쉽게 사용할 포도당 유사체 및 UDP - 포도당을 가입 할 수 있습니다. R 1 -R 4 = 변수 구조 변경, 예를 들어, 아지, 플루오로, 데 옥시, 싸이, 입체, 또는 동위 원소 라벨 변경에 대한; Y는 예를 들어 산소 또는 황, 또는 동위 원소로 표지 된 헤테로 가변 헤테로 =.
여기, 우리는 광고를 제공TreT 반응 조건에 최적화 된 대장균으로부터 발현 및 정제 TreT 포함한 TreT 합성 공정 etailed 프로토콜, 및 성상 전적으로 수행하는 개선 된 정제 방법. 이 수정 된 프로토콜은 반 예비 규모 (10 ~ 100 mg)을에 다양한 트레 할로 오스 유사체의 편법하고 효율적인 합성 및 정제 할 수 있습니다. 또한 제조 및 마이코 박테리아 세포의 급속한 형광 검출을 가능 1 시간 미만에서 마이코 박테리아에 트레할로스 기반 프로브를 관리하기위한 이러한 프로토콜의 사용을 입증한다.
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Protocol
상위 10 위 대장균 1. 발현 및 TreT의 정제
주 : TreT 발현 대장균 요청할 저자 연락하십시오 첨부 물질 전달 계약 (상위 10 위 E.로 변환 된 AraC 단백질의 제어하에 T.에 TENAX의 tret 유전자를 함유 pBAD TreT 플라스미드 19 대장균) . 다음 프로토콜은 일반적으로 약 4 ㎎ / ℓ의 단백질 수율을 제공합니다.
- 대장균을 TreT가 발현의 3 mL의 야간 문화를 준비합니다.
- 원성 육즙 (LB) 100 μg의 / ㎖의 앰피 실린을 함유하는 아가 플레이트 pBAD-TreT 발현 벡터로 형질 전환 킬 상위 10 위 대장균.
- 약 37 ℃에서 48 시간 동안 플레이트를 인큐베이션.
- 플레이트에서 하나의 식민지를 선택하고 문화 튜브에 100 μg의 / ㎖의 암피실린을 포함하는 LB 액체 배지의 3 mL를 접종.
- 37 & #에서 진탕 배양기에서 튜브를 배치176; C 하룻밤 175 RPM을 X.
- 대장균 TreT이 발현 된 단백질의 발현을 유도한다.
- 추가 750 mL를 좋아요 국물은 2,800 mL의 FERNBACH 문화 플라스크에 100 μg의 / ML의 암피실린로 보충. 빈으로 나중에 사용하기 위해 큐벳에 플라스크에서 전송 한 ML의 국물.
- 문화 플라스크 단계 1.1.4에서 생성 된 3 mL의 하룻밤 문화를 추가 한 후 인큐베이터에서 플라스크를 배치하고 37 ° C X 200 rpm으로 흔들. 주기적으로 단계 1.2.1에서 수집 한 빈 대 600 nm에서 문화의 흡광도를 확인합니다.
- 0.5-1.0 사이 도달 내지 600 nm에서의 흡광도되면 배양 1 M 용액 아라비 노스 (1 mM의 최종 농도) 750 μL를 첨가하여 TreT 발현을 유도한다. 인큐베이터에 플라스크를 돌아 X 200 rpm으로 37 ° C에서 하룻밤 흔들.
- 펠렛은 TreT 발현하는 대장균을 용균하고.
- 폴리 프로필렌 (B)에 문화를 전송ottle 4 ° C에서 4,000 XG에 15 분 동안 원심 분리기.
- 뜨는을 취소하고 인산염 완충 식염수 15 ㎖ (PBS)의 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 4 ° C에서 4,000 XG에 15 분 동안 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 전송합니다. 뜨는을 취소하고 하나 용해 (단계 1.3.4)를 세포 또는 -80 ° C에서 무기한 펠렛을 저장하기 위해 진행합니다.
- 한 50㎖ 원추형 튜브에 세척 완충액 (50 mM의 NaH를 2 PO 4, 500 mM의 염화나트륨, 20 mM의 이미 다졸, pH를 8.0) 20㎖에 한 미니 프로테아제 억제제 정제를 용해.
- 펠렛을 함유하는 원뿔형 튜브에 단백질 분해 효소 억제제 - 함유 세척 완충액을 전송. 펠릿 때까지 소용돌이는 다시 일시 중단됩니다.
- (75 % 진폭에서 2 분 15 초 실행 시간과 오프 45 초 45 초의 펄스 시퀀스)를 100ml의 비커에 재 현탁 세포를 전송하고 초음파로 세포를 용균.
- 50㎖의 금속 원추형 튜브 해물 전송4 ° C에서 15,000 XG에 60 분 동안 원심 분리기.
- 한 50㎖ 원추형 튜브에 0.2-0.45 ㎛의 주사기 필터를 통과하여 분해물을 명확히.
참고 얻어지는 파쇄물의 전형적인 농도 / ㎖ 100 밀리그램이다.
- 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)를 사용하여 E. 콜라이 세포 용 해물로부터 정제 TreT.
- 니켈 친 화성 칼럼 (5 ㎖ 침대 볼륨)으로 FPLC를 설정합니다. 탈 이온수 10 mL로 또는 열이 어떤 오염 물질이 깨끗해질 때까지 열을 씻으십시오. 세척 완충액 20 ㎖를 사용하여 열 평형 (50 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 500 mM의 염화나트륨, 20 mM의 이미 다졸, pH를 8.0) 1 mL / 분의 유속.
