Abstract
지중해 과실 파리 (medfly) Ceratitis capitata (WIEDEMANN) (파리목 : Tephritidae)은 매우 높은 농업 관련을 가진 해충 종입니다. 이는 생식 행동에 기인한다 : 그들은 계란과 펄프의 부화 유충 피드를 배치 할 때 여성은 과일과 야채의 외부 표면을 손상. 야생 C. capitata 인구는 전통적으로 분무 및 / 또는 환경 친화적 인 접근 방식이, 가장 성공적인은 멸균 곤충 기술 (SIT) 인 살충제를 통해 제어된다. 농성 대량 사육, 방사선 기반의 살균과 짝짓기를하는 능력을 유지하지만 비옥 한 자손을 생성 할 수없는 남성의 필드 자료에 의존한다. 출현과 함께 medfly 게놈 시퀀스의 가용성과 생명 공학 도구의 이후의 급속한 발전,이 종의 생물학에 대한 우리의 이해를 밀어 크게하고있다. 이 게놈 조작, 캘리포니아위한 새로운 전략의 확산을 선호N 인구 조절에인가 될 수있다.
이러한 맥락에서, 배아 미세 주입은 medfly 컨트롤의 도구 상자를 확장의 이중 역할을한다. 키 생물학적 과정을 조절하는 유전자의 기능을 방해 할 수있는 능력은, 참으로, medfly 침입을 기본 분자 기계에 대한 우리의 이해를 확장합니다. 또한, 배아 - 라인 변환을 달성하는 능력은 새로운 SIT 설정 미래 응용 분야에 대해 시험 할 수있는 다수의 형질 전환 균주의 제조를 용이하게한다. 실제로 유전자 조작은, 예를 들어, 현장에서 웅성 불임의 성능을 모니터링 할 수 바람직한 특성을 부여하기 위해 사용될 수 있으며, 또는 초기 생명 단계의 사멸을 초래할 수있다. 여기에서 우리는이 두 가지 목표를 달성하기 위해 medfly 배아로 핵산을 microinject하는 방법을 설명합니다.
Introduction
지중해 과실 파리는 (medfly) Ceratitis capitata는 국제적인 종 광범위하게 손상 과일과 재배 작물이다. 이 같은 장군 Bactrocera 및 Anastrepha에 속하는 것과 같은 여러 가지 해충 종을 포함 Tephritidae 가족에 속한다. medfly 패밀리의 대부분의 연구 종이며, 곤충 침입 (1)의 연구뿐만 아니라 해충 관리 전략을 최적화이 단지 모델이되었다.
medfly 300 개 이상의 야생의 종과 재배 식물 3,4를 공격 할 수있는 multivoltine 종입니다. 손상은 성인과 애벌레 단계 모두에 의해 발생 : 성관계 여성은 미생물이 상업적 품질에 영향을 미칠 수 있도록, 산란을 위해 과일의 표면을 관통, 과일 펄프의 애벌레 피드 반면. 세 애벌레 단계 후, 애벌레는 호스트에서 등장하고 토양에 번데기가되다. Ceratitis을capitata 아프리카, 중동, 웨스턴 오스트레일리아, 중남미, 유럽, 미국 (5)의 지역을 포함하여 거의 전 세계적으로 분포를 표시합니다.
가장 일반적인 전략 medfly 침략는 살충제의 사용을 포함하는 제한 (예를 들어, 말라 티온, 스피노 사드) 및 환경 친화적 해충 멸균 기법 (SIT) 6. 후자의 접근 방식은 조사를 이온화에 노출 멸균 렌더링 남성의 수천 수백의 야생으로 방출을 포함한다. 야생 암컷 같은 멸균 남성 정합 결국 박멸 선도 모집단 크기의 감소를 초래없이 자손을 초래한다. SIT는 전 세계 여러 캠페인에서 효과가 입증되었지만, 주요 단점은 양육 및 출시 될 곤충의 수백만 살균의 높은 비용을 포함한다. 출시 개인으로 표시하면 중에 분야에서 캡처 야생 곤충에서 멸균 구별 할 필요가있다활동을 모니터링하며, 현재 형광 분말을 사용하여 달성된다. 이러한 절차는 비용이 많이 드는 바람직하지 않은 부작용 (7)이있다.
