Introduction
Ограничение текущего лечения ВИЧ-1 является то, что они должны быть хронически введены, чтобы предотвратить прогрессирование заболевания. Пересадка ВИЧ-1 , резистентных Т - лимфоцит или гемопоэтических стволовых клеток, имеет потенциал для обеспечения долгосрочного контроля репликации ВИЧ-1 в отсутствие лекарственной терапии 1,2 , а также может быть эффективным подходом к достижению ВИЧ-1 - лекарство 3. Один из способов визуализации клеток , устойчивых к репликации ВИЧ-1, чтобы вставить один или несколько генов , кодирующих анти-ВИЧ-1 РНК или пептидов в клетки зараженного человека во время аутогенной трансплантации 4. Гены Несколько кандидатом анти-ВИЧ-1 были разработаны с учетом некоторых в клинических случаях, в комбинации из двух или трех 5 6, чтобы предотвратить развитие ВИЧ-1 , устойчивость к любым одним геном.
Анти-ВИЧ-1 РНК входят в число кандидатов для генной терапии комбинацией из-за их низкого потенциала, чтобы вызывать иммунный ответ и потому что онитранскрибируются с очень коротких последовательностей генов. Некоторые анти-ВИЧ-1 РНК были разработаны, чтобы предназначаться проникновение вируса и интеграции. Тем не менее, большинство анти-ВИЧ-1 РНК целевых шагов после интеграции в жизненном цикле вируса (рисунок 1). Ингибиторы после интеграции включают приманка РНК, нацеливание ВИЧ-1 регуляторные белки Tat или Rev 1, и антисмыслового на основе РНК, ориентированных на различные сайты в РНК ВИЧ-1, такие как рибозимы , 7, 8 и shRNAs U1i РНК 9. Методы , которые были использованы для сравнения эффективности анти-ВИЧ-1 РНК включает мониторинг вирусной репликации в клетках , трансдуцированных гены , кодирующие кандидатов РНК и измерения вирусного производства в клетках временно трансфицированных плазмидами , экспрессирующими кандидатских РНК и экспрессионной плазмиды ВИЧ-1 10 -13. Ранее мы использовали производственный анализ на ВИЧ-1 для скрининга РНК ВИЧ-1 для новых сайтов - мишеней рибозима 13-15. Эти методы, так как были усовершенствованы с целью оптимизации формата РНКмолекулы интерференции , экспрессированный из плазмиды ДНК в качестве shRNA или поставляется в виде синтетического миРНК 16. Анализ измеряет производство зрелых вирусов из эмбриональной почки (НЕК) 293Т клеток человека, и может быть использовано для сравнения эффектов ингибиторов , которые нацелены на шаги после интеграции в цикле репликации ВИЧ-1 (фигура 1). Для ингибиторов , которые нацелены на стадии предварительной интеграции, альтернативные анализы , такие как TZM-бл клеток инфективности 17 необходимы для оценки противовирусной эффективности.
Основные проблемы безопасности для доставки анти-ВИЧ-1 РНК в клинике включают потенциальные эффекты вне цели на человека РНК или белков, а также активации врожденного иммунитета датчиков. Для оценки токсичности анти-ВИЧ-1 киРНК, мы использовали анализ на жизнеспособность клеток в различных клеточных линиях 16. Мы также измерили активацию двухцепочечных иммунных датчиков РНК, РНК-активированная протеинкиназа R (PKR) и Toll подобные рецепторы 3 (TLR3), а также эксприжимное интерферона стимулируется гена, ADAR1 P150. Эти анализы могут быть использованы для подтверждения того, что эффективность анти-ВИЧ-1 РНК не из-за косвенного воздействия на жизнеспособность клеток или активации иммунной датчика. Они также полезны в исключении кандидатов в РНК с потенциальными токсичностью от дальнейшего развития.
