Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Обнаружение рН-зависимой активности Published: October 23, 2016 doi: 10.3791/54527
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Summary

Это исследование описывает биофизические, биохимические и молекулярные методы характеризуют шаперонную активность кишечной палочки HdeB в кислых условиях рН. Эти методы были успешно применены для других кислотно-защитных наставниками, таких как HdeA и может быть изменен, чтобы работать для других шаперонов и стрессовых условиях.

Abstract

Бактерии часто подвергаются к изменениям окружающей среды, такие как изменения рН, температуры, окислительно-восстановительного состояния, освещенности или механической силы. Многие из этих условий вызывают разворачивания белка в клетке и оказывают вредное воздействие на выживание организма. Группа не связаны, стресс специфических молекулярных шаперонов было показано, играют существенную роль в выживании этих условиях стресса. В то время как полностью сложена и компаньонка-неактивным до того стресса, эти белки быстро разворачиваются и становятся шаперонная-активными при определенных условиях стресса. После активации эти условно неупорядоченные хапероны связываются с большим числом различных агрегатных склонными белков, предотвращают их агрегацию и прямо или косвенно способствовать белок рефолдинга после возвращения в условиях без стресса. Основной подход для получения более детального понимания о механизме их активации и распознавания клиента включает в себя очистку и subsequenт характеристика этих белков с использованием в пробирке шаперонов анализов. Последующие действия в естественных условиях стресс - анализов абсолютно необходимы , чтобы подтвердить , независимо друг от друга полученный в пробирке результатов.

Этот протокол описывает в пробирке и в естественных условиях методы , чтобы охарактеризовать шаперонную активность Е. HdeB палочка, кислотно-активированный компаньонка. Измерения рассеяние света были использованы в качестве удобного чтения-аута для емкости HdeB для предотвращения кислотно-индуцированной агрегации установленного белка модель клиента, МДГ, в пробирке. Аналитические эксперименты ультрацентрифугирования были применены для выявления образования комплекса между HdeB и его белка клиент СДГ, чтобы пролить свет на судьбу клиента белков после их возвращения в условиях без стресса. Были проведены ферментные анализы активности клиента белков контролировать эффекты HdeB на рН-индуцированной инактивации и реактивации клиента. И, наконец, исследования выживаемости были использованы для Monitoг влияние функции шаперонного HdeB в естественных условиях.

Introduction

Распространенной природная среда , в которой микробные патогены опыт кислотно-индуцированного протеина условия разворачивание желудка млекопитающих (диапазон рН 1-4), чей кислый рН служит эффективным барьером против пищевых патогенов 1. Разворачивания белка и агрегации, которая вызывается боковой цепи аминокислоты протонирования, влияет на биологические процессы, повреждения оборудования клеточные структуры , и в конечном итоге приводит к гибели клеток в 1,2 раза . Поскольку рН бактериальной периплазмы уравновешивает практически мгновенно при рН среды за счет свободной диффузии протонов через пористую внешнюю мембрану, периплазматические и внутренние мембранные белки грамотрицательных бактерий являются наиболее уязвимые клеточные компоненты в условиях кислотно-стресс - 3. Для того, чтобы защитить их периплазматической протеом от быстрого повреждения кислотой опосредовано, грамотрицательные бактерии используют кислотно-активированный периплазмической шаперонов HdeA и HdeB. HdeA является условно неупорядоченных шаперонная 6,7. Активация HdeA требует глубоких структурных изменений, в том числе его диссоциации на мономеры, а также частичное разворачивание мономеров 6-8. После активации HdeA связывается с белками, которые разворачиваются в кислых условиях. Это эффективно предотвращает их агрегацию и во время инкубации при низком рН, а также при рН нейтрализации. При возврате до рН 7,0, HdeA облегчает рефолдинга своих клиентов белков в АТФ-независимым образом , и преобразует его обратно в димерной, шаперон-неактивной конформации 9. Точно так же, гомологичные шаперонная HdeB также шаперон-неактивными при рН 7,0. В отличие от HdeA, однако, шаперонная активность HdeB достигает своего максимума при кажущейся рН 4,0, условия , при которых HdeB до сих пор в значительной степени сложена и димерных 10. Кроме того, дальнейшее понижение рН CAUSэс инактивация HdeB. Эти результаты свидетельствуют о том, что, несмотря на обширные гомологии, HdeA и HdeB различаются по способу их функциональной активации позволяет им охватывать широкий диапазон рН с их защитной функции шаперона. Еще один шаперонная , который вовлечен в кислотной резистентности E. палочка является цитоплазматическим Hsp31, который , как представляется , стабилизировать развернутые клиентские белки , пока нейтральные условия не будут восстановлены. Точный механизм действия Hsp31, однако, остается загадочным 12. Учитывая , что другие Энтеропатогенная бактерии , такие как Salmonella , отсутствие оперон hdeAB, весьма вероятно , что другие еще неизвестные периплазматические шапероны могут существовать, которые участвуют в кислотной резистентности этих бактерий 11.

