Summary
HCN 채널과 보조 서브 유닛 사이의 상호 작용은 주요 우울 장애의 치료 대상으로 확인되었습니다. 여기서,이 단백질 - 단백질 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하기위한 형광 편광 - 기반 방법이 제공된다.
Abstract
과분극 활성화 주기적 뉴클레오티드 - 게이트 (HCN) 채널들이 신경 세포의 흥분성을 조절하는 기능을 뇌 전체에 보편적으로 표현된다. 해마 영역 CA1의 피라미드 뉴런이 채널의 세포 내 분포는 tetratricopeptide 반복 함유 Rab8b 상호 작용하는 단백질 (TRIP8b), 보조 서브 유닛에 의해 조절된다. HCN의 유전자 녹아웃은 HCN 채널의 기능을 제한하는 주요 우울 장애 (MDD)에 대한 치료로서 유용 할 수 있음을 시사 서브 유닛 또는 TRIP8b, 항우울제 같은 행동의 증가에 모두 리드 기공 형성. 중요한 치료 적 관심에도 불구하고, HCN 채널은 또한 그들이의 리듬을 조절 중심부에 표현된다. 심장 HCN 채널 차단과 관련된 오프 대상 문제를 회피하기 위해, 본 연구실은 최근 특히 뇌 HCN 채널 기능을 방해하기 위하여 HCN과 TRIP8b 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용을 표적으로 제안 하였다.여기에 초점이 TRIP8b의 tetratricopeptide 반복 (TPR) 도메인 및 HCN1의 C 터미널 꼬리 사이의 상호 작용에 있지만 TRIP8b는 두 가지 상호 작용 사이트의 서브 유닛을 형성 HCN의 기공에 결합한다. 이 프로토콜 TRIP8b 정제 및 HCN과 TRIP8b 사이의 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하는 높은 처리량 스크린을 실행하는 방법의 확장의 설명에서 설명한다. 높은 처리량의 선별 방법은 형광 편광 (FP)는 HCN1 C 말단 테일에 상응하는 산 펩티드 아미노 ㄱ 형광 표지 된 11 개의 큰 TRIP8b 단편의 결합을 모니터링하는 분석 기반 이용한다. 이 방법은 수 '히트'화합물은 출사 광의 편광 변화에 기초하여 식별된다. 유효성 검사 분석은 다음 화합물을 인공적 아닌 '히트'있는지 확인하기 위해 수행된다.
Introduction
과분극 활성화 환상 뉴클레오티드 게이팅 (HCN) 채널은 막 흥분성을 조절하는 하나의 중요한 역할을하는 중심부 및 중추 신경계에 발현된다. HCN 채널 HCN 채널 약리 기능을 제한하는 MDD 3의 신규 한 치료에 효과적 일 수 있음을 제시하는 여러 그룹을 이끌었다 주요 우울 장애 (MDD) 2의 병인에 연루되어있다. 그러나 직접 HCN 채널을 대상 이유로 인해 심장 활동 전위 (4)에서의 중요한 역할의 생존이 아니다. Ivabradine 유일한 FDA는 HCN 채널 길항제를 승인하는 서맥 효과 (5)를 생성하는 심부전의 치료에 사용된다. 따라서, 중추 신경계에서 독점적 HCN 채널 기능을 제한 약리학 적 제제에 대한 필요성이 존재한다.
반복 함유 Tetratricopeptide Rab8b 상호 작용하는 단백질 (TRIP8b하면) 뇌 정시이다HCN 채널 6,7의 표면 발현 및 현지화를 제어 HCN 채널 FIC 보조 서브 유닛. TRIP8b의 유전자 녹아웃 심장 8 HCN의 발현에 영향을주지 않고 뇌 HCN 채널 (7)의 감소를 야기한다. 흥미롭게도, TRIP8b 녹아웃 마우스는 강제 수영 작업과 꼬리 정지 작업 (7), 항우울제 효능 9-11 두 가지 일반적으로 사용되는 선별 검사에 적은 시간 움직이지를 보냅니다. 이 결과는 직접적으로, HCN 채널 함수의 소분자 길항제 HCN 채널 타겟팅 항우울제처럼 행동을 생성하기에 충분할 수있다 TRIP8b HCN과의 상호 작용을 방해 아닌 것을 제안한다.
TRIP8b은 두 가지 결합 부위에서 HCN에 결합한다. HCN의주기적인 염기 결합 도메인 (CNBD)는 TRIP8b 12, 13의 TPR 도메인에 TRIP8b있는 N 단말기의 보존 도메인과 상호 작용한다. 이에 관련된 CNBD의 잔류 있지만상호 작용 (14)에 매핑되고, 참여 TRIP8b의 영역은 80 아미노산의 단편을 13 이상으로 좁혀되지 않았다. 두 번째 상호 작용은 TRIP8b의 tetratricopeptide 반복 (TPR) 도메인과 HCN의 C 터미널 트리 펩티드 (HCN1, HCN2 및 HCN4에서 'SNL',하지만 HCN3에서 'ANM') 3,12 사이에 발생합니다. 이 C 꼬리 상호 작용의 최근 해결 결정 구조 (15)는도 5 (PEX5) peroxin, 퍼 옥시 솜 오기 수용체 간의 상호 작용과 실질적 구조적 유사성을 계시하고, 그 제 1 형 퍼 옥시 표적 서열 (PTS1) (16)를 포함하는, 파트너 상호 작용.