В следующих протоколов, процедур для выявления новых терапевтических РНК и оптимизировать формат существующих описаны. Эти методы полезны для скрининга РНК на основе ингибиторов пост-интеграционным репликации ВИЧ-1 и может быть адаптирована для скрининга других ингибиторов после интеграции, такие как малые молекулы , направленных Rev опосредованного экспорта вирусной РНК 18 или CRISPR / Системы Cas , предназначенные для целевой интегрированной ДНК ВИЧ-1 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клетки и Трансфекция
- Культура НЕК 293T клеток в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина. Приготовить 2 х 10 5 клеток / мл суспензии в клеточной культуральной среде. Добавить 500, 100 и 1000 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночного, 96-луночные и 12-луночные планшеты, для вирусного производства, жизнеспособности клеток и анализом активации иммунной системы , соответственно (рис 2А).
- Аккуратно водоворот пластин и инкубировать их O / N при 37 ° С с 5% CO 2. Рост клеток на 50-70% сплошности.
- Согласно плану трансфекции, подготовить разведений тест - РНК и их контроля в 1,5 мл микро трубок (например, рис 2B).
- Для вирусного анализа производства, подготовить 10 нг / мкл разведения плазмиды экспрессии ВИЧ-1 и добавляют по 10 мкл в каждую пробирку. Затем готовят 5 мкМ разведений тест-РНК и отрицательный контроль RNA. Добавление 2,5 или 10 мкл каждого тест-РНК и отрицательного контроля разбавления в соответствующие пробирки в течение 25 или 100 нм конечной концентрации.
- Для анализа жизнеспособности клеток, получением раствора 5 мкМ разведений тест-РНК и 10 мг / мл разбавление положительной контрольной РНК, с низкой молекулярной массой поли I А: С. Добавляют 2 мкл тест-РНК или положительных разведений контроль РНК в соответствующие пробирки для 100 нм или 200 мкг / мл конечной концентрации, соответственно.
- Для анализа активации иммунной системы, добавляют 20 мкл тест-РНК или РНК-положительных контрольных разведений, полученных на этапе 1.3.2. в соответствующие пробирки для 100 нм или 200 мкг / мл конечные концентрации соответственно.
Примечание: Для получения плазмид экспрессии РНК-тестирование, подготовить 10 нг / мкл разведений вместо 5 мкМ разведений тест-РНК, что дает конечные объемы 25 и 100 нг в течение шага 1.3.1. и 100 нг для шагов 1.3.2. и 1.3.3.
- Добавьте 50, 25 или 75 мкл DMEM в каждую пробирку для трансфекции вирусного продед ен ие, жизнеспособность клеток и анализы активации иммунной системы, соответственно. Для вирусных анализов производства, довести клетки и подготовленные трансфекцию трубки к 3 (BSL3) лаборатории уровня биологической безопасности перед следующим этапом.
- Добавляют 2 мкл реагента последовательно трансфекция для трансфекции трубок и инкубировать от 15 до 20 мин, чтобы позволить комплексов с образованием. Смотрите таблицу материалов для конкретного реагента трансфекции для использования.
- Добавить всю смесь для трансфекции с каждой микротрубы по каплям к соответствующим положениям в культуре клеток пластин. Аккуратно вихревой и инкубировать пластин в течение 48 ч при 37 ° С с 5% CO 2.
- Мера ВИЧ-1 производства (раздел 2), жизнеспособность клеток (раздел 3) и активации иммунной системы (раздел 4) в клеточной культуре пластин (рис 2С).
2. Вирусный Анализ производства,
- Удалите 24-луночного культуре клеток пластины из инкубатора и осторожно встряхните пластины внутри культуры клеток BSL3капот. Перенести 150 мкл супернатанта из каждой лунки к соответствующему лунку в 96-луночных плоскодонных пластины, которая будет использоваться для количественного определения ВИЧ-1 производства.
Примечание: Обычные вирусные квантификации анализы включают измерение экспрессии белка капсида ВИЧ-1 (р24) с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) 20, количественной оценки вирусной РНК с помощью обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) 21 и измерения активности от ВИЧ-1 RT фермента. Шаги 2,2 до 2,5 объяснить методы для количественного определения транскриптазы ВИЧ-1 активность 13,15,16. - Передача 5 мкл супернатанта в соответствующие лунки в 96-луночный планшет, содержащий 25 мкл вирусного нарушение коктейль 15 (таблица 1). Выдержите смесь в течение 5 мин при комнатной температуре и передавать пластину на радиоактивной рабочей станции.
