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Biochemistry

Detección de la actividad dependiente del pH de Published: October 23, 2016 doi: 10.3791/54527
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Summary

Este estudio describe las técnicas biofísicas, bioquímicas y moleculares para caracterizar la actividad chaperona de Escherichia coli HdeB en condiciones de pH ácido. Estos métodos se han aplicado con éxito para otros chaperones ácido-protectores tales como HdeA y puede ser modificado para trabajar para otros chaperones y condiciones de estrés.

Abstract

Las bacterias están expuestos con frecuencia a los cambios ambientales, tales como alteraciones en el pH, la temperatura, el estado redox, exposición a la luz o fuerza mecánica. Muchas de estas condiciones causar desplegamiento de la proteína en la célula y tienen un impacto perjudicial sobre la supervivencia del organismo. Un grupo de las chaperonas moleculares no relacionadas, estrés específica se ha demostrado que desempeñan papeles esenciales en la supervivencia de estas condiciones de estrés. Mientras totalmente plegada y chaperona-inactivo antes de estrés, estas proteínas se despliegan rápidamente y se convierten en chaperona-activa bajo condiciones de estrés específicos. Una vez activadas, estas chaperonas condicionalmente desordenadas se unen a un gran número de diferentes proteínas de agregación propensos, prevenir su agregación y facilitar directa o indirectamente la proteína de replegamiento a su regreso a condiciones de no estrés. El enfoque principal para obtener una comprensión más detallada sobre el mecanismo de activación de su reconocimiento y el cliente implica la purificación y subsequent caracterización de estas proteínas utilizando en ensayos in vitro de chaperona. El seguimiento en los ensayos in vivo de estrés son absolutamente esenciales para confirmar de manera independiente la obtenida en los resultados in vitro.

Este protocolo describe en vitro y en métodos in vivo para caracterizar la actividad chaperona de E. coli HdeB, una chaperona-ácido activado. Mediciones de dispersión de luz se utilizaron como un cómodo lectura de salida para la capacidad de HdeB para evitar la agregación inducida por ácido de una proteína cliente modelo establecido, MDH, in vitro. ultracentrifugación analítica experimentos se aplicaron a revelar la formación de complejos entre HdeB y su proteína LDH cliente, para arrojar luz sobre la suerte de proteínas cliente a su regreso a condiciones de no estrés. Se llevaron a cabo ensayos de actividad enzimática de las proteínas cliente de monitorizar los efectos de HdeB en la inactivación cliente pH inducida y la reactivación. Por último, se utilizaron estudios de supervivencia al monitor la influencia de la función chaperona de HdeB in vivo.

Introduction

Un entorno natural común en el que los patógenos microbianos experimentan condiciones que se desarrollan de proteínas inducidas por ácido es el estómago de mamíferos (intervalo de pH 1-4), cuyo pH ácido sirve como una barrera efectiva contra los patógenos transmitidos por los alimentos 1. Desplegamiento de la proteína y la agregación, que es causada por la protonación de la cadena lateral de aminoácido, afecta a los procesos biológicos, estructuras celulares daños y eventualmente causa la muerte celular 1,2. Dado que el pH de la periplasma bacteriano se equilibra de forma casi instantánea con el pH del medio ambiente debido a la difusión libre de protones a través de la membrana externa porosa, proteínas de la membrana periplásmicas e interior de las bacterias Gram-negativas son los componentes celulares más vulnerables en condiciones ácidas-estrés 3. Para proteger su proteoma periplásmico contra el daño mediado por ácido rápida, las bacterias Gram-negativas utilizan las chaperonas periplásmicas ácido activado HdeA y HdeB. HdeA es una chaperona condicionalmente desordenado 6,7. La activación de HdeA requiere profundos cambios estructurales, incluyendo su disociación en monómeros, y el que se desarrollan parcial de los monómeros 6-8. Una vez activado, HdeA une a las proteínas que se desarrollan en condiciones ácidas. Se evita con eficacia su agregación, tanto durante la incubación a pH bajo, así como la neutralización del pH. A su regreso a pH 7,0, HdeA facilita el repliegue de sus proteínas cliente de una manera independiente de ATP y la convierte de nuevo en su dimérica, la conformación inactiva chaperón-9. Del mismo modo, la HdeB chaperona homóloga también se chaperona inactiva a pH 7,0. A diferencia de HdeA, sin embargo, la actividad chaperona de HdeB alcanza su máximo aparente a pH 4,0, condiciones en las que se HdeB todavía en gran parte doblada y diméricas 10. Por otra parte, reduciendo aún más las caus pHes la inactivación de HdeB. Estos resultados sugieren que a pesar de su extensa homología, HdeA y HdeB difieren en su modo de activación funcional que les permite cubrir un amplio rango de pH con su función protectora chaperona. Una otra chaperona que se ha implicado en la resistencia a los ácidos de E. coli es el citoplasmática Hsp31, que aparece para estabilizar proteínas cliente desplegadas hasta que se restablecen las condiciones neutrales. El modo preciso de acción de Hsp31, sin embargo, se ha mantenido enigmática 12. Teniendo en cuenta que otras bacterias enteropatógenas tales como Salmonella carecen del operón hdeAB, es muy probable que puedan existir otras chaperonas periplásmicas aún no identificados que están involucrados en la resistencia de estas bacterias ácido 11.

