Introduction
Uma limitação dos actuais tratamentos do HIV-1 é que eles devem ser cronicamente administrado para prevenir a progressão da doença. Transplantação de VIH-1 resistente a linfócitos T, ou células-tronco hematopoiéticas, tem o potencial para proporcionar um controlo de longa duração de replicação do HIV-1 na ausência do tratamento medicamentoso 1,2 e pode também ser uma abordagem eficaz para atingir uma cura de HIV-1 3. Uma maneira de tornar as células resistentes ao HIV-1 é a replicação para inserir um ou mais genes que codificam para anti-HIV-1 RNA ou péptidos em células de um indivíduo infectado durante um transplante autólogo 4. Vários genes candidatos anti-VIH-1 foram concebidos com alguns estudos clínicos que entram em combinações de dois ou três 5 6, para prevenir o desenvolvimento de resistência do HIV-1 para um único gene.
Anti-HIV-1 RNA estão entre os principais candidatos para a terapia de combinação de genes devido ao seu baixo potencial para provocar respostas imunes e porquesão transcritas a partir de sequências de genes muito curtos. Alguns-HIV-1 anti RNAs foram projetados para direcionar entrada e de integração viral. No entanto, a maioria dos ARNs anti-HIV-1 como alvo passos pós-integração no ciclo de vida viral (Figura 1). Inibidores pós-integração incluem RNAs de engodo, tendo como alvo os HIV-1 proteínas reguladoras Tat ou Rev 1, e RNAs à base de anti-senso, tendo como alvo locais diferentes em HIV-1 RNA, como as ribozimas 7, 8 e shRNAs U1i RNAs 9. Os métodos que foram utilizados para comparar a eficácia dos anti-HIV-1-RNA incluem a monitorização de replicação virai nas células transduzidas com genes que codificam para os ARN candidatas e medindo a produção virai em células transitoriamente transfectadas com plasmídeos que expressam os ARN candidatas e um plasmídeo de expressão de HIV-1 10 -13. Nós já usou um ensaio de produção HIV-1 para a tela HIV-1 RNA para sites de destino nova ribozimas 13-15. Estes métodos já foram refinados para optimizar o formato de um ARNmolécula de interferência expressa a partir de DNA de plasmídeo como um shRNA ou entregue como um siARN sintética 16. O ensaio mede a produção de vírus maduras a partir de células 293T de rim embrionário humano (HEK), e pode ser usado para comparar os efeitos dos inibidores que têm como alvo as etapas de pós-integração no ciclo de replicação do HIV-1 (Figura 1). Para os inibidores que têm como alvo as etapas de pré-integração, ensaios alternativos, tais como um ensaio de infecciosidade de células TZM BL-17 são necessários para avaliar a eficácia antiviral.
As principais preocupações de segurança para a entrega de anti-HIV-1 RNA na clínica incluem potenciais efeitos fora do alvo em RNAs humanos ou proteínas, e ativação de sensores imune inata. Para avaliar a toxicidade do anti-HIV-1 siRNAs, utilizou-se um ensaio de viabilidade celular em diferentes linhas celulares 16. Nós também medido activação dos sensores imunes ARN de cadeia dupla, ARN activada proteína quinase R (PKR) e Toll like receptor 3 (TLR3), bem como expressão do gene de interferão estimulada, p150 ADAR1. Estes ensaios podem ser utilizados para confirmar que a eficácia do anti-HIV-1 RNA não é devido aos efeitos indirectos sobre a viabilidade celular ou a activação do sensor imune. Eles são também úteis na exclusão com RNAs candidatos potenciais toxicidades de desenvolvimento posterior.
Nos seguintes protocolos, os procedimentos para identificar novos RNAs terapêuticos e optimizar o formato das existentes são descritos. Os métodos são úteis para inibidores pós-integração baseadas em ARN rastreio de HIV-1 da replicação e pode ser adaptado para o rastreio de outros inibidores pós-integração, tais como pequenas moléculas de direccionamento Rev exportação mediada por ARN viral 18 ou CRISPR / sistemas Cas concebidos para direccionar integrada HIV-1 DNA 19.