Примечание: Шаг 2.2. необходимо только если Радиоактивность рабочая станция не доступна в лаборатории BSL3. Если пластины не должны быть удалены изBSL3 лаборатория, перейдите к шагу 2.3. и добавить 50 мкл радиоактивного / вирусного разрушения коктейлем (таблица 1), вместо 25 мкл радиоактивного коктейля. - Приготовьте радиоактивный коктейль 15 (таблица 1), и добавляют по 25 мкл в каждую лунку вирусного супернатанта и разрушающий коктейль. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 2 часов.
- SPOT 5 мкл реакционной смеси на соответствующие квадраты в стеклянном волокне ди этиламино Этил (ДЭАЭ) Фильтермат бумаги и позволяют пятна высохнуть в течение 10 мин. Пятно реакционную смесь на любой другой площади, так что никакие два образца непосредственно не граничить друг друга. Это помогает избежать перекрестное между образцами при определении импульсов в минуту (СРМ) на шаге 2.6.
- Промыть бумаги 5x в течение 5 мин 2 раза солевым раствором цитрата натрия (SSC) буфере (таблица 1), а затем два 1 мин промывками 95% -ным этанолом. Разрешить бумаги, чтобы высушить и запечатать их в мешки образца.
- Клип пакеты с образцами соntaining в Фильтермат бумагу в кассету и вставьте кассету в сцинтилляционного счетчика для микропланшетов. Установить счетчик для чтения ОЭР 32 P с датой отсчета , предусмотренной для партии [32 P] дТТФ , используемого в эксперименте. Выберите, какие образцы для чтения с помощью карты пластины и запустить счетчик.
- Для любого вирусного метода количественной оценки, разделить значения, полученные для каждой тест-РНК с помощью соседнего отрицательного контроля и умножить это значение на 100, чтобы получить процент ингибирования ВИЧ-1 производства для каждой повторности из тестовых РНК. Пример результатов сравнения различных тестовых РНК при различных концентрациях обеспечивается на рисунке 3.
3. Жизнеспособность клеток Анализ
- Удалите 96-луночные планшеты из инкубатора и добавить 20 мкл 5 мг / мл МТТ (3- [4,5-диметил-2-тиазолил] -2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид), разбавленный в фосфатно-солевом буфере Дульбекко ( DPBS) в каждую лунку. Инкубируйте пластин Fили 3 ч при температуре 37 ° С.
- Добавьте 150 мкл изопропанола, подкисленного с моющим средством (1% NP-40, 4 мМ HCl в изопропаноле) в каждую лунку и инкубировать пластин в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Определить оптическую плотность при 570 нм в спектрофотометре для микропланшетов.
- Вычислить относительную MTT метаболизм для каждого положительного контроля и тест-РНК путем деления значения, полученного для каждого образца на его смежного управления трансфекцию. Пример результатов сравнения различных тестовых РНК и положительный контроль обеспечивается на рисунке 4.
4. Анализ активации иммунной системы
- Удалите 12-луночные планшеты из инкубатора и аспирата культуральной среды. Осторожно промыть клетки дважды с ДЗФР и добавить 70 мкл холодного буфера для лизиса 22 (включая протеазы и фосфатазы ингибиторы, таблица 1) в каждую лунку. Инкубируйте пластин в течение 10 мин на льду.
- Передача лизаты клеток микро трубок и быстро замораживают их, погрузивтрубки в жидком азоте. Разрешить образцы оттаивать и повторить еще 2 циклов замораживания-оттаивания в общей сложности 3.
- Центрифуга лизатов в течение 15 мин при 4 ° C, 15700 XG, для осаждения остатков клеток. Передача супернатант к новым микротрубок и определяют концентрацию белка с помощью метода 23,24 Кумасси синим (Bradford).
- Устранить 75 мкг белка из каждого образца в денатурирующем полиакриламидном геле , 10% и переносят на нитроцеллюлозную мембрану , как это описано ранее 25,26.
- После электрофореза и переноса на мембрану, показывают полосы белка путем инкубирования мембраны в Ponceau S (таблица 1) в течение 1 мин с последующим промыванием в дважды дистиллированной воде. Используйте полосы и белка лестницы в качестве ориентира, чтобы разрезать мембрану при 80 и 55 кДа.
