Påvisning av pH-avhengig aktivitet av Published: October 23, 2016 doi: 10.3791/54527

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Jan-Ulrik Dahl¹, Philipp Koldewey^1,2, James C. A. Bardwell^1,2, Ursula Jakob¹

¹Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, ²Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Summary

Denne studien beskriver biofysiske, biokjemiske og molekylære teknikker for å karakterisere anstand aktivitet av Escherichia coli HdeB under sure pH-betingelser. Disse metodene har blitt brukt for andre syre-beskyttende anstand som HdeA og kan bli endret for å jobbe for andre anstand og stress forhold.

Abstract

Bakterier er ofte utsatt for miljømessige endringer, for eksempel endringer i pH, temperatur, Redox status, lyseksponering eller mekanisk kraft. Mange av disse betingelsene forårsaker protein utfolder seg i cellen, og har skadelig virkning på overlevelse av organismen. En gruppe av ikke-relaterte, stress-spesifikke molekylære anstand har vist seg å spille viktige roller i overlevelse av disse stressbetingelser. Mens fullt foldet og anstand-inaktiv før stress, disse proteinene raskt utfolde seg og bli anstand-aktiv under bestemte stress forhold. Når aktivert, disse betinget uordnede anstand bindes til et stort antall forskjellige aggregering utsatt proteiner, hindre deres aggregering og enten direkte eller indirekte lette protein refolding ved retur til ikke-stressbetingelser. Den primære metode for å få en mer detaljert forståelse om mekanismen for deres aktivering og klient erkjennelse innebærer rensing og subsequent karakterisering av disse proteiner ved anvendelse av in vitro-anstand analyser. Oppfølging in vivo spennings analyser er helt avgjørende for å uavhengig bekrefte den erholdte in vitro-resultater.

Denne protokollen beskriver in vitro og in vivo metoder for å karakterisere anstand aktivitet av E. coli HdeB, en syre-aktivert anstand. Lysspredningsmålinger ble anvendt som en enkel utlesning for HdeB evne til å forhindre at syre-indusert aggregasjon av en etablert modell klient protein, MDH, in vitro. Analytiske ultra-sentrifugeringsforsøk ble brukt for å avsløre kompleksdannelse mellom HdeB og sin klient protein LDH, å kaste lys inn i skjebnen til klient proteiner når de kommer tilbake til ikke-stressbetingelser. Enzymatiske aktivitetsanalyser til klient proteinene ble utført for å overvåke effekten av HdeB på pH-indusert klient inaktivering og aktivering. Til slutt ble overlevelses studier brukt til å over påvirkning av HdeB s anstand funksjon in vivo.

Introduction

En vanlig naturlig miljø der mikrobielle patogener oppleve syre-indusert protein utfolder forhold er pattedyr magen (pH 1-4), hvis sur pH fungerer som en effektiv barriere mot matbårne patogener ^1. Protein utfolding og aggregering, som er forårsaket av aminosyresidekjede protonering, virker biologiske prosesser, skader cellulære strukturer og til slutt fører til celledød ^1,2. Siden pH-verdien av den bakterielle periplasmaet likevekt nesten øyeblikkelig med miljø pH på grunn av den frie diffusjon av protoner gjennom det porøse ytre membran, periplasmatiske og indre membranproteiner av gram-negative bakterier er de mest utsatte cellulære komponenter under syre-spenningstilstander ^3. For å beskytte deres periplasmatiske proteom- mot raske syre-mediert skade, Gram-negative bakterier utnytte de syre aktivert periplasmatiske anstand HdeA og HdeB. HdeA er en betinget uordnede anstand 6,7. Aktivering av HdeA krever dyptgripende strukturelle endringer, herunder dissosiasjon inn monomerer, og delvis utspiller seg av monomerene ^6-8. Når aktivert, HdeA binder seg til proteiner som utspiller seg under sure forhold. Det forhindrer effektivt deres aggregering både under inkuberingen ved lav pH, så vel som ved pH nøytralisering. Ved retur til pH 7,0, letter HdeA refolding av sine klient proteiner i en ATP uavhengig og konverterer tilbake til sin dimer, anstand-inaktive konformasjon ^9. Tilsvarende er det homologe anstand HdeB også anstand-inaktiv ved pH 7,0. I motsetning HdeA, men når HdeB sin anstand aktivitet sin tilsynelatende maksimum ved pH 4,0, under hvilke forhold HdeB er fortsatt i stor grad brettet og dimere ^10. Videre ytterligere senke pH-Causes inaktivering av HdeB. Disse resultatene foreslår at til tross for sin omfattende homologi, HdeA og HdeB varierer i sin modus for funksjonell aktivering slik at de kan dekke et bredt pH-område med deres beskyttende anstand funksjon. En annen anstand som har blitt implisert i syreresistensen til E. coli er den cytoplasmiske Hsp31, som synes å stabilisere utfoldete klient proteiner inntil nøytrale betingelser er gjenopprettet. Den nøyaktige modusen for Hsp31 handling, men har holdt seg gåte ^12. Gitt at andre ropatogene bakterier som Salmonella mangler hdeAB operon, er det svært sannsynlig at andre ennå uidentifiserte periplasmatiske anstand kan eksistere som er involvert i syre motstand av disse bakteriene ^11.