- 칼럼 상 단계 1.3.8에서 얻어진 용 해물 (20 ㎖)을로드하고 흡광도 배경 수준에 도달 할 때까지 1 mL / 분의 유속으로 세척 완충액으로 태그되지 않은 단백질을 용출 (세척 완충액 중 통상 80 ~ 100 mL의 필요) .
- 용출 선형 g을 사용하여 TreT을 그의 - 태그1 mL / 분의 유속으로 60 분에 걸쳐 1-100%에서 용출 완충액 (50 mM의 NaH를 2 PO 4, 500 mM의 NaCl을 250 mM의 이미 다졸, pH를 8.0)의 radient. TreT이 용출하고 흡광도가 기준선 수준에 도달 할 때까지 4 ML의 분수를 수집합니다.
주 : 일반적으로, 용출 완충액 60 mL의 단백질을 용출하기 위해 필요하며, 단백질은 60-100% 용출 완충액 범위에서 용출. 약 용출 버퍼의 순수한 TreT 10 ~ 15 mL를 얻을 수있다. - 용출 버퍼 빈에 대한 280 nm에서 흡광도를 측정하여 TreT의 농도를 결정합니다.
- 트리스으로 교환 TreT 투석에 의해 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스) 버퍼입니다.
- 제조업체의 지시에 따라 투석 튜브를 제조 한 후, 탈 이온수 다음 트리스 완충액 (50 mM 트리스, 300 mM의 염화나트륨, pH를 8.0)으로 세척하여 프라임.
- 주사기와 무딘 바늘을 사용하여 투석 튜브에 TreT 샘플을로드합니다. 하룻밤을 투석트리스 완충액 2 L gainst.
- 투석 세척 수집 빈에 대해 280 nm에서 흡광도를 측정하여 TreT의 농도를 결정한다.
- 50 ML 원뿔 튜브에 TreT 솔루션을 전송하고, 트레 할로 오스 아날로그 합성 (2 단계)로 진행 또는 4 ℃에서 효소를 저장합니다.
참고 : TreT는 내열성 단백질이다. TreT 활동의 상당한 손실을 관측하지 않고 몇 달 동안 4 ℃에서 트리스 버퍼에 저장 하였다.
TreT 효소를 사용하여 트레 할로 오스 유사체 2. 한 단계의 합성
주 :이 프로토콜은 아래의 반응 효율 및 제품의 분자량에 따라 아날로그 오스 약 15 내지 30 ㎎을 전달할 수 4 mL의 부피에 기초하여, 반응 스케일을 설명한다. 반응 구성 요소를 원하는 경우 다소 트레 할로 오스 아날로그를 얻기 위해 확장 할 수 있습니다.
- (0.080 몰, 질량이 분자량에 따라 달라집니다) 포도당 유사체를 추가, UDP - 포도당 (0.15 ML 원뿔 관 160 밀리몰, 97.6 mg)을, 및 (0.080 밀리몰의 MgCl 2, 16.3 mg)을 얻었다. 이러한 구성 요소의 최종 농도는 각각 20 밀리미터, 40 밀리미터, 20 밀리미터이 될 것입니다.
- 필요한 경우 트리스 완충액의 적절한 양 (50 mM의 트리스, 300 mM의 염화나트륨, pH를 8.0) 300 μg의 / mL의 최종의 최종 효소 농도를 달성하기 위해 (단계 1.5.4로부터 구입) 트리스 완충액 TreT 추가 및 4 mL의 부피. 피펫은 혼합물을 상하로 부드럽게 또는 고체를 용해 튜브를 반전한다.
- 1 시간 동안 300 rpm으로 진탕 70 ° C에서 반응을 품어 후 냉각 얼음에 튜브를 배치합니다.
조 효소 반응 액으로부터 트레할로스 유사체 3. 정제
- 모든 액체가 필터를 통과 할 때까지 원심 필터 부 탈 이온수 3 mL로 첨가하고, 3,000 × g으로 원심 분리하여 막 중의 미량 글리세롤을 제거하기 위해 원심 분리 필터 장치 (명목 분자량 한계 (NWML) 10 kDa의)을 사전 린스튜브로 (약 20 분). 두 개의 추가 번 반복합니다. 직전 또는 반응 (단계 2.3) 동안이 단계를 완료합니다.
- (단계 230에서 얻은) 효소 반응 액을 냉각시킨 후, 미리 세정 원심 필터 유닛으로 옮긴다. 원심 필터 부 탈 이온수 및 전사 1 mL로 반응 관을 헹군다. 생성물의 최대 회수하는 반응 관의 세정을 반복.
- 모든 액체가 튜브 (약 20 분)에 필터를 통과 할 때까지 3000 XG에서 원심 필터 장치를 원심 분리기. 모든 액체가 튜브 (약 20 분)에 필터를 통과 할 때까지 3000 XG에 탈 이온수 및 3 ㎖ 원심 분리기로 원심 분리 필터 유닛의 상부 챔버를 씻어. 제품의 최대 복구를 위해 세척을 반복합니다.
- 원심 필터 유닛의 상부 챔버를 버린다. 튜브 (일반 여과 부피의 하단 여액에 혼합 베드 이온 교환 수지 (3g)를 첨가UME는 헹굼 수에 따라 8-15 ㎖)이다. 용액에 현탁 수지 입자를 유지하기에 충분한 속도에서 자기 교반 막대로 1 시간 동안 실온에서 교반 하였다.
- 상등액을 경사 분리하고 상기 수지를 제거하도록 필터. 나머지 수지를 씻어 탈 이온수 5 mL를 추가합니다. 상등액을 경사 분리하고 상기 제 경사 분리로부터의 생성물 용액을 결합하여 필터. 제품의 최대 복구를위한 수지의 반복 세척.