Протоколы , представленные здесь , позволяют контролировать рН-зависимой шаперонную активности HdeB в пробирке и в естественных условиях 10 и могут быть применены для исследования других шапероновтакие как Hsp31. С другой стороны , сложная сеть факторов транскрипции , которые контролируют экспрессию hdeAB потенциально могут быть исследованы с помощью естественных условиях стресс - теста в. Для того, чтобы охарактеризовать функцию шаперона белков в естественных условиях, различные экспериментальные установки могут быть применены. Один путь состоит в применении разворачивания белка стрессовые состояния и фенотипически характеризуют мутантные штаммы, которые либо сверхэкспрессии представляющего интерес гена или нести делеция гена. Протеомные исследования могут быть проведены, чтобы определить , какие белки больше не агрегированный в стрессовых условиях , когда шаперонная присутствует, или влияние компаньонкой на конкретного фермента может быть определена во время стрессовых условиях с использованием ферментативных анализов 14-16. В данном исследовании мы выбрали гиперэкспрессией HdeB в штамм rpoH удаления, в которой отсутствует фактор сигмы теплового шока 32. RpoH контролирует экспрессию всех основных Е. палочки наставники и его исключение как известно, увеличивает Сенсitivity к условиям окружающей среды , которые вызывают стресс разворачивания белка 15. В естественных условиях шаперонная активность HdeB определяли путем мониторинга его способностью подавлять чувствительность рН штамма Δ rpoH. В целом, протоколы , представленные здесь , обеспечивают быстрый и простой подход к характеризации активности кислой активированного шаперона в пробирке, а также в контексте в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Экспрессия и очистка периплазмической HdeB

Примечание: HdeB было выражено в Е. Клетки палочки , несущие плазмиду pTrc- hdeB 10 и очищают от периплазме при полимиксина лизиса.

  1. Подготовка ночной культуры Е. Клетки палочки , несущие плазмиду pTrc- hdeB 10 в 30 мл LB , содержащей 200 мкг / мл ампициллина (LB АМФ). Привить четыре 1 L культуры LB Amp и вырастить их при температуре 37 ° C и 200 оборотов в минуту до OD 600нм 0,7 не будет достигнута. Затем добавляют 300 мкМ IPTG, чтобы индуцировать экспрессию HdeB и уменьшить температуру роста до 30 ° С.
  2. Через 5 часов экспрессии белка при 30 ° С, собирают клетки центрифугированием при 8000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
  3. Промывают осадок клеток с помощью 100 мл буфера А (50 мМ Трис / HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,5) и центрифугируют клетки снова при 8000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
  4. Впоследствии, ресуспендируютосадок клеток в 80 мл буфера А, содержащего 1 мг / мл сульфата полимиксина. Для эффективного разрушения внешней мембраны, осторожно перемешать суспензии в течение 1 ч при температуре 4 ° С.
  5. Для удаления цитоплазматической фракции и остатков клеток, центрифугирование суспензии в течение 20 мин при 15000 х г при 4 ° С. Это приводит к ~ 60 мл надосадочной жидкости, содержащей растворимый HdeB.
  6. Диализировать супернатант, содержащий периплазматическому экстракт в течение ночи против 150x объема буфера В (20 мМ Трис / HCl, 0,5 мМ ЭДТА, рН 8,0) с использованием диализной мембраны с 6 кДа MW среза. Концентрат белков до 15 мл с помощью центробежных фильтра с молекулярной массой отсечке 3 кДа. Фильтр белкового раствора с использованием 0,2 мкм пор фильтра.
  7. Нанесите белок на колонку анионообменной хроматографии (объем колонки 5 мл), который был уравновешен с 5 объемами колонки буфера В при скорости потока 2,5 мл / мин. После того, как белок наносили на колонку, колонку промывают буфером Б в течение 10 мин прискорость потока 2,5 мл / мин. Элюировать HdeB с линейным градиентом от 0 до 0,5 М NaCl в буфере В течение периода времени 50 мин со скоростью потока 2,5 мл / мин 6.
  8. Определение фракций, содержащих HdeB с использованием 15% SDS-PAGE. Смешайте 20 мкл образца с 5 мкл 5х восстановленного SDS буфера для загрузки. Нагрузка 10 мкл на гель и запустить в Трис-глицин-буфере (14,4 г / л глицина, 2,9 г / л Трис, 1 г / л додецилсульфата натрия, рН 8,3). Выполнить геля при 150 В до тех пор, пока бромфеноловый группа мигрировала близко к нижней части геля (~ 45 мин).
  9. Бассейн всех HdeB-содержащие фракции, диализ при 4 ° С в течение ночи против 4 л буфера хранения HdeB (50 мМ Трис / HCl, 200 мМ NaCl, рН 8,0), и концентрат белка приблизительно до 300 мкМ, с использованием центробежных фильтра с молекулярной массой отсечке 3 кДа. Определить концентрацию HdeB при 280 нм , используя коэффициент экстинкции е = 280 нм 15,595 М -1 см -1. Подготовьте 100 мкл аликвоты и флеш-бесплатноZe аликвоты в жидком азоте.
    Примечание: HdeB можно хранить при -70 ° С в течение не менее 6 месяцев.

2. Сопровождающий Анализ активности Использование Термически Разворачивание малатдегидрогеназу (МДГ)

Примечание: Влияние очищенного HdeB на агрегацию термически разворачивания свиную митохондриальную малатдегидрогеназу (MDH) при различных значениях рН контролировали, как описано ниже. Все перечисленные концентрации белка относятся к концентрации мономера.