Los protocolos presentados aquí permiten controlar la actividad chaperona dependiente del pH de HdeB in vitro e in vivo 10 y se pueden aplicar para investigar otros chaperonestales como Hsp31. Alternativamente, la red compleja de factores de transcripción que controlan la expresión de hdeAB potencialmente puede ser investigada mediante el ensayo de estrés in vivo. Para caracterizar la función de chaperón de las proteínas in vivo, diferentes configuraciones experimentales se pueden aplicar. Una ruta es aplicar desplegamiento de la proteína condiciones de estrés y fenotípicamente caracterizar las cepas mutantes que sobreexpresan o bien el gen de interés o llevar una deleción del gen. Los estudios proteómicos pueden llevar a cabo para identificar las proteínas que ya no agregada en condiciones de estrés cuando la chaperona está presente, o la influencia de un acompañante en una enzima específica se pueden determinar durante condiciones de estrés utilizando métodos enzimáticos 14-16. En este estudio, se optó por sobreexpresan HdeB en una cepa de deleción rpoH, que carece del factor sigma de choque térmico 32. RpoH controla la expresión de los principales E. chaperones coli y su eliminación se sabe que aumenta sensitivity a condiciones de estrés ambiental que causan desplegamiento de la proteína 15. La actividad chaperona in vivo de HdeB se determinó mediante el control de su capacidad para suprimir la sensibilidad pH de la cepa Δ rpoH. En total, los protocolos presentados aquí proporcionan un enfoque rápido y directo para caracterizar la actividad de una chaperona-ácido activado in vitro, así como en el contexto in vivo.

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Protocol

1. Expresión y purificación de periplásmico HdeB

NOTA: HdeB se expresó en E. células de E. coli que albergan el plásmido pTrc- hdeB 10, y se purificó a partir del periplasma tras la lisis polimixina.

  1. Preparar un cultivo nocturno de E. coli células que albergan el plásmido pTrc- hdeB 10 en 30 ml de LB que contiene 200 mg / ml de ampicilina (LB Amp). Inocular cuatro 1 culturas L de LB Amp y crecer a 37 ° C y 200 rpm hasta que se alcanza OD 600 nm de 0,7. A continuación, añadir 300 mM IPTG para inducir la expresión de HdeB y disminuir la temperatura de crecimiento a 30 ° C.
  2. Después de 5 h de expresión de la proteína a 30 ° C, recoger las células por centrifugación a 8000 xg durante 5 min a 4 ° C.
  3. Lavar el sedimento celular con 100 ml de tampón A (Tris 50 mM / HCl, NaCl 50 mM, pH 7,5) y centrifugar las células de nuevo a 8.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
  4. Posteriormente, resuspenderel sedimento celular en 80 ml de tampón A, que contiene 1 mg de sulfato de polimixina / ml. Para la interrupción eficaz de la membrana externa, agitar suavemente la suspensión durante 1 hora a 4 ° C.
  5. Para eliminar la fracción citoplásmica y restos de células, centrifugar la suspensión durante 20 min a 15.000 xg a 4 ° C. Esto resulta en ~ 60 ml de sobrenadante que contiene el HdeB soluble.
  6. Se dializa el sobrenadante que contiene el extracto periplásmico durante la noche frente volumen 150x de tampón B (Tris / HCl 20, EDTA 0,5 mM, pH 8,0) utilizando una membrana de diálisis con 6 kDa MW línea de corte. Se concentran las proteínas a 15 ml usando unidades de filtro centrífugo con un peso molecular de corte de 3 kDa. Se filtra la solución de proteína usando un filtro de 0,2 micras de poro.
  7. Aplicar la proteína en una columna de cromatografía de intercambio de aniones (volumen de la columna 5 ml) que ha sido equilibrada con 5 volúmenes de columna de tampón B con un caudal de 2,5 ml / min. Una vez que la proteína se cargó en la columna, lavar la columna con tampón B durante 10 min auna velocidad de flujo de 2,5 ml / min. Eluir HdeB con un gradiente lineal de 0 a 0,5 M NaCl en tampón B durante un período de tiempo de 50 min con un caudal de 2,5 ml / min 6.
  8. Identificar las fracciones que contienen HdeB utilizando un 15% de SDS-PAGE. Mezclar 20 muestra l con 5 l de 5x tampón de carga SDS reducido. Carga de 10 l en el gel y ejecutar en tampón Tris-glicina (14,4 g / l de glicina, 2,9 g / L Tris, 1 g / l de sulfato de dodecilo de sodio, pH 8,3). Correr el gel a 150 V hasta que la banda de bromofenol migró cerca de la parte inferior del gel (~ 45 min).
  9. Piscina todas las fracciones HdeB que contienen, diálisis a 4 ° C durante la noche frente a tampón de almacenamiento HdeB 4 L (50 mM Tris / HCl, NaCl 200 mM, pH 8,0), y concentrar la proteína a aproximadamente 300 mM utilizando unidades de filtración centrífuga con un peso molecular de corte de 3 kDa. Determinar la concentración de HdeB a 280 nm usando el coeficiente de extinción ε 280 nm = 15.595 M -1 cm -1. Preparar 100 ml de alícuotas y sin flash enze las alícuotas en nitrógeno líquido.
    NOTA: HdeB se puede almacenar a -70 ° C durante al menos 6 meses.

