Abstract
Die Mittelmeerfruchtfliege (Ceratitis) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) ist eine Schädlingsarten mit extrem hohen landwirtschaftlichen Relevanz. Dies ist aufgrund seiner Fortpflanzungsverhalten: Frauen die äußere Oberfläche von Obst und Gemüse beschädigen, wenn sie Eier und die geschlüpften Larven ernähren sich von ihren Zellstoff lag. Wilde C. capitata Populationen werden traditionell durch Insektizid kontrolliert Spritzen und / oder umweltfreundliche Ansätze, die erfolgreichste ist die Sterile Insect Technique (SIT). Die SIT setzt auf Massenerziehung, strahlungsbasierte Sterilisation und Feld Freisetzung von Männern, die ihre Fähigkeit behalten, sich zu paaren, sind aber nicht in der Lage fruchtbare Nachkommen zu erzeugen. Das Aufkommen und die anschließende rasante Entwicklung biotechnologischer Werkzeuge, zusammen mit der Verfügbarkeit der Mittelmeerfruchtfliege Genomsequenz hat verstärkt unser Verständnis der Biologie dieser Spezies. Dies begünstigt die Verbreitung von neuen Strategien für die Genom Manipulation, die can Bevölkerungskontrolle angewendet werden.
In diesem Zusammenhang spielt Embryo Mikroinjektions eine doppelte Rolle in der Toolbox für Mittelmeerfruchtfliege Steuerung erweitert. Die Fähigkeit, mit der Funktion von Genen zu stören, die wichtige biologische Prozesse regulieren, in der Tat, erweitert unser Verständnis der molekularen Maschinen der Mittelmeerfruchtfliege Invasivität zugrunde liegen. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit Keimbahntransformation zu erreichen, um die Produktion von mehreren transgenen Stämme, die für zukünftige Anwendungen im Bereich neuen SIT Einstellungen getestet werden können. Tatsächlich kann die genetische Manipulation verwendet werden, um gewünschte Eigenschaften zu verleihen, die können zum Beispiel verwendet werden, sterile männliche Leistung auf dem Gebiet zu überwachen, oder dass in frühen Lebensphasen Letalität führen kann. Hier beschreiben wir eine Methode Nukleinsäuren in der Mittelmeerfruchtfliege Embryonen microinject diese beiden Hauptziele zu erreichen.
Introduction
Die Mittelmeerfruchtfliege (Ceratitis) Ceratitis capitata ist eine kosmopolitische Arten , die ausgiebig Schäden Früchte und Kulturpflanzen. Es gehört zur Familie Tephritidae, die zu den Gattungen Bactrocera und Anastrepha gehör mehrere Schädlingsarten, wie diejenigen einschließt. Die Mittelmeerfruchtfliege ist die am meisten untersuchten Arten dieser Familie, und es hat sich zu einem Modell nicht nur für die Untersuchung von Insekten Invasionen 1, aber auch 2 für die Optimierung von Pflanzenschutzstrategien geworden.
Die Mittelmeerfruchtfliege ist ein multivoltine Arten , die mehr als 300 Arten von Wild angreifen kann und Kulturpflanzen 3,4. Der Schaden wird sowohl durch die Erwachsenen und die Larvenstadien: begattete durchdringen die Oberfläche der Frucht für die Eiablage, so dass Mikroorganismen ihre Handelsqualität zu beeinflussen, während die Larven ernähren sich von dem Fruchtfleisch. Nach drei Larvenstadien, Larven aus dem Wirt entstehen und in den Boden verpuppen. Ceratitiscapitata zeigt eine nahezu weltweite Verbreitung, einschließlich Afrika, dem Nahen Osten, Westaustralien, Mittel- und Südamerika, Europa und Gebieten der Vereinigten Staaten von Amerika 5.