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Protocol
1. Células e transfecções
- Culturas de células HEK 293T em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. Prepara-se uma suspensão de 2 x 10 5 células / mL no meio de cultura celular. Adicionar 500, 100 e 1.000 mL da suspensão de células a cada poço de 24 poços, 96 poços e 12 poços placas, para a produção virai, a viabilidade celular e ensaios de activação imunitária, respectivamente (Figura 2A).
- Agite suavemente as placas e incubar O / N a 37 ° C com 5% de CO 2. Cultivar células a 50-70% de confluência.
- De acordo com um plano de transfecção, preparar diluições de ARN de teste e os controlos em tubos de 1,5 ml (micro exemplo, a Figura 2B).
- Para o ensaio de produção viral, preparar uma diluição de 10 ng / ul de um plasmídeo de expressão de HIV-1 e adicionar 10 uL a cada tubo. Próximo preparar 5 uM diluições de ARN de teste e um controlo negativo RNA. Adicionar 2,5 ou 10 ul de cada diluição de ARN de teste e de controlo negativo aos tubos correspondentes para 25 ou 100 nM de concentração final.
- Para o ensaio de viabilidade de células, preparar 5 uM diluições de ARN e um teste de 10 mg / ml de diluição do ARN de controlo positivo, de baixo peso molecular, poli I: C. Adicionar 2 mL de ARN de teste, ou de diluições de ARN controlo positivo para os correspondentes tubos de 100 nM ou 200 ug / ml de concentração final, respectivamente.
- Para o ensaio de activação imunitária, adicionar 20 ul de ARN de teste, ou de diluições de ARN de controlo positivo, preparado no passo 1.3.2. aos tubos correspondentes para 100 nm ou 200 ug / ml de concentração final, respectivamente.
Nota: Para os plasmídeos de expressão de ARN de teste, preparar diluições de 10 ng / ul em vez dos 5 uM diluições de ARN de teste, dando quantidades finais de 25 e 100 ng para o passo 1.3.1. e 100 ng para etapas 1.3.2. e 1.3.3.
- Adicionam-se 50, 25 ou 75 ul de DMEM a cada tubo de transfecção para prod viralução, a viabilidade celular e ensaios de activação imunitária, respectivamente. Para os ensaios de produção virais, trazem células e tubos de transfecção preparados para a 3 (BSL3) laboratório nível bio-segurança antes da próxima etapa.
- Adicionar 2 ml da sequencialmente reagente de transfecção para os tubos de transfecção e incubar 15 min a 20 para permitir que os complexos de modo a formar. Ver a Tabela de Materiais para o reagente de transfecção específico a ser utilizado.
- Adicionar toda a mistura de transfecção de cada gota a gota, para as posições correspondentes nas placas de cultura de células micro tubo. Agite suavemente e incuba-se as placas durante 48 h a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Meça HIV-1 de produção (seção 2), a viabilidade celular (seção 3) e ativação imune (secção 4) nas placas de cultura de células (Figura 2C).
2. Ensaio de produção virai
- Remover as placas de cultura celular de 24 poços da incubadora e agitar suavemente as placas no interior da cultura de células BSL3capuz. Transferir 150 ul de sobrenadante de cada poço para um poço correspondente de uma placa de 96 poços de fundo plano, que vai ser utilizado para quantificar a produção de HIV-1.
Nota: Os ensaios de quantificação virais mais comuns incluem a medição da expressão da proteína da cãpside de HIV-1 (p24) pelo ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) 20, a quantificação de ARN viral por transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) 21 e medindo a actividade da enzima RT HIV-1. Passos 2.2 a 2.5 explicar métodos para quantificar HIV-1 actividade RT 13,15,16. - Transferência de 5 ul de sobrenadante para poços correspondentes de uma placa de 96 poços, contendo 25 ul de uma perturbação viral cocktail 15 (Tabela 1). Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente e transferir a placa para uma estação de trabalho radioactividade.