Protokollene som presenteres her tillater å overvåke pH-avhengig anstand aktivitet av HdeB in vitro og in vivo ¹⁰ og kan brukes til å undersøke andre anstandslik som Hsp31. Alternativt kan den komplekse nettverket av transkripsjonsfaktorer som styrer ekspresjonen av hdeAB potensielt bli undersøkt ved in vivo-spenning assay. For å karakterisere anstand funksjon av proteiner in vivo, kan ulike forsøksoppsett brukes. En rute er å bruke protein utfoldelse spenningstilstander og fenotypisk karakter mutante stammer som enten overuttrykker genet av interesse eller bære en sletting av genet. Proteomic studier kan utføres for å identifisere hvilke proteiner ikke lenger aggregat i henhold til stressbetingelser når den anstand er til stede, eller påvirkning av en anstand på et bestemt enzym kan bestemmes under stressbetingelser ved hjelp av enzymatiske analyser ^14-16. I denne studien valgte vi å overuttrykker HdeB i en rpoH sletting belastning, som mangler den varme sjokk sigma faktor 32. RpoH styrer uttrykket av alle store E. coli anstand og dens sletting er kjent for å øke sensitivity miljømessige stress forhold som forårsaker protein utfolder ^15. In vivo-aktivitet av anstand HdeB ble bestemt ved å måle dens evne til å undertrykke pH-følsomheten til Δ rpoH belastning. Alt i alt har de protokoller som er presentert her tilveiebringe en rask og enkel måte å karakterisere aktiviteten av en syreaktivert anstand in vitro så vel som in in vivo sammenheng.

Protocol

1. Uttrykk og rensing av periplasmatiske HdeB

MERK: HdeB ble uttrykt i E. coli-celler som inneholder plasmidet pTrc- hdeB ^10, og renset fra periplasmaet ved polymyxin lyse.

1. Forbered en overnatting kultur av E. coli-celler som inneholder plasmidet pTrc- hdeB ¹⁰ i 30 ml LB inneholdende 200 ug / ml ampicillin (LB _Amp). Inokulere fire 1 L kulturer i LB _Amp og dyrke dem ved 37 ° C og 200 opm inntil OD _{600 nm} på 0,7 er nådd. Deretter legger 300 uM IPTG for å indusere ekspresjon av HdeB og senke dyrkningstemperaturen til 30 ° C.
2. Etter 5 timers av protein ekspresjon ved 30 ° C, høsting av cellene ved sentrifugering ved 8000 x g i 5 min ved 4 ° C.
3. Vask cellepelleten med 100 ml buffer A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) og sentrifuger cellene på nytt ved 8000 xg i 5 min ved 4 ° C.
4. Deretter resuspendercellepelleten i 80 ml buffer A, inneholdende 1 mg / ml polymyxin sulfat. For effektiv forstyrrelse av den ytre membran, forsiktig omrøring av suspensjonen i 1 time ved 4 ° C.
5. For å fjerne den cytoplasmiske fraksjonen og celleavfall, sentrifuger suspensjonen i 20 min ved 15.000 xg ved 4 ° C. Dette resulterer i ~ 60 ml supernatant inneholdende det oppløselige HdeB.
6. Dialyser supernatanten inneholdende det periplasmatiske ekstraktet over natt mot 150x volum av buffer B (20 mM Tris / HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8,0) ved anvendelse av en dialysemembran med 6 kDa MW cut-off. Konsentrer proteinene til 15 ml ved hjelp av sentrifugalkreftene filterenheter med en molekylvekt cut-off på 3 kDa. Filtrer den proteinløsning ved bruk av en 0,2 pm pore-filter.
7. Påføre proteinet på en anionbytter-kromatografi-kolonne (kolonnevolum 5 ml) som er blitt ekvilibrert med 5 kolonnevolumer buffer B med en strømningshastighet på 2,5 ml / min. Når proteinet er lastet på kolonnen, vaskes kolonnen med buffer B i 10 minutter veden strømningshastighet på 2,5 ml / min. Elute HdeB med en lineær gradient 0 til 0,5 M NaCl i buffer B i løpet av en periode på 50 min med en strømningshastighet på 2,5 ml / min ^6.
8. Identifisere fraksjoner inneholdende HdeB anvendelse av en 15% SDS-PAGE. Bland 20 ul prøve med 5 mL 5x redusert SDS lasting buffer. Belastning 10 pl bort på gelen og drives i Tris-glycin-buffer (14,4 g / l glycin, 2,9 g / l tris, 1 g / l natriumdodecylsulfat, pH 8,3). Kjør gelen ved 150 V, inntil bromfenol bandet har migrert nær bunnen av gelen (~ 45 min).
9. Basseng alle HdeB-inneholdende fraksjoner, dialyser ved 4 ° C natten over mot 4 L HdeB lagringsbuffer (50 mM Tris / HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0), og konsentrere proteinet til ca 300 pM ved hjelp av sentrifugal-filterenheter med en molekylvekt cut-off av 3 kDa. Bestemme konsentrasjonen av HdeB ved 280 nm ved anvendelse av ekstinksjonskoeffisienten ε _{280 nm} = 15 595 M ^-1 cm ^-1. Forbered 100 ul porsjoner og flash-friZe de delmengder i flytende nitrogen.
   MERK: HdeB kan oppbevares ved -70 ° C i minst 6 måneder.