Die am häufigsten verwendeten Strategien Mittelmeerfruchtfliege parasitäre Erkrankungen zu begrenzen , die Verwendung von Insektiziden (zB Malathion, Spinosad) und die umweltfreundliche Sterile Insect Technique (SIT) 6 beinhalten. Der zweite Ansatz beinhaltet die Freisetzung in die Wildnis von Hunderttausenden von Männern gegenüber ionisierender Bestrahlung steril durch Belichtung gemacht. Die Paarung solcher sterilisierten Männchen zu wilden Weibchen führt zu keiner Nachkommen, eine Verringerung der Bevölkerungsgröße zu verursachen, was schließlich zu Ausrottung führen. Obwohl hat SIT weltweit in mehreren Kampagnen bewährt, sind seine größten Nachteile die hohen Kosten für die Aufzucht und Millionen von Insekten Sterilisation freigesetzt werden. Kennzeichnung von freigesetzten Individuen zu unterscheiden, steril von wilden Insekten im Bereich nicht erfasst währendÜberwachung der Aktivitäten und wird derzeit unter Verwendung von fluoreszierenden Pulver erreicht. Diese Verfahren sind teuer und haben unerwünschte Nebenwirkungen 7.
Um zu optimieren und / oder wirksamer Ansätze für die Kontrolle dieses Schädlings, der Mittelmeerfruchtfliege Biologie und Genetik zu entwickeln, wurde von zahlreichen Forschern weltweit weit erforscht. Die Verfügbarkeit der Mittelmeerfruchtfliege Genomsequenz 8,9, werden neue Untersuchungen an Genfunktionen erleichtern. RNA-Interferenz ist ein leistungsfähiges Werkzeug für solche Studien, und es kann durch die Mikroinjektion von dsRNA (doppelsträngige RNA) oder siRNA (small interfering RNA) erreicht werden. Diese Technik ist verwendet worden, zum Beispiel, dass die Geschlechtsbestimmung Molekular cascade in C. demonstrieren capitata nur teilweise gegenüber derjenigen von 10 Drosophila konserviert.
Die Entwicklung von Protokollen Mittelmeerfruchtfliege Embryonen microinject C erlaubt capitata die erste nicht zu sein-Drosophilid Fliegenarten genetisch modifiziert werden. Als seine Eier ähnlich denen von Drosophila, sowohl in Bezug auf Morphologie und Widerstand sind 11 bis Desikkation, um das Protokoll Plasmid DNA in vorge blastoderm Embryonen liefern zunächst D. entwickelt melanogaster 12,13 zunächst wurde für den Einsatz in C angepasst capitata. Diese ersten Experimente Mittelmeerfruchtfliege Keimbahntransformation erlaubt basierend auf dem Transposon - Element Minos 11. Unter Verwendung anderer Transposon-basierte Ansätze Anschließend wurde das ursprüngliche System 14 modifiziert. Dies ist der Fall von piggyBac aus der Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Das Protokoll wurde seit weiter optimiert und dadurch die Transformation anderer Tephritiden Spezies 16-21 und auch von vielen anderen Diptera 22-31 erlaubt hat. Alle diese Systeme beruhen auf der Verwendung eines typischen binären Vektor / Helferplasmid Transformationssystem: artificial, defekte transpoSöhne gewünschten Gene enthalten , werden in das Plasmid DNA zusammengesetzt und in das Genom des Insekten integriert , indem das Transposase - Enzym 32 liefert. Eine Reihe von transgenen Mittelmeerfruchtfliege Linien wurden mit mehreren Funktionen, einschließlich Stämmen erzeugt, eine bedingte dominant-letale Gen trägt, die Letalität induziert, Stämme produzieren nur für Männer Nachkommen und erfordern somit keine zusätzlichen sexing Strategien und Stämme mit fluoreszierenden Spermien, was die Genauigkeit verbessern kann der SIT Überwachungsphase 33-37. Obwohl die Freisetzung in der Wildnis von transgenen Organismen in Pilotversuchen gegen Mücken aufgetreten ist nur 38,39 mindestens ein Unternehmen im Bereich 40 eine Reihe von transgenen Mittelmeerfruchtfliege Stämme für ihre Verwendung zu bewerten.
Embryo Mikroinjektions kann auch die Entwicklung von neuen genom Editing-Tools, wie zum Beispiel Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens), gruppierten regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom wiederholt (CR favorisierenISPR) / CRISPR associated protein 9 Nuklease (Cas9) und Homing-Endonukleasen Gene (HEG), die neue evolutionäre und Entwicklungsstudien ermöglichen wird, sowie die zur Verfügung stehende biotechnologische Toolbox erweitert. Genom-Bearbeitung Ansätze erlaubt bereits die Erzeugung von Gen-Antriebssysteme in Stechmücken 41, und deren Übertragung auf die Mittelmeerfruchtfliege steht unmittelbar bevor. Hier beschreiben wir ein universelles Protokoll für Mikroinjizierung Nukleinsäuren in der Mittelmeerfruchtfliege Embryonen, die nützlich für alle Anwendungen der oben genannten sein kann.