Nota: Passo 2.2. só é necessário se uma estação de trabalho de radioactividade que não está disponível no laboratório BSL3. Se as placas não precisam de ser removidos dolaboratório BSL3, vá para o passo 2.3. e adicionar 50 ul de radioactivos / viral cocktail ruptura (Tabela 1) em lugar dos 25 ul de coquetel radioactivos. - Prepara-se uma radioactivos cocktail 15 (Tabela 1), e adicionar 25 ul a cada poço de sobrenadante viral e cocktail de interrupção. Incubar as placas a 37 ° C durante 2 h.
- Ponto 5 uL da mistura de reacção sobre quadrados correspondentes de uma fibra de vidro Di Etil amino-etil (DEAE) de papel filtermat e deixar que as gotas para secar durante 10 min. Manchar a mistura de reacção em todos os outros quadrados de modo que não há duas amostras Boarder diretamente um ao outro. Isto ajuda a evitar o cruzamento entre amostras para determinar as contagens por minuto (cpm) no passo 2.6.
- Lavar os papéis 5x durante 5 min com tampão de 2x citrato de sódio salino (SSC) (Tabela 1), seguido por duas lavagens com um mínimo de 95% de etanol. Permitir que os papéis para secar e selá-los em sacos de amostras.
- Clip sacos de amostras containing do papel filtermat em uma fita e insira a cassete em um contador de cintilação de microplacas. Definir o contador para ler cpm de 32 P com a data de referência prevista para o lote de [32 P] dTTP utilizado na experiência. Selecionar quais amostras de ler usando o mapa da placa e iniciar o contador.
- Para qualquer método de quantificação viral, dividir os valores obtidos para cada teste de ARN pelo controlo negativo adjacente e multiplicar este valor por 100 para obter a percentagem de inibição da produção do VIH-1 para cada repetição dos ARN de teste. Um exemplo dos resultados que comparam diferentes RNAs de teste em diferentes concentrações é fornecido na Figura 3.
3. ensaio de viabilidade celular
- Remover as placas de 96 poços a partir da incubadora e adicionar 20 uL de 5 mg / ml de MTT (brometo de 3- [4,5-dimetil-2-tiazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazólio), diluído em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco ( DPBS) a cada poço. Incubar as placas de fou 3 horas a 37 ° C.
- Adicionar 150 uL de isopropanol, acidificado com detergente (1% de NP-40, de HCl 4 mM em isopropanol) a cada poço e incuba-se as placas durante 2 horas à temperatura ambiente.
- Determinar a absorvância a 570 nm num espectrofotómetro de microplacas.
- Calcular o metabolismo de MTT relativo para cada ARN de controlo e de teste positivo, dividindo o valor obtido para cada amostra pelo seu controlo de transfecção adjacente. Um exemplo dos resultados que comparam diferentes RNAs de teste e um controlo positivo é fornecida na Figura 4.
4. Activação Ensaio Imunológico
- Remover as placas de 12 poços a partir da incubadora e aspirar o meio de cultura. Lavar suavemente as células duas vezes com DPBS e adicionar 70 ul de tampão de lise frio de 22 (incluindo os inibidores de protease e fosfatase, quadro 1) a cada poço. Incubar as placas durante 10 min em gelo.
- Transferir os lisados celulares para micro tubos e rápido congelá-los por imersão dotubos em azoto líquido. Permitir que as amostras para descongelar e repetir por mais 2 ciclos de congelação descongelação para um total de 3.
- Centrifugar os lisados durante 15 minutos a 4 ° C, 15700 x g, para sedimentar os detritos celulares. Transferir o sobrenadante para novos tubos de micro e determinar a concentração de proteína usando o método de azul de Coomassie (Bradford) 23,24.
- Resolver 75 ug de proteína de cada amostra num gel de poliacrilamida desnaturante a 10% e transferir para uma membrana de nitrocelulose como anteriormente descrito 25,26.