2. anstand aktivitet Assay Bruke Varme Unfolding Malate dehydrogenase (MDH)

MERK: Påvirkningen av renset HdeB på aggregering av termisk utfolding svine-mitokondriell malat-dehydrogenase (MDH) ved forskjellige pH-verdier ble målt som beskrevet nedenfor. Alle oppførte proteinkonsentrasjoner refererer til monomerkonsentrasjon.

1. For å fremstille MDH, dialyser MDH ved 4 ° C natten over mot 4 liter buffer C (50 mM kaliumfosfat, 50 mM NaCl, pH 7,5) og konsentrere proteinet til ca 100 uM ved hjelp av sentrifugal-filterenheter med en molekylvekt cut-off på 30 kDa.
   MERK: Forsiktig dialyse av MDH kreves som MDH leveres som ammoniumsulfat løsning.
2. For å fjerne aggregater, sentrifuger proteinet i 20 minutter ved 20 000 xg ved 4 ° C. Bestem MDH konsentrasjon ved absorbans ved 280 nm (ε <sub> 280 nm = 7950 M ^-1 cm ^-1). Forbered 50 ul porsjoner av MDH og flash-fryse porsjoner for lagring.
3. Plasser en ml kvartskuvette inn en fluorescens spektrofotometer utstyrt med temperaturstyrt prøveholdere og rører. Sett λ _{ex / em} til 350 nm.
4. Legg passende volum av forvarmet (43 ° C) buffer D (150 mM kaliumfosfat, 150 mM NaCl) ved de ønskede pH-verdiene (her: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 og pH 5,0) til kyvetten og settet temperaturen i holderen til 43 ° C. Det totale volum er 1000 ul.
5. Legg 12,5 uM HdeB (eller alternativt det samme volum av lagringsbuffer for HdeB bufferkontroll) til bufferen, etterfulgt av tilsetning av 0,5 uM MDH. Begynn å overvåke lysspredning. Inkuber reaksjonen for 360 sek for å tillate tilstrekkelig utfoldelsen av MDH.
6. Heve pH til 7 ved tilsetning av 0,16 til 0,34 volum av 2 M bufret K ₂ HPO ₄ og fortsette resnor lysspredning for en annen 440 sek.
7. Angi omfanget av MDH aggregering som er registrert i fravær av anstand på et definert tidspunkt etter nøytralisering (her etter 500 sekunder, når maksimal lysspredning av MDH ble observert) til 100%. Normaliser HdeB aktivitet til lysspredningen signal av MDH i fravær av HdeB ved hver angitte pH-verdi.

3. Påvisning av HdeB-LDH Complex Dannelse av Analytical Ultrasentrifugering (AUC)

MERK: Sedimentation hastighets eksperimenter HdeB alene eller i kompleks med termisk utfoldelse laktat dehydrogenase (LDH) ble utført ved hjelp av en analytisk ultrasentrifuge.

1. For å fremstille LDH, dialyser LDH ved 4 ° C natten over mot 4 liter buffer C (50 mM kaliumfosfat, 50 mM NaCl, pH 7,5) og konsentrere proteinet til omtrent 200 pM ved hjelp av sentrifugal-filterenheter med en molekylvekt cut-off på 30 kDa.
   MERK: Forsiktig dialyse av LDH er nødvendig som LDH leveres som ammoniumsulfat-løsning.
2. For å fjerne aggregater, sentrifuger LDH i 20 minutter ved 20 000 xg ved 4 ° C. Bestem LDH-konsentrasjon ved absorbans ved 280 nm (ε _{280 nm} = 43 680 M ^-1 cm ^-1). Forbered 50 ul porsjoner av LDH og flash-fryse porsjoner for lagring.
3. Inkuber 3 uM LDH i nærvær og fravær av 30 pM HdeB i buffer D (pH 4 og 7, henholdsvis) i 15 min ved 41 ° C.
   MERK: Inkubasjon av LDH ved høyere temperaturer fører sin fullstendige aggregering, og ingen anstand effekt av HdeB kan observeres.
4. La prøvene avkjøles til romtemperatur. Deretter lastprøver i celler som inneholder standard sektorformet to-kanals center med 1,2 cm banelengde. Laster cellene inn i ultrasentrifuge og likevekt ved 22 ° C i minst 1 time før sedimentering.
5. Spin prøvene ved 22 ° C og 167 000 xg i de respektive rotor i 12 timer, og overvåke sedimentation av proteinet kontinuerlig ved 280 nm. Som tidligere vist, er signal-støyforholdet forbedres når den overførte lysintensitet for hver kanal blir målt i stedet for absorbans. Dette forbedrer også kvaliteten av påfølgende data montering.
6. Gjennomføre dataanalyse med SEDFIT (versjon 15.01b desember 2015), ved hjelp av kontinuerlig c (e) distribusjonsmodell ^17. En tutorial som beskriver hvordan du bruker SEDFIT kan bli funnet i referanse ^18.
   1. Angi sikkerhetsnivå for ME (Maximum Entropy) regularisering til 0,7.
7. Beregn buffer tetthet, så vel som viskositeten ved hjelp av SEDNTERP ^19. For å estimere mengden av aggregerte klient protein, sammenligne integralene for sedimentert LDH i pH 4 til pH 7 som en referanse.
   MERK: Integrering av sedimentedistribusjons tomter kan gjøres direkte i SEDFIT. Alternativ programvare for å analysere sedimentehastighetsdata kan bli funnet i en fersk gjennomgang ^20. </ Li>