2. Ensayo de la actividad chaperona Usando térmicamente despliegue malato deshidrogenasa (MDH)

NOTA: La influencia de HdeB purificado en la agregación de despliegue térmicamente porcino malato deshidrogenasa mitocondrial (MDH) a diferentes valores de pH se monitorizó como se describe a continuación. Todas las concentraciones de proteína enumerados se refieren a la concentración de monómero.

  1. Para preparar MDH, dializar MDH a 4 ° C durante la noche contra 4 L de tampón C (50 mM de fosfato de potasio, NaCl 50 mM, pH 7,5) y concentrar la proteína a aproximadamente 100 mM utilizando unidades de filtración centrífuga con un peso molecular de corte de 30 kDa.
    ATENCIÓN: se necesita diálisis cuidadosa de MDH como MDH se entrega como una solución de sulfato de amonio.
  2. Para eliminar los agregados, centrifugar la proteína durante 20 minutos a 20.000 xga 4 ° C. Determinar la concentración de MDH por absorbancia a 280 nm (ε <sub> 280 nm = 7,950 M -1 cm -1). Preparar 50 ml de alícuotas de MDH y flash-congelar las alícuotas para su almacenamiento.
  3. Colocar 1 ml cubeta de cuarzo en un espectrofotómetro de fluorescencia equipado con soportes de muestra de temperatura controlada y agitador. Establecer ex λ / em a 350 nm.
  4. Añadir los volúmenes adecuados de pre-calentado (43 ° C) tampón D (150 mM de fosfato de potasio, NaCl 150 mM) a los valores deseados de pH (aquí: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0, y pH 5,0) a la cubeta y conjunto la temperatura en el soporte de cubeta a 43 ° C. El volumen total es de 1.000 l.
  5. Añadir 12,5 M HdeB (o, alternativamente, el mismo volumen de tampón de almacenamiento HdeB para el control de tampón) a la memoria intermedia, seguido de la adición de 0,5 M MDH. Comenzar a controlar la dispersión de luz. Se incuba la reacción durante 360 ​​segundos para permitir la suficiente despliegue de MDH.
  6. Elevar el pH a 7 mediante la adición de 0,16-0,34 volumen de 2 M K sin búfer 2 HPO 4 y continuar reacuerdo dispersión de la luz para otro 440 seg.
  7. Ajuste el grado de agregación MDH que se registra en la ausencia de la chaperona en un punto de tiempo definido después de la neutralización (aquí después de 500 seg, cuando se observó la máxima dispersión de la luz de MDH) a 100%. Normalizar la actividad de HdeB a la señal de dispersión de la luz de MDH en ausencia de HdeB en cada valor de pH indicado.

3. Detección de HdeB-LDH Formación de complejos por ultracentrifugación analítica (AUC)

NOTA: los experimentos de velocidad de sedimentación de HdeB sola o en complejo con despliegue térmicamente lactato deshidrogenasa (LDH) se realizaron utilizando una ultracentrífuga analítica.

  1. Para preparar LDH, dializar LDH a 4 ° C durante la noche contra 4 L de tampón C (50 mM de fosfato de potasio, NaCl 50 mM, pH 7,5) y concentrar la proteína a aproximadamente 200 mM utilizando unidades de filtración centrífuga con un peso molecular de corte de 30 kDa.
    NOTA: Se requiere diálisis cuidadosa de LDH como LDH se suministra como solución de sulfato de amonio.
  2. Para eliminar los agregados, centrífuga de LDH durante 20 minutos a 20.000 xga 4 ° C. Determinar la concentración de LDH por absorbancia a 280 nm (ε = 280 nm 43.680 M -1 cm -1). Preparar 50 ml de alícuotas de LDH y flash-congelar las alícuotas para su almacenamiento.
  3. Incubar 3 LDH mu M en presencia y ausencia de HdeB 30 mM en tampón D (pH 4 y 7, respectivamente) durante 15 min a 41 ° C.
    NOTA: La incubación de LDH a temperaturas más altas resultados en su completa agregación, y ningún efecto chaperona de HdeB se pueden observar.
  4. Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente. A continuación, las muestras de carga en las células que contienen sector de la norma en forma de piezas centrales de 2 canales con 1.2 cm de espesor. Cargar las células en la ultracentrífuga y equilibrar a 22 ° C durante al menos 1 hora antes de la sedimentación.
  5. muestras de giro a 22 ° C y 167.000 xg en el rotor respectivo durante 12 horas, y supervisar la sedimentation de la proteína de forma continua a 280 nm. Como se ha demostrado anteriormente, la relación señal a ruido se mejora cuando la intensidad de la luz transmitida de cada canal se mide en lugar de absorbancia. Esto también mejora la calidad de la subsiguiente ajuste de datos.
  6. Llevar a cabo el análisis de datos con SEDFIT (versión 15.01b, Diciembre de 2015), utilizando el modelo de distribución continua c (s) 17. Un tutorial que describe cómo utilizar SEDFIT se puede encontrar en la referencia 18.
    1. Ajuste el nivel de confianza para la regularización ME (máxima entropía) a 0,7.
  7. Calcular la densidad de tampón, así como la viscosidad usando SEDNTERP 19. Para estimar la cantidad de proteína agregada cliente, comparar las integrales de LDH sedimentado en pH 4 a pH 7 como referencia.
    NOTA: La integración de las gráficas de distribución de sedimentación se puede hacer directamente en SEDFIT. Alternativa software para analizar los datos de velocidad de sedimentación se puede encontrar en una reciente revisión 20. </ Li>

