Summary

Utvärdering av effekt och toxicitet av RNA Targeting HIV-1-produktion för användning i Gene eller Drug Therapy

Published: September 05, 2016
doi:

Summary

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Abstract

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Introduction

En begränsning av nuvarande HIV-1-behandlingar är att de måste vara administreras kroniskt för att förhindra sjukdomsprogression. Transplantation av HIV-1 resistent T-lymfocyter, eller hematopoietiska stamceller, har potential att skapa långsiktig kontroll av HIV-1-replikation i frånvaro av läkemedelsbehandling 1,2 och kan också vara en effektiv metod för att uppnå en HIV-1 botemedel 3. Ett sätt att göra celler resistenta mot HIV-1-replikation är att sätta in en eller flera gener som kodar för anti-HIV-1 RNA eller peptider i en infekterad individs celler under en autolog transplantation 4. Flera kandidat anti-HIV-1-gener har utformats med några in kliniska prövningar i kombinationer av två 5 eller tre 6, för att förhindra utvecklingen av HIV-1-resistens mot någon enskild gen.

Anti-HIV-1 RNA är bland de bästa kandidaterna för kombinations genterapi på grund av deras låga potential att framkalla immunsvar och eftersom detranskriberas från mycket korta gensekvenser. Vissa anti-HIV-1 RNA har utformats för att rikta viralt inträde och integration. De flesta anti-HIV-1 RNA riktar efterintegrations steg i virusets livscykel (Figur 1). Post-integration inhibitorer innefattar lock RNA, med inriktning på HIV-1 reglerande proteiner Tat eller Rev 1, och antisense-baserade RNA, med inriktning på olika platser i HIV-1 RNA, såsom ribozymer 7, shRNAs 8 och U1i RNA 9. Metoder som har använts för att jämföra effekten av anti-HIV-1 RNA omfattar övervakning virusreplikation i celler transducerade med gener som kodar för kandidat RNA och mäta viral produktion i celler transient transfekterade med plasmider som uttrycker kandidat RNA och en HIV-1-expressionsplasmid 10 -13. Vi har tidigare använt en HIV-1-produktion analys för att screena HIV-1-RNA för ny ribozym målställen 13-15. Dessa metoder har sedan förfinats för att optimera utformningen av en RNAstörningar molekyl som uttrycks från plasmid-DNA som en shRNA eller levereras som en syntetisk siRNA 16. Analysen mäter produktionen av mogna virus från humana embryonala njur (HEK) 293T-celler, och kan användas för att jämföra effekterna av hämmare som riktar efterintegrations steg i HIV-1-replikationscykeln (Figur 1). För hämmare som riktar steg före integration, är alternativa analyser såsom TZM-bl cellinfektionsanalys 17 som behövs för att utvärdera antiviral effekt.

Stora säkerhetsrisker för leverans av anti-HIV-1 RNA i kliniken är de potentiella off-target effekter på människors RNA eller proteiner och aktivering av medfödda immun sensorer. För att utvärdera toxiciteten av anti-HIV-1 siRNA, har vi använt en cellviabilitet analys i olika cellinjer 16. Vi mätte också aktivering av de dubbelsträngade RNA-immunsensorer, RNA aktiverat proteinkinas R (PKR) och Toll like receptor 3 (TLR3), såväl som expres av interferon stimulerade genen ADAR1 P150. Dessa analyser kan användas för att bekräfta att effekten av anti-HIV-1 RNA är inte på grund av indirekta effekter på cellviabilitet eller immunsensoraktivering. De är också användbara i exklusive kandidat RNA med potentiella toxicitet från vidareutveckling.

I följande protokoll, förfaranden identifiera nya terapeutiska RNA och optimera formatet av befintliga beskrivs. Metoderna är användbara för screening RNA baserade efter integration hämmare av HIV-1-replikation och kan anpassas för att screena andra hämmare efter integration, såsom små molekyler som riktar Rev medierad export av viralt RNA 18 eller crispr / Cas-system utformade för att rikta integrerad HIV-1-DNA 19.

