Introduction
Une limitation du VIH-1, les traitements actuels est qu'ils doivent être administrés de façon chronique pour prévenir la progression de la maladie. Transplant du VIH-1 résistant à des lymphocytes T, ou cellules souches hématopoïétiques, a le potentiel de fournir le contrôle à long terme du VIH-1 replication en l'absence de traitement médicamenteux 1,2 et peut également être une approche efficace pour atteindre un VIH-1 cure 3. Une façon de rendre les cellules résistantes au VIH-1 réplication consiste à insérer un ou plusieurs gènes codant des anticorps anti-VIH-1 ARN ou des peptides dans les cellules d'un individu infecté au cours d' une transplantation autologue 4. Plusieurs candidats anti-VIH-1 des gènes ont été conçus avec des essais cliniques qui entrent en combinaison de deux 5 ou trois 6, pour prévenir le développement du VIH-1 résistance à un seul gène.
Anti-VIH-1 ARN sont parmi les meilleurs candidats pour la thérapie génique combinée en raison de leur faible potentiel pour obtenir des réponses immunitaires et parce qu'ilson transcrit à partir des séquences de gènes très courts. Quelques-anti-VIH-1 ARN ont été conçus pour cibler l'intégration et l'entrée virale. Cependant, la plupart des anti-VIH-1 ARN cible étapes de post-intégration dans le cycle de vie du virus (figure 1). Les inhibiteurs post-intégration comprennent des ARN leurre, ciblant les VIH-1 protéines régulatrices Tat ou Rev 1, et des ARN antisens à base, ciblant différents sites en ARN VIH-1, tels que ribozymes 7, shRNA 8 et U1i ARNs 9. Les méthodes qui ont été utilisées pour comparer l'efficacité des anti-VIH-1 ARN comprennent la surveillance de la réplication virale dans les cellules transduites avec les gènes codant pour des ARN candidates et en mesurant la production virale dans des cellules transfectées de manière transitoire avec des plasmides exprimant des ARN candidates et un rétrovirus VIH-1 du plasmide d' expression 10 -13. Nous avons déjà utilisé un test de production du VIH-1 à l' écran ARN VIH-1 pour les nouveaux ribozymes sites cibles 13-15. Ces méthodes ont été affinées pour optimiser la forme d'un ARNmolécule d'interférence exprimée à partir de l' ADN plasmidique comme un shRNA ou livré comme un siRNA synthétique 16. L'essai mesure la production de virus matures à partir de cellules de rein embryonnaire humain (HEK 293T), et peut être utilisé pour comparer les effets des inhibiteurs qui ciblent les étapes de post-intégration dans le cycle de réplication du VIH-1 (Figure 1). Pour les inhibiteurs qui ciblent les étapes de pré-intégration, les tests alternatifs comme une infectivité cellulaire dosage TZM-bl 17 sont nécessaires pour évaluer l' efficacité antivirale.
problèmes de sécurité majeurs pour la fourniture d'anti-VIH-1 ARN dans la clinique comprennent les effets hors-cible potentiels sur les ARN ou les protéines humaines, et l'activation des capteurs immunitaires innées. Afin d' évaluer la toxicité des anticorps anti-VIH-1 ARNsi, nous avons utilisé un test de viabilité cellulaire dans les différentes lignées cellulaires 16. Nous avons également mesuré l'activation des capteurs à double brin d'ARN immunitaire, l'ARN protéine kinase activée par R (PKR) et Toll like receptor 3 (TLR3), ainsi que l'expression de l'interféron stimulé gène, p150 ADAR1. Ces essais peuvent être utilisés pour confirmer l'efficacité des anticorps anti-VIH-1 ARN ne résulte pas d'effets indirects sur la viabilité cellulaire ou l'activation du capteur immunitaire. Ils sont également utiles en excluant les ARN candidats avec les toxicités potentielles de développement ultérieur.
Dans les protocoles suivants, les procédures pour identifier les nouveaux ARN thérapeutiques et d'optimiser le format de celles existantes sont décrites. Les méthodes sont utiles pour les inhibiteurs de post-intégration d'ARN de dépistage à base de VIH-1 réplication et pourraient être adaptés à l' écran d' autres inhibiteurs de post-intégration, tels que les petites molécules ciblant Rev exportation médiation de l' ARN viral 18 ou CRISPR / systèmes Cas conçus pour cibler intégrée ADN du VIH-1 19.
