Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Published: November 11, 2016 doi: 10.3791/54540
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1, 4, 1,5
1Davee Department of Neurology and Clinical Neurosciences, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Center for Molecular Innovation and Drug Discovery, Northwestern University, 3Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 4High Throughput Analysis Laboratory, Department of Molecular Biosciences, Northwestern University, 5Department of Physiology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University
* These authors contributed equally

Summary

Samspillet mellom HCN kanaler og deres hjelpe subenheten har blitt identifisert som et terapeutisk mål i Major Depressive Disorder. Her, en fluorescens-polarisasjons-basert metode for identifisering av lavmolekylære inhibitorer av dette protein-protein interaksjon, er presentert.

Abstract

Hyperpolarization aktiverte sykliske nukleotid-gated (HCN) kanaler er uttrykt overalt i hele hjernen, hvor de fungerer for å regulere excitability av nerveceller. Den subcellulære fordelingen av disse kanalene i pyramidale nevroner av hippocampus område CA1 er regulert av tetratricopeptide gjenta holdig Rab8b samspill protein (TRIP8b), en hjelpe subenhet. Genetisk knockout av HCN poredannende subenheter eller TRIP8b, begge fører til en økning i antidepressant-lignende oppførsel, noe som tyder på at å begrense funksjonen av HCN kanaler kan være nyttig som en behandling for depresjon (MDD). Til tross for betydelig terapeutisk interesse, er HCN kanaler også uttrykt i hjertet, der de regulerer rhythmicity. For å omgå off-target problemstillinger knyttet til blokkering av hjerte HCN kanaler, har vårt laboratorium nylig foreslått rettet mot protein-protein interaksjon mellom HCN og TRIP8b for å spesifikt forstyrre HCN kanalfunksjon i hjernen.TRIP8b binder seg til HCN pore forming subenheter på to forskjellige interaksjons områder, men her er fokuset på samspillet mellom tetratricopeptide repeat (TPR) domener av TRIP8b og C-terminal hale av HCN1. I denne protokollen, en utvidet beskrivelse av en fremgangsmåte for rensing av TRIP8b og utføring av et filter med høy gjennomstrøming for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av interaksjonen mellom HCN og TRIP8b, er beskrevet. Fremgangsmåten for high throughput screening anvender et Fluorescence Polarization (FP) -basert assay for å overvåke bindingen av en stor TRIP8b fragment til en fluorofor-merket elleve aminosyre peptid som tilsvarer det C-terminale hale HCN1. Denne metoden gir "hit" forbindelser som skal identifiseres på grunnlag av endring i polarisasjonen av emittert lys. Validerings analyser blir deretter utført for å sikre at "hit" forbindelser er ikke kunstig.

Introduction

Hyperpolarization aktiverte sykliske nukleotid-gated (HCN) kanaler er uttrykt i hjertet og sentralnervesystemet hvor de spiller en viktig rolle i å regulere membran oppstemthet en. HCN kanaler har vært innblandet i patogenesen av depresjon (MDD) 2, noe som har ført flere grupper til å foreslå at å begrense HCN kanalfunksjon farmakologisk kan være effektiv som en ny behandling for MDD tre. Men direkte rettet mot HCN kanaler er ikke levedyktig på grunn av deres viktige rolle i hjertets aksjonspotensial fire. Ivabradin, godkjente eneste FDA HCN kanal-antagonist, blir brukt til behandling av hjertesvikt for å produsere en effekt Bradykardisk 5. Som sådan, er det et behov for farmakologiske midler som begrenser HCN kanalfunksjon utelukkende i sentralnervesystemet.

Tetratricopeptide gjenta holdig Rab8b samspill protein (TRIP8b) er en hjerne spesific hjelpe subenheten av HCN kanaler som styrer overflate-ekspresjon og lokalisering av HCN kanaler 6,7. Genetisk knockout av TRIP8b fører til en reduksjon av hjerne HCN kanaler 7 uten å påvirke HCN uttrykk i hjertet åtte. Interessant, TRIP8b knockout mus bruker mindre tid immobile på tvungen svømme oppgave og hale suspensjon oppgave 7, to brukte screening tester for antidepressiv effekt 9-11. Disse resultatene antyder at snarere enn direkte rettet mot HCN kanaler med et lite molekyl antagonist av HCN kanalfunksjon, forstyrre interaksjonen mellom TRIP8b og HCN kan være tilstrekkelig til å fremstille antidepressiv-lignende oppførsel.

TRIP8b binder seg til HCN på to forskjellige bindingssteder. Den sykliske nukleotid bindende domene (CNBD) av HCN samhandler med en konservert domenet TRIP8b ligger N-terminal til TPR domener av TRIP8b 12,13. Selv om rester av CNBD som er involvert i dennesamhandling har kartlagt 14, har regionen TRIP8b som er involvert ikke blitt snevret ned utover en-80-aminosyre fragment 13. En annen interaksjon oppstår mellom tetratricopeptide gjenta (TPR) domener av TRIP8b og C-terminalen tripeptid av HCN ( 'SNL' i HCN1, HCN2, og HCN4, men 'ANM "i HCN3) 3,12. Den nylig løst krystallstrukturen 15 i denne C halen samspillet avdekket betydelige strukturelle likheter med samspillet mellom peroksisomal import reseptoren, peroxin 5 (PEX5), og dens samspill partnere, som inneholder type 1 peroksisom targeting sekvenser (PTS1) 16.