  1. Для подготовки МДГ, диализировать МДГ при температуре 4 ° С в течение ночи против 4 л буфера С (50 мМ фосфата калия, 50 мМ NaCl, рН 7,5) и концентрат белка приблизительно до 100 мкМ с использованием центробежных фильтра с молекулярной массой отсечке 30 кД.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательное диализ МДГ требуется в качестве МДГ поставляется в виде раствора сульфата аммония.
  2. Чтобы удалить агрегаты, центрифугировать белка в течение 20 мин при 20000 х г при 4 ° С. Определить концентрацию MDH по оптической плотности при длине волны 280 нм (ε <к югу от > 280 нм = 7950 М -1 см -1). Готовят 50 мкл аликвоты МДГ и флэш-замораживания аликвот для хранения.
  3. Поместите 1 мл кварцевую кювету в флуоресцентном спектрофотометре, оборудованного с контролируемой температурой держатели для образцов и мешалкой. Установите λ ех / эм до 350 нм.
  4. Добавьте соответствующие объемы подогретого (43 ° C) буфера D (150 мМ фосфат калия, 150 мМ NaCl) при требуемых значениях рН (здесь: рН 2,0, рН 3,0, рН 4,0 и рН 5,0) в кювету и множества температура в держатель кювет до 43 ° C. Общий объем составляет 1000 мкл.
  5. Добавить 12,5 мкМ HdeB (или альтернативно один и тот же объем буфера для хранения HdeB для управления буфером) в буфер, а затем добавлением 0,5 мкМ МДГ. Начать мониторинг рассеяния света. Инкубируйте реакции в течение 360 сек, чтобы обеспечить достаточное раскрытие МДГ.
  6. Повышения рН до 7 путем добавления 0.16-0.34 объема 2 М небуферизованном K 2 HPO 4 и продолжают повторнось рассеяния света на другой 440 сек.
  7. Установить степень агрегации MDH, который записывается при отсутствии шаперона в определенной точке времени после нейтрализации (здесь после 500 сек, когда наблюдалось максимальное светорассеяние MDH) до 100%. Нормализовать активность HdeB по к сигналу рассеяния света от MDH в отсутствие HdeB при каждом указанном значении рН.

3. Обнаружение HdeB-СДГ комплексообразования Аналитической ультрацентрифугирования (ППК)

Примечание: Седиментационные эксперименты по скоростям по отдельности или в комплексе с термически разворачивания лактатдегидрогеназы (ЛДГ) HdeB были выполнены с использованием аналитической ультрацентрифуге.

  1. Для подготовки ЛДГ, диализировать ЛДГ при температуре 4 ° С в течение ночи против 4 л буфера С (50 мМ фосфата калия, 50 мМ NaCl, рН 7,5) и концентрат белка приблизительно до 200 мкМ, с использованием центробежных фильтра с молекулярной массой отсечке 30 кД.
    Примечание: Тщательное диализного ЛДГ требуется, как LDН поставляется в виде раствора сульфата аммония.
  2. Чтобы удалить агрегаты, центрифуга ЛДГ в течение 20 мин при 20000 х г при температуре 4 ° С. Определить концентрацию ЛДГ по оптической плотности при 280 нм (ε 280 нм = 43680 М -1 см -1). Готовят 50 мкл аликвоты ЛДГ и флэш-замораживания аликвот для хранения.
  3. Выдержите 3 мкМ ЛДГ в присутствии и в отсутствие 30 мкМ HdeB в буфере D (рН 4 и 7, соответственно) в течение 15 мин при 41 ° C.
    Примечание: инкубация СДГ при более высоких температурах приводит к ее полной агрегации, и не шаперонная эффект HdeB можно наблюдать.
  4. Пусть образцы охлаждают до комнатной температуры. Затем образцы загрузить в клетки, содержащие стандартную форму сектора 2-канальные с 1,2 центральные см длины пути. Загрузить клетки в ультрацентрифуге и уравновешивания до 22 ° С в течение не менее 1 ч до осаждения.
  5. Образцы отжима при 22 ° С и 167000 XG в соответствующем роторе в течение 12 ч, а также следить за СЭДimentation из непрерывно при 280 нм белка. Как было показано ранее, соотношение сигнал-шум улучшается, когда передаваемая интенсивность света каждого канала измеряемое, а не оптической плотности. Это также улучшает качество последующей подгонки данных.
  6. Провести анализ данных с SEDFIT (версия 15.01b, декабрь 2015), используя модель 17 распределения непрерывной C (S). Учебник , описывающий , как использовать SEDFIT можно найти в ссылке 18.
    1. Установите уровень доверия для ME (Maximum Entropy) регуляризация до 0,7.
  7. Вычислить плотность буфера, а также вязкость , используя SEDNTERP 19. Для того, чтобы оценить количество агрегированного протеина клиента, сравнить интегралы осажденных ЛДГ в рН 4 до рН 7 в качестве эталона.
    Примечание: Интеграция графиков распределения оседания может быть сделано непосредственно в SEDFIT. Альтернативное программное обеспечение для анализа данных по скорости седиментации можно найти в недавнем обзоре 20. </ Li>

4. Мониторинг МДГ Инактивация и реактивации в присутствии HdeB

Примечание: Влияние очищенного HdeB на рефолдинга рН-разложенном МДГ определяли путем мониторинга активности MDH при нейтрализации.