- 트레할로스 아날로그 제품을 출발 물질 글루코오스 유사체의 완전한 전환이 달성되었는지 여부를 결정하기 위해 박층 크로마토 그래피 (TLC) 또는 HPLC에 의해 반응을 분석한다. TLC 분석 단계 4.1 참조 및 HPLC 분석을 위해 단계 4.2.
- 건조 된 제품을 제공하기 위해 동결 건조 또는 회전 증발에 의해 물을 제거합니다. 미 반응 글루코오스 유사체은 TLC 또는 HPLC 분석에서 관찰되지 않으면, 크로마토 그래피는 필요가 없다. 반응 yie를 얻기 위해 제품의 무게LD 및 핵 자기 공명을 수행는 (NMR) 분광 분석 (단계 4.3) 제품 구조 및 순도를 확인합니다.
- 반응 글루코오스 유사체는 TLC 분석에서 관찰 한 경우에, 크기 배제 컬럼을 사용하여 트레 할로 오스, 아날로그에서 분리.
- 제조업체의 지침에 따라 탈 이온수 포화, 여분의 미세 P2 폴리 아크릴 아미드 비드 크기 배제 매체를 포함하는 1 × 100cm 열을 준비합니다.
주 : 크기 배제 컬럼을 탈 이온수로 세척 후 재사용 될 수있다. - 재용 건조 효소 반응 생성물을 탈 이온수 0.5 ㎖의 (단계 3.7로부터 구입). 수동 크기 배제 컬럼 또는 열 흐름 어댑터를 사용하여 제품 솔루션을 적용한다. 탈 이온수 다른 0.5 mL를 조질 생성물을 함유 바이알 린스 및 크기 배제 컬럼에로드.
- 중력 유동에 의해 탈 이온수로 생성물을 용리 약 2m의 분획을 수집L 양.
- TLC (단계 4.1)에 의해 분수를 분석합니다. 순수한 트레할로스 유사체를 함유하는 분획을 풀.
- 건조 된 제품을 제공하기 위해 동결 건조 또는 회전 증발에 의해 물을 제거합니다. 반응 수율을 얻고 NMR 분석을 진행 할 수있는 제품을 체중 (단계 4.3 참조).
- 제조업체의 지침에 따라 탈 이온수 포화, 여분의 미세 P2 폴리 아크릴 아미드 비드 크기 배제 매체를 포함하는 1 × 100cm 열을 준비합니다.
트레 할로 오스 아날로그 제품 4. 분석
- TreT 반응의 박층 크로마토 그래피 (TLC) 분석을 수행한다.
주 :이 절차는 또한 크기 배제 칼럼 분획물을 분석하는데 사용될 수있다. 이는 TLC 플레이트 상에 화합물 염색을 관찰 할 TLC 분석에 앞서 반응 혼합물 또는 열 분획을 농축 할 필요가있다.- 마크 연필로 TLC 플레이트 상에 레인 수집 적절한 글루코오스 유사체 표준 트레할로스 아날로그 표준 (사용 가능한 경우), 반응 혼합물을 포함한 레인 (또는 분획 분석 물 (들)과 관련 표준 (들)에 적용 크기 전자xclusion 컬럼 정제), 및 공동 스폿. TLC 판에 각각의 샘플을 적용한 후, 플레이트가 건조 할 수 있습니다.
비고 : 반응 분석을 위해 샘플을 통상 2 μL를 TLC 플레이트에인가된다. - n 개의 부탄올 / 에탄올 / 탈 이온수를 사용하여 TLC 판 개발 (5 : 3 : 2).
- 설탕 함유 명소가 (일반적으로 5 분)을 시각화 할 수있을 때까지 다음 높은 설정에 핫 플레이트에 에탄올 (사탕 얼룩) 및 열에서 5 % H 2 SO 4를 찍어, 개발 TLC 판을 건조시킵니다.
- 마크 연필로 TLC 플레이트 상에 레인 수집 적절한 글루코오스 유사체 표준 트레할로스 아날로그 표준 (사용 가능한 경우), 반응 혼합물을 포함한 레인 (또는 분획 분석 물 (들)과 관련 표준 (들)에 적용 크기 전자xclusion 컬럼 정제), 및 공동 스폿. TLC 판에 각각의 샘플을 적용한 후, 플레이트가 건조 할 수 있습니다.
- 분리 탄수화물을 검출 할 수있는 임의의 HPLC 시스템을 사용 TreT 반응 혼합물의 HPLC 분석을 수행한다. 이 프로토콜은 굴절율을 이용하여 아미노 프로필 HPLC 컬럼 및 검출을 이용하여 분리 탄수화물을 포함한다.
- HPLC에 미리 열 가드를 포함 아미노 프로필 컬럼 (4.6 × 250 mm)를 연결합니다.
- 0.4의 유속을 탈 이온수에 80 % 아세토 니트릴 아미노 칼럼을 평형화용액 / 분.
- 아미노 프로필 열 상 반응 생성물 (또는 표준)의 솔루션을로드합니다.
- 0.4 mL / 분의 유속 및 50 ℃의 칼럼 온도에서 탈 이온수 중 80 % 아세토 니트릴 제품 (또는 표준)을 용리시킨다. 일반적으로 사용되는 실행 시간은 40 분입니다.
주 : 이러한 증발 광산란 검출 (ELSD)과 같은 다른 방법을 사용할 수 있지만 당 유사체를 출발 물질 및 트레할로스 아날로그 제품 모두는 굴절률에 의해 검출 될 수있다. 분, 트레 할로 오스 유사체는 15 ~ 25 분 사이에 용출 10 ~ 15 사이에 기술 된 조건을 사용하여, 포도당 유사체는 일반적으로 용출.