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Protocol
1. Experimenteller Aufbau
- Insectary Anforderungen
- Pflegen Sie alle C. capitata Lebensphasen bei 25 ° C, 65% Luftfeuchtigkeit und 12.12 h Hell / Dunkel - Lichtperiode.
- Jeweils etwa 1.500-2.000 Mittelmeerfruchtfliege Puppen in einem 6 L Käfig. Verwenden Sie einen Käfig mit einem Messingnetz auf der einen Seite mit Löchern klein genug , um die Eiablage 42 zu stimulieren. Setzen Sie einen Schwamm Streifen durch eine kleine Öffnung in der Basis Käfig fliegt mit Wasser mittels Kapillarwirkung zu liefern. Verwenden Sie eine Mischung aus Hefe und Zucker (1:10) als Nahrungsquelle für die Erwachsenen (1A). Erhöhen Sie die Menge an Hefe (bis zu 1: 3, Hefe: Zucker) sollten die Weibchen nicht Eier zu legen.
- Legen Sie eine Platte mit Wasser unter dem Käfig gefüllt, um die Eier zu sammeln durch das Sieb aufgebracht. Als jungfräulichen Weibchen Eiablage kann, warten Sie, bis die Fliegen mindestens 6-7 Tage alt sind, bevor Eier für die Mikroinjektionsexperimente zu sammeln. Dadurch wird sichergestellt, dass die Weibchen gepaart habenund dass die Eier befruchtet worden sind.
- Sammeln Sie die Eier durch Filtern des Wassers mit einem feinen Netz Sieb. Übertragen Sie die Eier aus dem Sieb in einer Kunststoff - Box Standard Larvenfutter enthält (1,5 LH 2 O, 100 ml HCl 1%, 5 g Breitspektrum antimikrobielle Mittel in 50 ml Ethanol gelöst, 400 g Zucker, 175 g entmineralisiertes Bierhefe, 1 kg Weichweizenkleie) mit einer Pasteurpipette.
- Legen Sie jedes Feld in einem transparenten Behälter mit einem Netto-Deckel geschlossen Luftzirkulation zu ermöglichen , und eine Schicht aus Kleie enthält , zu begünstigen Verpuppung (1B).
- Nach etwa 10 Tagen, überprüfen 3. Larvenstadium , die aus der Larvenfutter entstehen und springen nach unten in die Kleie - Schicht für Verpuppung.
- 24 Stunden später, sammeln die Puppen in einer kleinen Tasse mit einer weichen Bürste und sie zu einem neuen erwachsenen Käfig übertragen. Erwachsene entstehen normalerweise 10 Tage nach der Verpuppung. Die sich abzeichnende Fliege verwendet die ptilinum, eine aufblasbare Tasche befindet sich auf den Kopf über the Basis der Antennen, um das Ende des Puparium zu zwingen, aus. Nach dem Auftauchen kollabiert die ptilinum permanent im Inneren des Kopfes zurück.
- Herstellung von 1 L Nahrung für mikroinjizierten Larven
- Man löst 2,5 g Agar in 300 ml H 2 O.
- Warm 500 ml H 2 O auf einer heißen Rührplatte und lösen 4 g Natriumbenzoat, 4,5 ml 37% HCl, 42 g Hefeextrakt und 115 g dehydrierte Karotten Pulver.
- In dem Gemisch eine Lösung von 2,86 g Breitspektrum aufgelöst antimikrobielles Mittel in 10 ml absolutem Ethanol.
- das Medium in 15 cm runden Petrischalen verteilen und abkühlen lassen. Falls erforderlich, lagern bei 4 ° C.
- Slide Vorbereitung
- Legen Sie eine 2 cm Streifen doppelseitiges Klebeband auf einem Objektträger (75 x 26 mm 2) und die Ränder mit einem China - Marker markieren, um Öl Ausbreitung und die daraus folgende Austrocknung der injizierten Embryonen verhindern.