  1. Инкубируют 1 мкМ МДГ в буфере D в требуемых значениях рН (здесь: рН 2,0, рН 3,0, рН 4,0 и рН 5,0) в течение 1 ч при 37 ° С в отсутствие или в присутствии 25 мкМ HdeB. Затем, сдвиг температуры до 20 ° С в течение 10 мин.
    Примечание: Ни один МДГ рефолдинга не наблюдалось даже в присутствии HdeB когда МДГ инкубировали при температуре выше 37 ° С.
  2. Инициировать рефолдинга кислоты денатурированного МДГ, нейтрализуют пробы до рН 7 добавлением 0.13-0.42 объема 0,5 М фосфат натрия, рН 8,0.
  3. После инкубации в течение 2 ч при температуре 20 ° С, определяют активность MDH путем мониторинга уменьшение НАДН при 340 нм 9.
    Примечание: MDH катализирует NADH-зависимого снижения оксалоацетата в L-малат. Смешайте 50 мкл реакционной смеси инкубации с 950 мкл буфера для анализа (50 мМ фосфат натрия, рН 8,0, 1 мМ оксалоацетата и 150 мкМ NADH).
    Примечание: Конечная концентрация МДГ в буфере для анализа должен быть 44 нМ.
  4. Контролировать изменение оптической плотности, используя спектрофотометр, оснащенный блоком контроля температуры Пельтье установлен на 20 ° C.
  5. Отчет о MDH активность по сравнению с 44 нМ родной МДГ, которая была сохранена при рН 7,0.

5. Влияние HdeB сверхэкспрессии на Е. Выживание палочка под кислотному стрессу

Примечание: E. палочка 1655 геномную ДНК выделяли с использованием опубликованного протокола 21.

  1. Amplify hdeB из Е. палочки 1655 с помощью ПЦР с использованием праймеров hdeB - BamHI - I-Rev GGT GGT CTG GGA ТСС ТТА ATT CGG CAA GTC ATT и hdeB - EcoR I-ФВ GGT GAA TTC НКУ AGG AGG CGC ATG ААТ ATT TCA TCT CTC C.
  2. Настройка реакции ПЦР в 50 мкл следующим образом : 10 мкл 5х полимеразы буфера, 200 мкМ дНТФ, 0,5 мкМ праймера JUD2, 0,5 мкМ праймера JUD5, 150 нг геномной 1655 ДНК, 0,5 мкл ДНК - полимеразы, добавляют DDH 2 O до 50 мкл.
  3. Выполните амплификацию hdeB следующим образом : Шаг 1: 5 мин при 95 & deg ; С, 1 цикл; шаг 2: 30 сек при 95 ° С, 30 сек при 55 ° С, 30 сек при 72 ° С, 40 циклов; Шаг 3: 10 мин при 72 ° С.
  4. Клонирование в результате ПЦР - фрагмента в сайты EcoR I и BamH I плазмиды pBAD18 с использованием стандартных методов клонирования сайтов рестрикции. Очищают плазмиды с использованием набора для очистки плазмидной в соответствии с инструкциями изготовителя. Проверьте полученную плазмиду с помощью секвенирования 10.
  5. Transform плазмиды , выражающую HdeB или пустые pBAD18 борьбы с переносчиками в штамм BB7224 (Δ rpoH) (генотип: F -, λ -, e14 -, [araD139] B / г [6; (ФГДД-ЛАК) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 ZHF :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 ARAD + rpoH :: кан +; 16) с использованием химически компетентных клеток.
    Примечание: Этот штамм чувствительным к температуре.
  6. После того, как 45 сек теплового шока при 42 ° С и до посева, инкубировать клетки при 30 ° С и 200 оборотах в минуту. Выполнение одной колонии Штриховатост-аутов из положительных клонов и инкубировать в течение ночи при 30 ° C. Подготовка ночной культуры в 50 мл LB Amp и культивирования клеток , при 200 оборотах в минуту и 30 ° C.
  7. Развести в течение ночи культуры в 40 раз в 25 мл LB - Amp и расти бактерии , в присутствии 0,5% арабинозы (ARA) при температуре 30 ° C и 200 оборотов в минуту до OD 600 нм = 1,0 , чтобы индуцировать экспрессию белка HdeB.
  8. Для экспериментов с рН сдвига, используют LBAmp + Ара разбавить клетки OD 600 нм 0,5 и приспосабливаться к соответствующим значениям рН (здесь: рН 2,0, рН 3,0 и рН 4,0) путем добавления соответствующих объемов 5 М HCl.
  9. После того, как указанные моменты времени (рН 2, 1 мин; рН 3, 2,5 мин; рН 4, 30 мин), нейтрализуют культур путем добавления соответствующих объемов 5М NaOH.
  10. Следить за ростом нейтрализованных культур в жидкой культуре в течение 12 ч при 30 ° С с использованием измерений оптической плотности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HdeA и HdeB гомологичны E. палочки белки, известные защитить периплазмической белки от кислых условиях стресса 10. Наша работа показала, что похоже на HdeA, HdeB также функционирует как кислотный активированными молекул компаньонку. Тем не менее, в отличие от функций HdeA, HdeB при рН , который до сих пор потенциально бактерицидным, но значительно выше , чем рН оптимум HdeA 6,9,10,22. Для исследования Оптимум рН шаперонной активности HdeB в пробирке, нативный МДГ разводили в предварительно нагретом (43 ° C) буфера , указанного рН в присутствии или в отсутствие HdeB. После того, как 360 с после инкубации реакцию инкубацию нейтрализованы. Этот процесс нейтрализации вызывает агрегацию МДГ при 43 ° C 9. Представительные результаты показывают , что сигнал рассеяния света MDH в отсутствие HdeB резко возрастает при нейтрализации вследствие агрегации его МДГ (рис 1, близвед линия при каждом значении рН). При наличии HdeB, сигнал рассеяния света значительно уменьшается при нейтрализации от рН 4 или рН 5 , указывающее , что HdeB препятствует агрегации МДГ (Рисунок 1, рН 4 и рН 5). В противоположность этому , однако, при нейтрализации от рН 2 и рН 3, МДГ быстро агрегирует в той же степени , независимо от наличия или отсутствия HdeB (Рисунок 1, рН 2 и рН 3), что указывает , что оптимальное значение рН для шаперонной активности HdeB является между рН 4 и 5. буфер для хранения HdeB не оказывает влияния на агрегацию MDH (фиг.1, управления буфером), что свидетельствует о том , что Пониженный уровень сигнала рассеяния света МДГ в присутствии HdeB при рН 4, из - за своей функции шаперонов. HdeA является шаперон активным в его мономерной и разложенном виде при рН 2-3 , но не проявляет активности на уровне или выше рН 4 10. Эти результаты свидетельствуют о том, что HdeB имеет свою оптимальную шаперонную активность вокруг рН 4 10.