모두 작용 부위가 HCN 채널 기능이 필요하지만, TRIP8b의 TPR 도메인과 HCN1의 C 단자 트리 펩티드 사이의 상호 작용이 지배적 결합 부위로서 작용하고 HCN 표면 발현을 조절한다. 따라서, 이러한 상호 작용은이 연구에서 타겟팅 사이트로 선택되었다.기준이 TRIP8b HCN과의 상호 작용으로 이루어진다 원고의 나머지를 들어, 언급되는 이러한 상호 작용이다. 이 상호 작용은 그 함유 보존 C 단자 HCN의 C 말단 꼬리 (잔기 TRIP8b의 1A-4의 이성체 241-602)을 3 결합에 필요한 도메인 TPR 대응 TRIP8b 고도로 가용성 단편에 의해 효과적으로 요약된다.
이 상호 작용을 방해 할 수있는 작은 분자를 식별하는 높은 처리량 스크린을 개발하기 위해서는, 형광 편광 (FP)의 분석법을 사용 하였다 (17) 기반. 형광 편광은 편광 방출 된 형광 (18)의 편광도를 측정 형광 표지 된 리간드의 자극에 기초한다. 결합 파트너의 존재 하에서 형광성 리간드의 회전 운동이 제한되며, 편광 (19) 방출된다. 결합 파트너 t가없는그 리간드의 회전 운동은 탈 편광의 발광을 이끈다.
동봉 프로토콜 니켈 니트릴 로트리 아세트산의 니켈 (Ni-NTA) 비드를 사용하여 N 말단 태그 (6xHis) TRIP8b의 정제 (241-602)을위한 방법이 제시된다. 유사한 프로토콜은 프로토콜의 단계 7에서 사용한 글루타치온 S 트랜스퍼 라제 (GST) -tagged HCN1 C 말단 40 개 아미노산 (HCN1 용 C40)를 정제하기 위해 이용 하였다. 공간 고려 사항, 그 절차의 상세한 설명은 생략 하였다.
프로토콜의 7을 통해 2 단계에서, 높은 처리량 검사 작업 흐름 (그림 1 참조) 제공됩니다. 단백질 - 단백질 상호 작용은 높은 처리량 검사에 대한 악명 어려운 목표이며, 독자들은 주제 (20)에 대한 추가 리소스를 추구하는 것이 좋습니다.
2 단계 및 절차의 3 fo를 구축 정제 TRIP8b (241-602)의 체외 친 화성을 특징RA의 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC)의 HCN1 (HCN1 FITC)의 C 말단 테일에 대응 열한 아미노산 펩티드 -tagged. TRIP8b HCN-15 복합체의 결정 구조에 따라이 열한 아미노산 TRIP8b 세그먼트 (241-602)과 결합 생성하기에 충분하다. 2 단계에서, 상호 작용의 K D를 HCN1 FITC의 고정 농도로 (241-602) TRIP8b 적정에 의해 측정된다. 3 단계에서 2 단계에서 사용되는 HCN 펩타이드의 레이블이없는 버전은 FITC 태그가 결합 방해하는 경우 검사 모두 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC의 고정 농도로 적정한다. 이러한 실험은 높은 처리량 스크린에 사용 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC의 적절한 농도를 선택하는 필수적이다.
높은 처리량 스크린의 전제된다는 십이 생산할 예정 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC 사이의 상호 작용을 방해 할 수있는 소분자편광에 rease. 단계 4에서, 분석의 Z 계수 분석은 높은 처리량의 스크리닝 (단계 5)에 적합하도록 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC의 소정 농도 (21)를 산출한다. 6, 7 차 높은 처리량 화면에서 식별 된 안타 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC 사이가 아닌 비특이적 인 메커니즘을 통해 상호 작용을 방해하여 행동하는 것을 확인하는 검증 분석입니다 단계. 단계 6에서, carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)의 HCN1 펩티드 (HCN1 TAMRA)를 FITC 태그를 사용하여 FP 분석법을 손상 형광 화합물 필터링 달리 동일한 형광 편광 검정에 사용되는 표지 된이. 단계 7 큰 HCN1 C 말단 단편 (HCN1 C40)를 이용한 단백질 상호 작용에 의해 서로 가까워 셉터 비드 도너 비드로부터 일 중항 산소의 "터널링"에 기초 비드 기반 근접 분석을 사용 (22).
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Protocol
TRIP8b (241-602) 단백질의 정제 (1)
- 관할 E.으로 박테리아 단백질 발현 벡터 pGS21 3 (241-602) TRIP8b를 포함하는 플라스미드를 변형 대장균 제조업체의 지침에 따라 단백질 발현합니다. 플레이트 루리아 국물 (LB)의 문화 300 μL는 클로람페니콜과 암피실린의 5 ㎍ / ㎖로 -agar. 16 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
- 다음 날, 하나의 식민지가 클로람페니콜과 암피실린의 50 μg의 / ㎖와 50 ㎖ LB를 접종 선택합니다. (진탕) 16 시간 동안 37 ° C에서 문화를 품어.
- 암피실린 50 ㎍ / ml의 LB의 1 L에 50 ml의 문화를 추가합니다. 진탕 37 ° C에서 품어.
- 배양은 0.8 내지 1.2의 OD 판독 (600)에 도달하면, 18 ° C로 인큐베이터의 온도를 변경하여 최종 농도 1mM IPTG (이소 프로필 - 베타 - 디 - 티오 갈 락토 시드)를 추가한다. 단백질 발현 16 시간 동안 진행하도록 허용.
- E.는 스핀 다운 4 ° C에서 15 분 동안 6,000 XG에 대장균 박테리아 펠렛합니다. 원심 분리기에서 튜브를 제거한 후, 절차의 남은 얼음 위에서 박테리아를 유지한다. 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 0.25 밀리미터 (PMSF)을 완충액 A 36 ㎖ 중의 세균을 재현 탁.
- 높은 전력에서 30 초 '오프'에 '30 초 사이에 교대로 5 ~ 10 분 동안 평평한 볼트를 사용하여 얼음에 재현 탁 박테리아를 초음파 처리.
- 4 ℃에서 15 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기. 상등액은 아직 명확하지 않은 경우 추가로 15 분 동안 원심 분리기.
- 2 ml의 니켈 NTA 구슬의 컬럼에 뜨는을 적용합니다. 부드러운 락 4 ° C에서 60 분 동안 품어.
- 언 바운드 물질이 칼럼을 통해 흘러 버퍼 A. 500 ㎖로 세척 할 수 있도록 허용
- 버퍼 B. 250 ㎖로 열을 씻으십시오
- 버퍼 (A)의 125 ml를 5 mM의 이미 다졸 보충과 열을 씻으십시오.
- 아프로 단백질을 용출20 ml의 용출 버퍼와 열을 해요.
- 주사기를 사용 - 투석 카세트 (10 kDa의 분자량 컷오프)에 용출 된 단백질을 추가합니다. 39 ° C의 저온 인산염 완충액 (PBS) 4 L 60 분간 단백질을 투석.
- 차가운 PBS의 새로운 4 L 통에 투석 카세트를 이동합니다. 4 오 ℃에서 16 시간 동안 단백질을 투석
- 다음날 아침, 제조자의 지시에 따라하는 쿠마시 단백질 검정 키트를 사용하여 단백질 농도를 확인한다. 40 μM 미만의 농도가 관찰되는 경우, 제조자의 지시를 단백질 농축기를 사용하여 다음의 단백질을 농축시킨다. 저장 -80 ° C에서 나누어지는 및 동결.
2. 소규모 형광 편광 분석은 두 단백질 조각의 상호 작용의 특성을
- 40 μM TRIP8b (241-602) 200 μl를 해동하고 1.5 ML 튜브에 추가합니다. 11 추가 1.5 ml의 튜브에 PBS 100 μl를 추가합니다.
- 시리즈의 다음 튜브 원래 튜브로부터 TRIP8b (241-602) 100 ㎕를 전달 상하 피펫 팅하고, 처리를 반복하여 연속 희석을 수행한다. 이것은 0.01-40 μM에 이르기까지 TRIP8b (241-602)의 2 배 희석의 12 포인트 시리즈를 생성합니다.
- 0.1 μM HCN1 FITC (10 μM의 분취 량의 6.5 μL) 및 PBS에서 2 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT)의 650 μl의 마스터 믹스를 준비합니다.
참고 : 마스터 믹스가 2 배입니다. - 12 새로운 1.5 ml의 튜브를 설정합니다. 각 튜브에 HCN1 FITC를 포함하는 마스터 믹스 50 μl를 추가하고 12 연속 희석에서 각각 50 μl를 추가합니다.
참고 :이 12 튜브를 생성, 각 원래 시리얼 희석에서 0.05 μM HCN1 FITC 함유 TRIP8b (241-602)의 농도의 절반입니다. - 세중에 잘 당, 세이 판에 30 μl를 희석 시리즈를 추가합니다. 낮은 바인딩 검은 색 384 웰 플레이트를 사용합니다.
- 판 F 스핀또는 실온에서 900 XG에 2 분.
- , 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 플레이트를 참조하십시오. 다음 측정 파라미터를 사용하여 형광 편광을 측정 : 485 nm의 여기, 530 nm의 방출 505 nm의 다이크로 익 미러, 100 msec의 통합 시간.
- TRIP8b 대수 규모 (241-602) 농도 대 편광 (MP) 값을 플롯. 표지 HCN1 펩타이드에 대한 TRIP8b (241-602)의 친 화성 (K d 개)를 결정하기 위해 힐 식으로 데이터를 장착한다.
주 : 희석액을 제조하기위한, 멀티 - 웰 플레이트는 튜브 대신에 사용될 수있다.
3. 긍정적 인 제어를 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용을 검사
- 1.5 ML 튜브에 레이블이없는 HCN1 펩타이드 (200 μM) 200 μl를 추가합니다. 11 추가 1.5 ml의 튜브에 PBS 100 μl를 추가합니다. 제 1 튜브에 200 μL의 펩티드를 함유하는 튜브에서 100 μl를 전송하여 일련의 희석을 수행100 ㎕의 PBS의. 레이블이없는 HCN1 펩타이드의 2 배 희석 12 튜브를 생성하는 과정을 반복합니다.
- 0.2 μM HCN1 FITC 4 μM TRIP8b (241-602)의 650 μl의 마스터 믹스를 준비합니다.
참고 :이 배 솔루션입니다. - 12 새로운 1.5 ml의 튜브에 마스터 믹스 50 μl를 추가합니다.
- 1.5 ML 튜브에 각각의 용액을 희석 50 μl를 추가합니다.
- 물론 당 30 μl를 추가 중으로 검은 색 384 웰 마이크로 타이 터 플레이트를 넣습니다.
- 실온에서 900 XG에 2 분 동안 접시를 원심 분리기.
- FP 할 수있는 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 판을 읽어보십시오. 단계 2.7에 기재된 것과 동일한 설정을 사용한다.
- K d를 1 = IC (50) / (1 + [L] / K d를 2), K d를 1 레이블이없는의 친 화성을 나타냅니다 쳉 - 프 루소 프 방정식을 사용하여 TRIP8b의 레이블이없는 펩타이드 (241-602)의 친 화성을 계산 TRIP8b (241-602), IC (50)에 대한 펩타이드는 이전 단계에서 결정된다상기 표지 리간드를 대체하는 비 표지 된 리간드의 능력, [L] 단계 3.2 표지 리간드의 농도는를 나타내고, K의 D 2 표지 리간드 TRIPb (241-602)의 친 화성이다.
4. 평가 분석 성능 (계산 Z 팩터)
- 2 μM TRIP8b (241-602), 50 nM의 HCN1 FITC 및 FP 버퍼에 1 mM의 DTT와 FP 버퍼의 12 ml의 솔루션을 제공하여 마스터 믹스를 준비합니다.
참고 :이 40 μM TRIP8b (241-602)의 60 μL, 10 μM HCN1 FITC 60 μL 및 FP 버퍼의 1,080 μl를 필요로 할 것이다. - 검은 384- 웰 마이크로 타이 터 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스의 30 μL를 추가한다.
- 긍정적 인 제어 역할을 192 웰에 1 mM의 레이블이없는 HCN1 펩타이드의 1 μl를 추가합니다.
- 음성 대조군 역할을 192 우물에 FP 버퍼 1 μl를 추가합니다.
- 실온에서 900 XG에 2 분 동안 접시를 원심 분리기.
- 마일을 사용하여 판을 읽고croplate 리더.
- 다음 식을 사용하여 분석 용 Z 계수를 계산한다 : Z = 1 - * (σ POS -σ NEG) / (μ NEG -μ POS) σ의 POS 및 σ의 NEG는 양성 및 음성 대조군 웰의 표준 편차는 어디 및 μ POS 및 NEG μ는 양성 및 음성 대조군 웰의 평균 신호를 나타낸다.
5. 높은 처리량 화면
- TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC의 분취 량을 해동 얼음에 보관하십시오.
- FP 버퍼에 TRIP8b (2 μM) 및 HCN1 FITC (50 ㎚) 10 ㎖를 준비합니다.
- 피펫을 사용하여 384 웰 블랙 마이크로 타이 터 플레이트 바인딩 로우의 각 웰에 혼합물의 25 μl를 분배.
- 라이브러리 심사를 들어, 음향 액체 핸들러를 사용하여 컬럼의 각 웰 3 (각 40 μM 최종 농도) (22)에 화합물을 추가합니다.
참고 : 인해 relativel에이 분석으로 관찰 Y 낮은 적중률은 두 개의 서로 다른 화합물은 하나의 우물에 모아졌다. 각 활성 우물에서 두 화합물은 후속 활성을 부여하는 식별하기 위해 개별적으로 시험 하였다. - 열 한 각 플레이트 (23)와 같은 음성 대조군의 각 웰에 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 100 NL을 추가합니다.
- 열이 각 판의 24 양성 대조군의 각 웰에 레이블이없는 HCN1 펩타이드를 추가합니다.
- 실온에서 2 시간 동안 플레이트를 인큐베이션. 판을 읽거나 읽기 전에 16 시간 동안 4 ° C에서 품어.
- 접시 리더에 형광 편광을 측정합니다. 단계 2.7에 기재된 것과 동일한 설정을 사용한다.
- 100 %의 각 플레이트의 평균 양성 및 음성 대조군을 사용하여 신호를 정규화하여 억제율을 계산한다. X N은 신호 X에 대응하는 정규화 된 억제율 (%) 인 경우, X의 POS 식 XN = 100 % * - (- X) / (X NEG X POS) (X NEG)을 사용하여 NEG는 음성 대조군 웰로부터의 신호이다.
TAMRA-태그 HCN 펩타이드를 사용하여 조회수 6. 확인
- 유효성 검사는 TAMRA 표지 HCN1 펩타이드 (HCN1 TAMRA)를 사용하여 50 % 억제와 안타.
- 2 μM TRIP8b (241-602) 및 50 nM의 HCN1 TAMRA FP의 버퍼의 12 ML의 마스터 믹스를 준비합니다.
- 검은 384- 웰 마이크로 타이 터 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스를 25 ㎕를 분주.
- 각각의 우물에 각 활성 화합물의 연속 희석을 전송합니다. 각각의 농도가 200 μM, 0.2 μM의 범위에 충돌한다는 두 배 희석액은 만든다.
- 음성 대조군 반응을 위해, 각 웰에 DMSO 100 NL 옮긴다. 양성 대조군의 경우 200 ㎛에서 0.1 ㎛ 범위의 최종 농도로 희석 한 레이블이없는 HCN1 펩타이드의 100 NL을 추가합니다.
- 실온에서 접시를 품어2 시간 동안. 판을 읽거나 4에서 16 시간 동안 배양 읽기 전에 C를 °.
- 다음의 파라미터를 측정하여 형광 편광 (MP)를 측정 : 535 nm의 여기하는 단계; 580 nm의 방출; 535 nm의 다이크로 익 미러, 20 msec의 통합 시간.
- 네 파라미터 비선형 회귀 모델 (23)을 사용하여 각 화합물의 농도 의존적 FP 데이터를 끼워 맞춤으로써 IC 50 값을 계산한다.
비드 기반의 근접 분석 7. 용량 - 반응 확인
- 그의-태그 TRIP8b (241-602) (그의-TRIP8b) 및 GST-태그 HCN1 (GST- HCN1 C40) 융합 단백질의 1 분취 량을 해동 얼음에 보관하십시오.
- 400 nm의 그의-TRIP8b 40 nM의 GST HCN1 C40의 농도 분석 버퍼에 GST-HCN1 C40와 그의-TRIP8b을 결합합니다. 각 화합물의 혼합물의 300 μl를 준비 테스트 할 수 있습니다.
참고 : 화합물 11 다른 농도 플러스 DM에서 세중에서 실행됩니다SO 제어 (아무 화합물). - 제어 우물의 경우, GST-HCN1C40없이 그의-TRIP8b (200 ㎚)의 30 μl를 준비하고 개별적으로 분석 버퍼에 그의-TRIP8b없이 GST-HCN1C40 (20 ㎚)의 30 μl를 준비합니다.
- 16 채널 피펫을 사용하여 플레이트의 36 우물 (위의 단계 7.2에서 준비) GST-HCN1 C40 혼합물 : 각 화합물을 테스트 할 경우, 그의-TRIP8b 7 μl를 추가합니다. 단일 화합물을 테스트하기 위해, 행 AL의 12 가지 농도 및 열 1-3에있는 3 개의 복제를 정렬합니다. 열 행 N. 1-3에 열 행 M의 1-3 (7.3에서 준비) GST-HCN1 C40 솔루션의 7 μL를 (7.3에서 준비)가 그의-TRIP8b 솔루션의 7 μl를 추가 간단히 플레이트를 원심 분리 액체가 각 웰의 맨 아래에있는 확인하고 모든 거품을 제거 할 수 있습니다.
- 분배 히트 각 화합물의 농도 (행 K) 0.1 μM 아래로 (A 행)에 200 μM의 범위에 충돌하도록 상기 플레이트에 시험한다. 부피 분배행 AK에 분배 화합물의 양을 일치하는 행의 LN에서 DMSO.
- 2 분 동안 판을 흔들어 실온에서 2.5 시간 동안 배양.
- 분석 버퍼 방지 GST 채택 구슬 1:50 희석.
- 16 채널 피펫과 플레이트의 각 웰에 희석 채택 구슬의 3.5 μl를 추가하고 부드럽게 거품을 만드는 피하기 위해 피펫 팅하여 혼합한다.
- 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 접시를 품어.
- 분석 버퍼와 니켈 킬레이트 기증자 구슬 1:50 희석. 빛에 혼합물을 노출시키지 마십시오.
- 16 채널 피펫과 플레이트의 각 웰에 희석 된 기증자 구슬의 3.5 μl를 추가하고 부드럽게 거품을 만드는 피하기 위해 피펫 팅하여 혼합한다.
- 어둠 속에서 실온에서 1.5 시간 동안 접시를 품어.
- 접시 리더에서 읽어보십시오. 40 밀리 여기 시간, 100 밀리 초 발광 시간, 0.1 mm 감지 높이 : 다음 측정 매개 변수를 사용하여 플레이트 리더를 사용합니다.
- EAC 피팅 데이터에 의해 IC (50) 값을 계산네 파라미터 비선형 회귀 모델 (23)을 이용하여 H 화합물.
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Representative Results
이전 출판과 저작권 문제를 방지하기 위해, TAMRA 태그가 프로브 HCN1 TAMRA는 그림 2와 3을 생성하는 데 사용되었다. 이 대체가 결과에 상당한 차이를하지 않았 음을 참고하고, 프로토콜 HCN1 FITC와 위에서 설명한 것과 동일하다. HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602)과의 상호 작용을 평가하기 위해 2 단계 (그림 2)에 설명 된 프로토콜을 사용하여 HCN1 TAMRA의 고정 농도로 적정 하였다. 다음, 3 단계에서 설명 된 실험을 수행하고, 레이블이없는 HCN1 펩타이드는 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 TAMRA (그림 3)의 고정 농도로 적정 하였다.
분석은 높은 처리량 검사에 적합한 것을 확인하려면, 그 성능은 다음 4 단계에서 프로토콜에 의해 조사 하였다; 0의 Z 요소.89 분석은 높은 처리량 검사 (그림 4)에 대한 준비가되어 있음을 나타냅니다 얻었다. 이어서, 20,000 화합물 소분자 라이브러리, 50 % 이상의 억제율을 다음 모든 화합물 HCN1 TAMRA (6 단계) 상기 제 2 FP 분석에서 시험 하였다 5 단계에서 설명 된 절차에 의해 스크리닝 하였다. 마지막으로, 확인 된 히트 비드 기반의 근접 분석 (7 단계, 그림 5)에서 시험 하였다. NUCC-5953 히트 한 화합물은, 이들의 실험 결과 확인되었다.
그림 1 : 워크 플로우를 HTS 회로도 높은 처리량 검사에 대한 워크 플로우를 설명.. 프로토콜의 단계를 나타내는 각각의 삼각형 위에서 아래로부터도 진행한다. 을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.
그림 2 :. 단백질 - 단백질 상호 작용의 K d를 (A) 도식은 TRIP8b으로 2 단계에 설명 된 실험을 보여주는 (241-602)이 HCN1 TAMRA의 고정 농도로 적정한다 (회색) TRIP8b의 TPR 도메인 바인딩 11 아미노산 펩타이드 (단말기 'SNL'블랙에서 강조). TRIP8b의 농도로 (B)는 (241-602)은 증가, 더 HCN1 TAMRA 분자가 결합 된 편광 증가 (K D = 0.320.01μM에게)이된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 긍정적 인 컨트롤 IC (50) (A) 3 단계로 레이블이없는 HCN1 펩타이드에 대한 도식을 보여주는 실험 패러다임이 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 TAMRA의 고정 농도에 적정, 표지 된 펩티드 변위된다. (B) HCN1 TAMRA의 변위 (IC 50 = 1.070.08μM)를 나타내는 신호가 레이블이없는 HCN1 증가의 농도가 감소합니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4 :. HTS 대표 결과 (A)는 높은 처리량 SC 결과 재 N은 5 단계 그래프의 각 점은 단일 화합물을 나타냅니다에 설명 된 프로토콜을 사용하여 수행. X 및 Y 좌표는 각 실행에서 %의 억제에 의해 결정됩니다. 화면에서 (B)의 결과는 양성 및 음성 대조군 (범례 참조) 플롯. 각 화합물의 평균 백분율 저해 (분석의 2 점을 가로 질러)을 Y 축에 도시된다. TAMRA 표지 HCN1 펩타이드를 사용하여 확증 FP 실험에서 (C) 결과. 5 단계에서 50 %보다 큰 억제를 나타낸 화합물은, (A)와 같이 6 단계에서 사용되는 X 및 Y 좌표는 분석의 2 점에서 억제율 (%)에 의해 결정 하였다. 한 등. 3에서 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 5 :. 구슬 기반의 근접 분석은 (A) 도식은 비드 기반의 근접 분석을 게재합니다. TRIP8b는 (241-602)은 니켈 킬레이트 기증자 구슬을 결합하는 N 터미널 헥사 히스티딘 태그 (줄무늬 원)가 포함되어 있습니다. HCN1 C40은 수용체의 구슬을 결합하는 N 터미널 GST 태그가 포함되어 있습니다. TRIP8b의 TPR 도메인과 HCN1의 C 말단 트리 펩티드의 상호 작용에 의해 근접하게되면, 680 nm 파장 광에 의해 도너 비드의 여진이 일 중항 산소를 생성한다. 이 중항 산소 전송 에너지는 정의 된 반경 비드 셉터 빛의 방출을 초래한다. TRIP8b (241-602) 및 HCN1 C40의 고정 농도로 히트 화합물 (NUCC-5953)의 농도를 증가 (B) 적정. 한 등. 3에서 재현. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
때문에 MDD 24 치료 목표로서의 잠재력 중추 신경계 4 HCN 채널 기능을 길항 약물 학적 접근법에 상당한 관심이 있었다. 그러나, 이러한 노력들은 심장 박동 심장에서 HCN 채널의 중요한 역할 및 부정맥 (25)의 위험으로 정체되어왔다. 우리는 HCN과 뇌 특정 보조 단위체 TRIP8b (8) 사이의 상호 작용을 방해하는 것은 심장 HCN 채널 (3)에 영향을주지 않고 항우울제와 같은 효과를 생성하기에 충분할 수 있음을 추론. 이 가설은 쥐가 항우울제 같은 행동 7을 전시 TRIP8b 부족한 관찰에 의해 강화되었다. 이러한 상호 작용을 표적으로하는 MDD의 치료를위한 새로운 패러다임이 될 수있다.
TRIP8b의 TPR 도메인과 HCN1의 C 단자 트리 펩티드 사이의 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하기위한 상세한 프로토콜위에서 제시했다. 그 일반적인 어플리케이션을 용이하게하기 위해, 우리는 여기서 상기 분석의 개발을 주도 우리 추론을 설명한다. TRIP8b 두 위치에서 HCN의 서브 유닛에 결합하지만, 우리는 TRIP8b의 TPR 도메인과 HCN의 C 터미널 꼬리 사이의 상호 작용에 초점을 맞추었다. X 선 결정학에 의해 이러한 상호 작용의 구조 해명은 HCN (15)의 C 터미널 주변 TRIP8b의 TPR 도메인에 의해 형성된 깊은 주머니를 한 것으로 밝혀졌습니다. 두 번째 TRIP8b-HCN 상호 작용합니다 (TPR 도메인에 N 터미널 위치) TRIP8b의 80 아미노산의 스트레칭과 HCN의주기적인 염기 결합 도메인 사이에 발생합니다. 이러한 상호 작용은 각각의 단백질의 다양한 아미노산에 걸쳐 발생하고, 적은 잘 정의 분자간 상호 작용 (26)와 확산면을 구성한다. 이러한 구조의 관찰에 기초하여, 우리는 TRIP8b의 TPR 도메인과 HCN의 C 단자 사이의 상호 작용은 소분자 INHI 의해 파괴에 더 민감한 것으로 추론BITOR.
처음 TRIP8b의 큰 단편 긴 구조물이 알로 스테 릭 조절 부위가 있고 성공 확률을 높일 수있는 가정에 기초하여 분석에 사용 하였다. 전체 길이 TRIP8b 처음 사용하지만,이 방법은주기 - 해동 동결 단백질 응집, 저하, 감도에 의해 제한되었다. 그 후,이 중간에 크기 TRIP8b가 구축, 더 이상 한 (잔류 물 219-602)와 짧은 일 (잔류 물 259-602)이 중간 구조물하기 전에 시험 하였다 (잔류 물 241-602)가 선정되었다. 상술 한 네 잘림 각각 HCN의 C 단자 바인딩 관련된 TPR 도메인을 포함하지만, 단지 중간 길이 클론 (241-602)을 스크리닝 분석에서 사용하기에 충분히 안정 하였다. 특히, 추가의 분리 단계없이 2+ 니켈 친 화성 크로마토 그래피 후, 단백질의 대량 얻을 수 있었다.
choos 후TRIP8b과 HCN의 적절한 조각을 보내고, 우리는 다음 TRIP8b (241-602)에 표시된 HCN1 펩타이드의 친 화성을 결정했다. 일반적으로, 정확한 측정은 단지 리간드의 농도가 실질적으로 결합 파트너 (28)의 K D 이하이면 가능하다. 우리의 경우는 2 단계의 실험 HCN1 표지 펩티드의 50 nm의 사용 및 0.320.01μM의 K D를 획득. 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 자세한 실험 설계 고려 사항의 경우, 독자는 주제 27-30에 여러 가지 우수한 리뷰의 하나라고합니다.
우리가 TRIP8b의 표시 HCN1 펩타이드 (241-602)의 K D를 결정하면 라벨 자체가 결합 방해하는 경우, 우리는 결정했다. 3 단계에서, 우리는 표지 펩티드를 대체 할 TRIP8b (241-602)의 고정 농도에 레이블이없는 HCN1 펩티드를 적정에 의해 1.070.08 μM의 IC (50) 값을 얻을. 의 K D와 결합 TRIP8b (241-602) 및 쳉 - 프 루소 프 식을 적용하기위한 펩티드를 표시, 우리는 K D = 0.93μM로 TRIP8b (241-602)에 대한 레이블이없는 펩타이드의 친 화성을 평가했다. 이 표지 펩티드 TRIP8b (241-602)의 친화 근접 일치하고, 펩티드를 라벨링하는 것은 실질적 TRIP8b과의 친화력에 영향을 미치지 않았 음을 암시한다. 0.89의 인자 Z로 나타낸 바와 같이, 형광 편광 기초하여 화면의 중요한 특징은 잡음비 우수한 신호이다. 같은 다른 파라미터들과 함께, FP 신호의 변화의 크기는 결합 파트너 (TRIP8b (241-602))과 형광 표지 된 리간드의 사이즈의 크기에 의해 결정된다. (44에서 224 MP에) 편광의 변화는과의 자유와 결합 된 상태 사이의 11 아미노산 펩타이드 리간드와 관찰 ~ 42 kDa의 TRIP8b (241-602) 단백질은 대상의 상호 작용을 재현하기에 충분하며, 충분한 동적 범위를 제공한다 라이브러리 스크리닝.
ntent "> 어떤 높은 처리량 심사 분석의 과제 중 하나에 해당 구별 신호 강도의 인공적인 변화에서 화합물을 '히트'입니다. 형광 편광 기반 화면에서, 많은 화합물은 형광과 직접 상호 작용 또는에서 형광을 위해 하나 일반적입니다 자신., 두 가지 형광체를 이용한 2 단계의 선별 절차는 상술되어 이러한 문제를 회피.이 절차는 형광 화합물 및 화합물 스크리닝 과정을 진행한다 형광 직접 상호 작용 가능성을 감소시킨다. 또한 형광을 바인딩 일부 화합물은 생체 외 '수집기'역할 및 형광 편광 신호 비특이적 변화로 이어질. 이들 화합물은 단백질 - 단백질 상호 작용 (31, 32)를 세제 성 미셀 구조를 형성하고 억제하는 것으로 생각된다. 이러한 효과를 완화하기 위해, 중요 그 상위에 사용되는 형광 편광 버퍼다른 세제와 추가 검증이 고려되어야하지만 위에서 설명한 처리량 검사 프로토콜, 세제 (트리톤)를 포함한다.이는 상기 스크리닝 절차의 몇몇 중요한 제한이 있음을 유의해야한다. TRIP8b 두 위치에서 HCN에 결합되지만, 상기 스크린은 하나의 상호 작용 위치를 검사하고 CNBD 상호 작용을 표적으로 작은 분자를 식별하지 않을 것이다. 마찬가지로, 알로 스테 릭 N 말단 영역에 TRIP8b와의 상호 작용에 의해 TRIP8b HCN 결합을 조절하는 화합물은 안타로 식별되지 않습니다. 이러한 고려 사항은 모두 절차에 설명 스크리닝 분석에서 재현성을 보장 TRIP8b 작은 단편 (상기 참조)을 사용한 결과이다. 이러한 제한을 피하기 위해, 장래의 노력은 전체 길이 HCN를 포함하는 세포 기반 스크린을 사용으로 지향 될 수 있고 TRIP8b은 33, 34을 생성한다. 화면 정렬이 높은 t에 의존 할 수있다HCN과 TRIP8b 사이의 상호 작용을 방해하고, 세포 표면에서 HCN 채널의 발현을 제한 할 수있는 화합물을 확인하기 위하여 전기 생리 학적 방법 hroughput. 참고로,이 생체 내에서 오프 대상 효과로 이어질 수 있기 때문에 이러한 작은 분자가 직접 길항제로서 HCN 채널 기능을 제한되지 않았 음을 확인하기 위해 카운터 스크린을 포함해야 같은 접근한다.
HCN1, HCN2 및 HCN4 있지만 모두가 보존 된 'SNL'C 터미널 펩타이드를 가지고,이 트리 펩티드에 잔류 N 단자는 실질적으로 가능성 다릅니다 TRIP8b 결합 친화도에 영향을 미친다. 이는 소분자 화면에 의해 얻어진 또는 TRIP8b-HCN 상호 작용을 방해에서 HCN 이성체 특이성을 제공 할 수있는 다른 히트 화합물을 기반으로 설계된 히트 가능성을 제기한다. 최초 화면에서 NUCC-5953은 TRIP8b HCN1와 (3) 사이의 상호 작용을 방해 할 수있는 제 소분자 인 것이 확인되었다. 미래 세계에 법과신약 개발을위한 바람직한 화학적 성질에 추가 소분자 저해제를 식별 할 수있는 상기 분석과 케이.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Dialysis cassette | ThermoFisher | 66456 | |
| Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 - 1 gr | |
| 384-Well Black plate | Corning | 3820 | |
| Proxiplate | Perkin-Elmer | 6008289 | |
| Anti-GST Acceptor beads | Perkin-Elmer | 6760603C | |
| NiChelate | Perkin-Elmer | AS101D | |
| pGS21-a | Genscript | SD0121 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Coomassie Kit | ThermoFisher | 23200 | |
| Protein concentrator | ThermoFisher | 88527 | |
| Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader | Perkin-Elmer | #2300-001M | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | Agilent | 200131 |
References
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