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Protocol
1. Cellules et transfections
- Cultiver des cellules HEK 293T dans un milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine. Préparer une suspension de 2 x 10 5 cellules / ml dans le milieu de culture cellulaire. Ajouter 500, 100 et 1000 pi de la suspension cellulaire à chaque puits de 24 puits, des plaques à 96 puits et 12 puits, pour la production virale, la viabilité cellulaire et des essais d'activation immunitaire, respectivement (figure 2A).
- Agiter doucement les plaques et incuber O / N à 37 ° C avec 5% de CO 2. Cultiver les cellules à 50-70% de confluence.
- Selon un plan de transfection, préparer des dilutions d'ARN d'essai et de leurs contrôles dans 1,5 ml de micro tubes (exemple, la figure 2B).
- Pour le dosage de la production virale, préparer une 10 ng / ul de la dilution d'un VIH-1 du plasmide d'expression et ajouter 10 ul à chaque tube. préparer Suivant 5 uM dilutions d'ARN d'essai et un RN de contrôle négatifA. Ajouter 2,5 ou 10 ul de chaque ARN d'essai négatif et la dilution de commande pour les tubes correspondants 25 ou 100 concentrations finales nm.
- Pour le dosage de la viabilité des cellules, de préparer des dilutions de 5 um d'ARN d'essai et 10 mg / ml de dilution de l'ARN témoin positif, de faible poids moléculaire poly I: C. Ajouter 2 ul d'ARN d'essai ou des dilutions d'ARN de contrôle positif aux tubes correspondants pour 100 nM ou ml concentrations finales 200 ug / respectivement.
- Pour l'essai d'activation immunitaire, ajouter 20 pl d'ARN test ou des dilutions d'ARN témoin positif préparé à l'étape 1.3.2. aux tubes correspondants de 100 nm ou 200 ug / ml de concentration finale, respectivement.
Remarque: Pour les tests ARN des plasmides d'expression, préparer des dilutions de 10 ng / ul à la place des 5 um dilutions d'ARN d'essai, ce qui donne des quantités finales de 25 et 100 ng pour l'étape 1.3.1. et 100 ng pour les étapes 1.3.2. et 1.3.3.
- Ajouter 50, 25 ou 75 ul de DMEM à chaque tube de transfection virale pour production, la viabilité cellulaire et des essais d'activation immunitaire, respectivement. Pour les essais de production virale, apportent des cellules et des tubes de transfection préparés à un niveau de biosécurité 3 (BSL3) laboratoire avant l'étape suivante.
- Ajouter 2 ul du réactif de transfection séquentielle aux tubes de transfection et incuber pendant 15 à 20 minutes pour permettre de former des complexes. Voir la table des matières pour le réactif de transfection spécifique à utiliser.
- Ajouter le mélange de transfection entier de chaque goutte à goutte dans les positions correspondantes dans les plaques de culture cellulaire microtube. Remuer doucement et incuber les plaques pendant 48 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Mesurer le VIH-1 production (section 2), la viabilité des cellules (section 3) et l' activation immunitaire (section 4) dans les plaques de culture cellulaire (figure 2C).
2. Dosage de la production virale
- Retirez les plaques de culture cellulaire à 24 puits de l'incubateur et agiter doucement les plaques à l'intérieur de la culture cellulaire BSL3capuche. Transférer 150 pi de surnageant de chaque puits à un puits correspondant d'une plaque de 96 puits à fond plat, qui sera utilisé pour quantifier la production de VIH-1.
Nota: Les dosages de quantification virales courantes incluent la mesure de l'expression de la protéine HIV-1 capside (p24) par l' enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 20, la quantification de l' ARN viral par réaction de transcription inverse en chaîne par polymérase (RT-PCR) , 21 et en mesurant l'activité du VIH-1 RT enzyme. Les étapes 02.02 à 02.05 expliquer les méthodes pour quantifier le VIH-1 l' activité de RT 13,15,16. - Transfert 5 pi de surnageant à puits correspondant dans une plaque de 96 puits, contenant 25 ul d'une interruption virale cocktail 15 (tableau 1). Laisser incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante et à transférer la plaque à un poste de travail de la radioactivité.