Примечание: На этапе 4.4 Образцы могут быть запущены на 16 х 18 см 2 гели вниз до 34 кД, так что его легко разрезать мембрану в указанных точках и не прорезалполосы, представляющие интерес. В качестве альтернативы, некоторые гели могут работать с теми же образцами, чтобы избежать сокращения мембраны. - Промыть окрашивание Ponceau S с Трис-буферном солевом растворе , содержащем 0,05% Tween 20 (TBST, таблица 1). Добавить TBST с 5% молока обезжиренного, чтобы полностью покрыть мембраны. Инкубируйте мембраны при комнатной температуре при перемешивании в течение 1 ч.
- Инкубируйте мембраны O / N в TBST с 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА), и антитела, разбавленного до концентрации 1 в 1000 против ADAR1 (110 и 150 кДа), фосфо-PKR (62 кДа) и фосфо-IRF3 (47 кДа), для верхней, средней и нижней частей мембраны, соответственно.
- Промыть мембраны 5x в течение 5 мин с помощью TBST и инкубировать в TBST с 5% молока обезжиренного и меченных пероксидазой козьими антителами против кроличьих вторичными антителами (разведенные 1: 5000) в течение 1 часа.
- Вымойте мембраны 5x в течение 5 мин с TBST и применять раствор Электрохемилюминесценцию (ЭСЛ) для визуализации полос на пленках в соответствии с инструкциями изготовителя.
- После визуализации белковых полос на пленках, моют средней и нижней части мембраны в течение 10 мин с раствором антитела зачистки. Инкубируйте мембраны O / N в TBST с 3% БСА и антитела против общего PKR (при 1 в 500) и IRF3 (в 1 из 1000), для средней и нижней частей, соответственно. Повторите шаги 4.8. и 4.9. с помощью меченных пероксидазой козьего анти-мышиного вместо анти-кроличьего вторичного антитела для мембраны ПКР (средний).
- Промыть нижнюю часть мембраны 5x в течение 5 мин с помощью TBST и инкубировать мембрану в TBST, содержащим 3% BSA в течение 1 часа с антителом против актина (разведенные 1: 5000). Повторите шаги 4.8. и 4.9. с помощью меченных пероксидазой козьего анти-мышиного вместо анти-кроличьего вторичным антителом. Пример результатов сравнения различных тестовых РНК и положительный контроль обеспечивается на рисунке 5 см. Таблицу материалов для специфических антител , которые будут использоваться.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общая схема процедур показан на рисунке 2 , с примерным планом для трансфекции трех тестовых РНК и РНК управления , предоставленному на фигуре 2В. Для вирусных производства и жизнеспособность клеток анализы, неизменяемый для каждой испытательной конструкции нормирована отрицательного контроля. Реплики трансфицируют в наборах, так что каждый тест РНК нормирована на прилегающей к нему отрицательного контроля. Это сделано, чтобы избежать неточных данных, относящихся к времени между комплексообразовании и трансфекции, которые могут возникнуть, если, к примеру, все отрицательные контроли трансфицируют первым. Так как ВИЧ-1 может влиять на иммунные реакции 27,28, жизнеспособность клеток и анализом активации иммунной системы сделаны без добавления выражающего плазмиды ВИЧ-1.
Для определения оптимальной длины молекул РНК интерференции ориентации консервативную сайта в РНК ВИЧ-1 (позиция 1498-1519 в ВИЧ-1 , штамм NL4-3) 13, набор киРНК были разработаны (Фиг.3А). Использование производственного анализа на ВИЧ-1, процент активности RT по сравнению с клетками, трансфицированных с длинной Dicer субстрат нонсенс миРНК (грехами) вычисляли для клеток, трансфецированных с каждым тестом миРНК в различных количествах котрансфекцией со 100 нг плазмиды, экспрессирующей ВИЧ-1 штамм NL4-3 (фигура 3В).