4. Seguimiento MDH inactivación y reactivación en la Presencia de HdeB

NOTA: La influencia de HdeB purificado en el replegamiento de pH-desplegada MDH se determinó mediante el control de la actividad de MDH la neutralización.

  1. Incubar 1 MDH mu M en tampón D en los valores deseados de pH (aquí: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0, y pH 5,0) durante 1 hora a 37 ° C en la ausencia o presencia de 25 HdeB M. A continuación, cambiar la temperatura a 20 ° C durante 10 min.
    NOTA: No replegamiento MDH se observó incluso en presencia de HdeB cuando MDH se incubó a temperaturas superiores a 37 ° C.
  2. Para iniciar el replegamiento de ácido MDH desnaturalizado, neutralizar las muestras a pH 7 mediante la adición de 0,13 hasta 0,42 volumen de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0.
  3. Después de la incubación durante 2 horas a 20 ° C, determinar la actividad de MDH mediante el control de la disminución de NADH a 340 nm 9.
    NOTA: MDH cataliza la reducción dependiente de NADH de oxaloacetato en L-malato. Mezclar 50 l de la reacción de incubación con 950 l de tampón de ensayo (fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0, 1 mM oxaloacetato, y 150 mM de NADH).
    NOTA: La concentración final de MDH en el tampón de ensayo debería ser 44 nM.
  4. Monitorear el cambio en la absorbancia utilizando un espectrofotómetro, equipado con un bloque de control de temperatura Peltier se establece en 20 ° C.
  5. Informar de la actividad de MDH en relación con 44 nM MDH nativa que se ha mantenido a un pH de 7,0.

5. Efecto de la sobreexpresión en E. HdeB coli supervivencia bajo estrés ácido

NOTA: E. ADN genómico MG1655 coli se aisló usando un protocolo publicado 21.

  1. Amplificar hdeB de E. coli MG1655 mediante PCR utilizando cebadores hdeB - BamHI-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT ATT CGG CAA GTC y hdeB - EcoRI-FW GGT CGC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT TCA TCA TCT CTC C.
  2. Configurar la reacción de PCR en 50 l de la siguiente manera: 10 l de 5x tampón de la polimerasa, 200 mM dNTPs, 0,5 M imprimación JUD2, 0,5 M imprimación JUD5, 150 ng MG1655 ADN genómico, 0,5 l de ADN polimerasa, añadir ddH2O a 50 l.
  3. Realizar la amplificación de hdeB como sigue: Paso 1: 5 min a 95 ° C, 1 ciclo; paso 2: 30 segundos a 95 ° C, 30 seg a 55 ° C, 30 seg a 72 ° C, 40 ciclos; Paso 3: 10 min a 72 ° C.
  4. Clon resultante fragmento de PCR en los sitios EcoR I y BamH I del plásmido pBAD18 utilizando métodos estándar para la clonación de sitios de restricción. Se purificó el plásmido usando un kit de purificación de plásmido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Verificar el plásmido resultante por secuenciación 10.
  5. Transformar el plásmido que expresa HdeB o los pBAD18 de control de vectores vacíos en BB7224 cepa (Δ rpoH) (genotipo: F -, λ -, e14 -, [araD139] B / r [6; (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 ZHF :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 Arad + rpoH :: kan +; 16) utilizando células químicamente competentes.
    NOTA: Esta cepa es sensible a la temperatura.
  6. Después de 45 segundos de choque térmico a 42 ° C y antes de la galvanoplastia, las células se incuban a 30 ° C y 200 rpm. Realizar sola colonia racha de espera de los clones positivos y se incuba durante la noche a 30 ° C. Preparar un cultivo de una noche en 50 ml de LB Amp y cultivar las células a 200 rpm y 30 ° C.
  7. Diluir cultivos de una noche de 40 veces en 25 ml de LB Amp y crecer las bacterias en presencia de 0,5% de arabinosa (Ara) a 30 ° C y 200 rpm a una OD 600 nm = 1,0 para inducir la expresión de la proteína HdeB.
  8. Para los experimentos de desplazamiento de pH, utilizar LBAmp + Ara para diluir las células a 600 nm de 0,5 y se ajusta a los valores respectivos de pH (en este caso: pH 2,0, pH 3,0 y pH 4,0) mediante la adición de volúmenes apropiados de HCl 5M.
  9. Después de que los puntos de tiempo indicados (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min; pH 4, 30 min), neutralizar los cultivos mediante la adición de los volúmenes apropiados de NaOH 5 M.
  10. Monitorear el crecimiento de los cultivos neutralizados en cultivo líquido durante 12 horas a 30 ° C por medio de mediciones de DO.