Remarque: l'étape 2.2. est nécessaire seulement si un poste de travail de la radioactivité ne sont pas disponibles dans le laboratoire BSL3. Si les plaques ne doivent pas être retirés de lalaboratoire BSL3, passez à l'étape 2.3. et ajouter 50 ul de radioactive / virale perturbation cocktail (tableau 1) à la place des 25 pl de cocktail radioactif. - Préparer un cocktail radioactif 15 (tableau 1), et ajouter 25 ul à chaque puits de surnageant viral et la perturbation cocktail. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 2 heures.
- Point 5 ul du mélange réactionnel sur des carrés correspondants d'une fibre de verre Di éthyl amino éthyle (DEAE) de papier et Filtermat permettent aux taches sécher pendant 10 minutes. Repérez le mélange de réaction sur tous les autres carrés de sorte que deux échantillons Boarder directement les uns les autres. Cela permet d'éviter cross-over entre les échantillons lors de la détermination coups par minute (cpm) dans l'étape 2.6.
- Laver les papiers 5x pendant 5 min avec 2x citrate de sodium salin (SSC) tampon (tableau 1), suivi de deux lavages 1 min avec 95% d' éthanol. Laisser les papiers à sécher et les sceller dans des sacs d'échantillons.
- Clip sacs d'échantillons containing le papier Filtermat dans une cassette et insérez la cassette dans un compteur à scintillation de microplaques. Régler le compteur pour lire cpm 32 P à la date de référence prévue pour le lot de [32 P] dTTP utilisé dans l'expérience. Sélectionnez les échantillons à lire en utilisant la carte de la plaque et démarrer le compteur.
- Pour toute méthode de quantification virale, diviser les valeurs obtenues pour chaque ARN de test par le contrôle négatif adjacent et multiplier cette valeur par 100 pour obtenir le pour cent d'inhibition du VIH-1 production pour chaque répétition des ARNs de test. Un exemple des résultats de comparaison différents ARN d'essai à différentes concentrations est présentée à la figure 3.
Viabilité 3. Cellule Assay
- Retirer les plaques à 96 puits de l'incubateur et on ajoute 20 ul de 5 mg / ml de MTT (bromure de 3- [4,5-diméthyl-2-thiazolyl] -2,5-diphényl-2H-tétrazolium) dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco ( DPBS) à chaque puits. Incuber les plaques fou 3 heures à 37 ° C.
- Ajouter 150 ul d'isopropanol acidifié avec un détergent (1% de NP-40, du HCl 4 mM dans de l'isopropanol) à chaque puits et incuber les plaques pendant 2 heures à température ambiante.
- Déterminer l'absorbance à 570 nm dans un spectrophotomètre de microplaque.
- Calculer le métabolisme du MTT relatif pour chaque ARN témoin positif et un test en divisant la valeur obtenue pour chaque échantillon par le contrôle de transfection adjacente. Un exemple des résultats de comparaison différents ARN d'essai et un groupe témoin positif est fourni à la figure 4.
4. Essai d'activation immunitaire
- Retirer les plaques à 12 puits de l'incubateur et aspirer le milieu de culture. Lavez délicatement les cellules deux fois avec DPBS et ajouter 70 ul de tampon de lyse froid 22 (y compris les inhibiteurs de la protéase et la phosphatase, tableau 1) à chaque puits. Incuber les plaques pendant 10 minutes sur la glace.
- Transfert lysats de cellules dans des tubes micro et les congeler rapidement par immersion de lales tubes dans de l'azote liquide. Laisser les échantillons décongeler et répéter pendant 2 cycles de gel-dégel pour un total de 3.
- Centrifuger les lysats pendant 15 min à 4 ° C, 15 700 x g pour sédimenter les débris cellulaires. Transférer le surnageant dans de nouveaux tubes micro et déterminer la concentration en protéines en utilisant la méthode 23,24 bleu de Coomassie (Bradford).
- Résoudre 75 pg de protéine provenant de chaque échantillon dans un gel à 10% de Polyacrylamide dénaturant et les transférer à une membrane de nitrocellulose comme décrit précédemment 25,26.