С помощью анализа на жизнеспособность клеток, процент метаболизма МТТ определяли для клеток , трансфецированных с наиболее эффективными киРНК , идентифицированных на фигуре 3В. Данные были нормализованы к МТТ метаболизма в клетках , обработанных только трансфекции реагента (рисунок 4). Длинная двухцепочечную РНК (Poly I: C) снижение жизнеспособности клеток; Тем не менее, эффект был значительным только при самой высокой дозе оценены. Нет значительное снижение жизнеспособности клеток не наблюдалось для миРНК, направленных 1498 Si т.е в РНК ВИЧ-1, независимо от их длины. С помощью анализа активации иммунной системы , тот же набор РНК оценивали на их потенциал , чтобы вызвать иммунный ответ (рисунок 5). В условиях, когда поли I: С активированными экспрессию ADAR1 p150 и индуцированного фосфорилирования PKR и IRF3, не оказывает существенного влияния на маркеров активации иммунной системы не может наблюдаться для любого из испытуемых РНК.
Рисунок 1. Схема до и после интеграции этапов в цикле репликации ВИЧ-1. Предварительная интеграция (1-3) и после интегрирования (4-7) шагов в цикле репликации ВИЧ-1, показаны в коробках , указанных . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
2 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54486 / 54486fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Схема вирусного производства, жизнеспособности клеток и анализом активации иммунной системы . (А) Пластинчатые прилипшие клетки и культуры в течение 24 часов. Клетки высевают в 24-, 96- и 12-ти луночные планшеты в 500, 100 и 1000 мкл среды для культивирования клеток для вирусного производства, жизнеспособности клеток и анализом активации иммунной системы, соответственно. (B) Подготовка трансфекции трубок, трансфекции клеток и культуры в течение 48 часов. План пример трансфекция для набора из трех тестовых РНК (RNA1-3) показан с соответствующими контролями. Процедура трансфекцию также показана. (C) считыванием. Считывания для вирусного производства, жизнеспособности клеток и активации иммунных анализов записываются и подробно описаны в разделах 2, 3 и 4, соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этого рисунка. </ Р>
Рисунок 3. Влияние испытаний миРНК на ВИЧ-1 производства. (A) Проектирование миРНК с различными длинами и симметрий. Консервативную последовательность в РНК ВИЧ-1 (1498 целевого места) был использован для разработки симметричных и асимметричных миРНК (si1498-) с различной длиной (от 17 до 29 нуклеотид смысл прядей). Ожидаемый смысл (верх, черный) и антисмысловые (внизу, красные) пряди обозначены. (В) Ингибирование ВИЧ-1 производства путем si1498 вариантов длины. Процент (%) ингибирование ВИЧ-1 активности RT в супернатанте HEK293T клеток, трансфицированных симметричными или асимметричными вариантов длины si1498 показан относительно длинной Dicer подложки нонсенс миРНК (Sins). Каждый тест РНК по сравнению с грехами в различных дозах, по крайней мере в двух независимых трансфекциях с двух до трех повторностях. Данные являются выражessed как средние значения ± стандартная ошибка (средства SemS). Эта цифра была изменена с 16, авторское право Американского общества микробиологии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Влияние si1498 длины вариантов на жизнеспособность клеток HEK293T клетки трансфицировали поли I:. C при 50 и 200 мкг / мл (pIC50 и PIC200) и различных длинах и форматах si1498 при 100 нМ. % Метаболизма МТТ определяли относительно клеток, обработанных только для трансфекции реагента (Mock, М) в трех независимых трансфекций с двух до трех повторностях. Данные выражены в виде средних значений ± SEMs. Непарное Стьюдента-тесты были использованы для определения различных трансфекциях significantlу (*, P <0,05) снижение жизнеспособности клеток по отношению к фиктивных трансфицированных