- Após electroforese e transferência para uma membrana, revelam bandas de proteína por incubação da membrana em Ponceau S (Tabela 1) durante 1 min seguido de lavagem em água destilada duas vezes. Use as bandas e escada proteína como um guia para cortar a membrana em 80 e 55 kDa.
Nota: No passo 4.4 amostras pode ser executado em 16 x 18 cm 2 géis para baixo a 34 kDa, de modo que é fácil de cortar a membrana nas posições especificadas e não cortar através dabandas de interesse. Alternativamente, vários géis podem ser executados com as mesmas amostras para evitar o corte da membrana. - Lavar a coloração de Ponceau S com solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% de Tween 20 (TBST, Tabela 1). Adicionar TBST com leite não gordo a 5% para cobrir completamente as membranas. Incubam-se as membranas à temperatura ambiente com agitação durante 1 h.
- Incubam-se as membranas de O / N em TBST, com 3% de albumina de soro bovino (BSA) e anticorpos diluídos a 1: 1000 contra ADAR1 (110 e 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), e fosfo-IRF3 (47 kDa), para as peças de topo, meio e inferior da membrana, respectivamente.
- Lavam-se as membranas 5x durante 5 min com TBST e incubar em TBST com 5% de leite sem gordura e os anticorpos secundários anti-coelho de cabra marcado com peroxidase (diluído a 1: 5000) durante 1 h.
- Lava-se a membranas de 5x durante 5 min com TBST e aplicar a solução de electroquimioluminescência (ECL) para visualizar as bandas em películas de acordo as instruções do fabricante.
- Depois de visualizar as bandas de proteína sobre os filmes, lavar as peças do meio e inferior da membrana durante 10 minutos com uma solução de anticorpo de extracção. Incubam-se as membranas de o / n em TBST, com 3% de BSA e anticorpos contra PKR total de (a 1 em 500) e IRF3 (a 1 em 1000), para o meio e pedaços de fundo, respectivamente. Repita os passos 4.8. e 4,9. usando marcado com peroxidase de cabra anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho para a membrana PKR (meio).
- Lava-se a peça de fundo da membrana 5x durante 5 min com TBST e incubar a membrana em TBST, com 3% de BSA durante 1 hora com um anticorpo contra actina (diluído a 1: 5000). Repita os passos 4.8. e 4,9. usando marcado com peroxidase de cabra anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho. Um exemplo de resultados comparando diferentes RNAs de teste e um controlo positivo é fornecido na Figura 5. Veja a Tabela de Materiais para os anticorpos específicos a serem utilizados.
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Representative Results
Um esquema geral dos processos é mostrado na Figura 2, com um plano de transfecção exemplo para três RNAs de teste e um ARN de controlo fornecida na Figura 2B. Para os ensaios de viabilidade celular de produção e virais, a leitura para cada construto de teste é normalizada para um controlo negativo. Os duplicados estão transfectadas em conjuntos, de modo que cada ARN teste é normalizado para o seu controlo negativo adjacente. Isto é feito para evitar dados incorrectos relacionados com o tempo entre a complexação e a transfecção, o que pode ocorrer se, por exemplo, todos os controlos negativos são transfectadas primeiro. Uma vez que o HIV-1 pode afectar as respostas imunitárias 27,28, a viabilidade celular e ensaios de activação do sistema imunológico são feitas sem a adição de um VIH-1 expressando plasmídeo.
Para identificar a duração óptima de moléculas de interferência de ARN alvo um local conservado em HIV-1 RNA (posição 1498-141519 em estirpe HIV-1 NL4-3) 13, um conjunto de siRNAs foram desenhados (Figura 3A). Utilizando o ensaio de produção de HIV-1, a percentagem de actividade de RT comparado com células transfectadas com um longo Dicer substrato absurdo siRNA (Sins) foi calculada para as células transfectadas com cada um siRNA de teste em diferentes quantidades de co-transfecção com 100 ng de um plasmídeo que expressa estirpe HIV-1 NL4-3 (Figura 3B).