- Isolieren Plasmid - DNA im Handel erhältlichen Kits 34 verwendet wird . Auszufällen, das Plasmid unter Verwendung von Ethanol und resuspendieren in Injektionspuffer (0.1 mM Phosphatpuffer pH 7,4, 5 mM KCl) in der gewünschten Konzentration.
- Reinige in vitro synthetisierte lange dsRNA Phenol-Chloroform, ausfällen Isopropanol und resuspendieren in Injektionspuffer 43.
2. Embryo Vorbereitung
- Legen Sie ein Tablett mit Wasser unter einem Käfig gefüllt, die 6-7 Tage alte Erwachsene.
- Lassen Sie die Frauen für 30 min bis Eiablage und dann die Embryonen sammeln durch Filtern des Wassers ein feines Sieb mit. Halten Sie das Sieb in Wasser Austrocknung der Embryonen zu vermeiden.
- Dechorionate die Embryonen, die durch das Sieb für 5 Sekunden immerging in einer handelsüblichen 50% igen Bleichlösung.
- Waschen Sie die Embryonen vorsichtig durch wiederholtes das Sieb in sauberen Reinstwasser immerging (zumindest4-5 mal). Schließlich legen Sie das Sieb in saubere Reinstwasser. Verwenden Sie die Embryonen innerhalb von maximal 2 Stunden.
HINWEIS: Die Zeitsteuerung der Mikroinjektion ist die Notwendigkeit verwandten in vorge blastoderm Embryonen zu injizieren, während einer Phase der Kernteilungen vor Zellularisierung. Auf diese Weise können die injizierte DNA in die Kerne aufgewickelt zu werden, und zwar in die Ur-Keimzellkerne, die die Gameten stammen werden. In Drosophila beginnt Zellularisierung am Pol - Zellen bei etwa 90 min nach der Befruchtung (bei 25 ° C), mit blastoderm Bildung ca. 30 min später 44 auftritt, während in der Mittelmeerfruchtfliege Zellularisierung zwischen 9 und 12 Stunden 45,46 erfolgt. - Embryo Orientierung in Reihen
- Mit einem feinen Pinsel, sammeln etwa 50 Embryonen und legen Sie sie auf einer Platte aus schwarzem Filterpapier mit Wasser getränkt.
- Unter einem Sezieren Stereomikroskop, ordnen Sie die Embryonen in einer Reihe auf der oberen Fläche des doppelseitigen Klebeband aufdas Mikroskop - Objektträger einen feinen Pinsel (000) (Abbildung 1C) verwendet wird .
HINWEIS: Richten Sie die Embryonen alle in der gleichen Ausrichtung, wie Injektion in den hinteren Pol durchgeführt wird, wo Keimbahn entstehen wird; die hinteren Pol ist mit dem Mikropyle Bereich gegenüber. - Decken Sie die Embryonen mit einer Schicht aus Chlortrifluorethylen Öl, sicherzustellen, dass das Öl überschwappen nicht Porzellan Marker Grenzen (siehe 1.3).
Hinweis: Vor dem Abdecken der Embryonen mit Öl, kann ein weiterer Schritt durchgeführt werden: die Embryonen können für ein paar Minuten getrocknet werden, um ihre Flüssigkeitsgehalt zu reduzieren und damit den Eintritt der injizierten DNA-Lösung erleichtern. Dies kann helfen, embryo Platzen während des Einspritzens oder übermäßiger Leckage des eingespritzten Lösung, als Folge des hohen Flüssigkeitsdruck vermeiden.
3. Embryo Mikroinjektions
- Füllen Sie eine Nadel (1-2 ul) mit Plasmid-DNA oder dsRNA-Lösung (1-2 ug / ul) mit einer Mikropipette.
- Führen Mikroinjektions unter einem Stereomikroskop, ein Mikromanipulator mit Hilfe der Bewegungen der Nadel (Figur 1D) zu steuern. Verwenden Sie den Mikroskoptisch, um den Schlitten zu bewegen.
- Platzieren Sie den Schieber auf der Bühne des Umfangs.
- Legen Sie die Spitze der Nadel in den hinteren Pol des Embryos (Abbildung 1E).