т = "Рисунок 1" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 54527 / 54527fig1.jpg" />
Рисунок 1:. Шаперон активность HdeB при кислом рН 0,5 мкМ МДГ инкубировали в предварительно нагретом буфере D при указанном рН в отсутствие или в присутствии 12,5 мкМ HdeB на 360 сек при температуре 43 ° C. РН образцов затем повышали до рН 7 (как показано звездочкой) путем добавления 0.16-0.34 объема 2 М небуферизован K 2 HPO 4, агрегация МДГ измеряли еще в течение 440 сек путем мониторинга рассеяния света при 350 нм при нейтральный рН (синий фон). Рисунок изменяется от Даль и др. 10 исследований был первоначально .Этот опубликована в журнале Biological Chemistry. Даль JU, Кольдевей P, Salmon L, S Horowitz, Бардвелл JC, функции Jakob U. HdeB как кислотно-защитной компаньонки у бактерий. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. DOI: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright Американское общество по биохимии и молекулярной биологии.s / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Для решения ли HdeB образует стабильные комплексы и с другими клиентами белков, 3 мкМ ЛДГ термически разворачивались при 41 ° С в присутствии или в отсутствие 30 мкМ HdeB при различных значениях рН. Анализ поведения седиментации этих образцов методом аналитической ультрацентрифугирования проводили при 22 ° С. Когда ЛДГ и HdeB инкубировали вместе при рН 7 и 41 ° C, ЛДГ остается исключительно тетрамерный (молекулярная масса 120 кДа) и HdeB оставались димерных. Эти результаты указывают на то , что белки не образуют стабильных комплексов при рН 7, и ЛДГ не претерпевает каких - либо необратимых изменений в олигомеризации после 20 мин инкубации при 41 ° C (рисунок 2, зеленая линия). Точно так же, HdeB оставались димерных при инкубации при 41 ° С и рН 4,0, что указывает на низкий рН инкубацияиз HdeB не влияет на его олигомеризации состояние даже в условиях теплового шока (рис 2, красная линия). ЛДГ при инкубации при рН 4 и 41 ° С в отсутствие HdeB быстро агрегировать , как свидетельствует тот факт , что 40% ЛДГ осажденных до первого сканирования регистрировали (фигура 2, указано в правом верхнем углу). Оставшиеся ЛДГ появились осаждаться преимущественно в виде мономера (рис 2, синяя линия). В противоположность этому , инкубация ЛДГ и HdeB при рН 4 и 41 ° C вызвало значительную часть этих двух белков для совместного осадка (HdeB-ЛДГ С), образуя новый вид с молекулярной массой 134 кДа. Этот вид, вероятно, представляет собой комплекс между HdeB димеров и термически разворачивающейся ЛДГ. К тому же , в присутствии HdeB, не наблюдалось значительное скопление ЛДГ до седиментации, что согласуется с нашими измерениями агрегации в пробирке. Эти результаты показывают, что HdeB проявляет шаперонную активность в еедимерные формы при рН 4,0. Это резко контрастирует с HdeA, который Chaperone активен в своей мономерной форме. Очень динамичный характер HdeB , что позволяет ему пройти структурные перестройки между рН 4 и рН 7, вероятно , достаточно для активации функции шаперонного HdeB в 10.