Usando o ensaio de viabilidade celular, o metabolismo por cento de MTT foi determinada para as células transfectadas com os siRNAs mais eficazes identificadas na Figura 3B. Os dados foram normalizados para o metabolismo de MTT em células tratadas com o reagente de transfecção sozinho (Figura 4). Uma longa ARN de cadeia dupla (Poly I: C) reduziu a viabilidade celular; No entanto, o efeito foi significativo apenas na dose mais elevada avaliada. Não foi observada redução significativa na viabilidade celular para siRNAs visando a si 1498 te em ARN VIH-1, independentemente do seu comprimento. Usando o ensaio de activação imunitária, o mesmo conjunto de RNAs foram avaliadas quanto ao seu potencial para desencadear respostas imunes (Figura 5). Em condições em que a poli I: C activada a expressão de p150 ADAR1 e fosforilação induzida de PKR e IRF3, sem efeito significativo nos marcadores de activação imunitária poderia ser observado para qualquer um dos RNAs de teste.
Figura 1. Representação esquemática das etapas de pré e pós-integração no ciclo de replicação do HIV-1. Pré-integração (1-3) e de pós-integração (4-7) passos no ciclo de replicação do HIV-1 são apresentados em caixas delineadas . por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2. Representação esquemática da produção viral, a viabilidade celular e ensaios de ativação imune. Células aderentes (A) placa e cultura, durante 24 horas. As células são plaqueadas em 24-, 96- e 12- placas de poços em 500, 100 e 1.000 ul de meio de cultura celular para a produção virai, a viabilidade celular e ensaios de activação imunitária, respectivamente. (B) Prepare tubos de transfecção, as células transfectar e cultura durante 48 horas. Um exemplo de plano de transfecção de um conjunto de três RNAs de ensaio (RNA1-3) é mostrado com os controlos apropriados. O procedimento de transfecção é também ilustrada. (C) Leia-out. A leitura de para a produção viral, a viabilidade celular e ensaios de ativação imune são escritos e explicados em detalhe nas secções 2, 3 e 4, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ P>
Figura 3. Efeito de siRNAs de teste para o HIV-1 de produção. (A) Projeto de siRNAs com diferentes comprimentos e simetrias. Uma sequência conservada no RNA do HIV-1 (1,498 local alvo) foi utilizada para desenhar os siRNAs simétricos e assimétricos (si1498-) com diferentes comprimentos (17 e 29 cadeias de sentido de nucleótidos). O sentido esperado (parte superior, preto) e antisense (parte inferior, vermelho) vertentes são indicadas. (B) Inibição da produção de HIV-1 por variantes de comprimento si1498. A percentagem de inibição (%) do HIV-1 a actividade de RT no sobrenadante das células HEK293T transfectadas com variantes comprimento si1498 simétricas ou assimétricas é mostrado em relação a uma longa absurdo substrato Dicer siRNA (pecados). Cada ARN de teste foi comparado com pecados de diferentes doses em pelo menos duas transfecções independentes com dois a três repetições. Os dados são exprEssed como valores médios ± meios de erro padrão (SEMs). Esta figura foi modificada a partir de 16, copyright Sociedade Americana de Microbiologia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Efeito do comprimento si1498 variantes sobre a viabilidade celular de células HEK293T foram transfectadas com poli I:. C, a 50 e 200 ug / ml (pIC50 e PIC200) e comprimentos diferentes e formatos de si1498 a 100 nM. O metabolismo% de MTT foi determinada relativamente a células tratadas com o reagente de transfecção sozinho (Mock, M) em três transfecções independentes com dois a três repetições. Os dados são expressos como valores médios ± SEMs. Student não pareado testes t foram usadas para determinar se a diferentes transfecções significantly (*, P <0,05) reduziu a viabilidade celular relativa para as células falsamente transfectadas. Esta figura foi modificada a partir de 