- Après électrophorèse et transfert sur membrane, révèlent des bandes de protéine par incubation de la membrane dans Ponceau S (tableau 1) pendant 1 min , suivie d' un lavage à l' eau bidistillée. Utilisez les bandes et de protéines échelle comme un guide pour couper la membrane à 80 et 55 kDa.
Remarque: Dans l' étape 4.4 échantillons peuvent être exécutés sur 16 x 18 cm 2 gels vers le bas à 34 kDa, de sorte qu'il est facile de couper la membrane aux positions spécifiées et ne pas couper à travers lagroupes d'intérêt. Sinon, plusieurs gels peuvent être exécutés avec les mêmes échantillons pour éviter de couper la membrane. - Laver la coloration Ponceau S avec du tampon Tris salin contenant 0,05% de Tween 20 (TBST, tableau 1). Ajouter TBST avec 5% de lait non gras pour couvrir complètement les membranes. Incuber les membranes à la température ambiante sous agitation pendant 1 heure.
- Incuber les membranes O / N dans du TBST avec 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) et d'anticorps dilué à 1 en 1000 contre ADAR1 (110 et 150 kDa), phospho-PKR (62 kDa) et phospho-IRF3 (47 kDa), les pièces du haut, du milieu et du bas de la membrane, respectivement.
- Laver les membranes 5x pendant 5 minutes avec du TBST et incuber dans du TBST avec 5% de lait non gras et des anticorps secondaires marqués à la peroxydase de chèvre anti-lapin (dilué à 1 à 5000) pendant 1 h.
- Laver les membranes 5x pendant 5 min avec TBST et appliquer électrochimiluminescence (ECL) solution pour visualiser les bandes sur les films selon les instructions du fabricant.
- Après la visualisation des bandes de protéines sur des films, laver les pièces médianes et inférieures de la membrane pendant 10 minutes avec une solution d'anticorps de décapage. Incuber les membranes O / N dans du TBST avec 3% de BSA et d'anticorps contre PKR totale (à 1 à 500) et IRF3 (à 1 à 1000), pour le milieu et d'une partie inférieure, respectivement. Répétez les étapes 4.8. et 4.9. en utilisant marqué à la peroxydase de chèvre anti-souris à la place de l'anticorps secondaire anti-lapin pour la membrane PKR (milieu).
- Laver la partie inférieure de la membrane 5x pendant 5 minutes avec du TBST et on incube la membrane dans du TBST avec 3% de BSA pendant 1 heure avec un anticorps dirigé contre l'actine (dilué à 1 en 5000). Répétez les étapes 4.8. et 4.9. en utilisant marqué à la peroxydase de chèvre anti-souris à la place de l'anticorps secondaire anti-lapin. Un exemple des résultats comparant différents ARNs de test et un contrôle positif est fourni à la figure 5. Voir la table des matières pour les anticorps spécifiques à utiliser.
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Representative Results
Un schéma général de la procédure est représenté sur la figure 2 avec un plan de transfection par exemple pour les trois ARN d'essai et un ARN de commande prévue dans la figure 2B. Pour la production et la viabilité cellulaire des analyses virales, la lecture-out pour chaque construction d'essai est normalisée à un contrôle négatif. Réplicats sont transfectées dans des ensembles, de sorte que chaque ARN de test est normalisé à son contrôle négatif adjacent. Ceci est fait pour éviter que des données incorrectes en relation avec le temps entre complexant et la transfection, ce qui peut se produire si, par exemple, tous les témoins négatifs sont transfectées en premier. Puisque le VIH-1 peut affecter les réponses immunitaires 27,28, la viabilité cellulaire et des essais d'activation immunitaire sont réalisées sans l'addition d'un VIH-1 exprimant le plasmide.
Afin d'identifier la longueur optimale des molécules d'ARN d'interférence destinée à un site conservé dans l'ARN du VIH-1 (positions 1498-141519 souche VIH-1 NL4-3) 13, un ensemble de siRNA ont été conçues (figure 3A). En utilisant le dosage de la production de VIH-1, le pour cent de l'activité RT par rapport aux cellules transfectées avec une longue Dicer substrat non-sens siRNA (NAS) a été calculée pour les cellules transfectées avec chacun des ARNsi d'essai à différentes quantités de co-transfection avec 100 ng d'un plasmide exprimant VIH-1 souche NL4-3 (figure 3B).