순서 최적화 및 / 또는 해충의 제어를위한보다 효과적인 방법을 개발하기 위해서는, medfly 생물학 및 유전학 널리 전세계 많은 연구자들이 탐구되어왔다. medfly 게놈 서열 8, 9의 가용성, 유전자 기능에 대한 새로운 조사를 용이하게합니다. RNA 간섭은 이러한 연구를위한 강력한 도구이며 dsRNA를 (이중 가닥 RNA) 또는 siRNA를 (작은 간섭 RNA)의 미세 주입을 통해 달성 될 수있다. 이 기술을 보여주기 위해, 예를 들어, 사용 된 그 C.에서 결정 성 고분자 연쇄 capitata 일부만 초파리 (10)의에 대해 보존된다.
프로토콜의 발전은 C. 허용 medfly 배아 microinject 할 capitata이 아닌 첫 번째가 될 수 있습니다-Drosophilid 파리 종은 유전자 변형된다. 그 계란 11 탈수 양쪽 형태와 저항의 관점에서, 초파리와 마찬가지이기 때문에, 프로토콜은 제 D. 위해 개발 된 프리 배반 배아로 플라스미드 DNA를 전달하도록 melanogaster의 12, 13 C. 초기에 사용하도록했다 capitata. 이 첫 번째 실험은 transposable 요소 미노스 (11)에 따라 medfly 세균 라인 변환을 허용했다. 이어서, 원래의 시스템은 다른 트랜스포존 기반의 접근법을 사용하여 14 변형시켰다. 이것은 나비목 트리코 NI (15)로부터 피기 백하는 경우이다. 프로토콜은 이후 상기 최적화되었으며, 이는 많은 다른 파리목 22-31의 또 다른 tephritid 종의 16-21 변환 및 허가되었다. 모든 이러한 시스템은 일반적인 바이너리 벡터 / 헬퍼 플라스미드의 형질 전환 시스템의 사용에 의존한다 : 인공 결함을 견인원하는 유전자를 포함하는 아들은 플라스미드 DNA로 조립 및 트랜스 효소 (32)를 제공하여 곤충의 게놈에 통합되어 있습니다. 형질 medfly 라인의 수는 정확성을 향상시킬 수있는 형광 정자 균주 남성 만 자손을 생산하고, 따라서 추가적인 sexing 전략을 필요로하지 않으며, 균주 사멸을 유도하는 조건을 보이면서 치사 유전자를 운반하는 균주를 포함한 여러 기능과, 생성 된 농성 모니터링 단계 33-37의. 형질 전환 된 미생물의 야생에서 박리가 모기 만 (38, 39)에 대하여 파일럿 테스트에서 발생하지만, 하나 이상의 회사는 필드 (40)으로 사용하기위한 유전자 medfly 균주들을 평가하고있다.
배아 미세 주입도 (CR을 같은 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs), 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 팔린 드롬 반복 새로운 게놈 편집 도구의 개발을 선호 할 수 있습니다ISPR) / CRISPR 관련 단백질 (9) 뉴 클레아 제 (Cas9)과 새로운 진화 및 발달 연구를 활성화뿐만 아니라 가능한 생명 공학 도구 상자를 확장합니다 원점 복귀 엔도 뉴 클레아 유전자 (HEGs). 게놈 편집 방법은 이미 모기 41 유전자 드라이브 시스템의 생성을 허용하고 medfly 그들의 전송이 임박. 여기에서 우리는 위에서 언급 한 모든 응용 프로그램에 유용 할 수 있습니다 medfly 배아에서 핵산을 마이크로 인젝션위한 범용 프로토콜을 설명합니다.
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Protocol
1. 실험 셋업
- Insectary 요구 사항
- 모든 C. 유지 capitata 수명은 25 ° C, 65 % 습도와 12/12 시간 빛 / 어둠 광주에서 스테이지.