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Representative Results

HdeA y HdeB son homólogas E. proteínas coli, conocidos para proteger proteínas periplásmicas contra condiciones de estrés ácido 10. Nuestro trabajo reveló que al igual que HdeA, HdeB también funciona como un ácido activado chaperona molecular. Sin embargo, en contraste con funciones HdeA, HdeB a un pH que todavía es potencialmente bactericida, pero significativamente más alto que el pH óptimo de HdeA 6,9,10,22. Para investigar el pH óptimo de la actividad chaperona de HdeB in vitro, nativo MDH se diluyó en tampón precalentado (43 ° C) de pH indicado en presencia o ausencia de HdeB. Después de 360 ​​segundos de incubación, se neutralizó la reacción de incubación. Esta neutralización desencadena la agregación de MDH a 43 ° C 9. Los resultados representativos muestran que la señal de dispersión de luz de MDH en ausencia de HdeB aumenta dramáticamente la neutralización debido a la agregación de MDH (Figura 1, bllínea de acuse de recibo a cada pH). En presencia de HdeB, la señal de dispersión de luz se reduce significativamente la neutralización de pH 4 o pH 5 que indica que HdeB impide la agregación de MDH (Figura 1, pH 4 y pH 5). En contraste, sin embargo, la neutralización de pH 2 y pH 3, MDH agrega rápidamente en la misma medida independiente de la presencia o ausencia de HdeB (Figura 1, pH 2 y pH 3), lo que indica que el pH óptimo para la actividad chaperona de HdeB es entre pH 4 y 5. el tampón de almacenamiento HdeB no tuvo ningún efecto sobre la agregación de MDH (Figura 1, el control de tampón), lo que indica que la señal de dispersión de luz reducida de MDH en presencia de HdeB a pH 4 es debido a su función de la chaperona. HdeA se chaperón activo en su forma monomérica y desplegado a un pH de 2-3, pero no muestra actividad en o por encima de pH 4 10. Estos resultados sugieren que HdeB tiene su actividad óptima alrededor de pH 4 chaperona 10.

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Figura 1:. Actividad chaperona de HdeB a pH ácido 0,5 M MDH se incubó en tampón de pre-calentado D al pH indicado en la ausencia o presencia de 12,5 mM HdeB para 360 seg a 43 ° C. El pH de las muestras se elevó entonces a pH 7 (tal como se indica por el asterisco) mediante la adición de 0,16 a 0,34 de volumen 2 M K sin búfer 2 HPO 4, se midió la agregación de MDH para un 440 sec adicional mediante el control de la dispersión de luz a 350 nm en pH neutro (fondo azul). La figura es una modificación de Dahl et al. 10 .Este la investigación fue publicado originalmente en la revista Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, salmón L, S Horowitz, Bardwell JC, funciones Jakob U. HdeB como una chaperona ácido protector en bacterias. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10.1074 / jbc.M114.612986. Derechos de autor de la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular.s / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para abordar si las formas HdeB complejos estables también con otras proteínas cliente, LDH 3 M fue desplegado térmicamente a 41 ° C en presencia o ausencia de HdeB 30 micras, con diferentes condiciones de pH. Análisis del comportamiento de sedimentación de estas muestras por ultracentrifugación analítica se llevó a cabo a 22 ° C. Cuando LDH y HdeB se incubaron juntos a pH 7 y 41 ° C, se mantuvo LDH (peso molecular de 120 kDa) exclusivamente tetramérica y HdeB permaneció dimérica. Estos resultados indican que las proteínas no forman complejos estables a pH 7, y LDH no experimentan cambios irreversibles en la oligomerización sobre una incubación de 20 min a 41 ° C (Figura 2, línea verde). Del mismo modo, se mantuvo HdeB dimérica tras la incubación a 41 ° C y pH 4,0, lo que indica que la baja de incubación pHde HdeB no afecta a su estado de oligomerización, incluso en condiciones de choque térmico (Figura 2, línea roja). LDH cuando se incuba a pH 4 y 41 ° C en ausencia de agregados HdeB rápidamente como se indica por el hecho de que 40% de LDH sedimenta antes de la primera exploración se registró (Figura 2, se indica en la esquina superior derecha). La LDH restante apareció a los sedimentos predominantemente como monómero (Figura 2, línea azul). En contraste, la incubación de LDH y HdeB a pH 4 y 41 ° C causó una gran proporción de las dos proteínas de co-sedimentos (HdeB-LDH C), formando una nueva especie con un peso molecular de 134 kDa. Esta especie representa probablemente un complejo entre dímeros HdeB y LDH despliegue térmicamente. Por otra parte, en presencia de HdeB, no se observó agregación significativa LDH antes de la sedimentación, lo cual es consistente con nuestras mediciones de agregación in vitro. Estos resultados muestran que HdeB exhibe actividad chaperona en suforma dimérica a pH 4,0. Esto está en marcado contraste con HdeA, que se activa chaperón en su forma monomérica. La naturaleza muy dinámica de HdeB que permite que se someten a reordenamientos estructurales entre pH 4 y pH 7 es probable suficiente para la activación de la función chaperona de HdeB 10.