En utilisant le dosage de viabilité cellulaire, le métabolisme pour cent de MTT a été déterminée pour les cellules transfectées avec les ARNsi plus efficaces identifiés sur la figure 3B. Les données ont été normalisées en fonction du métabolisme du MTT dans les cellules traitées avec le réactif de transfection seul (figure 4). Un long ARN double brin (Poly I: C) a réduit la viabilité cellulaire; cependant, l'effet était significative à la plus forte dose évaluée. Aucune réduction significative de la viabilité des cellules a été observée pour les siRNA ciblant l'IS 1498 t'en ARN VIH-1, quel que soit leur longueur. En utilisant le dosage d'activation immunitaire, le même ensemble d'ARN ont été évalués pour leur capacité à déclencher des réponses immunitaires (figure 5). Dans des conditions où Poly I: C activé l'expression de p150 ADAR1 et la phosphorylation induite de PKR et IRF3, aucun effet significatif sur les marqueurs d'activation immunitaire a pu être observée pour aucun des ARNs de test.
Figure 1. Schéma des étapes pré- et post-intégration dans le cycle de réplication du VIH-1. Pré-intégration (1-3) et post-intégration (4-7) les étapes du cycle de réplication du VIH-1 sont présentés dans des boîtes décrites . S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2. Schéma de la production virale, la viabilité des cellules et des essais d'activation immunitaire. (A) Plate cellules et de la culture pendant 24 heures adhérentes. Les cellules sont étalées dans 24-, 96- et 12- plaques à puits à 500, 100 et 1000 ul de milieu de culture cellulaire pour la production virale, la viabilité cellulaire et des essais d'activation immunitaire, respectivement. (B) Préparer des tubes de transfection, les cellules transfecter, et de la culture pendant 48 heures. Un plan exemple de transfection pour un ensemble de trois ARN de test (RNA1-3) est représenté avec des contrôles appropriés. La procédure de transfection est également illustrée. (C) Read-out. La sortie de lecture pour la production virale, la viabilité des cellules et des essais d'activation immunitaire sont écrits et expliqué en détail dans les sections 2, 3 et 4, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. </ P>
Figure 3. Effet de siRNA de test sur le VIH-1 production. (A) La conception de siRNA avec différentes longueurs et symétries. Une séquence conservée dans l'ARN du VIH-1 (1498 au site cible) a été utilisée pour concevoir des ARNsi symétriques et asymétriques (si1498-) avec des longueurs différentes (17 à 29 brins de nucléotides sens). Le sens attendu (en haut, noir) et antisens (en bas, rouge) brins sont indiqués. (B) Inhibition du VIH-1 la production par des variantes de longueur si1498. L'inhibition pour cent (%) du VIH-1 activité RT dans le surnageant des cellules HEK293T transfectées avec des variantes de longueur de si1498 symétriques ou asymétriques est représentée par rapport à un long substrat de Dicer nonsense siRNA (Sins). Chaque ARN de test a été comparé à Sins à des doses différentes dans au moins deux transfections indépendantes avec deux à trois répétitions. Les données sont exprEssed valeurs moyennes ± des moyens d'erreur standard (SEMS). Ce chiffre a été modifié depuis 16 ans, le droit d' auteur de l' American Society for Microbiology. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Effet de la longueur si1498 variants sur la viabilité cellulaire des cellules HEK293T ont été transfectées avec le poly I:. C , à 50 et 200 ug / ml (et pCI50 pic200) et des longueurs différentes et des formats de si1498 à 100 nm. Le métabolisme% de MTT a été déterminée par rapport aux cellules traitées avec le réactif de transfection seul (Mock, M) en trois transfections indépendantes avec deux à trois répétitions. Les données sont exprimées sous forme de valeurs moyennes ± SEM. t-tests de Student non apparié ont été utilisés pour déterminer si les différentes transfections significantly (*, p <0,05) a réduit la viabilité des cellules par rapport aux cellules fictives transfectée. Ce chiffre a été modifié depuis 16 ans, le droit d' auteur de l' American Society for Microbiology. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Effet de la longueur de si1498 variantes sur les réponses immunitaires innées. Cellules HEK293T ont été transfectées avec pCI50, pic200 et différentes longueurs et formats de si1498 à 100 nM. L'activation de PKR et TLR3 ont été évalués par la mesure de PKR phosphorylée et IRF3, respectivement. Expression d'un gène interféron stimulé (ISG) a été évaluée en mesurant les ISG ADAR1 p150 niveaux par rapport à la variante exprimée constitutivement, p110 ADAR1. L'expression de l'actine a été utilisée comme témoin de chargement. Cette figure a été modifié depuis 16 ans, le droit d' auteur de l' American Society for Microbiology. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Nom du Buffer / Réactif | Composition |
| Viral perturbation cocktail | 60 mM de Tris-HCl (1 M de Tris-HCl, pH 7,8), KCl 75 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1,04 mM, 1% de NP-40. |
| cocktail radioactifs | 60 mM de Tris-HCl (1 M de Tris-HCl, pH 7,8), KCl 75 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1,04 mM, 10 pg / ml de poly (A), 0,33 pg / ml d' oligo dT. Ajouté immédiatement avant utilisation: mM dithiothréitol 8 (TNT, C 4 H 10 O 2 S 2) et 5 pi [32 P] dTTP (3000 Ci / mmol) Pour chaque 500 pi de cocktail. |
| Radioactive virale perturbation cocktail / | 60 mM de Tris-HCl (de 1 M de Tris-HCl, pH 7,8), KCl 75 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1,04, 0,1% de NP-40, 5 ug / ml de poly (A), de 0,16 ug / oligo- ml dT. Ajouté immédiatement avant utilisation: mM dithiothréitol 8 (TNT, C 4 H 10 O 2 S 2) et 5 pi [32 P] dTTP (3000 Ci / mmol) pour chaque 1 ml de cocktail. |
| 2x SSC | 17,53 g de NaCl et 8,82 g de citrate de sodium - 2 H 2 O 1 G 2 O. |
| Le tampon de lyse | 50 mM de Tris-HCl (1 M de Tris-HCl, pH 7,4), 150 mM de NaCl, 5 mM d'EDTA (0,5 M, pH 8,0), 10% v / v de glycerol, 1% v / v de NP-40. |
| Ponceau S | Acide acétique 2,5 g de Ponceau S et 5 ml dans 500 ml de H 2 O. |
| TBST 6,05 g de Tris, 8,76 g de NaCl et 1 ml de Tween 20 à 1 G 2 O. |
Tableau 1:. Composants de tampons non-commerciaux et réactifs Recettes pour tous les tampons non-commerciaux et réactifs sont fournis.
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Discussion
HIV-1 essai de production décrite a été réalisée en utilisant des cellules HEK293T (figure 2) et est similaire à essais utilisés pour cribler ARN VIH-1 pour un ribozyme efficace 13, shRNA 10,29, 30 ARNsi et les sites 11,31 U1i ARN cibles. L'utilisation de différentes méthodes pour quantifier le VIH-1 la production, la plupart des études ont mesuré la production virale 48 heures après co-transfection d'un plasmide d'expression de VIH-1 avec des ARN candidats. Après la production du VIH-1, des virions immatures subissent un clivage protéolytique des polyprotéines par le HIV-1 protéase pour devenir des virions matures, capables d'infecter de nouvelles cellules. Pour le VIH-1 RT activité enzymatique essai décrite dans les étapes 2.2. à 2.5., à la fois la production et des étapes de maturation sont évalués, puisque l'enzyme RT est actif seulement dans les virions matures. En revanche, la protéine de capside et de l'ARN viral peuvent être présents dans les virions matures et immatures. Par conséquent, la quantification de la production du VIH-1 p24 par ELISA ou par RT-PCR may effets des ARN thérapeutiques qui agissent sur l'étape de maturation du cycle de réplication du VIH-1, tels que des ribozymes qui localisent au virions VIH-1 32 et des molécules à base d'antisens qui inhibent le traitement de Gag en plus du VIH-1 expression de la protéine 13 manquer, 31. Une limitation des essais de production virale est que les cellules utilisées n'expriment les récepteurs appropriés pour l'entrée du VIH-1 et ne peuvent pas être utilisées pour évaluer les effets thérapeutiques sur des ARN du VIH-1 d'entrée ou d'intégration.