- 6 L 케이지 약 1,500-2,000 medfly 번데기를 놓습니다. 산란 (42)을 자극하기에 충분 작은 구멍 한쪽에 메쉬 황동 케이지를 사용합니다. 모세관 작용에 의해 물과 파리를 제공하기 위해 케이지의 기본에 작은 구멍을 통해 스폰지 스트립을 삽입합니다. 성인 (그림 1A)를위한 음식 소스로 효모와 설탕 (1시 10분)의 혼합물을 사용합니다. 효모의 양을 증가 (최대 1 : 설탕 : 3, 효모) 암컷이 알을 낳기에 실패합니다.
- 메시을 통해 퇴적 된 계란을 수집 케이지 아래에 물이 가득 접시를 놓습니다. 처녀 암컷이 알을 낳다 수 있듯이 파리는 미세 주입 실험에 계란을 수집하기 전에 적어도 6~7일 나이가 될 때까지 기다립니다. 이 여성이 성관계를 한 것을 보장합니다그리고 계란은 수정 된 된 것입니다.
- 미세 그물 여과기로 물을 필터링하여 계란을 수집합니다. 표준 애벌레 식품 (1.5 LH 2 O, 100 ml의 염산 1 %를 포함하는 플라스틱 상자에 스트레이너에서 계란을 이동 광범위 항균제가 50 ml의 에탄올 5g, 400g 설탕 175g 순수 맥주의 효모, 1 파스퇴르 피펫을 사용하여) 소프트 밀기울을 kg이다.
- 공기 순환을 허용 순 뚜껑 폐쇄 투명 용기에 각 창을 배치하고 밀기 층을 함유 번데기 (도 1b)을 선호.
- 약 10 일 후, 애벌레 음식에서 등장과 번데기의 쌀겨 층 아래로 뛰어 3 차 령 유충을 확인합니다.
- 24 시간 후, 부드러운 브러시를 사용하여 작은 컵에서 번데기를 수집하고 새로운 성인 케이지로 전송. 성인은 일반적으로 십일 번데기 후 등장. 신흥 비행은 ptilinum, 일 위의 머리에있는 팽창 주머니를 사용안테나의 전자베이스는 puparium의 끝을 강제로. 출현 후, ptilinum 영구적으로 다시 내 머리 축소합니다.
- 마이크로 인젝션 유충 1 L 식품의 제조
- 300 ML의 H 2 O 2.5 g 한천을 녹이고
- 따뜻한 500㎖의 H 2 핫 교반 접시에 O 및 4g 나트륨 안식향산 염을 용해, 4.5 ml의 37 % 염산, 42g 효모 추출물과 115g 탈수 당근 분말.
- 상기 혼합물에 10 mL의 무수 에탄올에 용해 된 2.86 g 광범위 항균제의 용액을 추가한다.
- 배양 접시 라운드 15cm의 매체를 배포하고 냉각 할 수 있습니다. 필요한 경우, 4 ℃에서 저장.
- 슬라이드 준비
- 현미경 슬라이드 (75 X 26mm 2)에 양면 테이프의 2cm 스트립을 놓고 중국 마커 가장자리를 표시, 기름 확산과 주입 된 배아의 필연적 인 탈수를 방지 할 수 있습니다.
- 시판 키트 (34)를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다. 에탄올을 사용하여 플라스미드를 석출 원하는 농도로 주입 버퍼 (0.1 mM의 포스페이트 버퍼 pH 7.4, 5 mM의 KCl을)에 재현 탁.
- 페놀 - 클로로포름을 사용하여 긴 dsRNA를 synthetized 체외에서 정화, 이소프로판올을 사용하여 침전 및 사출 버퍼 (43)에 다시 일시 중지합니다.
2. 배아 준비
- 6-7일 옛 성인을 포함하는 케이지 아래에 물이 가득 트레이를 배치합니다.
- 암컷은 30 분 동안 알을 낳다하고 정밀한 스트레이너를 사용하여 물을 필터링하여 배아를 수집 할 수 있습니다. 항상 배아 탈수를 방지하기 위해 물에 스트레이너를 유지합니다.
- 상업 50 % 표백제 용액에 5 초 동안 여과기를 immerging하여 배아를 Dechorionate.