Figura 2
Figura 2:. La detección de la formación de complejos entre HdeB y LDH desplegada a pH 4 por ultracentrifugación analítica 3 LDH mu M se incubó en presencia de un exceso HdeB 10-molar en tampón D (150 mM KHPO 4, NaCl 150 mM) durante 15 min a 41 ° C a pH 7 (línea verde) o pH 4 (línea de color negro). Para la comparación, LDH solo (línea azul) o HdeB solo (línea roja) se incubaron durante 15 min a 41 ° C a pH 4. Analytical velocidad de sedimentación ultracentrifugación se utilizó para determinar la estequiometría de HdeB, LDH, y el complejo formado entre HdeB y LDH en el DIFrentes condiciones de pH. Tenga en cuenta que ~ 40% LDH agregados antes de la primera exploración cuando se incuba a pH 4 y en ausencia de HdeB (como se indica en la esquina superior derecha). Se muestra una gráfica de distribución coeficiente de sedimentación (c (s)) analizó usando el programa SEDFIT. Las letras indican el estado oligomérico respectiva de LDH o HdeB, respectivamente: HdeB D, HdeB dímero; LDH M, monómero de LDH, LDH T, LDH tetrámero; HdeB-LDH C, complejo HdeB-LDH. La figura es una modificación de Dahl et al., 10. Esta investigación fue publicada originalmente en la revista Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, salmón L, S Horowitz, Bardwell JC, funciones Jakob U. HdeB como una chaperona ácido protector en bacterias. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10.1074 / jbc.M114.612986. Derechos de autor de la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. Haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.

Para probar si HdeB apoya el replegamiento de proteínas cliente sobre la neutralización, se analizó la influencia de HdeB en el replegamiento de MDH pH desnaturalizado. Térmicamente desnaturalizado MDH se incubó a diferentes valores de pH en presencia o ausencia de HdeB. Después de la incubación bajo pH, se neutralizó el pH (que inicia MDH replegamiento), y se determinó la actividad de MDH después de 2 hr. Como se muestra en la figura 3, se logró la reactivación significativa de MDH la neutralización de pH 4 en presencia de HdeB. No hay actividad de MDH se determinó cuando HdeB estaba ausente de la incubación a pH bajo.

figura 3
Figura 3: HdeB facilita el replegamiento de ácido desnaturaliza MDH a un estado enzimáticamente activo 1 M MDH se incubó en tampón D al pH indicado durante 1 hora a 37 ° C en ausencia o p.resencia de 25 M HdeB. Entonces, la temperatura se cambió a 20 ° C durante 10 min antes de que las muestras se neutralizaron a pH 7 por la adición de 0,5 M Na 2 HPO 4. Se tomaron alícuotas después de 2 h de incubación a 20 ° C y se ensayaron para la actividad de MDH. se muestra la actividad de MDH la neutralización en ausencia (barras blancas) o en presencia de HdeB (barras negras). se muestra la desviación estándar derivada de al menos 3 mediciones independientes. La figura es una modificación de Dahl et al., 10. Esta investigación fue publicada originalmente en la revista Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, salmón L, S Horowitz, Bardwell JC, funciones Jakob U. HdeB como una chaperona ácido protector en bacterias. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10.1074 / jbc.M114.612986. Derechos de autor de la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de estafigura.

Nuestros datos in vitro reveló que HdeB une diferentes proteínas cliente modelo a pH 4, impide su agregación y facilita cliente replegamiento condiciones de pH una vez neutros se restauran. Para investigar los efectos de HdeB in vivo, ensayos de supervivencia dependientes del pH se realizaron utilizando el rpoH eliminación cepa sensible a la temperatura. Esta cepa carece de la mayoría de los chaperones y por lo tanto es más susceptible a temperatura elevada, pH bajo o el estrés oxidativo 15. La sobreexpresión de HdeB bajo condiciones de pH neutro no mostró ningún efecto sobre la tasa de crecimiento de la cepa, que creció comparativamente bien a la cepa de control que alberga el pBAD18 vector vacío (Figura 4, sin tratar). En contraste, encontramos claras diferencias en su capacidad de reanudar el crecimiento del pH 3 o pH 4 tratamiento con la cepa que sobreexpresa HdeB que muestra de manera reproducible una mejor recuperación de bajo pH treatamento de la cepa de control. En contraste con nuestros datos in vitro, sin embargo, la presencia de HdeB tenía también un efecto protector significativo a pH 3. Esto podría ser debido a la alta concentración de HdeB en la célula, lo que puede cambiar el estado de oligomerización de HdeB hacia dímeros incluso a pH 3. Obsérvese que el cambio células a pH 2 o pH 3 dio como resultado efectos muy rápidos y altamente tóxicos, mientras que no se observó destrucción significativa cuando las células donde se incubaron a pH 4 9,10,22.