клеток. Эта цифра была изменена с 16, авторское право Американского общества микробиологии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Влияние длины si1498 вариантов на врожденные иммунные реакции. HEK293T клетки трансфицировали pIC50, PIC200 и различных длинах и форматах si1498 при 100 нМ. Активация PKR и TLR3 оценивали путем измерения фосфорилированный PKR и IRF3, соответственно. Экспрессия интерферона стимулированного гена (ISG) оценивали путем измерения уровней МСГ ADAR1 P150 по отношению к экспрессирован варианту, ADAR1 p110. Выражение актина использовали в качестве нагрузочного контроля. Это Figurе был изменен с 16, авторское право Американского общества микробиологии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Имя буфера / Реагент | Состав |
| Вирусный нарушение коктейль | 60 мМ Трис-HCl (с 1 М Трис-HCl, рН 7,8), 75 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2, 1,04 мМ ЭДТА, 1% NP-40. |
| Радиоактивный коктейль | 60 мМ Трис-HCl (с 1 М Трис-HCl, рН 7,8), 75 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2, 1,04 мМ ЭДТА, 10 мкг / мл поли (А), 0,33 мкг / мл олиго - дТ. Добавлено непосредственно перед употреблением: 8 мМ дитиотреитола (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) и 5 мкл [32 P] дТТФ (3000 Ки / ммоль) На каждые 500 мкл коктейля. |
| Радиоактивный / вирусный коктейль нарушения | 60 мМ Трис-HCl (с 1 М Трис-HCl, рН 7,8), 75 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2, 1,04 мМ ЭДТА, 0,1% NP-40, 5 мкг / мл поли (А), 0,16 мкг / мл олиго дТ. Добавлено непосредственно перед использованием: 8 мМ дитиотреитола (ДТТ, С 4 Н 10 O 2 S 2) и 5 мкл [32 P] дТТФ (3000 Ки / ммоль) в течение каждого 1 мл коктейля. |
| 2x SSC | 17,53 г NaCl и 8,82 г натрия цитрат - 2H 2 O в 1 LH 2 O. |
| буфер для лизиса | 50 мМ Трис-HCl (с 1 М Трис-HCl, рН 7,4), 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА (от 0,5 М, рН 8,0), 10% об / об глицерина, 1% об / об NP-40. |
| Понсо S | 2,5 г Понсо S и 5 мл уксусной кислоты в 500 мл H 2 O. |
| TBST 6,05 г Трис, 8,76 г NaCl и 1 мл Tween 20 в 1 LH 2 O. |
Таблица 1:. Компоненты некоммерческих буферов и реагентов Рецепты для всех некоммерческих буферов и реагентов предусмотрены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ производства ВИЧ-1 описано проводили с использованием клетки HEK293T (рисунок 2) и аналогично анализов , используемых для скрининга ВИЧ-1 РНК для эффективного рибозима 13, shRNA 10,29, миРНК 30 и U1i РНК 11,31 сайтов - мишеней. Используя различные методы для количественного определения ВИЧ-1 производства, большинство исследований измеряли вирусные производство на 48 часов после того, как со-трансфекции плазмиды экспрессии ВИЧ-1 с кандидатами РНК. После производства ВИЧ-1, незрелые вирионы претерпевают протеолитическое расщепление их полипротеинов с помощью протеазы ВИЧ-1, чтобы стать зрелыми вирионы, способные инфицировать новые клетки. Для анализа активности фермента RT ВИЧ-1, описанной в пунктах 2.2. 2.5., как производство и этапы созревания оцениваются, поскольку фермент RT активен только в зрелых вирионов. В противоположность этому, капсидного белка и РНК вируса может присутствовать в обеих зрелые и незрелые вирионы. Таким образом, количественной оценки ВИЧ-1 производства путем p24 ELISA или RT-PCR мAY пропустить эффекты терапевтических РНК , которые действуют на стадии созревания цикла репликации ВИЧ-1, такие как рибозимы , которые локализуются ВИЧ-1 вирионов 32 и антисмысловых на основе молекул , которые ингибируют обработку Gag в дополнение к ВИЧ-1 , экспрессии белка 13, 31. Ограничением вирусных производства анализов является то, что клетки, используемые не экспрессируют соответствующие рецепторы для ВИЧ-1 и запись не может быть использована для оценки влияния терапевтических РНК на ВИЧ-1, вход или интеграции.