- 정제 트레할로스 유사체의 NMR 분석.
- D 2 O (700 μL)의 정제 된 트레할로스 유사체를 용해 및 NMR 튜브 용액 옮긴다.
- 1 H NMR 적절한 설비 프로토콜에 따라 13 C NMR 스펙트럼을 획득.
- , 합성 정제 및 M. smegmatis에 6 TreAz (Msmeg)를 관리 할 수 있습니다.
- 15 ML 원뿔 튜브에 6 아지 6 데 옥시의 글루 코피 라노스 (6 GlcAz, 0.020 몰, 4.1 mg)을, UDP - 포도당 (0.040 몰, 24.4 mg)을, 그리고의 MgCl 2 (0.020 몰, 4.1 mg)을 추가합니다.
- 300 μg의 / ㎖의 최종 효소 농도와 1 ㎖의 최종 부피를 달성하기 위해 (단계 1.5.4로부터 구입) 트리스 완충액 TreT 추가. 피펫은 혼합물을 상하로 부드럽게 또는 고체를 용해 튜브를 반전한다.
- 15 분 동안 진탕 70 ° C에서 반응을 품어.
- 탈 이온수 3 mL로 효소 반응 혼합물을 희석하고, 미리 세척 원심 필터 유닛 (10 kDa의 NMWL)로 전송. 대부분의 액체는 대략 튜브에 필터를 통해 10 분을 통과 할 때까지 3000 XG에 필터 장치를 원심 분리기.
- 취소 일원심 필터 유닛의 전자 다락방. 25 분 동안 실온에서 교반하고 튜브 / 흔들림 혼합 베드 이온 교환 수지 (0.75 g)를 추가한다. 상등액을 경사 분리하고 상기 수지를 제거하도록 필터.
주의 : 단계 5.1.1-5.1.5 1 시간 미만 5㎜ 정도의 농도로 6 아지 트레할로스 (6- TreAz)의 수용액을 제공한다. 5 mM의 농도는 제품 기판의 정량적 변환 단계 동안 생성물의 최소 손실을 가정하고, 정화 단계 동안에에 대한 소요 희석에 기초하여 추정된다. 용액을 멸균 여과 원한다면 생물학적 샘플에 첨가하기 전에 될 수있다. - 100-1,000 μL의 최종 배양 부피 및 25 μM ~ 최종 6 TreAz 농도를 달성하기 위해 일반적으로 M. smegmatis의 로그 상 문화 (Msmeg) 6- TreAz 생성물 용액의 적절한 용적을 추가한다. 시간의 원하는 양 일반적 60 분 동안 37 ℃에서 세포를 인큐베이션.
- 아 지드 표지 세포에 형광 공역하기 위해 화학을 클릭 수행합니다. 이 프로토콜에서 Msmeg에서 세포 표면 아 지드에 형광 물질을 제공하기 위해 구리 - 촉매 아 지드 - 알킨 사이클로 (CuAAC)를 사용합니다.
- 5 분 동안 3,900 XG에서 세포를 원심 분리하고 PBS 0.5 % 소 혈청 알부민을 함유하는 세포를 세척 하였다. 두 번 반복합니다.
- 이를 해결하기 위해 PBS에 4 % 파라 포름 알데히드의 펠렛 세포를 다시 일시 중지합니다. 10 분 동안 배양 한 후, 세포를 세척하는 단계 5.2.1를 반복합니다.
- 138 μL PBS에서 펠렛 세포를 다시 일시 중지합니다.
- DMSO의 알킨-carboxyrhodamine 110 (알킨-488)의 1 ㎜ 주식 솔루션의 3 μL를 추가합니다.
- 탈 이온수에 아스 코르 빈산 나트륨의 새로 제조 한 60 mM의 원액의 3 μL를 추가합니다.
- 을 t- 부탄올 / 디메틸 설폭 트리스 [(1- 벤질 -1H- 1,2,3- 트리아 졸 -4- 일) 메틸] 아민 (TBTA)의 6.4 mM의 스톡 솔루션 (DMSO) 3 μL 추가 4 : 1.
- 3 & # 추가956; 탈 이온수 CuSO 4의 50 mM의 스톡 용액 L.
- 피펫 세포 현탁액의 상하 후 실온에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양한다.
- 단계를 반복 5.2.1 세포를 씻어. 150 μL PBS의 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 세포의 형광 분석을 수행합니다. 이 프로토콜에 표시된 Msmeg의 세포 형광을 시각화하기 위해 형광 현미경을 사용합니다.
- 현미경 슬라이드를 PBS에 현탁하고, 박테리아 세포의 10 μL를 추가하고 가볍게 커버 슬립의 에지를 이용하여 얇은 층으로 액체를 확산. 어둠 속에서 공기 건조 할 수 있습니다.
- 다음 접착제를 커버 샘플을 통해 미끄러 져 배치하고 적용, 건조 된 샘플을 통해 설치 매체의 10 μL를 추가합니다 (예를 들어, 매니큐어)를 고정합니다.
- 이미지 100X 배율 형광 현미경을 사용하여 슬라이드.