Figura 4
Figura 4: HdeB protege E. coli frente al pH ácido. HdeB (círculos rojos) se sobreexpresa en BB7224 (Δ rpoH) en presencia de 0,5% de arabinosa a 30 ° C. Se utilizaron células que albergan los BB7224 pBAD18 vector vacío como control (círculos negros). Panel superior izquierda muestra el crecimiento de ambos stlluvias a 30 ° C, pH 7. Las células se cambiaron a pH indicado mediante la adición de HCl 5 M, y se incubaron durante 1 min a pH 2 (panel superior derecho), 2,5 min a pH 3 (panel inferior izquierdo) o 30 min a pH 4 (panel inferior derecho). Posteriormente, los cultivos se neutralizaron mediante la adición de volúmenes apropiados de NaOH 5 M y el crecimiento se monitorizó en medios líquidos a 30 ° C. La figura es una modificación de Dahl et al., 10. Esta investigación fue publicada originalmente en la revista Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, salmón L, S Horowitz, Bardwell JC, funciones Jakob U. HdeB como una chaperona ácido protector en bacterias. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10.1074 / jbc.M114.612986. Derechos de autor de la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Con el fin de estudiar el mecanismo de la activación y la función chaperona de HdeB, grandes cantidades de HdeB tienen que ser expresado y purificado. Un número de sistemas de vectores de expresión están disponibles para la producción de altos niveles de una proteína diana, incluyendo pTrc o pBAD vectores, ambos de los cuales se utilizaron en este estudio. Los promotores son fácilmente accesibles para E. coli RNA polimerasa y la expresión de este modo permiten fuertemente upregulated de HdeB en cualquiera E. coli cepa. Este aspecto es especialmente relevante para el estudio in vivo sobreexpresión de HdeB bajo condiciones de estrés de ácidos, en los que se utilizó la cepa deficiente en rpoH. Esta cepa carece de la mayoría de las chaperonas y por lo tanto es más sensible a distintos factores de estrés, incluyendo la temperatura elevada, bajo pH y el estrés oxidativo 15. Como alternativa, la supervivencia de estudios similares a los que se presentan aquí se puede realizar en cepas mutantes que carecen del gen de interés.

t "> El diseño experimental para cualquier actividad chaperona o ensayo de replegamiento tiene que ser considerada cuidadosamente, tanto en cuanto al tipo de cliente, la concentración de la proteína cliente y el tampón condiciones. En los ensayos de chaperonas típicos, proteínas cliente modelo, tales como citrato sintasa, luciferasa, malato deshidrogenasa o se desnaturalizan en altas concentraciones de urea o de guanidina-HCl, y se diluyeron en tampón libre de agente desnaturalizante para inducir la agregación 23,13. las mediciones en la presencia de chaperones revelan el grado en que impiden la agregación de proteínas. Alternativamente, los clientes son térmicamente desplegada y se monitoriza la agregación de proteínas. en ambos casos, las mediciones de dispersión de luz se utilizan como lectura para la agregación de proteínas. chaperones activos previenen la agregación de despliegue proteínas cliente, lo que provoca una disminución en la señal de dispersión de la luz 6. tanto de estos montajes experimentales se pueden combinar con un bajo pH de incubación. Además de evaluar el molactividad chaperona ecular mediante el control de su capacidad para evitar la agregación de proteínas particulares del cliente, la influencia de acompañantes en los replegado cliente a su regreso a condiciones de estrés no puede ser probado 24. Esto es especialmente sencillo cuando las proteínas cliente poseen actividad enzimática, que puede ser utilizado como lectura cuantitativa para su inactivación y reactivación. Mientras replegamiento chaperona mediada es, naturalmente, un proceso dependiente de ATP, las chaperonas periplásmicas como HdeA, HdeB y Spy se han mostrado para facilitar el replegamiento cliente de una manera independiente de ATP, de acuerdo con la falta de energía en el periplasma 9,25.