Pour évaluer les effets des anti-VIH-1 ARN du cycle de réplication entier, différents modèles d' infection du VIH-1 ont été utilisés dans différentes lignées cellulaires de lymphocytes T ou des cellules sanguines primaires 5,33. Etant donné que ces lignées cellulaires sont difficiles à transfecter, des méthodes plus forte intensité de travail telles que l'insertion du gène vecteur lentiviral ou aptamère / peptide de conjugaison sont nécessaires pour fournir des quantités suffisantes d'anticorps anti-VIH-1 ARN d'observer des effets sur le VIH-1 replication. Cette limitation rend difficile de comparer rapidement la relation structure-activité entre les variantes d'un anti-VIH-1 ARN particulier ou d'effectuer un dépistage à grande échelle pour identifier le site cible optimale pour les nouvelles classes d'anti-VIH-1 ARN. Alors que des essais de production virale ont été utiles pour l'identification de nouvelles molécules anti-VIH-1 ARN, des modèles cellulaires de substitution dans les lignes facilement transfectées de cellules qui supportent le VIH-1 replication, telles que des cellules-BL TZM, serait utile pour le dépistage anti-VIH-1 ARNs ciblant d'autres étapes du cycle de réplication, comme l'entrée et de l'intégration.
En fonction de la classe d'anticorps anti-VIH-1 ARN, plusieurs mécanismes potentiels de toxicité ont été décrits. Par exemple, des ARN anti-sens sur la base, peuvent avoir des effets hors cible sur les ARN cellulaires contenant la même ou une séquence similaire à leur site cible prévu par le VIH-1 ARN. De même, des aptamères d'ARN, le modèle de l'élément de réponse trans-activation (TAR) ou élément de réponse Rev (RRE), pourraient affecter la fonction de pr cellulaireoteins, telles que la protéine de liaison d' ARN TAR (PBRT) 34. shRNA et de siRNA ont le potentiel supplémentaire d'affecter la voie d'interférence d'ARN par séquestrant les protéines d' ARNi 35 et certaines molécules U1i se sont avérés affecter l'épissage et le traitement des ARN cellulaires en séquestrant les protéines du petit ARN-protéine nucléaire U1 complexe 36. Alors que certains de ces effets peuvent être minimisés par une conception soignée, les mesures de toxicité cellulaire dans les écrans pour de nouvelles molécules anti-VIH-1 ARN sont utiles en excluant molécules potentielles hors-cible des effets de la poursuite du développement. En outre, les effets hors-cible pourraient indirectement inhiber le VIH-1 la production, ce qui rend la toxicité cellulaire une mesure importante dans la validation de l'efficacité des nouveaux anti-VIH-1 molécules identifiées à partir des écrans VIH-1 production.
L'essai de viabilité cellulaire décrite dans les étapes 3.1. à 3.4. est une variante d'un essai standard qui a été utilisé pour cribler diverse molécule antivirale s 37. L'essai mesure l'activité des enzymes cellulaires de NAD (P) H-dépendantes pour réduire le réactif MTT à sa forme pourpre insoluble de formazan. Le protocole est adapté des méthodes précédemment publiées 38 et plusieurs kits sont disponibles en utilisant MTT ou d' autres réactifs étroitement liés. Bien qu'il soit important de doser la viabilité des cellules dans la lignée cellulaire utilisée pour le dépistage anti-VIH-1 ARN, il convient de noter que les différentes lignées cellulaires varient quant à leur sensibilité envers la toxicité induite par l'ARN. Par exemple, Reynolds et al. , Démontré que l' ARNsi Dicer de substrat n'a eu aucun effet sur la viabilité cellulaire dans des cellules HEK293T, mais la viabilité des cellules MCF7 fortement réduite, DU145 et des cellules HeLa S3 39. Pour le dosage décrit ici, des cellules HEK293T sont utilisées à titre d'exemple (figure 4); cependant, le même essai a été effectué dans des cellules MCF7 pour évaluer la toxicité potentielle dans une lignée cellulaire qui est plus sensible à faible toxicité induite par l' ARN-16.