Для того, чтобы оценить эффекты анти-ВИЧ-1 РНК на весь цикл репликации, различные модели инфекции ВИЧ-1, были использованы в различных клеточных линий Т - лимфоцитов или первичных клеток крови 5,33. Так как эти клеточные линии являются трудными для трансфекции, более трудоемких методов, таких как введение генов лентивирусов вектор или аптамеров / пептидного сопряжения необходимы, чтобы доставить достаточное количество анти-ВИЧ-1 РНК наблюдать эффекты на репликации ВИЧ-1. Это ограничение делает диfficult быстро сравнить соотношение структура-активность между вариантами конкретного анти-ВИЧ-1 РНК или выполнять крупномасштабные скрининга для определения оптимальной целевой сайт для новых классов анти-ВИЧ-1 РНК. В то время как вирусные производственные анализы были полезны для идентификации новых молекул анти-ВИЧ-1 РНК, альтернативные клеточные модели в легко трансфицированных клеточных линий, которые поддерживают репликацию ВИЧ-1, такие как ПЗМ-бл клеток, было бы полезно для скрининга анти-ВИЧ-1 РНК, направленные на другие этапы цикла репликации, такие как запись и интеграции.
В зависимости от класса анти-1 ВИЧ-РНК, несколько потенциальных механизмов токсичности были описаны. Например, антисмысловые на основе РНК может иметь вне цели воздействие на клеточных РНК, содержащих одинаковые или аналогичные последовательности для их предполагаемого целевого участка в РНК ВИЧ-1. Аналогичным образом, РНК-аптамеры, смоделирован отклика элемента транс-активации (ТАР) или элемент ответа Rev (РРЭ), может повлиять на функцию клеточного PRoteins, такие как связывающий белок ТАР РНК (TRBP) 34. shRNAs и siРНК , имеют дополнительный потенциал , чтобы воздействовать на РНК - интерференции пути путем секвестирующих RNAi белками 35 и некоторых молекул U1i было показано , что влияет на сплайсинг и обработку клеточных РНК путем секвестрации белки U1 малой ядерной РНК-белок 36. В то время как некоторые из этих эффектов могут быть сведены к минимуму путем тщательного проектирования, измерения клеточной токсичности в экранах для новых анти-ВИЧ-1 РНК-молекул полезны за исключением молекул с потенциальными вне цели эффектов от дальнейшего развития. Кроме того, вне цели эффекты могут косвенно ингибировать ВИЧ-1 производства, что делает клеточную токсичность важное измерение при проверке эффективности новых анти-ВИЧ-1 молекул, идентифицированных с ВИЧ-1 производства экранов.
Анализ жизнеспособности клеток описано в пунктах 3.1. 3.4. является разновидностью стандартного анализа, который был использован для скрининга разнообразных противовирусной молекулы S 37. Анализ измеряет активность NAD (P) H-зависимые клеточные ферменты, чтобы уменьшить реагент МТТ в его нерастворимую фиолетовой форме, формазана. Протокол адаптирован из ранее опубликованных методов 38 и несколько комплектов доступны с помощью МТТ или других тесно связанных реагентов. В то время как важно для анализа жизнеспособности клеток в клеточной линии, используемой для скрининга анти-ВИЧ-1 РНК, следует отметить, что различные клеточные линии отличаются по их чувствительности по отношению к токсичности РНК-индуцированной. Например, Рейнольдс и др. Показали , что Dicer субстрат миРНК не оказывал влияния на жизнеспособность клеток в клетках HEK293T, но значительно снижает жизнеспособность клеток в MCF7, DU145 и HeLa S3 39 клеток. Для анализа , описанного здесь, HEK293T клетки используются в качестве примера (рисунок 4); Тем не менее, тот же анализ также было сделано в MCF7 клетках , чтобы оценить потенциальную токсичность в клеточной линии , которая является более чувствительной к малым РНК-индуцированной токсичности 16.