- Injizieren Sie die Lösung durch das Mikroinjektionssystem mit dem Pedal zu aktivieren. Die injizierte Flüssigkeit induziert einen Anstieg des Innendrucks, was zu einer leichten Bewegung des Embryos.
- Lassen Sie das Pedal und sofort, aber vorsichtig, entfernen Sie die Nadel aus dem Embryo.
- Beobachten etwas zytoplasmatischen Leckage an der Injektionsstelle.
HINWEIS: Um zwischen potentiellen tödlichen Wirkungen von DNA / dsRNA / siRNA und Mortalität aufgrund der Mikroinjektions pro diskriminierenverfahren selbst müssen Kontrollexperimente durchgeführt werden. Diese umfassen die Injektion von Puffer allein, oder, im Fall der reversen Genetik Experimenten eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) abgeleitetes doppelsträngige RNA (dsRNA-GFP) oder siRNA.
- Nach der Injektion inkubieren die Embryonen bei 25 ° C.
4. Post-Injektionsverfahren
- Zwei Tage nach der Injektion, überprüfen Sie die Folien für geschlüpften Larven (1F) unter einem Stereomikroskop. Die Larven können in der Öl bewegen, aber so schnell wie möglich zu Larvenfutter übertragen werden müssen. Aus diesem Grund überprüfen Sie die Folien mehrmals täglich.
- Mit einem feinen Pinsel (000), sanft übertragen die geschlüpften Larven auf die Karotte-basierte Larvenfutter. Übertragen Sie bis zu einem Maximum von 200 Larven pro jeder Petrischale.
- Inkubiere die Larven bei 65% Luftfeuchtigkeit (25 ° C). Stellen Sie sicher, dass der Deckel nicht an der Schale kleben bleibt, beeinträchtigt den Luftaustausch.
- Halten Sie die Petrischalen mit Deckelgeschlossen meist so, dass es noch den Luftstrom zu den Larven ist. Um eine übermäßige Trocknung zu vermeiden, überprüfen die Gerichte täglich und bei Bedarf, Wasser für die Verdunstung zu kompensieren.
- Legen Sie die Petrischalen in einem durchsichtigen Behälter mit einem Netz-Deckel geschlossen und eine Schicht aus Kleie enthält Verpuppung zu begünstigen. Als für die Routine Insektarium Aufzucht, 3. Larvenstadium Sprung aus dem Larvenfutter und in der Kleie verpuppen.
- Sammeln Sie die Puppen und legen Sie sie in einem kleinen Käfig für erwachsene Aufzucht und Screening (dies ist Generation 0, G0). Hinten die Nachkommen auf Standard-Larvenfutter.
- Im Falle von Transformationsexperimente Keimbahn, überprüfen Sie mögliche transformierte Individuen in der nächsten Generation (G1), als Individuen in der Regel injiziert Chimären sind. Trans Ereignisse, ja vielleicht in einem der Kerne der embryonalen syncytium aufgetreten sind, die entweder die Keimbahn oder die soma bilden.
- Bald nach dem Auflaufen, CO 2 mit G1 Personen betäuben und prüfen , ob transformationen Veranstaltungen unter einem Epifluoreszenz-Stereomikroskop. Um auf das Vorhandensein von roten Fluoreszenz-Bildschirm, verwenden Sie einen DsRedwide Filter (Ext 546/12;.. Emm 605/75), während auf Bildschirm für grüne Fluoreszenz verwenden, um die EYFP Filter (Ext 500/20;.. Emm 535/30) .
- Platzieren Sie verwandelt Menschen in einem kleinen Käfig mit Wildtyp Erwachsenen des anderen Geschlechts und ihren Ursprung einer neuen, zunächst heterozygot, Stamm.
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Representative Results
Hier berichten wir über zwei Anwendungen von Embryo Mikroinjektions an der funktionellen Charakterisierung eines Gens von Interesse (Fall 1) gerichtet ist, und bei der Erzeugung transgener Stämme (Fall 2) sind.
Lieferung von dsRNA in Embryonen Genfunktion zu entwirren.