фигура 2
Рисунок 2:. Обнаружение образования комплекса между HdeB и раскрытый ЛДГ при рН 4 с помощью аналитической ультрацентрифугирования 3 мкМ ЛДГ инкубировали в присутствии 10-мольного избытка HdeB в буфере D (150 мМ KHPO 4, 150 мМ NaCl) в течение 15 мин при 41 ° С при любом рН 7 (зеленая линия) или рН 4 (черная линия). Для сравнения, ЛДГ в одиночку (синяя линия) или одна HdeB (красная линия), инкубировали в течение 15 мин при 41 ° С при рН 4. Аналитическое скорость ультрацентрифугирования седиментация была использована для определения стехиометрии HdeB, ЛДГ, и комплекс, образованный между HdeB и ЛДГ в дифусловия гой рН. Обратите внимание, что ~ 40% ЛДГ агрегируются до первого сканирования при инкубации при рН 4 и при отсутствии HdeB (как отмечено в правом верхнем углу). Показана распределение коэффициента оседания участка (с (s)) анализировали с помощью программы SEDFIT. Буквы указывают соответствующие олигомерного состояния СДГ или HdeB, соответственно: HdeB D, HdeB димер; ЛДГ М, ЛДГ мономер, ЛДГ T, ЛДГ тетрамер; HdeB-ЛДГ C, HdeB-ЛДГ комплекс. Рисунок изменяется от Dahl и др. 10. Это исследование было первоначально опубликовано в журнале Biological Chemistry. Даль JU, Кольдевей P, Salmon L, S Horowitz, Бардвелл JC, функции Jakob U. HdeB как кислотно-защитной компаньонки у бактерий. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. DOI: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright Американское общество по биохимии и молекулярной биологии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную верSion этой фигуры.

Чтобы проверить, поддерживает ли HdeB на рефолдинга клиентских белков при нейтрализации, анализировали влияние HdeB на рефолдинга в рН-денатурированный МДГ. Термически денатурированный МДГ инкубировали при различных значениях рН в присутствии или в отсутствие HdeB. После инкубации низких рН, рН нейтрализовали (который инициирует MDH повторной укладки), и МДГ активность определяли через 2 ч. Как показано на рисунке 3, значительное реактивация МДГ была достигнута при нейтрализации от рН 4 в присутствии HdeB. Ни один МДГ активность не была определена, когда HdeB отсутствовал низкой инкубации рН.

Рисунок 3
Рисунок 3: HdeB облегчает рефолдинг кислоты денатурируют МДГ в ферментативно активной состоянии 1 мкМ МДГ инкубировали в буфере D при указанном рН в течение 1 ч при 37 ° С в отсутствие или в р.resence 25 мкМ HdeB. Затем температуру сдвинуты до 20 ° С в течение 10 мин , после чего образцы нейтрализовали до рН 7 добавлением 0,5 М Na 2 HPO 4. Аликвоты брали через 2 ч инкубации при температуре 20 ° С и анализируют на MDH активности. Активность МДГ при нейтрализации в отсутствие (белые столбики) или в присутствии HdeB (черные полосы) показан. Стандартное отклонение происходит от по меньшей мере, 3-х независимых измерений показана. Рисунок изменяется от Dahl и др. 10. Это исследование было первоначально опубликовано в журнале Biological Chemistry. Даль JU, Кольдевей P, Salmon L, S Horowitz, Бардвелл JC, функции Jakob U. HdeB как кислотно-защитной компаньонки у бактерий. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. DOI: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright Американское общество по биохимии и молекулярной биологии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этогоцифра.

Наши данные в пробирке показали , что HdeB связывает различные модели клиент белков при рН 4, предотвращает их агрегацию и облегчает клиенту рефолдинга когда - нейтральные условия рН восстанавливаются. Для того, чтобы исследовать влияние HdeB в естественных условиях, анализы выживаемости зависит от рН проводили с использованием чувствительной к температуре деформации rpoH удаления. Этот штамм не имеет наибольшее количество шаперонов и, следовательно , более восприимчивы к повышенной температуре, низком рН или окислительного стресса 15. Сверхэкспрессия HdeB в нейтральных условиях рН не показал никакого влияния на скорость роста штамма, который вырос сравнительно хорошо контрольного штамма , который таит в себе пустой вектор pBAD18 (рисунок 4, неочищенные). В отличие от этого , мы обнаружили явные различия в их способности возобновить рост при рН 3 или рН 4 лечения с гиперэкспрессией штамма HdeB показывая воспроизводимо улучшенное восстановление с низким рН сточtment чем контрольного штамма. В отличие от наших данных в пробирке, тем не менее, наличие HdeB было также значительно защитный эффект при рН 3. Это может быть из - за высокой концентрации HdeB в клетке, которая может сместиться состояние олигомеризации HdeB в сторону димеров даже при рН = 3. Обратите внимание , что смещение клеток до рН 2 или рН 3 приводило к очень быстрой и высокотоксичных эффектов, в то время как никакого существенного убийства не наблюдалось , когда клетки , где инкубировали при рН 4 9,10,22.