- 반복 적어도 (깨끗한 초순수에 스트레이너를 immerging 조심스럽게 배아를 씻으4-5 회). 마지막으로, 깨끗한 초순수에 여과기를 배치합니다. 최대 2 시간 이내에 배아를 사용합니다.
주 : 마이크로 인젝션의 타이밍이 종래 cellularization 핵 분열의 단계에서, 사전 배반 배아 내로 주입의 필요성에 관한 것이다. 이렇게 주입 된 DNA가 권취되는 핵 내로, 특히 생식을 발신한다 원시 생식 세포 핵에 있습니다. medfly cellularization 9 및 12 시간 45, 46 사이에 일어난 반면, 초파리에서 극 세포에서 cellularization는 배반 엽의 형성은 약 30 분 후에 44 발생으로 수정 후 약 90 분에 (25 ° C에서)를 시작합니다. - 행 배아 방향
- 좋은 붓을 사용하여, 약 50 배아를 수집하고 물에 담가 검은 필터 종이의 디스크에 배치합니다.
- 해부 실체 현미경, 양면 테이프의 상면에 행 배아를 마련미세 브러시 (000)를 사용하여 현미경 슬라이드 (도 1C).
참고 : 분사가 세균 줄 발생한 것 극부에서 수행 될 때, 모두 같은 방향으로 배아를 맞 춥니 다; 후방 극은 micropyle 영역에 반대입니다. - 클로로 기름의 층이 석유는 중국 마커 테두리 (1.3 참조)를 통해 유출되지 않도록하기와 배아를 커버.
참고 : 오일 배아를 피복하기 전에, 추가의 단계가 수행 될 수있다 : 배아는 액체 함량을 감소시키고 이에 따라 주입 DNA 용액의 진입을 용이하게하기 위해 몇 분 동안 건조 된 수있다. 이것은 높은 액체 압력의 결과로서, 주사 또는 주입 용액의 과다 유출시 배아 붕괴를 방지 할 수있다.
3. 배아 미세 주입
- 플라스미드 DNA 또는 마이크로 피펫을 사용하여 dsRNA를 용액 (1-2 μg의 / μL)와 바늘 (1-2 μL)를 입력합니다.
- 바늘 (도 1D)의 움직임을 제어하는 미세 조작기를 사용하여 실체 현미경 하에서 미세 주입을 수행한다. 슬라이드를 이동하려면 현미경 스테이지를 사용합니다.
- 범위의 무대에 슬라이드를 놓습니다.
- 배아 (그림 1E)의 후방 극에 바늘의 끝을 삽입합니다.
- 페달로 마이크로 인젝션 장치를 활성화하여 용액을 주입한다. 주입 액은 태아의 약간의 이동의 결과로, 내부 압력의 증가를 유도한다.
- 즉시 페달을 릴리스 조심스럽게 배아에서 바늘을 제거합니다.
- 주사 부위에 약간의 세포질 누설을 준수하십시오.
참고 : 인해 미세 주입 프로에 DNA / dsRNA를이 /의 siRNA와 사망의 잠재적 인 치명적 영향을 구별하는 방법자체 시저, 제어 실험을 수행해야합니다. 이러한 역 유전학 실험의 경우, 전용 버퍼의 주입을 포함하거나, 녹색 형광 단백질 (GFP)의 이중 가닥 RNA (dsRNA를-GFP) 또는 siRNA를를 - 유래.
- 주사는 25 ° C에서 배아를 품어 다음과 같습니다.
4. 후 주입 절차
- 이틀 주입 한 후, 실체 현미경 아래에서 부화 유충 (그림 1 층)에 대한 슬라이드를 확인합니다. 유충 오일 이동하지만 빨리 유생 식품에 전사 할 필요가있다. 이 때문에, 일 슬라이드를 여러 번 확인한다.
- 미세 페인트 브러시 (000)를 사용하여 부드럽게 당근 기반 애벌레 음식에 부화 유충을 전송합니다. 각 페트리 접시 당 200 애벌레의 최대까지 전송합니다.
- 65 %의 습도 (25 ° C)에서 애벌레를 품어. 뚜껑은 공기 교환을 손상, 접시에 충실하지 않음을 확인합니다.