Das innexin-5 - Gen kodiert für ein Spalt-Übergang, die in Insekten, exprimiert wird speziell in den männlichen und weiblichen Gonaden 43,47,48. Basierend auf der Information für eng verwandte Arten verfügbar, die dsRNA-induced gene silencing in der Ablation der Mittelmeerfruchtfliege weiblichen und männlichen Keimbahn zu erwarten. Eine Gesamtzahl von 2400 Embryonen wurden mit einer 2 & mgr; g / & mgr; l dsRNA Gemisch injiziert, von dem 548 Larven geschlüpft und 216 Erwachsene überlebt (nicht veröffentlichte Daten). In etwa 75% der Erwachsenen, Hoden und Eierstöcke erschienen entweder unter-develo seinped oder vollständig fehlen (Abbildung 2). Die Quantifizierung der innexin-5 - Transkript Hülle und Fülle in den Bäuchen von Personen aus beiden Geschlechtern bestätigte die deutlich geringere Expression des Gens, als Vergleich zu den Kontrollen.
Die Erzeugung von transgenen Linien mit fluoreszierenden Spermatozoen.
Medfly transgenen Stämme mit fluoreszenzmarkierten Spermien wurden 34 von Scolari und Kollegen , die durch Embryonen mit Plasmid - DNA injiziert wird . Das Gemisch enthielt zwei Plasmide in festen relativen Prozent gemischt: ein, der "Helfer - Plasmid", das piggyBac Transposase codiert; die andere, die "Donor-Plasmid", das künstliche Transposon enthalten und trug zwei Fluoreszenzmarkern, ausgedrückt eine in der soma von Männern und Frauen, die andere speziell in den Hoden. Der Promotor des Beta - 2-Tubulin - Gen, verantwortlich für die testes spezifische Expression wurde mit den codierenden Sequenzen der fluoreszierenden Proteine turboGFP am ATG fusioniert (Konstrukt # 1260) oder DsRedExpress (# 1261-Konstrukt), respectively. Eine Gesamtzahl von 821 Embryonen injiziert wurden, von denen 205 Larven geschlüpft und 37 Erwachsene erhalten. 9 Frauen und 8 wurden männliche Kreuzungen Set-up, von denen 6 fluoreszierende Nachkommen 34 gab (Lizenz , diese Daten von Elsevier erhalten wiederzuverwenden - Lizenznummer 3796240759880). Auch die erfolgreiche Transformation führte zur Entwicklung von Stämmen mit grünen und roten Fluoreszenz - Testes, bzw. (3).
Abbildung 1. Insectary Ausrüstung und Embryonen. (A) Standard Aufzucht Käfig enthält 1.500-2.000 Erwachsene. Die Weibchen legen ihre Eier durch das Messing an der Vorderseite des Käfigs ineinander greifen. Die Eier werden in Wasser aufgefangen. Auf der LinkenSeite des Käfigs, verwendet das Sieb um die Eier zu filtern, ist sichtbar. (B) Zwei Kisten mit Standardlarvenfutter enthält Larven. Die Boxen sind in einem größeren durchsichtigen Kunststoff-Box mit Kleie platziert Verpuppung zu erleichtern; das Netz die Box Abdeckung entfernt wurde. (C) Embryos in Reihen angeordnet. Die Kanten des doppelbeschichtete Band auf dem Objektträger wurden mit einer weißen Porzellan-Marker markiert. Eier auf dem Band ausgerichtet wird mit Chlortrifluorethylen Öl bedeckt sein. (D) Mikroinjektionsvorrichtung (links) , die mit einem Stereomikroskop mit einem Mikromanipulator ausgestattet (rechts). (E) Embryo - polig; Der rote Pfeil zeigt den hinteren Pol (der Injektionsstelle), während der schwarze Pfeil den vorderen Pol zeigt (wo der Mikropyle befindet). Maßstabsbalken = 500 & mgr; m. (F) ausgebrütete Larven im Öl zu bewegen. Maßstabsbalken = 500 & mgr; m. Please hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Männliche und weibliche mit unterentwickelten Gonaden. Weiblich (links) und männlichen (rechts) seziert Fortpflanzungsorgane. Oben: Wildtyp Personen mit normalen Gonaden. Unten: störten Personen mit unterentwickelten Gonaden. Zubehör Glands Männlich;: MAGs Sp: Spermathek. Maßstabsbalken = 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Transgene Männchen mit fluoreszierenden Hoden und Spermien. Ausgewachsene Männchen transformiert mit dem Konstrukt # 1260 und # 1261, beziehungsweise. Die Pfeile zeigen die Fluorescent Hoden. # 1260 Männer zeigen roten Körper und grünen Hoden, während # 1261 Männer rot Hoden und Grünkörper zeigen. Maßstabsbalken = 2 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Mikroinjektion von Nucleinsäuren in Insekten Embryonen ist ein universelles Verfahren, das sowohl die Analyse der Genfunktion und biotechnologischen Anwendungen erleichtert.