Estudiando el pH óptimo de una chaperona ácido-protector tal como HdeB es un reto debido a diversas razones: (i) los comportamientos de agregación de proteínas de tipo chaperón de cliente incluso bien establecidos, tales como citrato sintasa difieren a pH ácido; y (ii) solamente pocos sistemas búfer de trabajo en el intervalo de pH entre 2-5 y son suimesa tanto para la chaperona de interés y la proteína cliente. Decidimos usar un tampón de fosfato, aunque somos conscientes de que este es un sistema de amortiguación no ideal en condiciones de pH ácido. Sin embargo, se encontró que un tampón de fosfato a ser muy adecuado para caracterizar HdeA como ácido chaperona activado 9,22. mediciones de agregación son muy sensibles a los cambios en el contenido de la temperatura o tampón. Para eliminar los resultados falsos positivos, por lo que recomendamos probar siempre la influencia de tampón de almacenamiento chaperón sobre la agregación de cliente (Figura 1, el control de tampón). A veces la agregación de la proteína cliente se produce tan rápido que incluso el mejor acompañante podría no ser capaz de competir con el proceso de agregación. Por tanto, es esencial llevar a cabo pruebas preliminares para encontrar las condiciones óptimas de ensayo. Un buen ejemplo de esta situación se da en nuestros experimentos de ultracentrifugación, donde la incubación de la LDH a temperaturas de> 42 ° C es tan rápido que incluso elpresencia de un exceso de HdeB no impide la agregación de LDH. Además, el / co-chaperona relación de chaperona o la relación de chaperona / cliente tiene que ser determinada cuidadosamente 23. Empezamos a usar un nivel bastante alto HdeB: MDH relación de 50: 1 en experimentos preliminares y que nos ayudó en la identificación de pH 4 como el pH óptimo para la actividad chaperona de HdeB. luego continuó analizando HdeB: relaciones de MDH entre 1: 1 y 50: 1 a pH 4, la identificación de 25: 1 como la relación más eficaz. Por el contrario, HdeA suprime la agregación MDH como 10: 1 acompañante: relaciones de cliente 6,9,10,22. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que HdeA, en comparación con HdeB, es más eficaz en la supresión de la agregación MDH como chaperona menor: relaciones de cliente fueron suficientes para suprimir completamente la agregación MDH. Otro enfoque para investigar la supresión mediada por chaperona de la agregación de proteínas implican ensayos de spin-abajo, en la que los agregados de cliente se separó por centrifugación y se cuantificaron mediante SDS PAGE. Este enfoque también es adecuado para mONITOREO la influencia de las chaperonas en la agregación de proteínas in vivo. Las cepas mutantes que sobreexpresan cualquiera o la falta de interés de la chaperona están expuestos a la proteína despliegue condiciones de estrés. Posteriormente, las células se lisan y las fracciones solubles y agregados se separan y cuantifican 15,16,26.

Para la detección del complejo chaperona-cliente, aplicamos ultracentrifugación analítica. Debe observarse aquí que en base a la configuración experimental no es posible cuantificar directamente la cantidad de HdeB y monómeros de LDH unido en este complejo, ya que ambas proteínas absorben a 280 nm. Si se desea, la estequiometría del complejo chaperona-cliente se puede determinar mediante el etiquetado por separado chaperona y proteínas cliente con un cromóforo, cuyo máximo de excitación se encuentra dentro de la gama visible. Alternativamente, la estequiometría de los clientes a chaperones dentro de los complejos se puede determinar mediante el uso de PAGE nativa junto con transferencia de western cuantitativa. Siguiendo los protocolos presentados aquí, hemos sido capaces de caracterizar dos chaperonas moleculares, HdeA, y HdeB 9,10,22. En general, estos ensayos también se pueden utilizar para investigar el papel de los inhibidores potenciales de chaperones moleculares en el replegamiento de proteínas in vitro y in vivo o se pueden aplicar a probar chaperones sintéticos por su capacidad para prevenir la agregación cliente bajo estrés ácido. Además, los protocolos presentados aquí pueden ser utilizados para los análisis de mutaciones puntuales y / o variantes truncadas de las chaperonas activadas con ácido con el fin de arrojar luz sobre el mecanismo de su activación.

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Acknowledgments

Agradecemos a la doctora Claudia Cremers por su útil asesoramiento sobre ensayos de chaperonas. Ken Wan es reconocido por su asistencia técnica en la purificación HdeB. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Howard Hughes Médico (a JCAB) y los Institutos Nacionales de Salud de subvención RO1 GM102829 a JCAB y UJJ-UD es apoyado por una beca de investigación postdoctoral de la Fundación Alemana de Investigación (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEB10-beta E. coli cells New England Biolabs C3019I
Ampicillin Gold Biotechnology A-301-3
LB Broth mix, Lennox LAB Express 3003
IPTG Gold Biotechnology I2481C50
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Tris Amresco 0826-5kg
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Polymyxin B sulfate  ICN Biomedicals Inc. 100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter Corning 431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml) GE Healthcare Life Sciences 17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15% Bio-Rad 4561046
Malate dehydrogenase (MDH) Roche 10127914001
Potassium phosphate (Monobasic) Fisher Scientific BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic) Fisher Scientific BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer Hitachi FL25
Oxaloacetate Sigma O4126-5G
NADH Sigma  N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic Sigma  S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic Sigma  S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH) Roche 10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge Beckman Coulter 392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled Beckman Coulter 306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
Wizard Plus Miniprep Kit Promega A1470 used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose Gold Biotechnology A-300-500
Glycine DOT Scientific Inc DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette Hellma Analytics 119004F-10-40
Oligonucleotides Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530S
dNTP set Invitrogen 10297018
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL Millipore UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spectrophotometer Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa Spectrum Laboratories 132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K Millipore UFC803024
SDS Fisher Scientific bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler Thermo Fisher 4375786

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References

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Bioquímica No. 116 Molecular acompañante Estrés ácido respuesta al estrés la agregación de proteínas desplegamiento de la proteína bacterias dispersión de luz Proteína replegamiento interacción proteína-proteína Control de calidad de las proteínas.
Detección de la actividad dependiente del pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Acompañante HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; y<em&gt; En Vivo</em
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Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (116), e54527, doi:10.3791/54527 (2016).

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