Рисунок 4
Рисунок 4: HdeB защищает E. палочка против кислом рН. HdeB (красные кружки) была избыточно экспрессируется в BB7224 (Δ rpoH) в присутствии 0,5% арабинозы при 30 ° С. BB7224 клетки, несущие пустой вектор pBAD18 были использованы в качестве контроля (черные кружки). Верхняя левая панель показывает рост как годожди при 30 ° С, рН 7. Клетки были сдвинуты до указанного рН добавлением 5 М HCl, и инкубировали в течение 1 мин при рН 2 (правая верхняя панель), 2,5 мин при рН 3 (нижняя левая панель) или 30 мин при рН 4 (нижняя правая панель). Впоследствии культуры были нейтрализованы путем добавления соответствующих объемов 5М NaOH и рост контролировали в жидких средах при температуре 30 ° C. Рисунок изменяется от Dahl и др. 10. Это исследование было первоначально опубликовано в журнале Biological Chemistry. Даль JU, Кольдевей P, Salmon L, S Horowitz, Бардвелл JC, функции Jakob U. HdeB как кислотно-защитной компаньонки у бактерий. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. DOI: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright Американское общество по биохимии и молекулярной биологии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для изучения механизма активации и шаперонного функции HdeB, большие количества HdeB должны быть экспрессирован и очищен. Ряд векторных систем экспрессии доступны для получения высоких уровней белка-мишени, в том числе PTRC или pBAD векторы, оба из которых были использованы в этом исследовании. Промоутеры легко доступны для E. палочка РНК - полимеразы и , таким образом , позволяют сильно повышающей регуляции экспрессии HdeB в любом Е. штамм E.coli. Этот аспект особенно актуален для сверхэкспрессии в естественных условиях исследования HdeB в кислых условиях стресса, где использовали штамм дефицитных rpoH. Этот штамм испытывает недостаток большинства шаперонов и , таким образом , является более чувствительным к различным стрессоров, в том числе повышенной температуре, низким рН и окислительного стресса 15. В качестве альтернативы, выживание исследования похожи на те, что представлены здесь могут быть выполнены в мутантные штаммы, у которых отсутствует интерес ген.

т "> Экспериментальный дизайн для любого шаперонной активности или рефолдинга анализ должен быть тщательно рассмотрен, как в отношении типа клиента, концентрация белка клиента и буферных условий. В типичных шаперонов анализах, модель клиента белков, таких как цитрат - синтазы, люциферазы, или малатдегидрогеназу денатурируют в высоких концентрациях мочевины или гуанидина-HCl, и разбавляют в денатуранта свободных буфера , чтобы вызвать агрегацию 23,13. Измерения в присутствии хаперонов показывают , в какой степени они предотвращают агрегацию белка. В качестве альтернативы, клиенты являются термически развернутом и агрегация белка контролируется. В обоих случаях измерения рассеяния света используются в качестве отсчета для агрегации белка. Активные хапероны предотвращают агрегацию разворачивания клиента белков, тем самым вызывая уменьшение сигнала рассеяния света 6. Оба из этих экспериментальных установок можно сочетать с низким инкубирования рН. в дополнение к оценке мольныйecular шаперонная деятельность путем мониторинга их способность предотвращать агрегацию конкретного клиента белков, влияние наставниками на клиента рефолдинга после возвращения в условиях без стресса могут быть протестированы 24. Это особенно просто, когда клиент белки обладают ферментативной активностью, которые могут быть использованы в качестве количественного считывания для их инактивации и реактивации. В то время как компаньонка-опосредованной рефолдинга естественно АТФ-зависимый процесс, периплазматические наставники , такие как HdeA, HdeB и Spy , как было показано , чтобы облегчить клиенту Рефолдинг в АТФ-независимым образом, в соответствии с недостатком энергии в периплазмы 9,25.

Изучение Оптимум рН кислой-защитной компаньонки, таких как HdeB является сложной задачей по разным причинам: (I) агрегация поведение даже хорошо зарекомендовавших себя шаперонная-клиента белки, такие как цитрат-синтазы отличаются при кислом рН; и (II) только несколько буферных систем работают в диапазоне рН между 2-5 и SuiТаблица как для шаперона интереса и белка клиента. Мы решили использовать фосфатный буфер, хотя мы понимаем, что это не является идеальной системой буфера в кислых условиях рН. Тем не менее, фосфатный буфер было установлено, хорошо подходит для характеристики HdeA в качестве кислотного активированного шаперона 9,22. Измерения агрегации очень чувствительны к изменениям температуры или буфера содержания. Для устранения ложноположительных результатов, поэтому мы рекомендуем всегда проверять влияние буфера для хранения шаперонная на агрегацию клиента (Рисунок 1, управления буфером). Иногда агрегации белка клиента происходит настолько быстро, что даже лучшие шаперонная может быть не в состоянии конкурировать с процессом агрегации. Поэтому крайне важно, чтобы провести предварительные испытания для того чтобы найти оптимальные условия анализа. Хорошим примером такой ситуации дается в наших опытах ультрацентрифугирования, где инкубация ЛДГ при температурах> 42 ° C настолько быстро, что даженаличие избытка HdeB не препятствует агрегации ЛДГ. Кроме того, / со-шаперонная отношение шаперонная или отношение шаперонная / клиент должен быть тщательно просчитано 23. Мы начали использовать довольно высокую HdeB: соотношение MDH 50: 1 в предварительных экспериментах, и это помогло нам в определении рН 4 в качестве оптимального рН для шаперонного активности HdeB. Затем мы продолжили анализ HdeB: соотношения МДГ между 1: 1 и 50: 1 при рН 4, определение 25: 1, наиболее эффективное отношение. В противоположность этому , HdeA подавляется агрегация MDH как 10: 1 Сопровождающий соотношениях клиента 6,9,10,22. Таким образом, мы приходим к выводу, что HdeA, по сравнению с HdeB, является более эффективным в подавлении агрегации MDH как низший компаньонки: отношения клиента были достаточны, чтобы полностью подавить агрегацию MDH. Другой подход к исследованию шаперонную-опосредованной подавление агрегации белков связаны со спином вниз анализы, в которых агрегаты клиентов удаляются центрифугированием и количественно оценить с помощью SDS-PAGE. Такой подход также подходит для мвлияние мониторинг функционирования шаперонов на агрегацию белка в естественных условиях. Мутантные штаммы, которые либо гиперэкспрессией или отсутствие шаперона интереса подвергаются разворачивания белка стрессовых условиях. Затем клетки подвергают лизису и растворимые и агрегированные фракции разделяют и количественно 15,16,26.