e_content "> Comme anti-VIH-1 ARN ne peut être traitée et présentée au système immunitaire adaptatif, ils sont considérés comme moins immunogène par rapport aux anti-VIH-1 des protéines ou des peptides. Cependant, en fonction de leur séquence ou la structure, elles peuvent provoquer innée les réponses immunitaires, et plusieurs capteurs immunitaires et les voies de signalisation ont été identifiés qui peuvent répondre à de petits ARN (passé en revue dans 40). dans l'essai d'activation immunitaire décrit ici, les niveaux de PKR phosphorylé et IRF3 ont été comparés dans des cellules transfectées avec de petits ARN en tant que indication de la PKR ou TLR3 activation, respectivement. les deux sondes d'ARN sont présents dans un large éventail de lignées cellulaires et leur activation peut conduire à la production d'interférons de type 1 et, dans le cas de la PKR, un arrêt en translation. pour évaluer le potentiel des anticorps anti-VIH-1 ARN pour activer la production d'interférons de type 1 par d'autres voies, les niveaux du gène de l'interféron ADAR1 stimulée (P150) ont également été comparés dans des cellules transfectées avecanti-VIH-1 ARN. Comme l'ont démontré les effets du long contrôle positif ARNdb, Poly I: C, toutes ces réponses ont été actifs dans les cellules HEK293T (Figure 5) et des effets similaires ont été observés dans les cellules MCF7 16. Etant donné que ces réactions pouvaient inhiber la production de VIH-1 en l'absence d'effet sur la viabilité cellulaire, le dosage de l'activation immunitaire fournit une validation supplémentaire de l'efficacité de nouveaux anti-VIH-1 ARN. D'autres mesures qui pourraient être ajoutés à cette évaluation comprennent la mesure de la production de cytokines pro-inflammatoires et des interférons de type 1 dans le surnageant de culture cellulaire, et la mesure de l'expression de plusieurs gènes d'interféron stimulée. Etant donné que les cellules cibles du VIH telles que les macrophages et les cellules T CD4 + peuvent exprimer des niveaux différents de capteurs de l' immunité innée, les candidats identifiés à partir des essais décrits dans ce protocole doivent également être évalués pour la stimulation immunitaire potentielle dans ces types cellulaires.Pour l'ensemble des essais décriventd, l'étape critique pour obtenir des résultats reproductibles et précis est la préparation des tubes ADN ou d'ARN transfection (étape 1.3.). L'ADN plasmidique ou de l'ARN devraient être d'une grande pureté avec des concentrations déterminées avec précision. Il est également essentiel d'inclure les contrôles appropriés. Pour l'évaluation de nouveaux plasmides d'expression de l'ARN d'essai dans l'essai de production virale, un contrôle négatif approprié est le plasmide d'expression vide. Pour ARN antisens à base, un plasmide témoin négatif supplémentaire exprimant un ARN non-ciblage devrait également être inclus. Sequences pour un ribozyme non-ciblage et shRNA qui ne touchent pas la production du VIH sont fournis dans 13. Pour les ARNsi de test, le seul contrôle négatif qui peut être utilisé est un ARN non-cible et une séquence siRNA non ciblant appropriée pour le dosage de la production virale est de 16. Pour la viabilité cellulaire et des essais d'activation immunitaire, la régulation négative des cellules doit être traitée avec le réactif de transfection seul et il est critical qu'un témoin positif tel que le poly I: C est inclus pour confirmer que les cellules sont sensibles à la toxicité induite par l'ARN ou l'activation immunitaire. Pour l'ARN des plasmides d'expression, le plasmide vide devrait également être inclus pour faire en sorte que le vecteur lui-même est de ne pas avoir des effets toxiques sur les cellules.
Dans l'ensemble, les essais décrits ici représentent une bonne première étape vers l'identification des thérapies d'ARN sûrs et efficaces pour une utilisation dans le VIH-1 gène ou un traitement médicamenteux. Pour les molécules ciblant le VIH-1 ARN, il est également important de considérer la conservation de leur site cible dans le VIH-1 souches en circulation, et des méthodes détaillées pour calculer la conservation de la séquence ont été publiées antérieurement 15. Pour déplacer une molécule vers l'avant dans les essais cliniques, la toxicité et l'efficacité des études à long terme doivent être effectuées dans les cellules humaines primaires et dans des modèles animaux pour confirmer que les candidats identifiés seront sûrs et efficaces dans la clinique.
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Acknowledgments
Le travail présenté ici a été soutenue par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (accorde DCB-120266, PPP-133377 et HBF-348967 à AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
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