4. Overvåking MDH Inaktive og reaktive i nærvær av HdeB

MERK: Påvirkningen av renset HdeB på refolding av pH-utfoldet MDH ble bestemt ved å overvåke MDH aktivitet ved nøytralisering.

1. Inkuber 1 uM MDH i buffer D ved den ønskede pH-verdier (her: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 og pH 5,0) i 1 time ved 37 ° C i fravær eller nærvær av 25 pM HdeB. Deretter forskyves temperaturen til 20 ° C i 10 minutter.
   MERK: Ingen MDH refolding ble observert selv i nærvær av HdeB da MDH ble inkubert ved temperaturer høyere enn 37 ° C.
2. For å initiere refolding av denaturert syre MDH, nøytralisere prøvene til pH 7 ved tilsetning av 0,13 til 0,42 volum av 0,5 M natriumfosfat, pH 8,0.
3. Etter inkubasjon i 2 timer ved 20 ° C, bestemme MDH aktivitet ved å overvåke reduksjonen av NADH ved 340 nm ^ni.
   MERK: MDH katalyserer NADH avhengig reduksjon av oksaloacetat i L-malat. Bland 50 ul av inkubasjonen reaksjonen med 950 pl forsøksbuffer (50 mM natriumfosfat, pH 8,0, 1 mM oksaloacetat og 150 uM NADH).
   NB: Den endelige konsentrasjonen av MDH i analysebufferen bør være 44 nM.
4. Overvåke endringen i absorbans ved hjelp av et spektrofotometer utstyrt med et Peltier temperaturkontroll blokken settes til 20 ° C.
5. Rapport MDH aktivitet i forhold til 44 nM innfødte MDH som har blitt holdt ved pH 7,0.

5. Effekt av HdeB Overuttrykte på E. coli Survival henhold Acid Stress

MERK: E. coli MG1655 genomisk DNA ble isolert ved anvendelse av en protokoll som er publisert ^21.

1. Forsterke hdeB fra E. coli MG1655 ved PCR ved bruk primere hdeB - BamHI-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT og hdeB - EcoRI-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C.
2. Sett opp PCR reaksjonen i 50 ul som følger: 10 ul 5x polymerase buffer, 200 mM dNTP, 0,5 mikrometer primer JUD2, 0,5 mikrometer primer JUD5, 150 ng MG1655 genomisk DNA, 0,5 mL polymerase DNA, legge DDH ₂ O til 50 pl.
3. Utføre forsterkning av hdeB som følger: Trinn 1: 5 min ved 95 ° C, en syklus; Trinn 2: 30 sek ved 95 ° C, 30 sek ved 55 ° C, 30 sek ved 72 ° C, 40 sykluser; Trinn 3: 10 min ved 72 ° C.
4. Klon resulterende PCR-fragment inn i EcoR I og BamH I-setene til plasmid pBAD18 ved hjelp av standardmetoder for restriksjonssete kloning. Rense plasmid ved hjelp av et plasmid rensing kit i henhold til produsentens instruksjoner. Kontroller den resulterende plasmid ved sekvense ^10.
5. Transform plasmidet uttrykker HdeB eller de tomme vektor kontroll pBAD18 til belastning BB7224 (Δ rpoH) (genotype: F ^-, λ ^-, e14 ^- [araD139] _{B / r} [6, (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (FRUK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm ^R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn 10 (Tc ^S) suhX401 deoC1 Arad ⁺ rpoH :: Håkan ^{+, 16)} ved hjelp av kjemisk kompetente celler.
   MERK: Denne belastningen er temperaturfølsom.
6. Etter 45 sek varmesjokk ved 42 ° C og før pletteringen, inkubere cellene ved 30 ° C og 200 rpm. Utfør enkelt koloni strek-outs av de positive kloner og inkuber natten ved 30 ° C. Forbered en overnatting kultur i 50 ml LB _Amp og dyrke cellene ved 200 rpm og 30 ° C.
7. Fortynn natt kulturer 40 ganger inn i 25 ml _LB-Amp og dyrke bakteriene i nærvær av 0,5% arabinose (Ara) ved 30 ° C og 200 opm til en OD _600nm = 1,0 for å indusere HdeB proteinekspresjon.
8. For pH skift eksperimenter, bruker LBAmp + Ara å fortynne cellene til OD _600nm på 0,5 og tilpasse seg de respektive pH-verdier (her: pH 2,0, pH 3,0, og pH 4,0) ved å legge til passende mengder 5 M HCl.
9. Etter de angitte tidspunkter (pH 2, 1 min, pH 3, 2,5 min, pH 4, 30 min), nøytralisere kulturene ved tilsetning av egnede volumer av 5 M NaOH.
10. Overvåke veksten av de nøytraliserte kulturene i flytende kultur i 12 timer ved 30 ° C ved hjelp av OD-måling.

Representative Results

HdeA og HdeB er homolog E. coli-proteiner, som er kjent for å beskytte periplasmatiske proteiner mot syrestressbetingelser ^10. Vårt arbeid avdekket at lik HdeA, HdeB fungerer også som en syre aktivert molekylære anstand. Men i motsetning til HdeA, HdeB funksjoner ved en pH som fortsatt er potensielt baktericide, men vesentlig høyere enn den pH-optimum på HdeA ^6,9,10,22. For å undersøke pH-optimum på HdeB s anstand aktivitet in vitro, ble innfødt MDH fortynnet i forvarmet (43 ° C) buffer av den angitte pH-verdi i nærvær eller fravær av HdeB. Etter 360 sekunders inkubering ble inkubasjonen reaksjonen nøytralisert. Denne nøytralisering utløser aggregering av MDH ved 43 ° C ^9. Representative resultater viser at lysspredningssignalet av MDH i fravær av HdeB øker dramatisk ved nøytralisering på grunn av aggregering av MDH (fig 1, black linje på hver pH). I nærvær av HdeB, blir lysspredningssignalet betydelig redusert ved nøytralisering av pH 4 eller pH 5 indikerer at HdeB forhindrer aggregering av MDH (fig 1, pH 4 og pH 5). I motsetning til dette, men ved nøytralisering av pH 2 og pH 3, MDH hurtig tilslag i samme grad uavhengig av tilstedeværelse eller fravær av HdeB (figur 1, pH 2 og pH 3), noe som indikerer at pH-optimum for HdeB s anstand aktivitet er mellom pH 4 og 5. det HdeB lagringsbuffer hadde ingen virkning på aggregering MDH (fig 1, bufferkontroll), som indikerer at den reduserte lysspredningssignalet av MDH i nærvær av HdeB ved pH 4 er på grunn av sin anstand funksjon. HdeA er anstand aktiv i sin monomere og ufoldet form ved pH 2-3, men viser ingen aktivitet ved eller over pH 4 ^10. Disse resultatene tyder på at HdeB har sin optimale anstand aktivitet rundt pH 4 ^10.

t = "Figur 1" src = "/ files / ftp_upload / 54527 / 54527fig1.jpg" />
Fig. 1: anstand aktivitet av HdeB ved sur pH-verdi 0,5 uM MDH ble inkubert i forvarmet buffer D ved den angitte pH-verdi i fravær eller nærvær av 12,5 pM HdeB for 360 sekunder ved 43 ° C. PH-verdien i prøvene ble deretter hevet til pH 7 (som vist med asterisk) ved tilsetning av 0,16 til 0,34 volum 2 M bufret K ₂ HPO _4, ble MDH aggregering målt i ytterligere 440 sekunder ved å måle lysspredning ved 350 nm ved nøytral pH (blå bakgrunn). Figuren er modifisert fra Dahl et al. ¹⁰ .Dette forskning ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, laks L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB fungerer som en syre-beskyttende anstand i bakterier. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright American Society for biokjemi og molekylærbiologi.s / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å løse enten HdeB danner stabile komplekser også med andre klient proteiner, ble 3 uM LDH termisk foldes ut ved 41 ° C i nærvær eller fravær av 30 pM HdeB ved ulike pH-betingelser. Analyse av sedimente oppførselen til disse prøvene ved hjelp av analytisk ultrasentrifugering ble utført ved 22 ° C. Når LDH og HdeB ble inkubert sammen ved pH 7 og 41 ° C, forble LDH utelukkende tetramere (molekylvekt på 120 kDa) og HdeB forble dimer. Disse resultatene indikerte at proteinene ikke danner stabile komplekser ved pH 7, og LDH gjennomgår ikke noen irreversible endringer i oligomerisering ved en 20 minutters inkubering ved 41 ° C (figur 2, grønn linje). Likeledes forble HdeB dimerisk ved inkubering ved 41 ° C og pH 4,0, noe som indikerer at lav pH inkubasjonav HdeB ikke påvirke oligomeriseringsprosessen tilstanden selv under varme sjokktilstander (figur 2, rød linje). LDH når inkubert ved pH 4 og 41 ° C i fravær av HdeB hurtig aggregert som vist ved det faktum at 40% av LDH sedimentert før det første søket ble registrert (Figur 2, er angitt i øvre høyre hjørne). De resterende LDH først på for å sedimentere hovedsakelig som monomer (figur 2, blå linje). I motsetning til dette, inkubering av LDH og HdeB ved pH 4 og 41 ° C førte til en stor andel av de to proteinene til co-sediment (HdeB-LDH _C), som danner en ny art med en molekylvekt på 134 kDa. Denne arten representerer trolig et kompleks mellom HdeB dimerer og termisk utfolder LDH. Videre, i nærvær av HdeB, ble ingen signifikant LDH aggregering før sedimentering observert, noe som er i overensstemmelse med våre in vitro aggregering målinger. Disse resultatene viser at HdeB viser anstand aktivitet i sindimer form ved pH 4,0. Dette står i sterk kontrast til HdeA, som er anstand aktiv i sin monomere form. Selve dynamikken i HdeB som gjør at den kan gjennomgå strukturelle rearrangements mellom pH 4 og pH 7 er sannsynligvis tilstrekkelig for aktivering av HdeB sin anstand funksjon ^10.

Fig. 2: Påvisning av kompleksdannelse mellom HdeB og utbrettet LDH ved pH 4 ved hjelp av analytisk ultrasentrifugering 3 uM LDH ble inkubert i nærvær av et 10-molart overskudd HdeB i buffer D (150 mM KHPO _4, 150 mM NaCl) i 15 min ved 41 ° C ved enten pH 7 (grønn linje) eller pH 4 (sort linje). For sammenligning ble LDH alene (blå linje), eller HdeB alene (rød linje) inkubert i 15 minutter ved 41 ° C ved pH 4. Analytiske ultrasentrifugesedimenteringshastigheten ble benyttet for å bestemme støkiometrien av HdeB, LDH, og komplekset dannet mellom HdeB og LDH på difskjellige pH-forhold. Merk at ~ 40% LDH samlet før første skanningen når inkuberes ved pH 4 og i fravær av HdeB (som nevnt i øvre høyre hjørne). Vist er en sedimenterings koeffisient fordeling plot (c (e)) analyseres ved hjelp av programmet SEDFIT. Bokstaver angir de respektive oligomere tilstand av LDH eller HdeB henholdsvis: HdeB _D, HdeB dimer; LDH _M, LDH monomer, LDH _T, LDH tetramer; HdeB-LDH _C, HdeB-LDH kompleks. Figuren er modifisert fra Dahl et al. ^10. Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, laks L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB fungerer som en syre-beskyttende anstand i bakterier. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright American Society for biokjemi og molekylærbiologi. Klikk her for å se et større version av dette tallet.

For å teste om HdeB støtter refolding av klient proteiner ved nøytralisering, ble HdeB innflytelse på refolding av pH-denaturert MDH analysert. Termisk denaturert MDH ble inkubert ved forskjellige pH-verdier i nærvær eller fravær av HdeB. Etter å ha lav pH inkubering ble pH nøytralisert (som initierer MDH refolding), og MDH aktivitet ble bestemt etter 2 timer. Som vist i figur 3, var signifikant reaktivering av MDH oppnådd ved nøytralisering fra pH 4 i nærvær av HdeB. Ingen MDH aktivitet ble bestemt da HdeB var fraværende fra lav pH inkubasjon.

Figur 3: HdeB forenkler folding på nytt av syre denaturert MDH i en enzymatisk aktiv tilstand 1 uM MDH ble inkubert i buffer D ved den angitte pH-verdi i 1 time ved 37 ° C i fravær av eller s.resence på 25 mikrometer HdeB. Deretter ble temperaturen skiftet til 20 ° C i 10 minutter før prøvene ble nøytralisert til pH 7 ved tilsetning av 0,5 M Na HPO _{2 4.} Aliquoter ble tatt etter 2 timers inkubasjon ved 20 ° C og analysert med hensyn på aktivitet MDH. MDH aktivitet ved nøytralisering i fravær (hvite søyler) eller tilstedeværelse av HdeB (svarte søyler) vises. Standardavvik er avledet fra minst 3 uavhengige målinger er vist. Figuren er modifisert fra Dahl et al. ^10. Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, laks L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB fungerer som en syre-beskyttende anstand i bakterier. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright American Society for biokjemi og molekylærbiologi. Klikk her for å se en større versjon av dennefigur.

Vår in vitro data viste at HdeB binder ulike modell klient proteiner ved pH 4, hindrer deres aggregering og forenkler klient refolding gang nøytrale pH-forhold er gjenopprettet. For å undersøke effekten av HdeB in vivo, ble pH-avhengig overlevelse analyser utført ved bruk av temperaturfølsomme belastning rpoH sletting. Denne stamme mangler de fleste anstand, og er derfor mer utsatt for forhøyet temperatur, lav pH eller oksidativt stress ^15. Overekspresjon av HdeB under nøytrale pH-betingelser viste ingen effekt på veksten av stammen, som vokste forholdsvis godt til kontrollstammen som havner den tomme vektoren pBAD18 (figur 4, ubehandlet). I motsetning til dette, fant vi tydelige forskjeller i deres evne til å fortsette veksten på pH 3 eller pH 4 behandling med HdeB overekspresjon belastningen viser reproduserbart økt utvinning fra lav pH treatment enn kontrollstammen. I motsetning til våre in vitro-data, men nærværet av HdeB hadde også en betydelig beskyttende effekt ved pH 3. Dette kan være på grunn av den høye konsentrasjonen av HdeB i cellen, som kan forskyve oligomerisering tilstand av HdeB mot dimere til og med ved pH 3. Merk at skiftende celler til pH 2 eller pH 3 resultert i svært raske og svært giftige effekter, mens ingen signifikant drapet ble observert når cellene der inkuberes ved pH 4 ^9,10,22.

Figur 4: HdeB beskytter E. coli mot sur pH. HdeB (røde sirkler) ble overuttrykt i BB7224 (Δ rpoH) i nærvær av 0,5% arabinose ved 30 ° C. BB7224 celler som de tomme vektor pBAD18 ble brukt som kontroll (svarte sirkler). Øvre venstre panel viser en vekst på både stRegnet ved 30 ° C, ble pH 7. Celler forskjøvet til den indikerte pH ved tilsetning av 5 M HCl, og inkubert i 1 min ved pH 2 (øverst til høyre panel), 2,5 minutter ved pH 3 (nederst til venstre panel) eller 30 minutter ved pH 4 (nedre panel til høyre). Deretter kulturer ble nøytralisert ved tilsetning av egnede volumer av 5 M NaOH og vekst ble kontrollert i flytende medier ved 30 ° C. Figuren er modifisert fra Dahl et al. ^10. Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, laks L, Horowitz S, Bardwell JC, Jakob U. HdeB fungerer som en syre-beskyttende anstand i bakterier. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright American Society for biokjemi og molekylærbiologi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

For å studere mekanismen for aktivering og anstand funksjon av HdeB, store mengder HdeB har til å bli uttrykt og renset. En rekke ekspresjonssystemer vektorsystemer er tilgjengelige for produksjon av høye nivåer av et mål-protein, inkludert pTrc eller pBAD vektorer, som begge ble brukt i denne studien. Initiativtakerne er lett tilgjengelig for E. coli RNA polymerase og dermed tillate sterkt oppregulert uttrykk for HdeB i enhver E. coli-stamme. Dette aspektet er spesielt relevant for in vivo studie av overekspresjon HdeB under sure stressbetingelser, hvor det rpoH -deficient stammen ble benyttet. Denne stammen mangler det meste av anstand og således er mer sensitive overfor forskjellige stressfaktorer, inkludert forhøyet temperatur, lav pH og oksidativt stress ^15. Som et alternativ overlevelse studerer lik de som er presentert her kan utføres i mutantstammer som mangler genet av interesse.

t "> Det eksperimentelle design for en hvilken som helst anstand aktivitet eller refolding analysen må vurderes nøye, både i forhold til den type klient, idet konsentrasjonen av klienten proteinet og bufferbetingelser. I typiske anstand analyser, modell klient proteiner, så som citratsyntaseaktivitet, luciferase, eller malatdehydrogenase blir denaturert i høye konsentrasjoner av urea eller guanidin-HCl, og fortynnet i denatureringsmiddel-fri buffer for å indusere aggregering ^23,13. Målinger i nærvær av anstand viser i hvilken grad de hindrer proteinaggregering. Alternativt klientene er termisk utfoldet og proteinaggregering blir overvåket. i begge tilfeller er lysspredende målinger anvendes som avlesning for proteinaggregering. Aktive anstand forhindre aggregering av utfoldelsen klient proteiner, og dermed forårsaker en reduksjon i den lysspredning signal ^6. begge av disse forsøksoppsett kan kombineres med lav pH inkubasjon. i tillegg til å vurdere molecular anstand aktivitet ved å overvåke deres evne til å hindre aggregering av bestemte klient proteiner, kan påvirkning av anstand på klient refolding ved retur til ikke-stress forhold testes ^24. Dette er spesielt enkelt når klienten proteinene besitter enzymatisk aktivitet, som kan anvendes som kvantitativ avlesning for deres inaktivering og aktivering. Mens anstand-mediert refolding er naturligvis en ATP-avhengig prosess, har periplasmatiske anstand som HdeA, HdeB og Spy blitt vist å lette klient refolding i en ATP-uavhengig måte, i samsvar med mangel på energi i periplasmaet ^9,25.