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Representative Results
T. TENAX TreT 약 4 mg의 표준 단백질 발현 및 정제 기술을 사용하여 / L의 수율로 대장균을 얻었다. 단일 니켈 친 화성 크로마토 그래피 단계 (대표 FPLC 트레이스가도 4에 도시 됨) 대장균 파쇄물로부터 TreT를 정화하기에 충분했다. TreT 합성 과정에 대한 우리의 초기 출판물에 설립 된 바와 같이, 재조합 T.의 TENAX TreT는 다양한 포도당 유사체-많은의 광범위한 변환 할 수있는 것은 상업적으로 이용 가능한-에 대응하는 트레 할로 오스 유사체 높은 효율을 19입니다. 우리의 처음보고 된 프로토콜을 사용하여 당 유사체를 출발의 번호 HPLC 결정된 반응 수율을 제공하기 표 1은 기판의 TreT 성행위 및 합성을위한 적합성의 범위를 나타낸다. 아지, 플루오로, 데 옥시 등 다양한 구조 변경,싸이 및 당 링 주위의 다른 위치에서의 입체 화학적 변경은 메인 예외가 4- 위치에서 변형되는과, 야생형 효소에 의해 내약성.
그림 4 : FPLC에 의해 TreT 정화용 대표 결과. 콜라이 용 해물로부터 재조합의 T. TENAX TreT 정제 1.4.1-1.4.4 단계에서 설명한 바와 같이, 니켈 친 화성 크로마토 그래피를 이용하여 수행 하였다. 청색, 자외선 (UV) 흡수 트레이스; 밝은 녹색, 용출 버퍼의 농도 짙은 녹색, 압력. TreT에 해당하는 피크는 화살표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : TreT 반응 대표 수율. HPLC는 결정된 여러 트레 할로 오스 유사체에 대한 TreT 반응의 고립 수율. ND, 감지되지 않습니다. - 반응 최적 프로토콜을 사용하여 반 제조용 수행되지 나타낸다. * 크기 배제 크로마토 그래피 단계가 필요되었음을 나타냅니다. 수평 분할 선은 오스 당 고리상의 변형의 위치를 분리한다. 허가 기준 (19)에서 적응 표; 이 작품에서 분리 수율을 포함하도록 업데이트되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
여기서, 우리는 TreT 합성 공정의 전반적인 효율 및 속도를 개선 당초 프로토콜의 최적화를보고한다. 원래 프로토콜은 10 mM의 포도당를 사용하는 동안alogue 40 mM의 UDP 글루코스, 그 비교 변환 효과적으로 반응에 따라 생성 된 생성물의 양을 두 배로하고 비교적 고가 인 UDP 글루코스의 낭비를 제한하는 20 mM 글루코스 및 40 mM의 UDP 글루코스를 사용하여 얻어 질 수 있다고 판단했다 . 포도당 아날로그 및 UDP - 포도당의 몰량을 사용하면 낮은 변환 결과. 원하는 경우 정지 (70 ° C에서 15 분에서 6 TreAz 내지 6 GlcAz의 양적 전환에 의해 입증 된 많은 유사체를 위해 유사한 전환을 유지하면서, 반응 시간은 초기에보고 된 60 분 이하로 짧아 질 수있다 ) 5 및도 6.
본원에보고 된 정제 프로토콜은 실질적으로 비 - 크로마토 스핀 투석 / 이온 교환법 원래 효소 침전 / 실리카 겔 크로마토 그래피 방법을 대체 향상된다. 이 수정 사항에 대한 이론적 근거는 TreT가 r에 있다는 것입니다eaction 혼합물 중립 트레할로스 아날로그 생성물을 제외하고는, 이온 종의 전체로 구성되어있다. 따라서, 혼합물을 스핀 투석 된 효소를 제거하고 적은 45 분의 수용액을 정제하여 트레 유사체를 제공하는 상기 이온 종을 모두 제거하는 혼합 층 이온 교환 수지로 처리 될 수있다. 이러한 모든 수성 정제 방법은 환경에 유해한 유기 용매, 시간 소모적 인 단계를 증발시키고, 여과하고, 특히 비 화학자 들어, 느리고 성가신 과정 드라이로드를 실리카 겔 크로마토 그래피를 피한다. HPLC 분석 전술 한 TLC를 사용하거나 결정 양적 전환을 나타낼 TreT 반응은이 정제 방법에 의한 이온 교환에 설탕 결합에 제품 손실보고 된 반응 규모 가능성 약 60~80% 절연 수율을 제공한다 수지 (대표 절연 수율은 표 1 참조). 미 반응 포도당 유사체가 남아있는 경우,이를 물로 용출 폴리 아크릴 아미드 비드 기반 크기 배제 컬럼을 이용하여 원하는 트레할로스 아날로그 생성물로부터 분리 될 수있다. 바람직한 경우이 또한 아미노 컬럼 제조용 규모 HPLC를 사용하여 수행 될 수있다. 생성물 순도는 TLC, HPLC, 및 / 또는 NMR 분광 분석으로 평가 될 수있다. 그림 5는 설명 프로토콜을 통해 합성 하였다 6 TreAz, 대표적인 분석 데이터를 보여줍니다. TLC 및 HPLC 데이터는이 반응 6 TreAz 생성물 6- GlcAz 기판의 양적 전환을 지시하고, 스핀 투석 / 이온 교환 정제 단계 후에 단리 수율은 58 %이었다. 1 H, 13 C NMR 분광 분석은 특히 α, 새로 형성된 글리코 시드 결합의 α-입체뿐 아니라 순도 포함 6 TreAz 생성물의 구조를 확인 하였다.
그림 5 : TreT 반응 대표 분석 데이터. (A) 및 TLC (B) -6- TreAz 내지 6의 GlcAz TreT - 촉매 전환의 HPLC 분석. 스핀 투석 / 이온 교환 정제 후의 6 TreAz 생성물 (C) 1 H NMR 및 (D) 13 C NMR 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
결핵균의 특정 검출 용 트레 유사체의 상기 값이 주어지면, TreT 프로세스 결핵 연구 및 진단 애플리케이션 트레할로스 기반 프로브의 개발 및 사용을 용이하게한다. 이러한 유형의 응용 프로그램을 설명하기 위해, 우리는 최적화 된 TreT 사용빠르게 준비 정화, 6-TreAz - 트레 할로 오스 기반 클릭 화학 프로브를 형광 검출을 가능하게 9 -to 마이코 박테리아를 관리 할 수있는 프로세스 (워크 플로우와 대표 데이터는 그림 6에 표시됩니다). 간단히, TreT 정량적으로 15 분에서 6 TreAz 상업적 6 GlcAz 변환하는 데 사용하고,이어서 반응 혼합물을 45 분 걸렸다 스핀 투석 / 이온 교환 정제 방법으로 실시 하였다 (다중 세정 단계들이 증가 생략 된 속도). 따라서, 공지 된 농도의 순수한 6- TreAz (~ 5 mM)을 수용액 원액 만 1 시간 생성 하였다. 6 TreAz 주식은 즉시 클릭 화학 매개 결찰 (20), (21)에 대한 핸들을 포함 세포 표면의 아 지드 라벨을 수행하는 모델 박테리아 Msmeg (최종 6 TreAz 농도 ~ 25 μM)의 성장 문화를 투여 하였다 형광 프로브. 그후,표지 된 세포를 6 TreAz 처리 셀 강한 형광을 나타내었다 형광 현미경에 의해 분석 하였다. 예상 한 바와 같이, 6 TreAz 또는 처리되지 않은 대조 시료 6- TreAz 흡수 및 대사 도입 구에 필요한 기능 트레할로스 수송 22 누락하고, 형광을 나타내지 않았다.
그림 6 : TreT 합성 트레 할로 오스 아날로그를 사용하여 마이코 박테리아의 신속한 검출을위한 대표 결과. (A) 6- 트레의 신속한 합성, 정제, 그리고 사용하기위한 플로Msmeg의 형광 검출을위한 아즈. 프로토콜 5.1.1-5.1.6는 아 지드와 세포 표면의 대사 라벨링을 달성하기 Msmeg 라이브를 투여 한 다음, 합성 및 (a ~ 5mM의 1 시간 안에 수용액을주는) -6- TreAz를 정화하는 데 사용 된 단계. 단계 5.2.1-5.2.9에 설명 된대로 다음, 화학 (CuAAC)를 클릭하는 알킨 수정 형광, 알킨-488과 세포 표면의 아 지드를 반응 하였다. 기능적 트레할로스 수송을 Msmeg의 대조 시료 미처리 또는 트레할로스 트랜스 (Δ sugC)를 결여 남아있는 동안 (야생형 및 Δ sugC :: sugC)이, 강한 형광을 나타내었다 않았다 함유 -6- TreAz 처리 Msmeg의 (B) 형광 이미징 . 허가 기준 (19)에서 적응 그림; 개선 된 TreT 프로토콜에서 워크 플로우 및 이미지 데이터로 업데이트. 스케일 바, 5 μm의. 부디이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
트레할로스 유사체는 식품 및 의약품의 보존에서 미생물 감염 (6)의 진단 및 치료에 다양한 분야에 영향을 미칠 가능성이있다. 기존의 다단계 화학 합성 방법은 (당연히 복잡한 마이코 박테리아 당지질 발생, 예를 들어) 수정의 여러 사이트와 복잡한 트레 할로 오스 유사체를 생산하는 데 유용합니다. 그러나, 이들 방법은 비교적 간단한 일 치환 트레할로스 유사체 9, 13, 14의 합성에 적용되는 경우에도 변함 길고 비효율적이다. 대안적인 합성 방법은 신속하고 효율적으로 상기 분야의 값을 가질 수있다 트레할로스 유사체의 다양한 유형을 제조하는 데 필요한. 자연 트레할로스 합성 효소를 이용 생 촉매 방식은 가장 약속을 개최합니다. 여러 트레 할로 오스 합성 경로 있지만자연에 존재하는, 우리는 여러 가지 이유로 트레 할로 오스 아날로그 합성을위한 이상적인 효소로 T.의 TENAX (18)로부터 TreT을 고려하십시오.
T. TENAX에서 TreT이 반응은 향상된 속도 및 대량 생산 설정의 미생물 오염 방지를 위해 가열 될 수 있도록, 열 안정성이다. T. TENAX에서 TreT 트레 할로 오스를 분해 할 수없는 단방향 효소이다. T. TENAX에서 TreT는 대장균에서 발현 및 정제에 대한 의무이며, 그 선적 및 보관이 용이 한 것입니다. TreT 반응은 단일 단계이고, 이는 단순한 기판 글루코스 UDP 글루코스를 포함한다. 구조적 / 기능적으로 다양한 포도당 유사체 많은 수의 다수의 상용 공급 업체에서 사용할 수 있습니다. UDP 글루코스 특히 TreP 도너 β-D- 글루코스 -1- 인산에 비해 비교적 저렴하고 당 공여체이다. T. TENAX에서 TreT 높은 홍보가포도당 기판 구조 omiscuity, 그래서 다양한 트레 할로 오스 유사 액세스 할 수 있습니다. TreT 반응 혼합물로부터 생성물의 정제를 빠르고 간단하다.