- 뚜껑을 페트리 접시를 유지유충에 공기 흐름이 여전히 존재하도록 주로 마감했다. 과도한 건조를 방지 매일 요리를 확인하고, 필요한 경우, 증발을 보상 물을 추가합니다.
- 그물 뚜껑에 의해 폐쇄 투명한 용기에 배양 접시를 놓고 밀기울 층을 포함하는 번데기를 선호 할 수 있습니다. 일상 insectary 양육에 관해서는, 3 차 령 애벌레 애벌레 음식 중 점프는 밀기울에 번데기가되다.
- (이 세대 0, G0 임) 번데기를 수집하고 성인 양육 및 선별을위한 작은 케이지에 배치합니다. 후면 표준 애벌레 음식의 자손.
- 주입 개인 키메라 일반적으로 세균이 라인 전환 실험의 경우, 차세대 변형 가능한 개인 (G1)에 대해 확인한다. 전위 이벤트는, 참으로, 세균 온라인 또는 소마를 형성 할 것이다 배아 syncytium의 핵 중 어느 발생했을 수 있습니다.
- 곧 출현 후, CO 2를 사용 G1 개인 마취 및 TRANSF 확인표면 형광 실체 현미경 아래 ormation 이벤트. 잠시 녹색 형광을위한 화면으로 EYFP 필터를 사용 (..; EMM 30분의 535 내선 20분의 500), (EMM 75분의 605.. 내선 12분의 546) 적색 형광의 유무를 선별하기 위해, DsRedwide 필터를 사용 .
- 이성의 야생형 성인과 함께 작은 새장에 변형 개인을 배치하고, 초기 이형, 긴장을 기원.
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Representative Results
여기에서 우리는 각각의 관심의 유전자의 기능적 특성에 관한 배아 미세 주사의 두 응용 프로그램 (사례 1)을보고하고, 형질 전환 균주의 발생 (사례 2)에서.
배아에 dsRNA를 배달 유전자 기능을 해명합니다.
innexin-5 유전자를 곤충에서, 남성 및 여성 생식기 43,47,48 구체적으로 표현 갭 정션을 인코딩한다. 밀접한 관련 종의 사용 가능한 정보에 기초하여, dsRNA에 의해 유도 된 유전자 침묵은 medfly 여성 및 남성 생식 세포의 제거 될 것으로 예상되었다. 2400 배아의 총 수는 548 유충이 부화하고 216 성인 (게시되지 않은 데이터) 살아있는 2 μg의 / μL dsRNA를 혼합, 주입 하였다. 성인, 고환 및 난소의 약 75 %에 미달 develo의를로 등장PED 또는 완전히 결석 (그림 2). 컨트롤에 비해 남녀 모두에서 개인의 복부에 innexin-5 사본 풍부의 정량화는 유전자의 상당히 낮은 발현을 확인했다.
형광 정자와 형질 전환 균주의 생성.
Medfly 형광 표지 된 정자와 형질 전환 균주를 플라스미드 DNA와 배아를 주입하여 스콜라리와 동료 (34)에 의해 생성되었다. 하나의 "헬퍼 플라스미드의"피기 백 트랜스의 인코딩; 혼합물 대해 고정 비율로 혼합 개의 플라스미드를 포함 다른는 "기증자 플라스미드는"인공 트랜스포존을 포함하고 두 형광 마커를 실시, 하나는 특히 고환에서 남성과 여성의 소마의 다른 표현. T 개의 책임이있는 베타 - 튜 불린 2 유전자의 프로모터,에스테스 특정 식 turboGFP (# 1260를 구성) 또는 DsRedExpress 각각 (# 1261를 구성) 형광 단백질의 코딩 서열과 ATG에 융합시켰다. (821) 배아의 총 수는, 주입 (205) 유충이 부화하는 37 성인은 살아 있었다. (- 라이센스 번호 3796240759880 엘스 비어에서 얻은 이러한 데이터를 재사용 할 라이센스) (9) 여성 8 남성 횡단 형광 자손에게 34 준 6있는, 업을 설정했다. 성공적인 변환은 녹색과 적색 형광 고환, 각각 (그림 3)과 균주의 개발을 주도.