Protocol

1. Celler och transfektioner Kultur HEK 293T-celler i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin. Bered en 2 x 10 5 celler / ml suspension i cellodlingsmediet. Tillsätt 500, 100 och 1000 | j, l av cellsuspensionen till varje brunn i 24-brunnars, 96-brunnars och 12-brunnars plattor, för viral produktion, cellviabiliteten och immunaktiveringsanalyser, respektive (Figur 2A). Snurra försiktigt p…

Representative Results

Ett allmänt schema över de förfaranden som visas i figur 2 med ett exempel transfektion plan för tre test RNA och en styr RNA tillhandahålls i figur 2B. För virala produktion och cellernas viabilitet analyser är utläsningen för varje test konstrukt normaliserat till en negativ kontroll. Replikat transfekteras i satser, så att varje test RNA normaliserades till dess intilliggande negativ kontroll. Detta görs för att undvika felaktiga uppgifter…

Discussion

HIV-1-produktion analys som beskrivits utfördes med användning av HEK293T-celler (figur 2) och liknar analyser som användes för att screena HIV-1-RNA för effektiv ribozym 13, shRNA 10,29, siRNA 30, och U1i RNA 11,31 målställen. Med hjälp av olika metoder för att kvantifiera HIV-1-produktion, har de flesta studierna mättes viral produktion 48 timmar efter samtransfektion av en HIV-1-expressionsplasmid med kandidat RNA. Följer på produktionen av HIV-…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Arbetet presenteras här stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) (ger DCB-120.266, PPP-133.377 och HBF-348.967 till AG).

Materials

DMEM HyClone GE Healthcare SH30243.01
FBS HyClone GE Healthcare SH30396.03
Penicillin/Streptomycin Gibco Thermo Fisher 15140-122
Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. Corning 353075, 353047, 353043
Micro tubes Axygen Corning 311-08-051
Low molecular weight Poly I:C InvivoGen 3182-29-6
DharmaFECT-1 Dharmacon T-2001-01 transfection reagent for synthetic RNAs
TransIT-LT1 Mirus MIR 2300 transfection reagent for RNA expression plasmids
Nonidet P40 (NP-40) USB 19628
[32P]dTTP Perkin Elmer BLU505H
poly(A) RNA template  Sigma-Aldrich 10108626001
oligo(dT)12-18 DNA primer Thermo Fisher 18418-012
DEAE filtermat paper  Perkin Elmer 1450-522
Microplate scintillation counter Perkin Elmer 1450-024
MTT Sigma-Aldrich M-2128
DPBS HyClone GE Healthcare SH30028.02
Microplate spectrophotometer Bio-rad 1706930
Lysis buffer tablets Roche 4693159001, 4906837001 protease and phosphatase inhibitors
Microcentrifuge Eppendorf 5415R
Bradford reagent Bio-rad 500-0006
Gel running chamber Hoefer SE600
Semi-dry transfer cell Bio-rad 1703940
Protein ladder EZ-Run Thermo Fisher BP3603-500
Nitrocellulose membrane Bio-rad 162-0094
BSA Sigma-Aldrich A9647-1006
Antibody stripping solution Millipore 2504
ECL – Pierce Thermo Fisher  PI32106
ADAR1 antibody from Dr. B.L. Bass
phospho-T446-PKR antibody Abcam ab32036
phospho-S396-IRF3 antibody Cell Signaling 4947
PKR antibody from Dr. A. Hovanessian
IRF3 antibody Cell Signaling 11904
Actin antibody Millipore MAB1501
Peroxidase-labeled goat anti-rabbit KPL 474-1506
Peroxidase-labeled goat anti-mouse KPL 474-1806
Ponceau S  Sigma-Aldrich 6226-79-5

References

  1. Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
  2. Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
  3. Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
  4. DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
  5. Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
  6. DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
  7. Scarborough, R. J., Gatignol, A. HIV and Ribozymes. Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).
  8. Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
  9. Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
  10. McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
  11. Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
  12. Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
  13. Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
  14. Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
  15. Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
  16. Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
  17. Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
  18. Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev – mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
  19. Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
  20. Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
  21. Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
  22. Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  25. Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
  26. Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
  27. Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
  28. Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
  29. ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
  30. Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
  31. Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
  32. Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
  33. Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
  34. Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
  35. Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
  36. Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
  37. Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
  38. Riss, T. L., et al., Sittampalam, G. S., et al. . Assay Guidance Manual. , (2004).
  39. Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
  40. Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).

Play Video

Cite This Article
Scarborough, R. J., Adams, K. L., Del Corpo, O., Daher, A., Gatignol, A. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (115), e54486, doi:10.3791/54486 (2016).

View Video