Die jüngste Veröffentlichung der Genomsequenzen von einer zunehmenden Anzahl von Insektenarten führt zu einem dringenden Bedarf an Werkzeugen für die funktionelle Charakterisierung von Genen von noch unbekannter Funktion. RNA-Interferenz ist eine der wertvollsten Methoden erwiesen abzuleiten molekularen Funktionen 49 und embryo Mikroinjektion erleichtert diese Studien.
Die Injektion von Plasmid - DNA kann verwendet werden , Insekten Genome zu modifizieren Transposase-vermittelte Gen - Insertion verwendet, und in jüngster Zeit , Genom-Editing - Tools (zB TALEN, CRISPR / Cas9, HEG). Diese Techniken haben bereits die Entwicklung von Stämmen von mehreren Insektenarten erlaubt, die für die Schädlingsbekämpfung Programme verwendet werden könnten, die beide an der Tilgung oder beim Ersatz von Wildpopulation Ziel with Insekten mit modifizierten biologischen Eigenschaften. In diesem Protokoll beschreiben wir ein optimiertes Verfahren für die Mittelmeerfruchtfliege embryo Mikroinjektion entweder mit Plasmid-DNA oder dsRNA.
Die Verfügbarkeit von gut etablierten und kosteneffektive halbtrockene Larven Medium für Mittelmeerfruchtfliege Aufzucht, sowie die umfangreiche molekulare Informationen über die Jahre erreicht, indem die Forscher die Geschlechtsbestimmung und Zellularisierung Prozess in dieser Spezies zu studieren, stark die Schaffung eines zuverlässigen erleichtern Embryo Mikroinjektions Protokoll. Insbesondere wurde die Aufzucht Protokoll optimiert die maximale Fruchtbarkeit und Vitalität der Embryonen zu gewährleisten. Dies ist wichtig, um die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens tragfähige Erwachsenen mit der geringsten Anzahl von injizierten Embryonen möglich zu maximieren. Verschiedene Protokolle sind für die Mittelmeerfruchtfliege Aufzucht, wie die Karotte-basierte Larven Nahrung, die wir nach hinten beschreiben die injizierten Larven. Jedoch ist dieses Verfahren teurer und ihre Herstellung ist zeitaufwendiger alsandere Medien für die Routine Aufzucht verwendet.
Ein wichtiges Hindernis für die Verwendung von Mikroinjektions ist die unspezifische durch die mechanische Manipulation der Embryonen verursachte Schäden. Dies umfasst mehrere Variablen Überleben der Embryonen beeinflussenden wie das Anstechen der embryo Membranen mit dem Pinsel verwendet , um die Embryonen zu orientieren, um die injizierten Volumina, die Injektionsstelle und Puffer, und die Art der Nadel 50 verwendet werden. Einige dieser Parameter sind optimiert worden, wie beispielsweise die injizierten Volumen und dem Puffer. Im Falle von Nadeln, können sie auch in-house mit einem Abzieher hergestellt werden, und dies erfordert einen Optimierungsschritt die ideale Protokoll zu bestimmen.
Zu den wichtigsten Nachteilen in der Mikroinjektionsverfahren ist auch dechorionation: Obwohl dieser Schritt die Eier leichter Handler zu machen wesentlich ist (dh weniger schlüpfrig) und zur Erleichterung der Injektion, verlängerte Exposition gegenüber Bleich stark embryonalen Vitalität beeinträchtigen. for diesem Grund wird das Protokoll wir hier beschreiben, berichtet über die Verwendung einer sehr kurzen dechorionation Zeit (5 sec), die als guter Kompromiss zwischen Entfernung der Chorion und Überlebensrate festgelegt wurde.