그림 1. Insectary 장비 및 배아. (A) 표준은 1,500-2,000 성인을 포함 케이지를 양육. 암컷은 황동을 통해 계란은 케이지의 전면에 메쉬 누워. 계란 물에 수집됩니다. 왼쪽에케이지의 측면은, 계란을 필터링하는 데 사용되는 스트레이너 볼 수 있습니다. (B) 표준 애벌레 음식을 포함 유충의 두 상자입니다. 박스는 번데기를 용이 밀기를 포함하는 더 큰 투명한 플라스틱 상자에 배치된다; 상자를 덮고있는 그물이 제거되었습니다. (C) 배아 행에 배치. 슬라이드에 이중 코팅 테이프의 가장자리는 흰색 중국 마커로 표시했습니다. 테이프에 정렬 된 계란은 클로로 기름으로 덮여됩니다. (D) 마이크로 인젝션 장치 (왼쪽) 미세 조작기 (오른쪽)를 구비 한 입체 현미경에 연결된다. (E) 배아 기둥; 검은 색 화살표합니다 (micropyle가있는) 전방 극을 나타내는 반면 빨간색 화살표는 극부 (주사 부위)을 나타냅니다. 스케일 바 = 500 μm의. 오일의 이동 (F) 부화 유충. 스케일 바 = 500 μm의. 탄원그 자체로는이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 남성과에서 개발 생식선 여성. 여성 (왼쪽)과 남성 (오른쪽) 생식 책자를 해부. 위 : 정상 생식선 야생 형 개인. 아래 : 아래 개발 생식선과 개인을 방해. 멕 : 남성 액세서리 땀 샘; SP : spermathecae. 스케일 바 = 500 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 형질 전환은 각각 구조의 # 1260 및 # 1261, 형질 전환 형광 고환과 정자. 성인 남성과 수컷. 화살표는 FLUO를 나타낸다rescent 고환. # 1261 남성 빨간 고환과 녹색의 몸을 보여 반면 # 1260 남성은 빨강, 몸과 녹색 고환을 보여줍니다. 스케일 바 = 2 mm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
곤충 배아 핵산 마이크로 인젝션은 유전자 기능 및 생물 공학적 응용 분석 모두를 용이하게하는 범용 기술이다.
곤충 종의 증가로부터 게놈 시퀀스의 최근 간행물은 아직 미지의 기능 유전자의 기능적 특성화 도구 시급 리드. RNA 간섭 분자 기능 (49)을 추론하기위한 가장 중요한 방법 중 하나 입증 배아 미세 주입이 연구를 용이하게하고있다.
플라스미드 DNA의 주입 트랜스 - 매개 유전자 도입을 이용하여 곤충 게놈을 수정하는데 사용될 수 있으며, 최근에는 게놈 편집 툴 (예 TALEN, CRISPR / Cas9, HEGs). 이러한 기술은 이미 박멸 또는 야생 모집단의 여분 w 양쪽 목표 해충 제어 프로그램에 사용될 수있는 다수의 곤충 종의 균주의 개발을 허용 할i 번째 수정 생물학적 기능과 곤충. 이 프로토콜에서 우리는 플라스미드 DNA 또는 dsRNA를 하나와 medfly 배아 미세 주입에 최적화 된 방법을 설명합니다.
의 가용성 잘 확립하고 비용 효율적인 medfly 양육뿐만 아니라,이 종의 성 결정 및 cellularization 과정을 공부하는 연구자들에 의해 수년에 걸쳐 달성 된 광범위한 분자 정보에 대한 반 건조 애벌레 매체, 크게 신뢰할 수의 설립을 촉진 배아 미세 주입 프로토콜입니다. 특히, 사육 프로토콜은 배아의 최대 불임과 활력을 위해 최적화되었다. 이것은 가능한 주입 배아의 수가 최소 가능한 성인 획득 확률을 최대화하는 것이 중요하다. 다른 프로토콜은 우리가 뒷면에 주입 유충을 설명하는 당근 기반 애벌레 음식으로, medfly 양육 사용할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 고가이며, 그것의 제조는보다 더 많은 시간이 걸린다루틴 사육에 사용되는 다른 매체.