Studerer pH optimum på en syre-beskyttende anstand som HdeB er utfordrende på grunn av ulike grunner: (i) aggregering atferd selv veletablerte anstand-klient proteiner som citratsyntaseaktivitet avviker ved sur pH; og (ii) bare noen få buffersystemer arbeide i pH-området mellom 2-5 og er suitabell for både anstand av interesse og klienten protein. Vi besluttet å bruke fosfatbuffer, selv om vi er klar over at dette er en ikke-ideell buffersystem under sure pH-betingelser. Men fosfatbuffer ble funnet å være godt egnet til å karakter HdeA som syre aktivert anstand ^9,22. Aggregering målinger er svært følsomme overfor endringer i temperatur eller bufferinnhold. For å eliminere falske positive resultater, anbefaler vi derfor å alltid teste påvirkning av anstand lagring buffer på klient aggregering (figur 1, buffer kontroll). Noen ganger aggregering av klienten proteinet skjer så hurtig at selv de beste anstand ikke kan være i stand til å konkurrere med aggregeringen prosessen. Det er derfor viktig å kunne foreta foreløpige tester for å finne de optimale analysebetingelser. Et godt eksempel på en slik situasjon er vist i våre ultra-sentrifugeringsforsøk hvor inkubasjon av LDH ved temperaturer> 42 ° C er så rask at selvnærvær av et overskudd av HdeB hindrer ikke LDH aggregering. I tillegg har anstand / co-anstand forhold eller anstand / klient forhold skal fastsettes nøye ^23. Vi begynte å bruke en ganske høy HdeB: MDH forhold på 50: 1 i innledende eksperimenter og som har hjulpet oss med å identifisere pH 4 som den optimale pH for anstand aktivitet HdeB. Deretter fortsatte å analysere HdeB: MDH-forhold mellom 1: 1 og 50: 1 ved pH 4, som identifiserer 25: 1 å være det mest effektive forhold. I kontrast, HdeA trykt MDH aggregering som 10: 1 anstand: klientforhold ^6,9,10,22. Dermed konkluderer vi med at HdeA, i forhold til HdeB, er mer effektiv i å undertrykke MDH aggregering som lavere anstand: klientforhold var tilstrekkelig til å undertrykke MDH aggregering. En annen tilnærming til å undersøke anstand-mediert hemming av protein aggregering involvere spin-down-analyser, der klient aggregater fjernes ved sentrifugering og kvantifisert ved SDS PAGE. Denne tilnærmingen er også egnet for monitoring påvirkning av anstand på protein aggregasjon in vivo. Mutant stammer som enten overuttrykker eller mangler anstand av interesse blir utsatt for protein utfolder stress forhold. Deretter blir cellene lysert og oppløselige og aggregerte fraksjoner blir separert og kvantifisert ^15,16,26.

For påvisning av klient anstand kompleks, søkte vi analytisk ultrasentrifugering. Det skal her bemerkes at på grunnlag av de eksperimentelle oppsettet er det ikke mulig direkte å kvantifisere mengden av HdeB og LDH-monomerer bundet i komplekset, som begge proteiner absorberer ved 280 nm. Om ønsket, kan støkiometrien av den anstand-klient kompleks bestemmes ved separat å merke anstand og klient-protein med en kromofor, hvis magnetisering maksimum ligger innenfor det synlige område. Alternativt kan støkiometrien av klienter til anstand innenfor kompleksene bli bestemt ved hjelp av nativ PAGE koblet med kvantitativ western blot. Ved å følge de protokollene som presenteres her, var vi i stand til å karakterisere to molekylære anstand, HdeA, og HdeB ^9,10,22. Generelt kan disse analysene kan også anvendes for å undersøke rollen av potensielle inhibitorer av molekylære anstand i protein refolding in vitro og in vivo, eller kan brukes for å teste syntetiske anstand for deres evne til å hindre aggregering klient under sure stress. I tillegg kan de protokoller som er presentert her benyttes for analyser av punkt-mutasjoner og / eller forkortede varianter av de syreaktiverte anstand for å kaste lys inn i mekanismen for deres aktivering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEB10-beta E. coli cells	New England Biolabs	C3019I
Ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-3
LB Broth mix, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Polymyxin B sulfate	ICN Biomedicals Inc.	100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%	Bio-Rad	4561046
Malate dehydrogenase (MDH)	Roche	10127914001
Potassium phosphate (Monobasic)	Fisher Scientific	BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer	Hitachi	FL25
Oxaloacetate	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled	Beckman Coulter	306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
Wizard Plus Miniprep Kit	Promega	A1470	used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose	Gold Biotechnology	A-300-500
Glycine	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette	Hellma Analytics	119004F-10-40
Oligonucleotides	Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
dNTP set	Invitrogen	10297018
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	Millipore	UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI	Beckman Coulter	393127
Varian Cary 50 spectrophotometer	Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher	4375786