Die Protokolle zur Rückseite der anschließenden Lebensphase verwendet werden, sind auch relevant. Larven von injizierten Embryonen Schlüpfen aus dem Öl so schnell wie möglich entfernt werden. Öl ist in der Tat wesentlich Austrocknung der Embryonen zu verhindern, kann aber auf die Larven schädlich sein. Das verwendete Verfahren Larven zu entfernen, die Zeit in das Öl ausgegeben, und die Art des Lebensmittels verwendet werden, sind alle wichtigen Variablen, die berücksichtigt werden müssen, da sie die letzte Überlebensrate beeinträchtigen kann.
Bei Erwachsenen und Larven Screening können die Immobilisierungsverfahren auch kritisch sein. Medfly Erwachsene können 2 entweder Eis oder CO immobilisiert werden, aber bei längerer Exposition kann für erwachsene Überleben schädlich sein. Als eine Alternative zur Mikroinjektion embryo hat orale Verabreichung erwiesenwerden, um eine weniger invasive und potenziell Hochdurchsatzverfahren zur RNAi-Tests durchführen. Es kann besonders wirksam sein in Arten, die nicht zugänglich sind Mikroinjektions sowie für RNAi-vermittelte Schädlingsbekämpfung in Feldpopulationen.
In dieser Arbeit wurden zwei Fälle berichtet, als Beispiele für die Anwendungsmöglichkeiten der beschriebenen Protokoll: Erstens, die erfolgreiche Transformation durch Transposase-vermittelte Geninsertion des Mittelmeerfruchtfliege Genoms, die zur Schaffung von mehreren Stämmen mit fluoreszierenden Hoden geführt. Unter Verwendung eines ähnlichen Mikroinjektionsverfahren ist es auch möglich, dsRNA zu injizieren, wobei die Auswirkungen des Zuschlags bis zum Erwachsenenstadium sichtbar ist.
Die Einrichtung eines zuverlässigen Mikroinjektionsprotokoll für die Mittelmeerfruchtfliege Embryonen öffnete den Weg zu prüfen, genetisch veränderte Stämme als Werkzeug zur Kontrolle Fliegen in der Wildnis, als alternative oder ergänzende Strategien zu klassischen Ansätzen, einschließlich der Sterile InsectTechnik. Schließlich, 51 die jüngsten Fortschritte in der Technologie für die automatisierte Mikroinjektions in Zebrafischembryonen möglicherweise könnte für die Schaffung transgener Stämme der Mittelmeerfruchtfliege und anderen relevanten Schädlinge die Entwicklung von Hochdurchsatz - Delivery - Systeme mit wichtigen Relevanz helfen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x injection Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl | ||
| Construct Plasmid | |||
| Helper Plasmid | |||
| dsRNA | Phenol-Chloroform purified | ||
| Standard Larval food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
| Carrot Larval Food | 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L | ||
| Adult Food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | |
| Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | |
| Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | |
| Double slided tape | |||
| Whatman Black circle paper | Sigma-Aldrich | Z695505 | |
| Bleach | Diluite 1:2 before use | ||
| Paintbrush (000) | |||
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Adult cages | |||
| Chlorotrifluoroethylene oil | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Ceratitis capitata | The strain used is ISPRA |
References
- Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
- Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
- Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
- Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
- Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
- Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. , Springer. (2005).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- i5k Genome Sequencing Initiative for Insects and Other Arthropods. , Available from: http://arthropodgenomes.org/wiki/i5K (2016).
- Handler, A. Medfly Genome Annotation Groups. , Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016).
- Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
- Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
- Hoy, M. Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. , 3rd edn, Academic Press. (2013).
- Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
- Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
- Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
- Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
- Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
- Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
- Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
- Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
- Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
- Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
- Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
- Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
- Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. , e216 (2007).
- Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. , e219 (2007).
- Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
- Takken, W., Scott, T. W. Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. , Springer. Netherlands. (2003).
- Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. 3-26 (2000).
- Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
- Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
- Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
- Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
- Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
- Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
- Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
- Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
- Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
- Gilbert, L. Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. , Academic Press. (2009).
- Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A. Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. , Springer. 85-93 (2007).
- Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
- Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F. Transgenic insects: techniques and applications. Benedict, M. Q. , CABI. 188-207 (2014).
- Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, Suppl 15 2. S11 (2014).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