16, copyright Sociedade Americana de Microbiologia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Efeito do comprimento si1498 variantes em respostas imunes inatas. Células HEK293T foram transfectadas com pIC50, PIC200 e comprimentos diferentes e formatos de si1498 a 100 nM. A activação de PKR e TLR3 foram avaliados através da medição da PKR fosforilada e IRF3, respectivamente. A expressão de um gene de interferão estimulada (ISG) foi avaliada através da medição dos ISG ADAR1 P150 níveis relativos à variante constitutivamente expresso, p110 ADAR1. A expressão da actina foi utilizado como um controlo de carga. esta figure foi modificado a partir de 16, copyright Sociedade Americana de Microbiologia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do Tampão / Reagente | Composição |
| Cocktail interrupção Viral | Tris-HCl 60 (a partir de Tris-HCl 1 M, pH 7,8), KCl 75 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1,04 mM, 1% de NP-40. |
| cocktail radioativo | Tris-HCl 60 (a partir de Tris-HCl 1 M, pH 7,8), KCl 75 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1,04 mM, 10 ug / ml de poli (A), 0,33 ug / ml de oligo dT. Adicionado imediatamente antes da utilização: ditiotreitol 8 mM (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) e 5 ul [32 P] dTTP (3.000 Ci / mmol) Por cada 500 ul de coquetel. |
| Radioactive cocktail perturbação / viral | Tris-HCl 60 (a partir de Tris-HCl 1 M, pH 7,8), KCl 75 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1,04 mM, 0,1% de NP-40, 5 ug / ml de poli (A), 0,16 ug / oligo ml dT. Adicionado imediatamente antes da utilização: ditiotreitol 8 mM (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) e 5 uL de [32P] dTTP (3000 Ci / mmol) para cada 1 mL de coquetel. |
| 2x SSC | 17,53 g de NaCl e 8,82 g de citrato de sódio - 2H 2 O em 2 O. 1 LH |
| O tampão de lise | Tris-HCl 50 (a partir de Tris-HCl 1 M, pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM (a partir de 0,5 M, pH 8,0), 10% v / v de glicerol, 1% v / v de NP-40. |
| Ponceau S | 2,5 g de Ponceau S e 5 ml de ácido acético em 500 ml de H 2 O. |
| TBST 6,05 g de Tris, 8,76 g de NaCl e 1 mL de Tween 20 em 1 LH 2 O. |
Tabela 1:. Componentes de tampões não-comerciais e reagentes Receitas para todos os tampões não comerciais e reagentes são fornecidos.
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Discussion
O ensaio de produção de HIV-1 descrita foi realizada utilizando células HEK293T (Figura 2) e é semelhante para os ensaios utilizados para rastrear ARN de HIV-1 para ribozima eficaz 13, shRNA 10,29, ARNsi 30, e U1i locais de ARN alvo 11,31. Usando diferentes métodos para quantificar a produção de HIV-1, a maioria dos estudos mediram a produção virai de 48 h após a co-transfecção de um plasmídeo de expressão do VIH-1 com RNAs candidatos. Após a produção do VIH-1, os viriões imaturos sofrem clivagem proteolítica dos seus poliproteínas pelo HIV-1 protease para se tornar viriões maduros, capazes de infectar novas células. Para o ensaio da actividade enzimática de RT de HIV-1 descrito nas etapas 2.2. a 2.5., tanto a produção e as etapas de maturação são avaliados, uma vez que a enzima RT só está activo em viriões maduros. Em contraste, a proteína da cápside virai e ARN podem estar presentes em ambos os viriões maduros e imaturos. Portanto, quantificar a produção do VIH-1 por ELISA p24 ou RT-PCR may perca efeitos de ARN terapêuticos que actuam no passo de maturação do ciclo de replicação do HIV-1, tais como ribozimas que localizam ao HIV-1 virions 32 e moléculas baseadas em anti-sentido que inibem o processamento da mordaça, para além do VIH-1 a expressão da proteína 13, 31. Uma limitação de ensaios de produção virai é que as células utilizadas não expressam os receptores apropriados para o HIV-1 de entrada e não pode ser usado para avaliar os efeitos terapêuticos de ARN de HIV-1 de entrada ou de integração.
Para avaliar os efeitos de anti HIV-1 ARN em todo o ciclo de replicação, vários modelos de infecção por HIV-1 têm sido utilizadas em diferentes linhas de células T de linfócitos ou células sanguíneas primárias 5,33. Uma vez que estas linhas celulares são difíceis de transfectar, mais métodos de trabalho intensivo, como a inserção de genes de vetor lentiviral ou aptâmero / conjugação de péptidos são necessários para entregar uma quantidade suficiente de HIV-1 anti RNAs para observar os efeitos na replicação do HIV-1. Esta limitação torna difficult comparar rapidamente a relação estrutura-actividade entre variantes de um determinado ARN anti-HIV-1 ou realizar o rastreio em larga escala para identificar o local alvo ideal para novas classes de anti-HIV-1 RNA. Embora os ensaios de produção virais têm sido úteis para identificar novas moléculas anti-HIV-1-RNA, modelos celulares alternativos em linhas celulares facilmente transfectadas que suportam a replicação de HIV-1, tais como células-bl TZM, seria útil para o rastreio de anti-HIV-1 RNAs dirigidas a outras etapas do ciclo de replicação, como a entrada e integração.
Dependendo da classe de anti-HIV-1-RNA, foram descritos vários mecanismos potenciais de toxicidade. Por exemplo, ARN anti-sentido com base em pode ter efeitos fora do alvo de ARN celulares contendo a mesma ou uma sequência semelhante ao seu local alvo pretendido em HIV-1 RNA. Da mesma forma, aptâmeros de RNA, modelado após o elemento de resposta de trans-activação (TAR) ou Rev elemento de resposta (RRE), pode afetar a função do pr celularoteins, tais como a proteína de ligação de ARN de TAR (TRBP) 34. shRNAs siRNAs e têm o potencial para afectar adicionado a via interferência de ARN por sequestrantes proteínas de ARNi 35 e algumas moléculas U1i foram mostrados para afectar o splicing e de processamento de ARN celular por sequestro de proteínas da pequena U1 RNA-proteína nuclear complexo 36. Embora alguns desses efeitos podem ser minimizados pelo design cuidado, as medições da toxicidade celular em telas para novas moléculas anti-HIV-1 RNA são úteis na exclusão de moléculas com potenciais efeitos fora do alvo de maior desenvolvimento. Além disso, os efeitos fora do alvo poderia indiretamente inibir HIV-1 de produção, tornando toxicidade celular uma medida importante na validação da eficácia de novos anti HIV-1-moléculas identificados a partir de telas de HIV-1 de produção.
O ensaio de viabilidade celular descrito nas etapas 3.1. para 3,4. é uma variante de um ensaio padrão que tem sido utilizado para rastrear molécula antiviral diversificada S 37. O ensaio mede a actividade de enzimas celulares de NAD (P) H-dependentes para reduzir o reagente MTT a sua forma insolúvel púrpura, formazano. O protocolo é adaptado de métodos previamente publicados 38 e vários kits estão disponíveis usando MTT ou outros reagentes estreitamente relacionadas. Embora seja importante para ensaio de viabilidade celular na linha celular utilizada para o rastreio de anti-HIV-1 RNA, deve notar-se que diferentes linhas de células variar na sua sensibilidade para a toxicidade induzida por ARN. Por exemplo, Reynolds et ai. Demonstraram que os siRNAs Dicer substrato não teve nenhum efeito sobre a viabilidade celular em células HEK293T, mas a viabilidade celular significativamente reduzida em células MCF7, DU145 e células HeLa S3 39. Para o ensaio aqui descrito, as células HEK293T são usados como um exemplo (Figura 4); No entanto, o mesmo ensaio foi também realizado em células MCF-7 para avaliar a toxicidade potencial de uma linha de células que é mais sensível a pequenas toxicidade induzida por 16 de ARN.
e_content "> Uma vez que o HIV-1 anti ARN não pode ser processado e apresentado ao sistema imunitário adaptativo, eles são considerados menos imunogénica em comparação com anti-HIV-1 de proteínas ou péptidos. No entanto, dependendo da sua sequência ou estrutura, que pode eliciar inata respostas imunes, e vários sensores imunes e vias de sinalização tenham sido identificados que podem responder aos pequenos RNAs (revisto em 40). no ensaio de activação imunitária aqui descrita, os níveis de PKR fosforilada e IRF3 foram comparados em células transfectadas com pequenos RNAs como um indicação de PKR ou TLR3 activação, respectivamente. Ambos os sensores de ARN estão presentes numa vasta gama de linhas celulares e a sua activação pode levar à produção de tipo 1 interferões e, no caso de PKR, uma paragem de tradução. para avaliar o potencial para anticorpos anti HIV-1-RNA para activar a produção de interferons do tipo 1 por vias alternativas, os níveis da ADAR1 gene estimulado-interferão (p150) foram também comparados em células transfectadas comanti-HIV-1 RNA. Tal como demonstrado pelos efeitos do tempo de controlo positivo ARNcd, poli I: C, todas estas respostas eram activos em células HEK293T (Figura 5) e foram observados efeitos semelhantes em células MCF7 16. Uma vez que estas respostas poderiam inibir a produção do VIH-1, na ausência de efeitos sobre a viabilidade das células, o ensaio de activação imune fornece uma validação adicional para a eficácia de novos RNAs anti-HIV-1. Outras medidas que podem ser adicionados a esta avaliação incluem a medição da produção de citoquinas inflamatórias do tipo 1 e interferões no sobrenadante da cultura celular, e medindo a expressão de vários genes de interferão-estimuladas. Uma vez que as células alvo do HIV, tais como as células T CD4 + e os macrófagos podem expressar níveis diferentes de sensores imunes inatas, candidatos identificados a partir dos ensaios descritos no presente protocolo também devem ser avaliadas por estimulação imunológica potencial nestes tipos de células.Para todos os ensaios descrevemd, o passo crítico para a obtenção de resultados reprodutíveis e precisos, é a preparação dos tubos de transfecção de ADN ou ARN (passo 1.3.). O DNA de plasmídeo ou de ARN deve ser de elevada pureza com concentrações determinada com precisão. Também é crítico para incluir os controlos apropriados. Para a avaliação de novos plasmídeos de expressão de ARN de teste no ensaio de produção viral, um controlo negativo adequado é o plasmídeo de expressão vazio. Para os ARN anti-sentido com base em, um plasmídeo de controlo negativo adicional que expressa um ARN não segmentação também devem ser incluídos. As sequências para uma ribozima não-direccionamento e shRNA que não afectam a produção de HIV são fornecidos em 13. Para siRNAs de teste, o único controlo negativo que pode ser utilizado é um ARN não-direccionamento e um não-sequência de direccionamento siRNA apropriado para o ensaio de produção virai é fornecida em 16. Para a viabilidade celular e ensaios de activação do sistema imunológico, o controlo negativo deve ser células tratadas com o reagente de transfecção sozinho e é critical que um controlo positivo, tal como poli I: C é incluído para confirmar que as células são sensíveis à toxicidade induzida por ARN ou activação imunitária. Para os plasmídeos de expressão de ARN, o plasmídeo vazio também devem ser incluídos para garantir que o próprio vector não tem efeitos tóxicos sobre as células.
Em geral, os ensaios aqui descritos representam um bom primeiro passo para a identificação de terapias de ARN seguros e eficazes para utilização no HIV-1 gene ou a terapia de droga. As moléculas de direccionamento para o HIV-1 RNA, é também importante considerar a conservação do seu local alvo em métodos detalhados estirpes de HIV-1 circulante, e para calcular a conservação da sequência foram publicados previamente 15. Para mover uma molécula para a frente em ensaios clínicos, estudos de toxicidade e eficácia a longo prazo devem ser realizados em células humanas primárias e em modelos animais para confirmar que os candidatos identificados serão segura e eficaz na clínica.
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Acknowledgments
O trabalho aqui apresentado foi apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) (concede DCB-120.266, PPP-133377 e HBF-348967 para AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
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