마이크로 인젝션의 사용에 중요한 장벽 배아의 기계적 조작에 의해 야기되는 비특이적 손상이다. 이는 배아, 주입 볼륨 주사 부위 버퍼를 배향하기 위해 사용되는 붓 태아 막의 피어싱 배아의 생존에 영향을 미치는 여러 변수를 포함하고, 바늘 형 (50)을 사용 하였다. 이러한 매개 변수 중 일부는 이러한 주입 된 볼륨 및 버퍼로, 최적화되었다. 바늘의 경우에, 그들은 또한 풀러를 사용하여 자체적으로 생성 될 수 있으며, 이는 최적의 프로토콜을 결정하는 최적화 단계를 요구한다.
마이크로 인젝션 절차의 주요 단점 중도 dechorionation입니다 :이 단계 (즉, 덜 미끄러운) 및 주입을 용이하게하기 위해, 표백제에 장기간 노출이 크게 영향을 줄 수 있습니다 배아 활력 핸들러에 계란을 쉽게하는 것이 필수적이지만. FO따라서 R, 우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 융모막과 생존 비율의 제거 사이 좋은 타협으로 설립 된 매우 짧은 dechorionation 시간 (5 초)의 사용을보고합니다.
후면 후속 삶의 단계에 사용되는 프로토콜도 적합하다. 주입 배아 부화 유충은 가능한 한 빨리 오일로부터 제거되어야한다. 오일은 배아의 탈수를 방지하지만, 유충에 유해 할 수있는 사실상 필수적이다. 유충, 오일에 소요되는 시간을 제거하는 데 사용되는 방법 및 사용하는 식품의 종류는 최종 생존율을 손상시킬 수 있기 때문에, 고려해야 할 중요한 변수이다.
성인과 애벌레를 심사 할 때, 고정화 방법은 중요 할 수 있습니다. Medfly 성인 CO 2 얼음 또는를 사용하여 고정 할 수 있지만, 장기간 노출 성인 생존에 해로운 수 있습니다. 배아 미세 주입에 대한 대안으로, 경구 전달을 입증했다RNAi의 분석을 수행 할 수있는 덜 침습적 잠재적으로 높은 처리량 방법 일. 그것은 마이크로 인젝션에 대한 의무뿐만 아니라 필드 인구에서 RNAi를 매개 해충 제어하지 않습니다 종에서 특히 효과적 일 수있다.
첫째, 성공적인 변화를 형광 고환 여러 균주의 설립을 주도 medfly 게놈의 트랜스 매개 유전자 삽입을 통해 : 프로토콜의 가능한 응용 프로그램의 예 바와 같이 본 논문에서는 두 가지 경우보고 된 바있다. 유사한 마이크로 인젝션 절차하여, 상기 최저의 효과 어른까지 표시되는 단계와, dsRNA를 주입하는 것도 가능하다.
medfly 배아 안정적인 마이크로 인젝션 프로토콜의 설립은 멸균 곤충 포함한 전통적인 방법의 대안 또는 보완적인 전략으로, 야생에서 파리를 제어하는 수단으로 유전자 변형 된 균주를 고려하는 방식으로 개방기술. 마지막으로, 얼룩말 어류 배아의 자동 미세 주입을위한 기술의 최근 발전은 잠재적 medfly 및 기타 관련 해충 (51) 형질 전환 균주를 생성하는 중요한 관련성 높은 처리량 전달 시스템의 개발에 도움이 될 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x injection Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl | ||
| Construct Plasmid | |||
| Helper Plasmid | |||
| dsRNA | Phenol-Chloroform purified | ||
| Standard Larval food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
| Carrot Larval Food | 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L | ||
| Adult Food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | |
| Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | |
| Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | |
| Double slided tape | |||
| Whatman Black circle paper | Sigma-Aldrich | Z695505 | |
| Bleach | Diluite 1:2 before use | ||
| Paintbrush (000) | |||
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Adult cages | |||
| Chlorotrifluoroethylene oil | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Ceratitis capitata | The strain used is ISPRA |
References
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