Abstract
Kemiskt modifierade versioner av trehalos, eller trehalos analoger, har tillämpningar inom biologi, bioteknik och läkemedelsvetenskap, bland andra områden. Till exempel har trehalos analoger som bär detekterbara taggar använts för att detektera Mycobacterium tuberculosis och kan ha applikationer som tuberkulos diagnostiska medel. Hydrolytiskt stabila versioner av trehalos också bedrivs på grund av deras potential för användning som icke-kalori sötningsmedel och bioskydd- medel. Trots överklagandet av denna klass av föreningar för olika tillämpningar, deras potential förblir ouppfyllda på grund av avsaknaden av en robust väg för sin produktion. Här rapporterar vi ett detaljerat protokoll för att snabbt och effektivt ett steg biokatalytisk syntes av trehalos-analoger som kringgår de problem som är förknippade med kemisk syntes. Genom att använda termo trehalos syntas (tret) enzym från Thermoproteus tenax, kan trehalos analoger vara geneed i ett enda steg från glukos analoger och uridindifosfat glukos i högt utbyte (upp till kvantitativ omvandling) i 15-60 min. En enkel och snabb icke-kromatografisk reningsprotokoll, som består av spinndialys och jonutbyte, kan leverera många trehalos analoger av känd koncentration i vattenlösning i så lite som 45 min. I de fall där oreagerad glukos analog idag återstår, kan utföras kromatografisk rening av trehalos analoga produkten. Sammantaget ger detta förfarande en "grön" biokatalytisk plattform för skyndsam syntes och rening av trehalos-analoger som är effektiva och tillgängliga för icke-kemister. För att exemplifiera tillämpningen av denna metod, beskriver vi ett protokoll för syntesen, alla vatten rening och administration av en trehalos-baserad klick kemi sond till mykobakterier, som alla tog mindre än en timme och aktiverade fluorescensdetektering av mykobakterier. I framtiden, föreställer vi att bland other tillämpningar kan detta protokoll tillämpas på snabb syntes av trehalos-baserade prober för diagnostik tuberkulos. Till exempel, kortlivade radionuklider modifierad trehalos analoger (t.ex. 18 F-modifierade trehalos) kan användas för avancerade kliniska avbildningsmetoder såsom positronemissionstomografi-datortomografi (PET-CT).
Introduction
Trehalos är en symmetrisk icke-reducerande disackarid som består av två glukosenheter som är förenade med en 1,1-α, α-glykosidbindningen (Figur 1A). Medan trehalos är frånvarande från människor och andra däggdjur, är det som förekommer allmänt i bakterier, svampar, växter och ryggradslösa djur 1. Den primära roll trehalos i de flesta organismer är att skydda mot miljöpåfrestningar, såsom uttorkning 1. Dessutom är vissa humana patogener kräver trehalos för virulens, inklusive tuberkulos orsakar Mycobacterium tuberculosis, som utnyttjar trehalos som en förmedlare av cellhölje biosyntes och som en byggsten för konstruktionen av immunmodulerande glykolipider 2.
Figur 1: Trehalos och trehalos analoger. (A) Struktur för naturlig trehalos och en onaturlig trehalos-analog, där X är en strukturell modifiering. (B) Exempel på trehalos analoger som rapporterats i litteraturen som har potentiella tillämpningar inom biokonservering och bioimaging.
Tack vare sin unika struktur och fysiologiska funktioner har trehalos dragit stor uppmärksamhet för användning i bio (techno) logisk och biomedicinska tillämpningar 3. De skyddande egenskaperna hos trehalos observerades i natur- t.ex. dess slående förmåga hjälpa till att upprätthålla liv i "uppståndelse" växter som har genomgått extrem uttorkning 4 -har sporrade sin omfattande användning i biokonservering applikationer. Trehalos har använts för att bevara ett brett spektrum av biologiska prover, såsom nukleinsyror, proteiner, celler och vävnader 3. Till exempel, är trehalos används som en stabiliserande tillsats i ett antal läkemedels thatt är på marknaden, inklusive flera anti-cancer monoklonala antikroppar 3. Som väl är trehalos används som sötningsmedel i livsmedelsindustrin, och det används flitigt för produkt bevarande i både livsmedels- och kosmetikaindustrin. Antagandet av trehalos för dessa typer av kommersiella tillämpningar initialt begränsas av oförmågan att erhålla stora kvantiteter av rent trehalos från naturliga källor eller genom syntes. Emellertid har ett effektivt enzymatiskt förfarande för ekonomisk framställning av trehalos från stärkelse nyligen utvecklats, vilket har sporrat dess utbredda kommersiella användningen 5.
Kemiskt modifierade derivat av trehalos, som här kallas trehalos analoger, har fått allt större uppmärksamhet för olika tillämpningar (generisk struktur visas i figur 1 A; specifika exempel på trehalos analoger som visas i Figur 1B) 6. Till exempel, är lakto-trehalos en trehalos analog med en av sina glukosenheter ersatta med galaktos, därmed dess 4-ställning hydroxylgruppen har en inverterad stereokemiska konfigurationen. Lakto-trehalos har samma stabiliserande egenskaper som trehalos men är resistent mot nedbrytning av intestinala enzymer, vilket gör det attraktivt som en icke-kalorilivsmedelstillsats 6, 7.
Vår grupp intresse i trehalos analoger avser främst deras värde som mykobakterier specifika prober och hämmare. De Barry och Davis grupper utvecklat en fluorescein-konjugerad keto-trehalos analog, som heter FITC-keto-trehalos, som visade sig metaboliskt märka cellväggen av levande M. tuberculosis, vilket möjliggör dess detektion genom fluorescensmikroskopi 8. Den Bertozzi lab utvecklade mindre azido-trehalos (TreAz) analoger som metaboliskt kan märka cellväggen och därefter vara Detsad användning av klickkemi och fluorescensanalys 9. Dessa framsteg pekar på möjligheten att använda trehalos baserade prober som diagnostiska avbildningsmedel för tuberkulos. Trehalos analoger har också bedrivits som hämmare av M. tuberculosis på grund av deras potential att störa vägar i bakterien som är väsentliga för viabilitet och virulens 10, 11, 12.
Hittills främsta hindret för utveckling av trehalos-analoger för bio (techno) logiska och biomedicinska tillämpningar är bristen på effektiva syntesmetoder. De två traditionella vägar till att producera trehalos analoger lita på kemisk syntes (Figur 2). En väg involverar desymmetrization / modifiering av naturliga trehalos, medan den andra involverar börjar med korrekt funktionaliserade monosackaridenbyggstenar och genomförande av kemiska glykosylering tillsmida 1,1-α, α-glykosidbindning. Dessa metoder, som nyligen har diskuterats i översiktsartiklar 13, 14, har visat sig vara användbara för att åstadkomma flerstegssyntes av små mängder av komplexa trehalos innehållande naturliga produkter, såsom sulfolipid-1 från M. tuberculosis 15. Dock båda metoderna är i allmänhet ineffektiva, tidskrävande, oåtkomlig för icke-kemister, och dessutom inte anses vara miljövänlig. Således, för att syntetisera vissa typer av trehalos analoger, är dessa strategier inte är idealiska.
Figur 2: Approaches to trehalos analog syntes. Kemiska metoder för trehalos analog syntes, som visas till vänster, använda flerstegsförfaranden som innebär svåra Protection / avlägsnande, desymmetrization, och / eller glykosylering steg. Enzymatisk syntes, som visas till höger, använder enzym (er) för att stereoselektivt konvertera enkla, oskyddade substrat för att trehalos analoger i vattenlösning. Den enzymatiska protokollet som rapporteras häri använder en trehalos-syntas (tRet) enzym för att omvandla glukos-analoger och UDP-glukos till trehalos analoger i ett enda steg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En effektiv biokatalytisk väg till trehalos analoger skulle underlätta produktion, utvärdering och tillämpning av denna lovande klass av molekyler. Medan den kommersiella enzymatisk process för trehalos produktion 5 inte är anpassningsbara till att syntetisera analoger eftersom det använder stärkelse som ett substrat, det finns andra biosyntetiska banasätt i naturen som kan utnyttjas för trehalos analog syntes. Men forskning inom detta område, som nyligen granskades 6, har varit begränsad. En rapport används en metod inspirerad av Escherichia coli trehalos-biosyntesvägen för att komma åt en enda fluor-trehalos analog från motsvarande fluor-glukos. Emellertid kräver detta tillvägagångssätt en tre-enzymsystem som har begränsad effektivitet och allmängiltighet 8. Ett annat tillvägagångssätt som har undersökts är att använda trehalos fosforylas (TREP) i den motsatta riktningen, vilket i princip medger ett steg syntes av trehalos analoger från glukos analoger och glukos-1-fosfat 6, 16, 17. Även om detta tillvägagångssätt kan ha framtida löfte, både inverterande och behålla Treps närvarande har nackdelar för analog syntes. Till exempel, inverterande Treps har en oöverkomligt expensive donatormolekyl (β-D-glukos 1-fosfat) och behålla Treps har dålig enzymexpressionsutbyten / stabilitet och begränsad substrat promiscuity. Betydande förbättringar (t.ex., via enzymteknik) kommer att behövas innan TREP-medierad analog syntes är praktisk.
För närvarande är det mest praktiska tillvägagångssättet för den enzymatiska syntesen av trehalos analoger för att använda en trehalos-syntas (tRet) enzym, som omvandlar glukos och uridindifosfat (UDP) glukos till trehalos i ett enda steg 6. Vi rapporterade nyligen att använda Thermoproteus Tenax tret-en termo och enkelriktad enzym 18 -till syntetisera trehalos analoger från glukos analoger och UDP-glukos (Figur 3) 19. Detta enzym fungerar endast i det syntetiska riktning och undviker problemet med trehalos nedbrytning finns i TREP systemet. Detta enstegsreaktion could fyllas i en timme, och ett brett utbud av trehalos analoger nås i högt utbyte (upp till> 99% bestämd genom högupplösande vätskekromatografi (HPLC)) från lättillgängliga glukos analoga substrat (se tabell 1 i Representativa resultat sektion).
Figur 3: tRet-katalyserad ett-stegssyntes av trehalos analoger. Den tret enzymet från T. tenax kan stereoselektivt gå lättillgängliga glukos analoger och UDP-glukos till att bilda trehalos analoger i ett steg. R1-R4 = Variabel strukturell modifiering, t ex azido-, fluoro-, deoxi-, tio-, stereo eller isotop etikett ändringar; Y = variabel heteroatom, exempelvis syre eller svavel, eller isotopiskt märkt heteroatom.
Här ger vi adETALJERAD protokoll för syntesförfarandet tRet, inklusive uttryck och rening av tRet från E. coli, optimerad tRet reaktionsbetingelser, och en förbättrad reningsmetod som utförs helt och hållet i den vattenhaltiga fasen. Denna modifierade protokollet möjliggör den ändamålsenligt och effektiv syntes och rening av olika trehalos analoger på en semi-preparativ skala (10-100 mg). Vi visar också användningen av detta protokoll för att förbereda och administrera en trehalos-baserad sond till mykobakterier i mindre än en timme, vilket möjliggjorde snabb fluorescens detektion av mykobakteriella celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Expression och rening av tRet från Top10 E. coli
OBS: Vänligen kontakta författarna att begära tret-uttryckande E. coli-stam (pBAD tRet plasmid, innehållande T. tenax tret genen under kontroll av AraC-proteinet, omvandlas till Top10 E. coli 19) och överlåtelseavtalet medföljande material . Följande protokoll ger typiskt en proteinutbyte av ungefär 4 mg / L.
- Förbered en 3 ml nattgammal kultur av tret-uttryckande E. coli.
- Strimma Top10 E. coli transformerad med pBAD-tRet expressionsvektor på en lysogeni buljong (LB) agarplatta innehållande 100 ug / ml ampicillin.
- Inkubera plattan vid 37 ° C under ca 48 timmar.
- Plocka en enda koloni från plattan och inokulera 3 ml flytande LB-medium innehållande 100 | ig / ml ampicillin i en kultur rör.
- Placera röret i ett skakande inkubator vid 37 & #176; C x 175 rpm över natten.
- Inducera proteinexpression i tRet-uttryckande E. coli.
- Lägg 750 ml Terrific-buljong kompletterad med 100 | j, g / ml ampicillin till ett 2800 ml Fernbach odlingskolv. Överföring 1 ml buljong från kolven till en kyvett för senare användning som en blank.
- Tillsätt 3 ml natten kultur som genereras i steg 1.1.4 till odlingskolven, sedan placera kolven i en inkubator och skaka vid 37 ° C x 200 rpm. Regelbundet kontrollera absorbansen för kulturen vid 600 nm mot blind uppsamlats i steg 1.2.1.
- När absorbansen vid 600 nm når mellan 0,5-1,0, inducerar tRet expression genom att tillsätta 750 mikroliter av en M arabinos lösning (1 mM slutkoncentration) till odlingen. Returnera kolven till inkubatorn och skaka över natten vid 37 ° C x 200 rpm.
- Pellet och lysera tret-uttryckande E. coli-celler.
- Överför kulturen till en polypropylen Bottle och centrifugera i 15 min vid 4000 xg vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 15 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Överför cellsuspensionen till ett 50 ml koniskt rör och centrifugera i 15 min vid 4000 xg vid 4 ° C. Kassera supernatanten och antingen fortsätta till cell-lys (steg 1.3.4) eller lagra pelleten på obestämd tid vid -80 ° C.
- Lös upp en proteasinhibitor mini tablett i 20 ml tvättbuffert (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0) i en 50 ml koniska rör.
- Överföra proteasinhibitom innehållande tvättbuffert till den koniska rör innehållande pelleten. Skaka tills pelleten resuspenderas.
- Överföra resuspenderas cellerna till en 100 ml bägare och lysera cellerna genom sonikering (pulssekvens av 45 sekunder på, 45 sekunder av med en körtid av 2 min och 15 sekunder vid en amplitud på 75 procent).
- Överför lysatet till en 50 ml metall koniskt röroch centrifugera i 60 minuter vid 15.000 xg vid 4 ° C.
- Klargöra lysatet genom passage genom en 0,2-0,45 ^ m sprutfilter in i ett 50 ml koniskt rör.
OBS: Den typiska koncentrationen av lysat erhållna 100 mg / ml.
- Rena tRet från E. coli cellysat med hjälp av snabb protein-vätskekromatografi (FPLC).
- Ställa in FPLC med en nickelaffinitetskolonn (5 ml bäddvolym). Tvätta kolonnen med 10 ml avjoniserat vatten eller tills kolonnen är ren från eventuella föroreningar. Jämvikta kolonnen med användning av 20 ml av tvättbuffert (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0) vid en flödeshastighet av 1 ml / min.
- Ladda lysatet (20 ml), som erhållits från steg 1.3.8 på kolonnen och eluera omärkta proteiner med tvättbuffert vid en flödeshastighet av 1 ml / min tills absorbansen når bakgrundsnivåer (typiskt 80-100 ml tvättbuffert krävs) .
- Eluera His-märkt tRet genom användning av en linjär gradient av elueringsbuffert (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0) 1-100% under 60 min vid en flödeshastighet av 1 ml / min. Samla 4 ml fraktioner tills tret har elueras och absorbansen når baslinjen nivå.
OBS: Typiskt används 60 ml av elueringsbuffert som krävs för eluering av proteinet, och proteinet elueras i 60-100% elueringsbuffert intervallet. Cirka 10-15 ml ren tret i elueringsbuffert erhålls. - Bestämma koncentrationen av tRet genom att mäta absorbansen vid 280 nm mot en elueringsbuffert tomt.
- Utbyte tRet in i tris (hydroximetyl) aminometan (Tris) buffert genom dialys.
- Efter beredning av dialysslangen i enlighet med tillverkarens instruktioner, prime det genom sköljning med avjoniserat vatten och därefter Tris-buffert (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
- Ladda tRet provet i dialysrör med användning av en spruta och trubbig nål. Dialysera över natten enmedelt 2 L av Tris-buffert.
- Bestämma koncentrationen av tRet genom att mäta absorbansen vid 280 nm mot en blank uppsamlades från dialys tvätt.
- Överföra tRet lösningen till en 50 ml koniska rör och fortsätt till trehalos analog syntes (steg 2) eller förvara enzymet vid 4 ° C.
OBS: tRet är ett värmestabilt protein. Den tRet lagrades i Tris-buffert vid 4 ° C i flera månader utan att observera betydande förlust av aktivitet.
2. Ett steg Syntes av trehalos analoger Använda tRet Enzyme
OBS: Protokollet nedan beskriver en reaktion skala baserad på 4 ml volym, som kan leverera ca 15-30 mg trehalos analog beroende på reaktionseffektiviteten och molekylvikt av produkten. Reaktionskomponenterna kan skalas för att få mer eller mindre trehalos analog om så önskas.
- Lägg glukosanalog (0,080 mmol, massan kommer att bero på molekylvikt), UDP-glukos (0.160 mmol, 97,6 mg) och MgCl2 (0,080 mmol, 16,3 mg) till en 15 ml koniska rör. De slutliga koncentrationerna av dessa komponenter kommer att vara 20 mM, 40 mM och 20 mM, respektive.
- Lägga tRet i Tris-buffert (erhållen från steg 1.5.4) och, om nödvändigt, en lämplig volym av Tris-buffert (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0) för att uppnå en slutlig enzymkoncentration av 300 ^ g / ml och en slutlig volym av 4 ml. Pipett blandningen upp och ned försiktigt eller vänd röret för att lösa det fasta materialet.
- Inkubera reaktionen vid 70 ° C med skakning vid 300 varv per minut under en timme, sedan placera röret på is för att svalna.
3. Rening av trehalos analoger från rå enzymatisk reaktion Blandning
- Förspolning en centrifugal filterenhet (nominell molekylviktsgräns (NWML) 10 kDa) för att avlägsna spår glycerol i membranet genom att tillsätta 3 ml avjoniserat vatten till centrifugal filterenheten och centrifugering vid 3000 x g till dess att all vätska passerar genom filtretin i röret (ca 20 min). Upprepa ytterligare två gånger. Fullborda detta steg omedelbart före eller under reaktionen (steg 2,3).
- Efter kylning av den enzymatiska reaktionsblandningen (erhållen från steg 2,3), överför det till pre-sköljdes centrifugal filterenhet. Skölj reaktionsröret med 1 ml avjoniserat vatten och överföring till centrifugal filterenhet. Upprepa sköljning av reaktionsröret för maximal återvinning av produkten.
- Centrifugera centrifugal filterenhet vid 3000 x g till dess att all vätska passerar genom filtret in i röret (ca 20 min). Skölj den övre kammaren av centrifugal filterenhet med 3 ml avjoniserat vatten och centrifugera vid 3000 xg tills all vätska passerar genom filtret in i röret (ca 20 min). Upprepa sköljningen för maximal återvinning av produkten.
- Kasta den övre kammaren av centrifugfilterenheten. Lägga blandad bädd jonbytarharts (3 g) till filtratet vid botten av röret (typiskt filtrat volume är 8-15 ml beroende på antalet sköljningar). Rör om vid rumstemperatur under 1 timme med en magnetisk omrörarstav vid en hastighet tillräcklig för att hålla hartspärlorna suspenderade i lösningen.
- Dekantera supernatanten och filtrera den för att avlägsna hartset. Tillsätt 5 ml avjoniserat vatten för att skölja den återstående harts. Dekantera supernatanten och filtrera den, att kombinera den med produktlösningen från den första dekantering. Upprepa sköljning av hartset för maximal återvinning av produkten.
- Analysera reaktionen genom tunnskiktskromatografi (TLC) eller HPLC för att bestämma om fullständig omvandling av glukos analoga utgångsmaterial till trehalos analoga produkten uppnåddes. Se steg 4,1 för TLC-analys och steg 4,2 för HPLC-analys.
- Avlägsna vatten genom lyofilisering eller roterande indunstning för att ge den torkade produkten. Om ingen oreagerad glukos analog observerades under TLC eller HPLC-analys, är rening genom kromatografi onödig. Väg produkten för att erhålla reaktions Yield och utför kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopianalys (steg 4,3) för att bekräfta produktens struktur och renhet.
- Om oreagerad glukos analog observerades under TLC-analys, separera den från trehalos analog med användning av en storleksuteslutningskolonn.
- Bered en 1 x 100 cm kolonn innehållande avjoniserat vattenmättade, extra fin P2 polyakrylamid pärla storlek uteslutningsmedium enligt tillverkarens anvisningar.
OBS! Storleksuteslutningskolonn kan återanvändas efter tvättning med avjoniserat vatten. - Åter upplösa den torkade enzymatiska reaktionsprodukten (erhållen från steg 3,7) i 0,5 ml avjoniserat vatten. Applicera produkten lösningen på storleksuteslutningskolonn manuellt eller med användning av en kolonn flödesadapter. Skölj flaskan som innehöll råprodukten med ytterligare 0,5 ml avjoniserat vatten, och lägger det i storleksuteslutningskolonn.
- Eluera produkten med avjoniserat vatten genom gravitationsflöde och samla fraktioner av ungefär 2 mL volym.
- Analysera fraktionerna med TLC (steg 4,1). Pool fraktionerna innehållande ren trehalos-analog.
- Avlägsna vatten genom lyofilisering eller roterande indunstning för att ge den torkade produkten. Väg den produkt för erhållande av reaktionsutbytet och fortsätt till NMR-analys (se steg 4.3).
- Bered en 1 x 100 cm kolonn innehållande avjoniserat vattenmättade, extra fin P2 polyakrylamid pärla storlek uteslutningsmedium enligt tillverkarens anvisningar.
4. Analys av trehalos Analoga produkter
- Utföra tunnskiktskromatografi (TLC) -analys av tRet reaktion.
OBS: Detta förfarande kan även användas för att analysera storleksuteslutningskolonn fraktioner. Det kan vara nödvändigt att koncentrera reaktionsblandningen eller kolonnfraktioner före TLC-analys för att observera förening färgning på TLC-plattan.- Mark körfält på TLC-plattan yta med en blyertspenna och tillämpa analyt (er) och relevant standard (s) till lämpliga körfält, inklusive glukosanalogen standard, trehalos analoga standard (i förekommande fall), reaktionsblandningen (eller fraktioner som samlats in från storlek exclusion kolonnrening), och en co-plats. Efter applicering varje prov till TLC-plattan, låt plattan torka.
OBS: För reaktionsanalys, typiskt 2 mikroliter av provet som appliceras på TLC-plattan. - Utveckla TLC-plattan med användning av n-butanol / etanol / avjoniserat vatten (5: 3: 2).
- Torka den framkallade TLC-plattan och sedan doppa den i 5% H 2 SO 4 i etanol (socker fläck) och värm på en värmeplatta på hög inställning tills sockerinnehållande fläckar kan visualiseras (typiskt 5 minuter).
- Mark körfält på TLC-plattan yta med en blyertspenna och tillämpa analyt (er) och relevant standard (s) till lämpliga körfält, inklusive glukosanalogen standard, trehalos analoga standard (i förekommande fall), reaktionsblandningen (eller fraktioner som samlats in från storlek exclusion kolonnrening), och en co-plats. Efter applicering varje prov till TLC-plattan, låt plattan torka.
- Utför HPLC-analys av tret reaktionsblandningar med hjälp av någon HPLC-system som kan separera och detektera kolhydrater. Detta protokoll innebär kolhydrat separation med hjälp av en aminopropyl HPLC-kolonn och detektion med hjälp av brytningsindex.
- Fästa aminopropyl kolonn (4,6 x 250 mm) innehållande en pre-skyddskolonn till HPLC.
- Jämvikta aminopropyl kolonnen med 80% acetonitril i avjoniserat vatten vid en flödeshastighet av 0,4ml / min.
- Fyll lösningen av reaktionsprodukten (eller standard) på aminopropyl kolonnen.
- Eluera produkten (eller standard) med 80% acetonitril i avjoniserat vatten vid en flödeshastighet av 0,4 ml / min och en kolonntemperatur av 50 ° C. Typiskt är körtiden som används är 40 min.
OBS: Både glukosanalogen utgångsmaterialet och trehalos analoga produkten kan detekteras genom brytningsindex, även om andra metoder såsom evaporativ Ijusspridnings-detektering (ELSD) skulle kunna användas. Användning av de betingelser som beskrivits, glukos analoger eluera vanligtvis mellan 10-15 min och trehalos analoger eluerar mellan 15-25 minuter.
- NMR-analys av renade trehalos analoger.
- Lös renat trehalos analog i D2O (700 mikroliter) och överför lösningen till ett NMR-rör.
- Förvärva en H och 13C NMR-spektra i enlighet med lämpliga NMR anläggningsprotokoll.
- Syntetisera, rena och administrera 6-TreAz till M. smegmatis (Msmeg).
- Lägga 6-azido-6-deoxi glukopyranos (6-GlcAz, 0,020 mmol, 4,1 mg), UDP-glukos (0,040 mmol, 24,4 mg) och MgCl2 (0,020 mmol, 4,1 mg) till en 15 ml koniska rör.
- Lägga tRet i Tris-buffert (erhållen från steg 1.5.4) för att uppnå en slutlig enzymkoncentration av 300 ^ g / ml och en slutlig volym av 1 ml. Pipett blandningen upp och ned försiktigt eller vänd röret för att lösa det fasta materialet.
- Inkubera reaktionen vid 70 ° C med skakning under 15 min.
- Späd den enzymatiska reaktionsblandningen med 3 ml avjoniserat vatten och överföra den till en förtvättad centrifugal filterenhet (NMWL 10 kDa). Centrifugera filterenheten vid 3000 xg tills det mesta av vätskan passerar genom filtret in i röret, ca 10 min.
- Släng the övre kammare centrifugfilterenheten. Lägga blandad bädd jonbytarharts (0,75 g) till röret och rör om / skaka vid rumstemperatur i 25 min. Dekantera supernatanten och filtrera den för att avlägsna hartset.
OBS: Steps 5.1.1-5.1.5 tillhandahålla en vattenhaltig lösning av 6-azido-trehalos (6-TreAz) vid ca 5 mM koncentration på mindre än en timme. 5 mM koncentration beräknas baserat på den kvantitativa omvandlingen av substrat till produkt och den utspädning som äger rum under reningsstegen, förutsatt minimal förlust av produkt under dessa steg. Lösningen kan vara sterilfiltreras före tillsats till ett biologiskt prov om så önskas. - Tillsätt en lämplig mängd av 6-TreAz produktlösningen till en log-fas kultur M. smegmatis (Msmeg), typiskt för att uppnå en slutlig odlingsvolym 100-1000 mikroliter och en slutlig 6-TreAz koncentration av ~ 25 | iM. Inkubera cellerna vid 37 ° C under den önskade mängden tid, typiskt 60 min.
- Utföra klicka kemi för att konjugera en fluorofor till azid-märkta celler. I detta protokoll använder Cu-katalyserade azid-alkyn cykloaddition (CuAAC) för att leverera en fluorofor till cellytan azider i Msmeg.
- Centrifugera cellerna vid 3900 xg under 5 min, och sedan tvätta cellerna med PBS innehållande 0,5% bovint serumalbumin. Upprepa två gånger.
- Åter suspendera pelleterade cellerna i 4% para-formaldehyd i PBS för att åtgärda dem. Efter inkubation under 10 minuter, upprepa steg 5.2.1 att tvätta cellerna.
- Återsuspendera pelleterade celler i 138 mikroliter PBS.
- Tillsätt 3 mikroliter av en 1 mM stamlösning av alkyn-karboxirodamin 110 (alkyn-488) i DMSO.
- Lägg 3 mikroliter av en nyframställd 60 mM stamlösning av natrium-askorbat i avjoniserat vatten.
- Lägg 3 mikroliter av en 6,4 mM stamlösning av tris [(1-bensyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) metyl] amin (TBTA) i tert-butanol / dimetylsulfoxid (DMSO) 4: 1.
- Tillsätt 3 & #956; L av en 50 mM stamlösning av CUSO4 i avjoniserat vatten.
- Pipettera cellsuspensionen upp och ner, sedan inkubera i mörker vid rumstemperatur under 30 min.
- Upprepa steg 5.2.1 att tvätta cellerna. Återsuspendera cellerna i 150 mikroliter PBS.
- Utföra cellulär fluorescensanalys. I detta protokoll använder fluorescensmikroskopi att visualisera cellulära fluorescens märkt Msmeg.
- Tillsätt 10 mikroliter av bakterieceller suspenderade i PBS till ett objektglas och lätt sprida vätskan i ett tunt skikt med hjälp av kanten av ett täckglas. Låt lufttorka i mörker.
- Tillsätt 10 mikroliter av monteringsmedium över det torkade provet, sedan placera täckglas över provet och applicera lim (t.ex. nagellack) för att immobilisera.
- Bild bilderna med hjälp av ett fluorescensmikroskop vid 100X förstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
T. tenax tRet erhölls från E. coli i ett utbyte av ca 4 mg / L med användning av standardproteinexpressions och reningstekniker. En enda nickel-affinitetskromatografi steg var tillräcklig för att rena tRet från E. coli-lysat (en representativ FPLC kontur visas i figur 4). Som fastställs i vår första offentliggörandet på syntesförfarandet tret, är rekombinant T. tenax tret kan omvandla en bred variation glukos analoger-varav många är kommersiellt tillgängliga till motsvarande trehalos analoger med hög verkningsgrad 19. Tabell 1, vilket ger HPLC-bestämd reaktionsutbyten för ett antal utgångsglukos analoger med hjälp av vår initialt protokoll, visar omfattningen av tret substrat promiskuitet och dess lämplighet för syntes. Olikartade strukturella förändringar, inklusive fluoro-, deoxi-, azido-,tio- och stereokemiska förändringar i olika positioner runt sockerringen är väl tolereras av enzymet av vild typ, med det främsta undantaget är ombyggnadsarbeten vid 4-positionen.
Figur 4: Representativa resultat för tRet rening genom FPLC. Rening av rekombinant T. tenax tRet från E. coli-lysat utfördes med användning av nickel-affinitetskromatografi såsom beskrivs i steg 1.4.1-1.4.4. Blå, ultraviolett (UV) absorbans spår; ljusgrön, koncentration av elueringsbuffert; mörkgrön, tryck. Den topp som motsvarar tRet indikeras med en pil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Representativ avkastning för tRet reaktionen. HPLC-bestämd och isolerade utbyten av tret reaktion i flera trehalos analoger. ND, inte upptäcks. - Indikerar reaktionen inte utförs på en semi-preparativ skala med användning av optimerat protokoll. * Anger att en gelkromatografi steg krävdes. Horisontella skiljelinjer separera position ändring på trehalos sockerringen. Tabell anpassat från referens 19 med tillstånd; uppdaterats med isolerade utbyten från detta arbete. Klicka här för att ladda ner filen.
Häri rapporterar vi optimeringar till vår ursprungliga protokoll som förbättrar den totala effektiviteten och hastigheten hos syntesprocessen tret. Medan det ursprungliga protokollet som används 10 mM glukos enalogue och 40 mM UDP-glukos, bestämdes det att jämförbar omvandling kan erhållas med användning av 20 mM glukos och 40 mM UDP-glukos, effektivt fördubbla mängden produkt som genereras per reaktion och begränsa slöseri med UDP-glukos, som är relativt dyr . Användning av ekvimolära mängder av glukos analoga och UDP-glukos resulterade i lägre omvandlingar. Om så önskas kan reaktionstider också förkortas till mindre än initialt 60 min och ändå behålla jämförbar omvandling för många analoger, som visades av den kvantitativa omvandlingen av 6-GlcAz till 6-TreAz i endast 15 minuter vid 70 ° C ( Figurerna 5 och 6).
Reningsprotokollet som rapporteras häri är väsentligt förbättrad, som ersätter den ursprungliga enzym utfällning / silikagelkromatografi metod med en icke-kromatografisk centrifuge dialys / jonbyte metod. Skälet till denna ändring är att tret reaction blandning består helt och hållet av joniska arter utom för den neutrala trehalos analog produkt. Därför kan blandningen vara spinn-dialyserades för att avlägsna enzym och behandlades sedan med blandad bädd jonbytarharts för att avlägsna alla jonslag, vilket ger renat trehalos analogen i vattenlösning i så lite som 45 min. Denna all vattenhaltig reningsmetod undviker miljöskadliga organiska lösningsmedel, tidskrävande indunstnings- och filtreringssteg, och torrlast silikagelkromatografi, vilket är en långsam och besvärlig process, i synnerhet för icke-kemister. För tRet reaktioner som uppvisar kvantitativ omvandling såsom bestämdes med användning av den beskrivna TLC eller HPLC-analyser, ger denna reningsmetod isolerade utbyten om ca 60 till 80% vid den rapporterade reaktionsskalan, med produktförlust sannolikt på grund av bindning av vissa socker till jonbyte harts (se tabell 1 för representativa isolerade utbyten). I de fall där oreagerad glukosanalogen fortfarande,det kan separeras från den önskade trehalos analog produkt med användning av en polyakrylamid pärl-baserade storleksuteslutningskolonn, under eluering med vatten. Om så föredras, detta kan också åstadkommas genom användning av preparativ skala HPLC med en aminopropyl-kolonn. Produktrenhet kan bedömas genom TLC, HPLC och / eller NMR-spektroskopisk analys. Figur 5 visar representativa analytiska data för sex-TreAz, som syntetiserades via beskrivna protokollet. TLC och HPLC-data indikerade kvantitativ omvandling av 6-GlcAz substrat till 6-TreAz produkt för denna reaktion, och det isolerade utbytet efter de spin dialysis / jonbyte reningssteg var 58%. Ett H och 13 C-NMR-spektroskopisk analys bekräftade strukturen hos den sex-TreAz produkt, notably inklusive α, α-stereokemin hos den nybildade glykosidbindningen, samt dess renhet.
Figur 5: Representativa analytiska data för det tRet reaktionen. (A) TLC och (B) HPLC-analys av tRet-katalyserad omvandling av 6-GlcAz till 6-TreAz. (C) en H NMR och (D) 13 C-NMR-spektra av 6-TreAz produkt som erhålls efter centrifuge dialys / jonbyte rening. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Med tanke på det ovan nämnda värdet av trehalos analoger för specifik detektion av M. tuberculosis, bör tRet processen underlätta utvecklingen och användningen av trehalos-baserade prober för forskning tuberkulos och diagnostiska tillämpningar. För att demonstrera denna typ av applikation, använde vi den optimerade tRetprocess för att snabbt framställa, rena och administrera 6-TreAz-en trehalos-baserad klick kemi sonden 9 -till mykobakterier för att möjliggöra fluorescensdetektering (arbetsflöde och representativa data visas i figur 6). I korthet sattes tRet används för att omvandla kommersiella 6-GlcAz till 6-TreAz kvantitativt i 15 min, varefter reaktionsblandningen fick genomgå centrifugeringsdialys / jonbyte reningsmetod, som tog endast 45 min (flera sköljningssteg utelämnades för att öka fart). Sålunda erhölls en vattenhaltig förrådslösning av ren 6-TreAz av känd koncentration (~ 5 mM) alstras i endast en timme. Den 6-TreAz lager blev omedelbart administreras till en växande kultur av modell bakterien Msmeg (slutlig 6-TreAz koncentration ~ 25 pM) för att åstadkomma azid märkning av cellytan, vilket inbäddade ett handtag för klick kemi-medierad ligering 20, 21 av en fluorescerande sond. Senare,märkta cellerna analyserades med fluorescensmikroskopi, vilket visade stark fluorescens för 6-TreAz-behandlade celler. Som väntat prover kontroll som inte behandlades med 6-TreAz eller att de saknade en funktionell trehalos transportör 22, som krävs för 6-TreAz upptag och metabolisk inkorporering 9, visade ingen fluorescens.
Figur 6: representativa resultat för snabb detektion av mykobakterier med hjälp av en tret syntetiserade trehalos analog. (A) arbetsflöde för snabb syntes, rening, och användning av 6-TreAz för fluorescensdetektion av Msmeg. Steg 5.1.1-5.1.6 av protokollet användes för att syntetisera och rena 6-TreAz (vilket ger en ~ 5 mM vattenlösning i 1 timme) och sedan administrera det att leva Msmeg att åstadkomma metabolisk märkning av cellytan med azider. Nästa, som beskrivs i steg 5.2.1-5.2.9, klicka kemi (CuAAC) utfördes för att reagera på cellytan azider med en alkyn-modifierad fluorofor, alkyn-488. (B) Fluorescens avbildning av 6-TreAz-behandlade Msmeg innehållande en funktionell trehalos transportör (vildtyp och Δ sugC :: sugC) visade stark fluorescens, medan kontrollprover av Msmeg lämnas obehandlade eller som saknar trehalos transportör (Δ sugC) inte gjorde det . Figur anpassad från referens 19 med tillstånd; uppdateras med arbetsflöden och bilddata från den förbättrade tRet protokollet. Skalstrecken, 5 ^ M. Snälla duklicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trehalos analoger har potential att påverka olika områden, från konservering av livsmedel och läkemedel till diagnos och behandling av mikrobiella infektioner 6. Befintliga flerstegs kemiska syntesmetoder är användbara för att framställa komplexa trehalos analoger med flera webbplatser för modifiering (t.ex., naturligt förekommande komplexa mykobakteriella glykolipider). Men dessa metoder är undantagslöst långdragen och ineffektiv, även när den tillämpas på syntesen av jämförelsevis enkla monosubstituerade trehalos analoger 9, 13, 14. Alternativa syntetiska metoder behövs för att snabbt och effektivt producera olika typer av trehalos-analoger som kan ha värde i ovan nämnda områden. Biokatalytiska metoder som utnyttjar trehalos-syntes enzymer från naturen håller mest lovande. Även om flera trehalos-syntetiserande vägarförekommer i naturen, anser vi tret från T. tenax 18 vara den idealiska enzymet för trehalos analog syntes av flera skäl.
TRet från T. Tenax är termostabilt, vilket gör att reaktioner som skall värmas för förbättrad hastighet och för förhindrande av mikrobiell kontaminering i storskaliga produktionsinställningar. TRet från T. tenax är en enkelriktad enzym som inte har förmåga att bryta ned trehalos. Tret från T. Tenax är mottaglig för uttryck och rening från E. coli, och dess transport och lagring är enkel. Den tret reaktion är ett enda steg och det handlar om enkla substrat glukos och UDP-glukos. Ett stort antal strukturellt / funktionellt olika glukos analoger är tillgängliga från ett flertal kommersiella leverantörer. UDP-glukos är ett relativt billigt glukos donator, särskilt i jämförelse med den TREP donator β-D-glukos 1-fosfat. Tret från T. tenax har hög promiscuity för glukossubstratstrukturen, så olika trehalos analoger är tillgängliga. Produktrening från tRet reaktionsblandningen är snabb och enkel.
Häri rapporterade vi en detaljerad optimerat protokoll för trehalos analog syntes som kapitaliserar på ovanstående positiva attribut tRet enzymet. Den tret processen kan användas för att få tillgång till en mängd av rena trehalos analoger på en semipreparativ skala (10-100 mg), men ytterligare uppskalning bör vara möjlig om så önskas. Många typer av analoger nås i vår tidigare och nuvarande arbete, inklusive azido-, deoxi-, fluoro-, och tio-trehaloses, liksom trehalos stereoisomerer, men andra modifikationer kommer också att vara möjligt (t.ex. stabil isotopmärkt och radiomärkt trehaloses är av särskilt intresse). Syntes och reningssteg i tret processen är operativt enkel och kan lätt utföras av personal som inte är utbildade i syntetisk chemistry. En av de mest attraktiva funktioner i tRet processen är att både syntes- och reningssteg kan utföras i en mycket kort tidsperiod, som sträcker sig från 1-4 timmar beroende på antalet tvättningssteg önskas (notera: om storleksuteslutningskolonn det krävs rening för att separera trehalos analoga produkten från oreagerat glukosanalogen, ökar detta den totala tiden till ca 2 dagar, vilket fortfarande är avsevärt snabbare än befintliga metoder för trehalos analog syntes).
Även om tret processen är det mest effektiva enzymatiska vägen till åtkomst trehalos analoger rapporterats ännu, har det vissa nackdelar som ger möjlighet till framtida förbättringar. Först, även om UDP-glukos är relativt billigt jämfört med andra sockerdonatorer, effektiviteten i tRet process kan förbättras ytterligare genom att koppla den med en enzymatisk syntes av UDP-glukos från en billigare källa, t.ex., α-D-glukos 1- fosfat, eller genom identifying en billig ersättning för UDP-glukos. En andra potentiell begränsning av denna metod är att reaktionen omfattning slutligen styrs av substratet tolerans av tRet. Medan toleransen hos vildtyp tRet är ganska hög (se tabell 1), kan vissa analoger inte syntetiseras med användning av denna metod (t.ex. 4-ställning-modifierade analoger). Därför kommer modifierade versioner av tret med ökad substrattolerans vara värdefullt. För det tredje, medan många tRet katalyserade reaktioner fortsätta med kvantitativ omvandling, kräver lägre omvandlings ett kromatografiskt reningssteg. I detta protokoll har vi fokuserat på att använda en relativt långsam storleksuteslutningsprocess eftersom det är billigt, kräver ingen specialutrustning, och kan utföras enbart med vatten eluering. Alternativt skulle HPLC-rening med användning av en preparativ skala aminopropyl kolonn användas som en snabbare metod för produktrening. Trots vissa av dessa begränsningar ger tRet processenen kraftfull plattform för snabb och effektiv framställning av trehalos-analoger, och borde påskynda utvärderingen av dessa och tillämpning i bio (techno) logiska och biomedicinska områden. Framtida förbättringar av tret processen, som diskuterats ovan, kommer att ytterligare stärka forskning och ansökningar avseende trehalos och dess derivat.
Trehalos analoger har potentiellt värde inom olika områden. Som nämnts i inledningen, är naturligt trehalos används för biokonservering och mat sötningsmedel applikationer, så trehalos analoger med egenskaper såsom motstånd nedbrytning kan vara attraktiv. Dessutom har en mängd av stabila isotopmärkta och radiomärkta versioner av naturliga trehalos är kommersiellt tillgängliga för forskningsändamål, och tret processen kan säkert ge snabb och effektiv tillgång till dessa molekyler. Trehalos analoger är också av intresse för inriktning patogener med sonder och inhibitorer eftersom trehalos är frånvarande från däggdjur. en aplämpningen på detta område som är av särskilt intresse är detektion av mykobakterier. M. tuberculosis, vilka smittämnen av tuberkulos, som dödar 1,5 miljoner människor per år, innehåller unika trehalos bearbetningsvägar som är frånvarande från däggdjur. Till exempel trehalos-återvinning transportören och nedströms enzymer som innehåller trehalos i yttre membran bosatt glykolipider är inte närvarande i däggdjur 22. Targeting denna mykobakterier specifika maskiner med detekterbara trehalos analoger representerar en attraktiv metod för in vivo-avbildning av M. tuberculosis-infektion i modellsystem och eventuellt humanpatienter. I själva verket har de ovanstående exemplen på FITC-keto-trehalos och TreAz (Figur 1B) har banat väg för en sådan utveckling 8, 9. För att underlätta tillgången av dessa verktyg till forskarsamhället, rapporterade vi här ett protokoll för att snabbt synthesizning och med användning av 6-TreAz till bild mykobakterier i kombination med klickkemi.
Detta protokoll kan anpassas för att utveckla andra detekterbara trehalos analoger som kan vara användbara för tuberkulos diagnostiska tillämpningar. Till exempel, Barry och Davis först föreslog den möjliga användningen av 18 F-fluor-trehalos som ett positronemissionstomografi (PET) sond för in vivo-avbildning av mykobakteriell infektion 8. Den tret process kan vara perfekt för att förverkliga detta mål. TRet har förmåga att snabbt och kvantitativt alstra 2-fluor-trehalos från 2-fluor-glukos (se tabell 1), som är kritisk, eftersom 18 F-2-fluor-glukos är kortlivad (18 F halveringstid = 110 min ), vilket nödvändiggör extremt snabb kemi. Vidare är lätt tillgänglig 18 F-2-fluor-glukos eftersom det redan används i kliniken för PET-avbildning av tumörer. Användning av den beskrivna tRet process för deveckling av 18 F-fluor-trehalos och andra trehalos analoger för olika applikationer pågår i våra laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB agar | Research Products International | L24021 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| Luria broth | Research Products International | L24045 | |
| Terrific Broth | Research Products International | T15050 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A3256 | |
| Phosphate-buffered Saline | GE Healthcare | SH30256 | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | I5513 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | S374 | |
| Syringe filter, 0.45 µm | Fisher Scientific | 09719D | |
| Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free | Thermo Scientific | 88666 | |
| HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| TRIS base ultrapure | Research Products International | T60040 | |
| Dialysis tubing, MWCO 12–14,000 | Fisher Scientific | 21-152-16 | |
| Glucose analogues | CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals | Examples of vendors that offer numerous glucose analogues | |
| 6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz) | CarboSynth | MA02620 | |
| UDP-Glucose | abcam Biochemicals | ab120384 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher Scientific | M33 | |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit | EMD Millipore | UFC901008 | |
| Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin | Bio-Rad | 444-9999 | |
| Extra-Fine Bio-Gel P2 media | Bio-Rad | 150-4118 | |
| Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates | EMD Millipore | 1056280001 | |
| n-Butanol | Fisher Scientific | A399 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | S25310A | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145 | |
| Deuterium oxide, 99.8% | Acros Organics | 351430075 | |
| Aminopropyl HPLC column | Sigma Aldrich | 58338 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Para-formaldehyde | Ted Pella | 18505 | |
| Alkyne-488 | Sigma Aldrich | 761621 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Click Chemistry Tools | 1061 | |
| tert-Butanol | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | W387520 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotechnology | 10001 |
References
- Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology. 13, 17-27 (2003).
- Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions. PLoS Pathog. 9, 1003447 (2013).
- Ohtake, S., Wang, Y. J. Trehalose: Current use and future applications. J. Pharm. Sci. 100, 2020-2053 (2011).
- Adams, R. P., Kendall, E., Kartha, K. K. Comparison of free sugars in growing and desiccated plants of Selaginella lepidophylla. Biochem. Syst. Ecol. 18, 107-110 (1990).
- Kubota, M. Glycoenzymes. Ohnishi, M. , Japan Scientific Societies Press. (2000).
- Walmagh, M., Zhao, R., Desmet, T. Trehalose analogues: latest insights in properties and biocatalytic production. Int. J. Mol. Sci. 16, 13729-13745 (2015).
- Kim, H. -M., Chang, Y. -K., Ryu, S. -I., Moon, S. -G., Lee, S. -B. Enzymatic synthesis of a galactose-containing trehalose analogue disaccharide by Pyrococcus horikoshii trehalose-synthesizing glycosyltransferase: Inhibitory effects on several disaccharidase activities. J. Mol. Catal. B: Enzym. 49, 98-103 (2007).
- Backus, K. M., et al. Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis. Nat. Chem. Biol. 7, 228-235 (2011).
- Swarts, B. M., et al. Probing the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry. J. Am. Chem. Soc. 134, 16123-16126 (2012).
- Rose, J. D., et al. Synthesis and biological evaluation of trehalose analogs as potential inhibitors of mycobacterial cell wall biosynthesis. Carbohydr. Res. 337, 105-120 (2002).
- Wang, J., et al. Synthesis of trehalose-based compounds and their inhibitory activities against Mycobacterium smegmatis. Bioorg. Med. Chem. 12, 6397-6413 (2004).
- Gobec, S., et al. Design, synthesis, biochemical evaluation and antimycobacterial action of phosphonate inhibitors of antigen 85C, a crucial enzyme involved in biosynthesis of the mycobacterial cell wall. Eur. J. Med. Chem. 42, 54-63 (2007).
- Sarpe, V. A., Kulkarni, S. S. Regioselective protection and functionalization of trehalose. Trends in Carbohydr. Res. 5, 8-33 (2013).
- Chaube, M. A., Kulkarni, S. S. Stereoselective construction of 1,1-alpha,alpha-glycosidic bonds. Trends in Carbohydr. Res. 4, 1-19 (2013).
- Leigh, C. D., Bertozzi, C. R. Synthetic studies toward Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-I. J. Org. Chem. 73, 1008-1017 (2008).
- Chaen, H., et al. Efficient enzymatic synthesis of disaccharide, alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside, by trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii. J. Appl. Glycosci. 48, 135-137 (2001).
- Vander Borght, J., Soetaert, W., Desmet, T. Engineering the acceptor specificity of trehalose phosphorylase for the production of trehalose analogs. Biotechnol. Progr. 28, 1257-1262 (2012).
- Kouril, T., Zaparty, M., Marrero, J., Brinkmann, H., Siebers, B. A novel trehalose synthesizing pathway in the hyperthermophilic Crenarchaeon Thermoproteus tenax: the unidirectional TreT pathway. Arch. Microbiol. 190, 355-369 (2008).
- Urbanek, B. L., et al. Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria. ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).