여기서, 우리는 TreT 효소의 상기 긍정적 인 속성을 대문자 트레할로스 아날로그 합성 상세한 프로토콜 최적화를보고 하였다. TreT 처리가 필요한 경우 추가로 스케일 업이 가능해야하지만, 반 제조용 (10-100 ㎎)을 순수한 트레할로스 유사체의 다양한 액세스하기 위해 사용될 수있다. 유사체 수많은 종류 아지, 데 옥시, 플루오로, 및 티오 trehaloses뿐만 아니라, 트레 할로 오스 입체는 우리 종래 및 본 연구에 접속되었지만, 다른 변형도 가능할 것이다 (예를 들면, 안정 동위 원소 표지 및 방사성 표지 trehaloses)이 특히 관심이다. TreT 프로세스의 합성 및 정제 단계는 운영 체제 간단하고 쉽게 합성 체 훈련되지 않은 사람에 의해 수행 될 수있다Mistry의. 만약 크기 배제 컬럼 다음 TreT 공정의 가장 큰 매력 중 하나는 모두 합성 및 정제 단계는 주 (원하는 세척 단계의 수에 따라 1~4시간 이르기까지 매우 짧은 시간에서 실행될 수 있다는 정제는 반응 당 유사체로부터 트레할로스 아날로그 생성물을 분리하는 데 필요한이 빠른 트레할로스 유사체 합성을위한 기존의 방법)보다 실질적으로 여전히 약 2 일에 총 시간을 증가시킨다.
TreT 프로세스는 아직보고 트레할로스 유사체 액세스하는 가장 효율적인 경로 효소이지만, 향후 개선의 기회를 제공하는 몇 가지 단점이있다. UDP 글루코스 다른 당 공여체에 비해 비교적 저렴하지만 먼저, 상기 TreT 공정의 효율은 더 싼 광원으로부터 UDP 글루코스 효소 적 합성, 예를 들면, α-D 글루코오스 -1-와 결합함으로써 개선 될 수 있습니다 인산, 또는 identifyi로UDP - 포도당 저렴한 대리를 ng를. 이 방법의 제 2 전위 제한 반응 범위는 궁극적 TreT의 기판 공차에 의해 지배된다는 점이다. 야생형 TreT의 공차 (표 1 참조) 상당히 높은 반면, 일부 유사체는 이러한 방법 (예를 들어, 4 위치 변성 유사체)을 사용하여 합성 할 수 없다. 따라서, 증가 된 기판 허용 오차 TreT의 설계 버전은 도움이 될 것입니다. 많은 TreT - 촉매 반응이 양적 전환을 진행하는 동안 셋째, 낮은 변환은 크로마토 그래피 정제 단계를 필요로한다. 이 프로토콜에서, 우리는 저렴하므로 특수 장비를 필요로하지 않으며, 상대적으로 느린 크기 배제 공정을 이용하여 집중 및 물 용출 전적으로 수행 될 수있다. 대안으로, 예비 스케일 아미노 칼럼을 이용한 HPLC 정제 제품 정화용 빠른 방법으로 사용될 수있다. 이러한 제한의 일부에도 불구하고, TreT 프로세스 제공트레 할로 오스 유사체의 신속하고 효율적인 준비를위한 강력한 플랫폼, 그리고 바이오 (테크노)에서의 평가 및 응용 프로그램 논리 및 생물 의학 분야를 신속하게해야합니다. 상술 TreT 프로세스 미래 개선, 추가 연구 및 트레 할로 오스 및 그 유도체에 관한 어플리케이션을 강화할 것이다.
트레 할로 오스 유사체는 다양한 분야의 잠재적 인 가치를 가지고있다. 서론에서 언급 한 바와 같이, 자연 트레 할로 오스 그래서 트레 할로 오스 등의 분해 저항성 등의 특성을 가진 유사 매력 일 수 있고, biopreservation 식품 감미료 응용 프로그램에 사용됩니다. 또한, 천연의 트레할로스 안정 동위 원소 표지 및 방사성 표지 된 버전의 다양한 연구 목적으로 상업적으로 이용 가능하고, TreT 프로세스 확실히 이들 분자를 빠르고 효율적으로 액세스를 제공 할 수있다. 트레 할로 오스 유사체 트레 할로 오스가 포유 동물에서 존재하기 때문에 프로브 및 억제제와 병원체를 대상에 대한 관심 또한 있습니다. 하나의 AP = 연합 뉴스특히 관심의이 영역의 습곡은 마이코 박테리아의 검출이다. 결핵균, 연간 1,500,000명 사망 결핵의 원인이 에이전트는 포유 동물에서 결석 고유 트레 할로 오스 처리 경로가 포함되어 있습니다. 예를 들면, 트레 할로 오스 재활용 컨베이어와 외막 상주 당지질로 트레할로스를 포함 하류 효소는 포유류 (22)에 존재하지. 검출 트레 할로 오스 유사체로이 마이코 박테리아 특정 기계를 표적으로하는 모델 시스템과 아마도 인간 환자의 결핵균 감염의 생체 내 이미징에 매력적인 접근 방식을 나타냅니다. 실제로, FITC 케토 TreAz 트레 할로 오스 (도 1b)의 상기 예는 발전 8,9 길을 마련했다. 연구 커뮤니티에이 도구의 접근을 용이하게하기 위해, 우리는 여기에 신속하게하기위한 프로토콜을보고 synthesiz보내고 및 클릭 화학와 함께 이미지 마이코 박테리아에 6 TreAz를 사용하여.