Для обнаружения клиент-шаперонного комплекса, мы применили аналитическую ультрацентрифугирования. Следует отметить здесь, что на основании экспериментальной установки не представляется возможным, чтобы непосредственно определить количество HdeB и ЛДГ мономеров, связанный в этом комплексе, так как оба белка поглощают при 280 нм. При желании, стехиометрия шаперонная-клиента комплекса может быть определена отдельно мечения компаньонку и белка клиента с хромофором, чье возбуждение максимум лежит в пределах видимого диапазона. В качестве альтернативы, стехиометрия клиентов к сопровождающим внутри комплексов может быть определена с использованием нативного ПААГ в сочетании с количественным вестерн-блоттинга. Следуя протоколы , представленные здесь, мы смогли охарактеризовать два молекулярных шаперонов, HdeA и HdeB 9,10,22. В целом, эти анализы могут быть также использованы для изучения роли потенциальных ингибиторов молекулярных шаперонов в белковом рефолдинга в пробирке и в естественных условиях , или могут быть применены для тестирования синтетических шаперонов для их способности предотвращать агрегацию клиента в услови х кислотного стресса. Кроме того, протоколы, представленные здесь, могут быть использованы для анализа точечных мутаций и / или усеченных вариантов кислотно-активированный шаперонов для того, чтобы пролить свет на механизм их активации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы благодарим доктора Клаудии Cremers за ее полезные советы по шаперонов анализов. Кен Ван признан за его технической помощи в очистке HdeB. Эта работа была поддержана Медицинского института Говарда Хьюза (к JCAB) и Национальных институтов здравоохранения грант RO1 GM102829 к JCAB и Ujj-UD поддерживается постдокторской исследовательской стипендии, предоставленной исследовательским фондом немецкой (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEB10-beta E. coli cells New England Biolabs C3019I
Ampicillin Gold Biotechnology A-301-3
LB Broth mix, Lennox LAB Express 3003
IPTG Gold Biotechnology I2481C50
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Tris Amresco 0826-5kg
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Polymyxin B sulfate  ICN Biomedicals Inc. 100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter Corning 431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml) GE Healthcare Life Sciences 17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15% Bio-Rad 4561046
Malate dehydrogenase (MDH) Roche 10127914001
Potassium phosphate (Monobasic) Fisher Scientific BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic) Fisher Scientific BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer Hitachi FL25
Oxaloacetate Sigma O4126-5G
NADH Sigma  N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic Sigma  S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic Sigma  S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH) Roche 10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge Beckman Coulter 392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled Beckman Coulter 306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
Wizard Plus Miniprep Kit Promega A1470 used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose Gold Biotechnology A-300-500
Glycine DOT Scientific Inc DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette Hellma Analytics 119004F-10-40
Oligonucleotides Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530S
dNTP set Invitrogen 10297018
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL Millipore UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spectrophotometer Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa Spectrum Laboratories 132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K Millipore UFC803024
SDS Fisher Scientific bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler Thermo Fisher 4375786

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
  2. Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).
  3. Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
  4. Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  5. Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Conditional disorder in chaperone action. Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).
  6. Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).
  7. Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).
  8. Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
  9. Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).
  10. Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).
  11. Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).
  12. Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).
  13. Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
  14. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  15. Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).
  16. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).
  17. Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  18. Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. , Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm (2016).
  19. Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. , Available from: http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page (2012).
  20. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  21. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
  22. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).
  23. Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
  24. Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).
  25. Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
  26. Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).

Tags

Биохимия выпуск 116 Molecular Сопровождающий кислота Стресс стресс ответ Protein Aggregation разворачивания белка бактерии светорассеяние Protein Рефолдинг белок-белковое взаимодействие белка Контроль качества.
Обнаружение рН-зависимой активности<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Сопровождающий HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; и<em&gt; В Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, … More

Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (116), e54527, doi:10.3791/54527 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter