Summary
Um protocolo modificado para a manipulação ploidy usa um choque de calor para induzir uma tenda de um ciclo na citocinese no embrião. Este protocolo é demonstrado no peixe-zebra, mas podem ser aplicados a outras espécies.
Abstract
Manipulação de ploidia permite transformações úteis, tais como diplóides para tetraploids, ou haplóides para diplóides. No peixe-zebra Danio rerio, especificamente a geração de diplóides ginogenéticos homozigóticos é útil na análise genética, porque permite a produção directa de homozigotos de um único mãe heterozigótica. Este artigo descreve um protocolo modificado para a duplicação de ploidia com base num impulso de calor durante o primeiro ciclo celular, choque térmico 2 (HS2). Através da inibição de duplicação centriole, este método resulta em uma tenda preciso divisão celular durante o segundo ciclo celular. A baia de divisão de um ciclo preciso, acoplado a duplicação DNA afetado, resulta na duplicação do genoma inteiro. Protocolos associados com este método incluem ovo e esperma recolha, tratamento com UV de esperma, fertilização in vitro e pulso de calor para provocar um atraso da divisão do ciclo de uma célula e a duplicação de ploidia. Uma versão modificada deste protocolo pode ser aplicadopara induzir alterações de ploidia em outras espécies animais.
Introduction
Este protocolo permite a manipulação de ploidia de embriões de peixe-zebra, tal como na geração de diplóides ginogenéticos homozigóticos de haplóides ginogenéticos (Figura 1) ou a produção de tetraplóides. Isto é conseguido através da indução de um atraso na citocinese correspondente a precisamente um ciclo celular (Figura 2A, 2B). O atraso tecla de um ciclo na citocinese é conseguido por tratamento com choque térmico. O protocolo padrão de Choque Térmico (SH) como originalmente descrito por Streisinger e colegas envolvido um impulso de temperatura durante o período de MPF 13-15, resultando em uma tenda a divisão celular de um ciclo durante o primeiro ciclo celular 1. A eficiência deste protocolo foi recentemente melhorado pela digitalização dos ciclos celulares início com uma janela deslizante temporal do tratamento de choque térmico. Esta verificação identificado um ponto de tempo depois de um choque de calor, ainda dentro do primeiro ciclo celular (22-24 MPF), que resulta em uma maior taxa de EMBRyos com uma tenda a divisão celular de um ciclo, que neste caso afecta o segundo ciclo celular 2. A observação de que as manipulações experimentais durante o primeiro ciclo celular interferir com a divisão celular durante o segundo ciclo celular e causar a duplicação do ADN conteúdo também tem sido relatada em outras espécies de peixe 3,4. Referimo-nos a este protocolo modificado como Choque Térmico 2 (HS2 - o termo "2" indica que o impulso de calor ocorre num ponto de tempo mais tarde do que o método HS padrão, e que o atraso do ciclo celular causado por HS2 ocorre durante o segundo ciclo celular ). Estes estudos mostraram que a base de prisão citocinese após o choque térmico é a inibição de duplicação centriole durante o impulso de calor, o que afecta a formação do fuso e indução sulco no seguinte ciclo celular. Resultados HS2 em rendimentos de parada do ciclo celular se aproximando de 100%, e as taxas de ploidia duplicação até 4 vezes superior HS standard 2.
sagacidade embriões tratadosha choque térmico durante o ciclo celular blastomere apresentam muitos efeitos deletérios, sugerindo que o choque térmico afeta vários processos necessários para a divisão celular 2. Por outro lado, se o choque de calor é aplicada antes do início do ciclo celular (período de tempo de 0-30 MPF), parece ter efeitos consistentes com interferência específica com a duplicação centriole e não parece afectar outros processos celulares essenciais 2 . Estes estudos mostraram que o tempo antes da iniciação da divisão blast�ero parece ser um período de desenvolvimento passível de choque térmico utilizando como ferramenta para manipular especificamente através da inibição de ploidia centriole. A causa subjacente da aparente selectividade para a choque térmico na duplicação centríolo é desconhecida, mas pode estar relacionada a uma degradação seletiva de subestruturas centrossoma observados em estresse por calor em certos tipos de células, como leucócitos 5.
sincronização temporal de embrionáriosenvolvimento é conseguido por fertilização in vitro (FIV). O uso de esperma não tratada durante resultados de fertilização em embriões diplóides que após a HS2 induzidas por um ciclo tenda cytokinesis tornar tetraploid. O uso de espermatozóides tratados com UV, que transporta ligações cruzadas que inativam o seu DNA, resulta em embriões haplóides ginogenéticos 6, que após HSII induzidas por um ciclo cytokinesis tenda tornar diplóides ginogenéticos 2. Devido a toda a duplicação do genoma, resultando, os últimos ginogenéticos diplóides são homozigóticos em cada locus único em todo o genoma. Para concisão, nos referimos a ginogenéticos embriões haplóides como "haplóides" e embriões diplóides ginogenéticos homozigotos como "diplóides homozigotos". Se viáveis e férteis, diplóides homozigóticos pode ser utilizado para iniciar linhas estéreis e letais-livre. homozygosity direta induzida por HS2 deve também ser facilmente incorporados na análise genética ou telas genéticas, uma vez que diplóides homozigotos de fêmeas que são portadores heterozigotos de Muttaxas de exposição ções de homozigose em altas e fixas (50%) rácios 2.
O protocolo a seguir descreve etapas para executar HS2 e induzem a duplicação ploidy com homozigose completa. Para a produção tetraplóide, solução de esperma deve ser tratada. Para a produção de diplóide homozigótica, o esperma deve ser inactivado por tratamento com UV. Além disso, como descrito na discussão, marcadores de pigmentos visíveis pode também ser usado para facilitar a identificação dos diplóides homozigóticos. Companheiro de peixe-zebra, principalmente durante a primeira 3 horas do início do seu ciclo de luz 7, e ambos os adultos e os ovos são sensíveis aos ritmos circadianos 8, portanto, para obter os melhores resultados do procedimento de fertilização in vitro deve ocorrer dentro deste período de tempo.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a University of Wisconsin - Madison e Animal Care Institucional e diretrizes Use Committee (IACUC) (University of Wisconsin - Madison Assurance número A3368-01).
1. Seleção de fêmeas para coleta de ovos via acasalamento Interrompida
NOTA: protocolos baseados em FIV contar com a extrusão dos óvulos maduros de fêmeas através de pressão manual 9. protocolos anteriores usaram fêmeas diretamente de tanques ou em acasalamentos de pares sem as fêmeas submetidas comportamento libertação do óvulo, mas apenas uma pequena fração dessas mulheres (cerca de 20% ou menos, dependendo da linha de peixe-zebra) produzem ovos extrudados e competentes sob pressão manual. Em um procedimento melhorado, as fêmeas são pré-classificadas para a postura de ovos por observação visual direta, seguido pela interrupção imediata de acasalamento. Este procedimento é muito eficaz, como quase todas as mulheres pré-selecionados através deste rendimento etapa de acasalamento interrompido ovos extrudados e competentesmediante pressão manual.
- A tarde antes do experimento, criar pares de acasalamento da estirpe de peixe-zebra desejado em caixas de acasalamento de peixe-zebra padrão. Mantenha homens na mesma câmara como fêmeas ainda fisicamente separadas a partir deles, seja por meio de uma divisão caixa de acasalamento ou colocando o homem sob uma inserção de postura ea fêmea dentro da inserção.
- Na manhã do experimento, remover a partição física, colocando ambos os sexos masculino e feminino na mesma pastilha de postura, de modo que o acasalamento começa.
- Inspecione visualmente os tanques que contêm pares de acasalamento para detectar extrusão de ovos durante o acasalamento natural. Aos primeiros sinais de extrusões de ovo, separado masculina e feminina para interromper a reprodução. Após a separação a partir de machos, fêmeas manter os pré-seleccionado, quer separadamente ou misturadas no mesmo tanque. Use várias fêmeas, dependendo do número de embriões desejados (tipicamente 50-150 ovos / fêmea).
2. Preparar uma solução de esperma
NOTA: a fertilização in vitro relies na exposição dos ovos maduros a uma solução de esperma. Esta solução pode ser não tratada, para gerar zigotos diplóides (o qual após tratamento HS2 tornaram embriões tetraplóides) ou UV-tratado, para gerar zigotos haplóides (o qual após tratamento HS2 tornaram embriões diplóides homozigóticos). Esperma protocolos de preparação anteriores sugeriu a utilização de tubos capilares para recolha de sémen a região anal do sexo masculino vivos, mas foi um processo ineficaz uma vez que apenas uma pequena fracção de esperma produziu machos 9. O protocolo apresentado a seguir baseia-se em vez sobre a preparação esperma de testículos dissecados cortadas, que produz resultados mais confiáveis.
- Preparar a solução de Hank antes do tempo como solução de pré-mistura de um Hank, composto de todos os componentes (Soluções 1, 2, 4 e 5), exceto a solução de bicarbonato de sódio (solução 6). Preparar a solução de 6 fresco e adicionar à pré-mistura da manhã da experiência (Tabela 1). Para fazer a solução de Hanks (solução final, a preparação da manhãprocedimento de fertilização in vitro), misture 990 ul de Premix de Hank e 10 ul da recém-feitos Solução 6.
- Eutanásia machos pela exposição excessiva ao tricaina como uma solução de 0,016% em água condicionado.
- Prepare tricaina como uma solução de estoque de 0,2% em água (tampão a pH 7,0 com Tris 1M pH 9,0) e manter a 4 ° C. Adicionar 8 mL de uma solução de estoque tricaina por 100 ml de água numa proveta, e utilizar um líquido para transferir os machos à solução tricaina.
- Usar o equivalente de testículos de um macho por embraiagem necessário para ser fertilizado num volume de solução de Hank correspondente a 100 uL para cada macho (por exemplo, os testículos de 10 machos recolhidos em 1 ml de solução de Hank, para fertilizar 10 embraiagens com 100 ul / embraiagem).
- Confirmar eutanásia por cessação de movimentos de emalhar por 15 minutos. Após a eutanásia, remova os machos do copo com uma colher. Lavar os machos brevemente com água condicionada e seque-os levemente, colocando-os brevemente sobre vários locais de umapapel toalha.
- Para remover os testículos, primeiros decapitar sacrificados machos usando tesouras de dissecação ou uma lâmina de barbear, e fazer um corte longitudinal ao longo do abdômen com dissecando scissors.Under um microscópio de dissecação com uma fonte de luz refletida, remover os órgãos internos com uma pinça de dissecação. Puxe cada uma das massas testículos com uma pinça e colocá-los dentro do tubo de microcentrífuga contendo solução de Hank.
NOTA: Testículos pode ser identificado como cada uma das duas estruturas alongadas de aspecto translúcido encontrados ao lado das paredes do corpo e que convergem perto da cloaca. Testículos pode ficar 2-3 minutos sobre uma superfície da placa de Petri após a dissecação, e antes da sua colocação em solução de Hank. - Liberar o esperma para a solução por corte dos testículos com uma espátula estreita e / ou cuidado pipetando para cima e para baixo 5-6 vezes os testículos em solução com uma micropipeta 1.000 ul-ponta, evitando a formação de bolhas de ar. Deixar depositar o testículos detritos.
- Guardar a solução de espermatozóides no gelo, onde ele pode manter a sua potência para até 2-3 horas. Se procedendo à luz UV-tratamento de solução de esperma, transferir a solução para um tubo de microcentrífuga limpo deixando as partes de trás dos testículos.
3. Tratamento de UV
NOTA: O tratamento de UV é usada para a ligação cruzada de ADN de esperma de modo a torná-lo inactivo no embrião. Este passo só é usado quando a produção de embriões diplóides ginogenéticos haplóides ou homozigotos ginogenéticos. solução de esperma para o tratamento de UV devem ser separados a partir de pedaços de testículos (passo 2.4), como grandes peças podem proteger o esperma de o tratamento com UV.
- Transferir a solução esperma para um poço seco e limpo de uma placa de vidro depressão sentado em uma cama de gelo (por exemplo gelo dentro de uma placa de petri). Use até 1 ml de solução de espermatozóides por placa de vidro bem.
- Expor a solução de esperma de UV, colocando a placa de vidro depressão no leito de gelo sob uma lâmpada UV. Tratar a solução do esperma para 90 segundos com um 115 V (60 Hz, 0.68A) lâmpada UV em um 19 cm (7,5 polegadas) de distância. Com o fim de uma ponta de pipeta, misturar suavemente a solução cada 30 segundos durante o tratamento com UV (utilizar uma ponta de pipeta limpa a cada 30 seg).
- Usando uma ponta de pipeta limpa e micropipeta, transferir a solução de espermatozóides tratados para um novo tubo de microcentrífuga. Armazenar em gelo até ser necessário para a fertilização in vitro (não mais do que 2-3 horas de extracção).
4. Extrusão manual de óvulos maduros
NOTA: As fêmeas obtidas por interrupção do acasalamentos naturais prontamente produzir ovos sob anestesia e pressão manual. Durante este procedimento, o tratamento tricaina deve ser cuidadosamente controlada para evitar a exposição excessiva que pode impedir a recuperação das fêmeas.
- Anestesiar fêmeas por exposição à luz a solução tricaina: fêmeas de transferência com uma rede de tricaina solução em água condicionado (feita pela adição de 8 ml de tricaina solução stock de 0,2% a 100 ml de água de peixe condicionado) por cerca de 2-5 minutos, até a parada de peixe movimento Gill. <li> Assim que uma mulher interrompe o movimento de emalhar, use uma colher para recolher e brevemente lave-o em água condicionada. Ainda usando a colher para mover o peixe, seque-o levemente, colocando-o brevemente e repetidamente em vários locais de uma toalha de papel, em seguida, transferi-lo para um e seco placa de 10 cm de diâmetro petri limpo. Aproxime-se do peixe com a colher na anterior à direção posterior, para evitar potencialmente danificar o opérculo branquial.
- Use lenços de laboratório ou tecido mole para secar delicadamente ainda mais a área anal, para evitar quaisquer ovos liberados a partir prematuramente sendo ativado pela água. Amortecendo os dedos levemente com água (para evitá-los furando a escamas de peixe), coloque um dedo de uma das mãos nas costas do sexo feminino como suporte, e com um dedo da outra mão aplicar uma leve pressão ao longo do abdômen da fêmea até que os ovos se tornar extrudido.
- Usar uma espátula estreita para mover os ovos para longe do corpo da mulher. Coloque a fêmea de volta em um tanque com água condicionada para a recuperação.
- Ative (com exposição à água) e fertilizar (com esperma solução adição) ovos simultaneamente e dentro de 90 segundos após a extrusão (ver secção 5).
5. Fertilização In Vitro
NOTA: a fertilização Zebrafish em cruzamentos naturais é externo, dependente do lançamento simultâneo e ativação por água de óvulos e espermatozóides durante o acasalamento. Em fertilização in vitro imita este processo, expondo os ovos de solução de esperma, na presença de água. volume de água é inicialmente pequena (1 ml), a fim de aumentar a concentração efectiva do esperma. A ligação através de esperma ocorre no prazo de 15-20 seg 10 </ Sup>, e o volume de água pode, então, ser aumentada. Chorion levantamento contribui ainda mais para a próxima sincronização da embreagem através da limitação da janela para a competência para a ligação dos espermatozóides 11,12. Os embriões resultantes, portanto, exibir ciclos de divisão celular em grande parte simultâneos durante os estágios iniciais de clivagem.
- Adicionar 100 ul de solução de esperma (correspondente ao equivalente de testículos de um macho - ver Parte 2) para a embraiagem de ovos extrudido sobre uma placa de petri. Agite suavemente a ponta da pipeta usado para adicionar a solução de espermatozóides entre os ovos para misturar o esperma e os ovos juntos, certificando-se de não levantar a ponta da superfície da placa de petri para evitar danos ovo.
- ativar imediatamente os ovos, adicionando 1 ml de solução embrionário médio (E3) (água condicionada também é aceitável como um substituto para a E3 nas partes 5 a 7) e novamente misture delicadamente óvulos e espermatozóides rodando suavemente com a ponta da pipeta. Iniciar um temporizador para iniciar a temporização relativa à adubação. Em 1 mpf no volume de 1 ml, inundar o prato com E3. Antes de continuar, deixe repousar até 10-12 mpf para permitir a ativação do ovo, incluindo a expansão córion completo.
6. O tratamento de choque térmico
NOTA: Um choque térmico aplicado no embrião inicial inibe a duplicação centriole, resultando em um complemento incompleto de centrioles para conduzir a formação do fuso durante o ciclo celular subsequente 2. A ausência de fuso por sua vez resulta na falta de formação de sulco 13.
- Após a expansão das córions (10-12 MPF), despeje os embriões a partir da placa de petri em um coador de chá. Lavar a placa de petri utilizando um frasco de lavagem com E3, a fim de recolher quaisquer embriões restantes no coador de chá.
- Coloque o coador de chá com os embriões dentro de um copo num banho pré-aquecido com E3 a 28,5 ° C. Pré-equilibrar o copo e E3 à temperatura do banho de água e verifique se não há E3 suficiente para que todos os embriões no chácoador são expostos ao meio.
- Aos 22 mpf, remova o coador de chá do banho de água de 28,5 ° C, brevemente apagá-lo em uma toalha de papel para remover o excesso de umidade, e colocá-lo dentro de um copo E3 semelhante pré-aquecido em um banho térmico a 41,4 ° C.
- Aos 24 mpf, transferir o coador de chá de volta para a E3, em banho-maria a 28,5 ° C após uma breve blotting. Aos 29 mpf, use um frasco de lavagem com E3 para transferir os embriões do coador de chá para uma placa de Petri de 10 cm.
7. Seleção de embriões com um One-ciclo Citocinese Stall
- Durante o período de tempo de 35-45 MPF, sob um microscópio de dissecação com uma fonte luminosa transmitida, seleccionar os embriões que são submetidos a clivagem simétrico na fase de 2 células, e que são, portanto fertilizado. Remover embriões que não são submetidos a clivagem celular.
- Continuar a observar os embriões fertilizados, seleccionados para a divisão celular normal durante o primeiro ciclo celular, e durante o segundoOND ciclo celular (50-65 MPF).
- Classificar os embriões de acordo com as seguintes categorias (Figura 2C): 4 células ( "no box", no 2: standard arranjo 2 para um embrião de 4 células); 3 células ( "tenda parcial", em um aberrantes 2 células menores: 1 arranjo de grandes células); 2 e células ( "impasse", embriões exibindo um atraso do ciclo de uma célula numa mistura 1: 1 arranjo idêntico ao de um embrião de duas células). Organizar os embriões paralisadas em uma placa de petri fresca.
NOTA: Nesta fase, embriões no 2: arranjo 2 correspondem àquelas em que durante o segundo ciclo celular nem blastomere sofreu uma tenda divisão celular; embriões em um aberrantes 2 células menores: 1 arranjo de grandes células correspondem àquelas onde de choque térmico causado uma tenda do ciclo celular durante o segundo ciclo celular em um blastomere mas não o outro; e embriões "estagnadas" numa proporção de 1: 1 arranjo correspondem àqueles em que durante o segundo ciclo celular ambos os blastómeros foram submetidos a divisão celular desejadotenda. embriões paralisadas deve retomar a clivagem celular durante o período seguinte do ciclo celular (65-80 MPF). A disposição dos blastómeros podem ser variável, devido aos sinais incompletos do ciclo celular anterior para estabilizar o eixo de 2,14, mas a maioria dos embriões vai formar uma blástula relativamente normal que pode sofrer o desenvolvimento normal. - Permitir que embriões para desenvolver na placa de Petri, com um limite de 80 embriões por placa de 10 cm. Aos 24 hpf, observar os embriões para determinar se eles têm uma morfologia característica normal dos embriões diplóides diplóides ou homozigóticos 6 (medida normal da extensão do eixo (Figura 3A, 3C)), em contraste com a extensão do eixo reduzida e aumento da espessura da característica corpo de haplóides (Figura 3B)), e / ou avaliar diploidização utilizando marcadores genéticos de pigmento em 36 MPF, tal como ouro ou albino e outros tais ensaios (Figura 3 e ver abaixo) 2,6,9. Remova todos os embriões que parecem ter uma morfologia haplóides, ou que tenham lisadas ou apresentar outros defeitos grosseiramente anormais.
NOTA: Se desejar, permitir que os embriões a se desenvolver até 5 dias após a fertilização, continuando a remover embriões lisadas ou grosseiramente anormais em uma base diária e adicionando fresco E3 para refrescar o meio. NOTA: Sobrevivência embriões podem também ser cultivados após a insuflação da bexiga natatória no dia 5 por transferência para um sistema de alimentação e incubação sob condições padrão.
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Representative Results
Apesar de a uma célula-box ciclo citocinese, a replicação do ADN ocorre normalmente em tais embriões, o que resulta na duplicação do teor de ADN do embrião (figura 1). O protocolo Streisinger Choque Térmico (HS standard) envolve um pulso de calor durante o período de 13-15 minutos após a fertilização (MPF) e induz principalmente detenção cytokinesis durante a primeira divisão celular embrionária em 35 mpf 1,2, enquanto que o método derivado descrito aqui, referido como choque térmico 2 (HS2), utiliza um choque de calor durante o período de 22-24 MPF e induz a paragem do citocinese durante a segunda divisão de células embrionárias a 50 MPF (Figura 2; 2,3,4). Aos 24 hpf, a observação dos embriões permitem determinar se eles têm uma característica morfologia normal de embriões diplóides diplóides ou homozigotos, ou o corpo mais curto e mais largo eixo característico morfologia de embriões haplóides (Figura 3)
Figura 1: tipos de adubação. (A) de acasalamento natural. gametas masculinos e femininos são tratados, resultando em um diplóide natural. (B) O esperma é tratado com UV, o que resulta na destruição do DNA paterno e a produção de zigotos haplóides. Se não for tratada, tais haplóides não sobrevivem passado dia 2-3 do desenvolvimento. (C) Tratamento de zigotos haplóides com choque térmico 2 (HS2) inibe um ciclo de citocinese da mitose no embrião inicial. Este ciclo celular stall, casald para a replicação do DNA afetado, gera diplóides homozigotos que podem se tornar adultos viáveis e férteis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: HS2 promove a duplicação do genoma inteiro se atrasando o segundo ciclo celular. Padrão (A) celular clivagem de um embrião sem tratamento durante os primeiros três ciclos celulares, correspondendo a embriões 2-, 4- e 8-celulares. De tratamento (B) HS2 resulta numa tenda de um ciclo de divisão celular durante o segundo ciclo celular. Durante o stall, em curso de síntese de DNA resulta em embriões submetidos diploidização, a partir de qualquer haplóides para diplóide (n -> 2n) ou diplóide para tetraplóide (2n -> 4n) (ver texto). Após este tenda, o embrião é retomada a divisão celular, com o newly adquiriu ploidia. (C) HS2-embriões tratados podem exibir uma variedade de arranjos blastomere dependendo se blastómeros exibem um atraso divisão celular durante o segundo ciclo celular: i) "não tenda": nem exibe blastomere um atraso, resultando numa proporção de 2: arranjo característico 2 de embriões de estágio de 4 células, ii) "tenda parcial": apenas um de dois blastómeros exibe um atraso, resultando numa aberrante 2: Esquema 1, e iii) "impasse": ambos os blastómeros exibem um atraso, resultando numa proporção de 1: 1 arranjo característico de embriões fase de 2 células. Em (A - C), os núcleos são representados como círculos azuis, com o evento diploidização representada por uma expansão do tamanho nuclear. Ver referência 2 para um diagrama que descreve o comportamento do centríolo como base proposta para a tenda divisão celular. Por favor clique aqui para ver uma versi maioresem dessa figura.
Figura 3: Morfologia de diplóides naturais, haplóides e gynogenotes. (A) Morfologia embrionário normal de um diplóide obtido através de cruzamentos naturais. (B) embriões haplóides exibem um eixo do corpo mais curto e mais largo. (C) diplóides homozigotos têm morfologia normal do corpo. Embriões, adicionalmente, realizar uma mutação recessiva no golden gene de pigmentação para facilitar o rastreamento herança DNA parental: mães são portadores homozigotos para uma mutação em ouro e pais de tipo selvagem para este gene. Assim, diplóides naturais, heterozigotos para o dourado, apresentam-tipo selvagem pigmentação, enquanto ambos os haplóides (hemizygous de ouro) e diplóides homozigotos (homozigotos para ouro) apresentam pigmentação mutante. Barra de escala = 0,5 mm. Painéis modificado a partir do reConferência 2, reproduzido com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | componentes | Condições de armazenamento |
| Hanks Solução 1 | 8,0 g de NaCl, e 0,4 g de KCl em 100 ml de ddH2O | Armazenar a 4 ° C |
| Hanks Solução 2 | 0,358 g de Na 2 HPO anidra 4, e 0,6 g de KH 2 PO 4 em 100 ml de ddH2O | Armazenar a 4 ° C |
| Hanks Solução 4 | 0,72 g de CaCl2 em 50 ml de ddH2O | Armazenar a 4 ° C |
| Hanks 5 Solução | 1,23 g de MgSO 4 7H 2 O ∙ em 50 ml de ddH2O | Armazenar a 4 ° C |
| Pré-mistura de Hank | Adicionar, na seguinte ordem: 10,0 ml de Solução de 1, 1,0 ml de solução 2, 1,0 ml de solução 4, 86,0 ml de ddH 2 O, e 1,0 ml de solução 5 | Armazenar a 4 ° C |
| Hanks Solução 6 | 0,33 g de NaHCO3 em 10 ml de ddH2O | Prepare fresco na manhã do procedimento de fertilização in vitro |
Tabela 1. Preparação de soluções de Hank.
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Discussion
As etapas críticas
É fundamental para o trabalho em condições de efetiva em fertilização in vitro. Para garantir um bom suprimento de óvulos maduros (passo 1), as fêmeas configurado para o acasalamento não deveria ter sido criado em cruzes de acasalamento durante pelo menos 5 dias e deve aparecer grávida. Durante a interrupção da reprodução, um observador pode monitorar 15-30 tanques de forma adequada para a primeira aparição de extrusão de ovo natural. Interrupção de acoplamento deve ocorrer o mais rapidamente possível, quando os primeiros ovos são libertadas através de acasalamentos naturais, a fim de permitir que a maioria dos ovos de permanecer dentro das fêmeas para o procedimento de FIV. Estas mulheres, que agora estão prontos para a extrusão manual dos óvulos maduros, podem ser mantidos separados para até 2 horas sem efeito aparente na libertação do óvulo subsequente. Para preparar uma solução de esperma efectiva (passo 2), os machos devem aparecer robusta e idealmente com uma tonalidade avermelhada, que é característica de criação de peixe-zebra machos. A dissecção limpo normalmente envolve remoDEIXANDO O faixa intestinal, puxando-o em direcção à parte posterior do corpo, e a bexiga natatória puxando-se anteriormente. Após a remoção dos órgãos internos centrais, os testículos permanecem massas alongadas como translúcido ao lado de cada lado da parede interna do corpo. Evitar incluindo órgãos indesejados (por exemplo, intestino) na solução de esperma; Se necessário separar estes a partir de testículos de trabalhar sobre uma superfície da placa de petri seco antes de ser colocado em solução de Hank. Para obter elevadas taxas de fertilização durante a fertilização in vitro (Passo 4), é essencial que os ovos extrudidos são mantidas até competente adição de esperma. Ovos competentes para a fertilização exibem um tom ligeiramente amarelado e são translúcidas. Evite ovos que tenham qualquer contacto com a água antes da adição de esperma, já que a água irá desencadear a activação do ovo e ativação prematura impedirá a fertilização. activação de água e fertilização deve ocorrer dentro de 90 seg de extrusão a partir da fêmea, a fim de evitar a desidratação de ovos, o que vailevar a sua degradação. Se necessário, os ovos extrudido pode ser mantido durante períodos mais longos (até 1,5 horas ou mais) em 100-200 ul de solução de Hank suplementada com 0,5% de Albumina de Soro Bovino (BSA) 17 (ao preparar a solução de Hank para este fim específico, preparar a pré-mistura para corrigir o teor de água adicionada durante a suplementação de BSA). Se os ovos foram mantidos competente com a ajuda de uma solução de BSA de Hank, BSA a remover o excesso de Hank a partir dos ovos utilizando uma micropipeta e fertilizar dentro de 1 min.
Um passo crítico para o sucesso de diploidização usando HS2 é a triagem de embriões parado (passo 7). triagem inicial de simetricamente clivagem embriões de 2 células seleciona para os embriões que se tornam fertilizados e começam a divisão celular (dispermy ocasional durante resultados de fertilização in vitro em embriões de que a transição diretamente de 1 a 4 células em 35-50 mpf - esses embriões devem ser descartados). ciclo celular ocorre a cada 15 min durante estes primeiros st embrionárias(idades 35-50 MPF para o primeiro ciclo celular, 50-65 MPF para o segundo ciclo de célula, e assim por diante), de modo de triagem de clivagem de embriões durante os primeiros 10 minutos de cada ciclo celular assegura uma ausência de sobreposição entre os ciclos e precisas identificação de uma barraca de divisão celular.
Modificações e solução de problemas
A força do tratamento com UV no passo 3 (por exemplo, tempo de exposição, a potência da lâmpada, a distância à lâmpada) pode ser ajustada, se necessário por meio de testes as taxas de fertilização iniciais, bem como a frequência de haplóides, na ausência de tratamento HSII subsequente: a quantidade correcta de exposição aos raios UV não tem um efeito significativo sobre as taxas de fertilização, enquanto resultando em 100% de embriões haplóides (ver resultados representativos para distinguir haplóides a partir de embriões diplóides). Demasiada exposição aos raios UV provoca taxas de fertilização reduzidas, presumivelmente devido a efeitos deletérios sobre a função do esperma, enquanto a exposição UV insuficiente produz embriões diplóides devido tO inactivação incompleta do ADN de esperma.
Se os embriões apresentam defeitos de desenvolvimento ou letalidade após a retomada da clivagem da célula (passo 7), a temperatura de choque térmico no passo 6 pode ser ligeiramente reduzido (por exemplo, a 41,0 ° C) para aumentar a sobrevivência dos embriões; condições que resultam em fracções aproximadamente iguais de 3-celular aberrante e paralisadas embriões 2-celular durante o segundo ciclo celular (e são, por conseguinte, perto de limiar de um efeito sobre a duplicação centriolar) resultar em mínimas defeitos de desenvolvimento posteriores e aumento da sobrevivência após a retomada do ciclo celular .
O método HS2 incorpora um mecanismo conveniente e intrínseca para avaliar tenda a divisão celular (e duplicação do genoma, pois, toda), uma vez que a observação direta de embriões como elas se desenvolvem permite rastrear os vários ciclos celulares. A selecção manual de embriões que tenham sido submetidos a uma tenda do ciclo de divisão de células permite uma produção de uma população uniforme de embrião diploidizeds. HS2 pode ser realizada de qualquer estirpe genética peixe-zebra (por exemplo, AB, Tubingen, WIK), como as da tenda uma divisão de células actua como um mecanismo intrínseco para confirmar a duplicação do ADN. Além disso, os marcadores genéticos visíveis introduzidos na estirpe pode ser utilizada para facilitar a identificação de embriões diploidized (Figura 3). Por exemplo, o uso de ovos de fêmeas que são homozigotas para mutações recessivas em genes da pigmentação, tais como o ouro ou albino, podem ser combinados com o esperma derivado a partir de estirpes do tipo selvagem que transportem alelos normais para o mesmo gene de pigmentação. Nesta situação, porque espermatozóides tratados com UV não pode contribuir de pigmento alelos de tipo selvagem, embriões diplóides e haplóides homozigóticos exibem a mutação recessiva pigmento. Além disso, diplóides homozigotos apresentam a morfologia do tipo selvagem em 24 hpf, em nítido contraste com a morfologia haplóides menos extensa. A combinação do aparecimento da característica recessiva materna e Embry globalO morfologia confirma duplicação ploidia bem sucedida. Outra confirmação pode ser obtida através de contagem de cromossomos de embriões tratados e não tratados.
O sistema de marcação genética descrita acima, com base em marcadores genéticos visíveis recessivos, também permite a confirmação da ausência de ADN derivadas de esperma na descendência, já que os embriões resultantes exibem de tipo selvagem pigmentação apenas se o esperma não foi completamente inactivada por tratamento UV . Na ausência de um sistema de marcação genética, uma amostra de embriões pode ser deixada a desenvolver-se na ausência de choque térmico para confirmar que todos os embriões apresentam a morfologia haplóide em 24 hpf, e, portanto, que a inactivação do DNA do esperma foi completa. Em conjunto com o esperma totalmente inativado, este mesmo sistema de marcação genética também permite detectar possíveis falhas corpo polar espontânea. Tal evento resultará no aparecimento de embriões recessiva marcados com morfologia diplóide sem um tratamento diploidização. bo polar espontâneady falha não foi observada em peixes-zebra, mas é relatado em Xenopus tropicalis 18. Se estiver presente em um dado sistema, este evento espontâneo teria de ser reduzida ou controlada por, a fim de implementar de forma óptima manipulação de ploidia.
Limitações da técnica
A capacidade de produzir gynogenotes viáveis baseia-se na ausência de variantes genéticas de fundo que, quando homozigotos são prejudiciais. Assim, o sucesso do procedimento vai variar dependendo da estirpe utilizada genética. Selecção de estirpes genéticas através de múltiplas gerações de gynogenesis foi mostrado para melhorar a viabilidade 1.
O método HS2, quando usado em conjunto com o esperma não tratadas para produzir embriões diplóides, também permite a produção de embriões tetraplóides com uma frequência elevada. No entanto, neste caso, devido à transformação de diplóide tetraplóide, marcadores genéticos não prontamente permitir a confirmação da genom todae duplicação. Neste caso, a observação da tenda do ciclo de uma célula em embriões sincronizados e selecção de embriões paralisadas deve segurar selecção tetraplóide, e as contagens de cromossomas podem ser utilizados para confirmar ainda mais ploidia.
Significância em relação aos métodos existentes / alternados
Embora descrito por Streisinger mais de 40 anos 1, o método HS padrão não tem sido amplamente utilizado devido ao fraco rendimento. Em vez disso, a manipulação de ploidia baseou-se quase exclusivamente no método alternativo e relativamente mais eficiente da pressão inicial, o que resulta na duplicação de ploidia por meio da inibição da segunda divisão meiótica. No entanto, os primeiros resultados de pressão em proporções variáveis de homozigose gene 9,19, o que diminui o seu valor como uma ferramenta genética. Estudos recentes mostram que HS2, uma modificação do protocolo padrão SH, ou seja, a aplicação do impulso de calor em um momento diferente, durante o primeiro ciclo celular (a 22-24período de mpf em HS2, em comparação com 12-14 mpf em HS standard) resulta em até 4 vezes maior rendimento de produções diplóides homozigotos.
A acção do impulso de calor pode ser inferido a ocorrer, em virtude da inibição de duplicação centriole durante o tempo de choque de calor (22-24 MPF, durante o primeiro ciclo celular), que não tem, por conseguinte, o complemento adequada para gerar uma fuso e mediar divisão celular durante o seguinte ciclo celular (50-65 MPF, que corresponde ao segundo ciclo celular). duplicação Centríolo pode retomar na ausência de choque de calor durante os ciclos subsequentes de células, permitindo o desenvolvimento de prosseguir depois de um ciclo de tenda de uma célula precisa. Porque os ciclos de duplicação centríolo e replicação de DNA são interdependentes 20, replicação do DNA continua normalmente, mesmo durante a divisão estagnou no segundo ciclo celular. Isto resulta em toda a duplicação do genoma precisa e completa homozigotia.
As aplicações futuras
21.
Abordagens semelhantes para HS2 pode ser aplicado a outras espécies com a fertilização externo, mesmo que não tenham actualmente a ser usado como sistemas genéticos. Este métodoem particular tira proveito de um período de tempo desde a fertilização através da iniciação do ciclismo blastomere onde um pulso de calor pode afetar a duplicação centríolo e gerar uma tenda divisão celular precisa e duplicação do genoma inteiro sem produzir efeitos no desenvolvimento deletérios. Assim, este período de tempo precoce pode ser explorado para a sensibilidade de choque térmico para desenvolver métodos genéticos baseados em manipulação de ploidia em outros sistemas animais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Pipetteman P-1000 | any maker | ||
| Pipette tips 1,000 µl | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (cat No. UVP18006201) | available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting) |
| UV glasses | any maker | ||
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| Tea strainer | available in kitchen stores | ||
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| water bath (2) | any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series) | ||
| Hanks’ Solution 1 | see above | see above | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 2 | see above | see above | 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hanks’ Solution 4 | see above | see above | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hank's Premix | see above | see above | add, in the following order: 10.0 ml Solution 1; 1.0 ml Solution 2; 1.0 ml Solution 4; 86.0 ml ddH2O; 1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C |
| Hanks’ Solution 6 | see above | see above | 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure. |
| Hank's Solution (final solution) | see above | see above | Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution) |
References
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