이 프로토콜은 결핵 진단 응용에 유용 할 수있는 다른 검출 트레할로스 유사체의 개발에 적용 할 수있다. 예를 들어, 베리 및 데이비스 미코 박테리아 감염 제 (8)의 생체 내 영상을위한 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 프로브로서 18 F 플루오 트레할로스의 가능한 사용을 제안했다. TreT 프로세스는이 목표를 실현하기위한 이상적 일 수있다. 18 F-2- 플루오로 글루코오스 (18 F 반감기 = 110 분 단기이므로 TreT 신속하고 정량적으로 2- 플루오 글루코스로부터 2- 플루오로 트레할로스를 발생시킬 중요하다 (표 1 참조) ), 매우 빠른 화학을 필요. 이미 종양 PET 이미징에 대한 임상에서 사용되는 또, 18 F-2- 플루오 글루코스 쉽게 가능하다. 데브 대한 설명 TreT 프로세스의 사용18 F 플루오로 트레 할로 오스의 elopment 및 각종 응용 프로그램의 다른 트레 할로 오스 유사체는 우리의 실험실에서 현재 진행 중입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB agar | Research Products International | L24021 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| Luria broth | Research Products International | L24045 | |
| Terrific Broth | Research Products International | T15050 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A3256 | |
| Phosphate-buffered Saline | GE Healthcare | SH30256 | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | I5513 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | S374 | |
| Syringe filter, 0.45 µm | Fisher Scientific | 09719D | |
| Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free | Thermo Scientific | 88666 | |
| HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| TRIS base ultrapure | Research Products International | T60040 | |
| Dialysis tubing, MWCO 12–14,000 | Fisher Scientific | 21-152-16 | |
| Glucose analogues | CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals | Examples of vendors that offer numerous glucose analogues | |
| 6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz) | CarboSynth | MA02620 | |
| UDP-Glucose | abcam Biochemicals | ab120384 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher Scientific | M33 | |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit | EMD Millipore | UFC901008 | |
| Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin | Bio-Rad | 444-9999 | |
| Extra-Fine Bio-Gel P2 media | Bio-Rad | 150-4118 | |
| Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates | EMD Millipore | 1056280001 | |
| n-Butanol | Fisher Scientific | A399 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | S25310A | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145 | |
| Deuterium oxide, 99.8% | Acros Organics | 351430075 | |
| Aminopropyl HPLC column | Sigma Aldrich | 58338 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Para-formaldehyde | Ted Pella | 18505 | |
| Alkyne-488 | Sigma Aldrich | 761621 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Click Chemistry Tools | 1061 | |
| tert-Butanol | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | W387520 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotechnology | 10001 |
References
- Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology. 13, 17-27 (2003).
- Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions. PLoS Pathog. 9, 1003447 (2013).
- Ohtake, S., Wang, Y. J. Trehalose: Current use and future applications. J. Pharm. Sci. 100, 2020-2053 (2011).
- Adams, R. P., Kendall, E., Kartha, K. K. Comparison of free sugars in growing and desiccated plants of Selaginella lepidophylla. Biochem. Syst. Ecol. 18, 107-110 (1990).
- Kubota, M. Glycoenzymes. Ohnishi, M. , Japan Scientific Societies Press. (2000).
- Walmagh, M., Zhao, R., Desmet, T. Trehalose analogues: latest insights in properties and biocatalytic production. Int. J. Mol. Sci. 16, 13729-13745 (2015).
- Kim, H. -M., Chang, Y. -K., Ryu, S. -I., Moon, S. -G., Lee, S. -B. Enzymatic synthesis of a galactose-containing trehalose analogue disaccharide by Pyrococcus horikoshii trehalose-synthesizing glycosyltransferase: Inhibitory effects on several disaccharidase activities. J. Mol. Catal. B: Enzym. 49, 98-103 (2007).
- Backus, K. M., et al. Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis. Nat. Chem. Biol. 7, 228-235 (2011).
- Swarts, B. M., et al. Probing the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry. J. Am. Chem. Soc. 134, 16123-16126 (2012).
- Rose, J. D., et al. Synthesis and biological evaluation of trehalose analogs as potential inhibitors of mycobacterial cell wall biosynthesis. Carbohydr. Res. 337, 105-120 (2002).
- Wang, J., et al. Synthesis of trehalose-based compounds and their inhibitory activities against Mycobacterium smegmatis. Bioorg. Med. Chem. 12, 6397-6413 (2004).
- Gobec, S., et al. Design, synthesis, biochemical evaluation and antimycobacterial action of phosphonate inhibitors of antigen 85C, a crucial enzyme involved in biosynthesis of the mycobacterial cell wall. Eur. J. Med. Chem. 42, 54-63 (2007).
- Sarpe, V. A., Kulkarni, S. S. Regioselective protection and functionalization of trehalose. Trends in Carbohydr. Res. 5, 8-33 (2013).
- Chaube, M. A., Kulkarni, S. S. Stereoselective construction of 1,1-alpha,alpha-glycosidic bonds. Trends in Carbohydr. Res. 4, 1-19 (2013).
- Leigh, C. D., Bertozzi, C. R. Synthetic studies toward Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-I. J. Org. Chem. 73, 1008-1017 (2008).
- Chaen, H., et al. Efficient enzymatic synthesis of disaccharide, alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside, by trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii. J. Appl. Glycosci. 48, 135-137 (2001).
- Vander Borght, J., Soetaert, W., Desmet, T. Engineering the acceptor specificity of trehalose phosphorylase for the production of trehalose analogs. Biotechnol. Progr. 28, 1257-1262 (2012).
- Kouril, T., Zaparty, M., Marrero, J., Brinkmann, H., Siebers, B. A novel trehalose synthesizing pathway in the hyperthermophilic Crenarchaeon Thermoproteus tenax: the unidirectional TreT pathway. Arch. Microbiol. 190, 355-369 (2008).
- Urbanek, B. L., et al. Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria. ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).