e_content "> Так как анти-ВИЧ-1 РНК не могут быть обработаны и представлены в адаптивной иммунной системы, они считаются менее иммуногенным по сравнению с анти-ВИЧ-1, белков или пептидов. Тем не менее, в зависимости от их последовательности или структуры, они могут вызвать врожденные иммунные реакции, а также несколько иммунных датчики и сигнальные пути были идентифицированы , которые могут реагировать на малых РНК (обзор в 40). в анализе активации иммунной системы, описанной здесь, уровни фосфорилированной PKR и IRF3 сравнивали в клетках , трансфицированных малыми РНК в качестве индикация PKR или TLR3 активации, соответственно. Оба датчика РНК присутствуют в широком диапазоне клеточных линий и их активация может привести к получению 1-го типа интерферонов и, в случае PKR, ведут к остановке в переводе. чтобы оценить потенциал для анти-ВИЧ-1 РНК, чтобы активизировать производство 1-го типа интерферонов альтернативными путями, уровни интерферона-стимулированных генов ADAR1 (P150) сравнивались также в клетках, трансфицированныханти-ВИЧ-1 РНК. Как было показано последствий длительного положительного контроля дцРНК, поли I: С, все эти реакции были активны в клетках HEK293T (рисунок 5) , и аналогичные эффекты наблюдались в клетках MCF7 16. Так как эти реакции могут ингибировать ВИЧ-1 производства при отсутствии воздействия на жизнеспособность клеток, анализ иммунной активации обеспечивает дополнительную проверку достоверности данных по эффективности новых РНК анти-ВИЧ-1. Дальнейшие измерения, которые могут быть добавлены к этой оценки включают измерение производства воспалительных цитокинов и типа 1 интерферонами в супернатант клеточной культуры, и измерения экспрессии нескольких генов интерферона-стимулированной. Так как целевые ВИЧ клетки , такие как CD4 + Т - клеток и макрофагов может выражать различные уровни врожденного иммунитета датчиков, кандидаты , идентифицированные из анализов , описанных в данном протоколе также должны быть оценены для потенциальной стимуляции иммунной системы в этих типах клеток.Для всех анализов описываютд, критический шаг для получения воспроизводимых и точных результатов является получение ДНК или РНК, трансфекцию трубок (шаг 1.3.). Плазмидную ДНК или РНК должна быть высокой чистоты с концентрацией точно определены. Важно также, чтобы включить соответствующие элементы управления. Для оценки новых экспрессии тест РНК плазмид в вирусном анализе производства, соответствующий отрицательный контроль является пустым выражением плазмиды. Для получения антисмысловых на основе РНК, также должна быть включена дополнительная группа отрицательного контроля плазмида экспрессии ненацеливании РНК. Последовательности для ненацеливании рибозима и shRNA которые не влияют на производство ВИЧ предоставляются в 13 лет . Для тестирования киРНК, единственный отрицательный контроль , который может быть использован , является ненацеливании РНК и соответствующий ненацеливании последовательности миРНК для вирусного анализа продукции обеспечивается в 16. Для жизнеспособности клеток и анализом активации иммунной системы, в качестве отрицательного контроля должны быть клетки, обработанные только трансфекционную реагентом и он представляет собой Сritical, что положительный контроль, такие как поли I: C включен, чтобы подтвердить, что клетки реагируют на РНК-индуцированной токсичности или иммунной активации. Для получения плазмид экспрессии РНК, пустой плазмидой также должны быть включены, чтобы гарантировать, что сам вектор не имеющие токсическое действие на клетки.
В целом, анализы, описанные здесь, представляют собой хороший первый шаг к определению безопасных и эффективных методов лечения РНК для использования в ВИЧ-1 гена или лекарственной терапии. Для молекул , ориентированных на РНК ВИЧ-1, также важно рассмотреть вопрос о сохранении их целевого сайта в ВИЧ-1 циркулирующих штаммов, а также подробные методы для расчета сохранения последовательности были ранее опубликованы 15. Чтобы переместить молекулу вперед в клинических испытаниях, долгосрочные исследования токсичности и эффективности должны быть выполнены в первичных человеческих клетках и на животных моделях, чтобы подтвердить, что идентифицированные кандидаты будут безопасными и эффективными в клинике.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Работа, представленная здесь, была поддержана Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) (гранты DCB-120266, PPP-133377 и HBF-348967 к AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
References
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
- Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
- Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
- Scarborough, R. J., Gatignol, A.
- Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
- Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
- McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
- Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
- Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
- Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
- Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
- Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
- Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
- Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
- Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
- Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
- Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
- Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
- Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M.
- Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
- Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
- Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
- Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
- ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
- Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
- Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
- Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
- Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
- Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
- Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
- Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
- Riss, T. L., et al. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
- Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).