Selv om begge interaksjons områder er nødvendig for HCN kanal funksjon, fungerer samspillet mellom TPR domener av TRIP8b og C-terminalen tripeptid av HCN1 som den dominerende bindingssetet og regulerer HCN overflate uttrykk. Derfor ble denne interaksjonen valgt som målretting området i denne studien.For resten av manuskriptet, når det henvises til samspillet mellom TRIP8b og HCN, er det på denne interaksjonen det blir referert til. Dette samspillet er rekapitulert av en lett oppløselig fragment av TRIP8b tilsvarende sin konservert C terminal inneholder TPR domener som kreves for å binde den C-terminale halen av HCN (rester 241-602 av 1a-4 isoformer av TRIP8b) 3.

For å utvikle et filter med høy gjennomstrøming for å identifisere små molekyler som er i stand til å forstyrre denne interaksjonen, en fluorescens-polarisering (FP) -basert assay ble anvendt 17. Fluorescens-polarisasjon er basert på eksitasjon av en fluorofor-merket ligand med polarisert lys, og måle graden av polarisasjon av den utsendte fluorescensen 18. I nærvær av en bindingspartner, er rotasjonsbevegelsen av det fluorescerende ligand begrenset og polarisert lys emitteres 19. I fravær av en bindingspartner, than rotasjonsbevegelse av liganden fører til utslipp av depolarisert lys.

I den vedlagte protokoll, er en fremgangsmåte for rensing av N-terminal-merket (6xHis) TRIP8b (241-602) ved anvendelse av nikkel-nitriltrieddiksyre (Ni-NTA) perler presentert. En tilsvarende protokoll ble anvendt for å rense den glutation-S-transferase (GST) -tagged C-terminale 40 aminosyrer av HCN1 (HCN1 C40) anvendt i trinn 7 av protokollen. For plasshensyn, ble en detaljert beskrivelse av den prosedyren utelatt.

I trinn 2 til 7 av protokollen, er en high throughput screening arbeidsflyten presentert (se figur 1). Protein-protein interaksjoner er en notorisk vanskelig mål for high throughput screening og leserne rådes til å oppsøke flere ressurser på emnet 20.

Trinn 2 og 3 av fremgangsmåten karakterisere in vitro affinitet for det rensede TRIP8b (241-602) konstruere fora fluoresceinisotiocyanat (FITC) -tagged elleve aminosyre peptid som tilsvarer det C-terminale halen av HCN1 (HCN1 FITC). Ut fra krystallstrukturen av den TRIP8b-HCN-komplekset 15, dette elleve aminosyre-segmentet er tilstrekkelig til å danne binding med TRIP8b (241-602). I trinn 2, blir Kd av interaksjonen målt ved titrering TRIP8b (241-602) i en fast konsentrasjon av HCN1 FITC. I trinn 3, blir et ikke-merket versjon av HCN peptidet anvendt i trinn 2 titreres inn i en fast konsentrasjon av både TRIP8b (241-602) og HCN1 FITC for å undersøke om den FITC tag forstyrrer binding. Disse eksperimentene er viktig å velge de riktige konsentrasjoner av TRIP8b (241-602) og HCN1 FITC brukes i høy gjennomstrømming skjermen.

Premisset for høy gjennomstrømning skjermen er at et lite molekyl som kan forstyrre samspillet mellom TRIP8b (241-602) og HCN1 FITC vil produsere en desemberrease i polarisert lys. I trinn 4, blir Z-faktor av analysen beregnet 21 for en gitt konsentrasjon av TRIP8b (241-602) og HCN1 FITC for å sikre at analysen er passende for høy kapasitets screening (trinn 5). Trinn 6 og 7 er validerings analyser for å bekrefte at treff identifisert i primær høy gjennomstrømning skjermen opptrer ved å forstyrre samspillet mellom TRIP8b (241-602) og HCN1 FITC heller enn gjennom en uspesifikk mekanisme. I trinn 6, carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) -merket HCN1 peptid (HCN1 TAMRA) er brukt i en ellers identisk fluorescens polarisering analyse for å filtrere fluorescerende forbindelser som kompromittere FP analysen med FITC tag. Trinn 7 benytter et større HCN1 C-terminale fragment (HCN1 C40) og benytter en kulebasert nærhet assay, som er basert på den "tunnelering 'av en singlett oksygen fra en donor vulst til en akseptor vulst bringes nær hverandre ved å interagere proteiner 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rensing av TRIP8b (241-602) Protein

  1. Transform plasmidet inneholder TRIP8b (241-602) i bakterieprotein ekspresjonsvektor pGS21 tre inn i kompetente E. coli for protein uttrykk i henhold til produsentens instruksjoner. Plate 300 pl av kulturen på Luria-medium (LB) -agar med 5 ug / ml kloramfenikol og ampicillin. Inkuber platen ved 37 ° C i 16 timer.
  2. Den neste dagen, plukke en enkelt koloni å vaksinere 50 ml LB med 50 mikrogram / ml kloramfenikol og Ampicillin. Inkuber kulturen ved 37 ° C i 16 timer (med risting).
  3. Tilsett 50 ml kultur til 1 liter LB med 50 ug / ml Ampicillin. Inkuber ved 37 ° C med risting.
  4. Når kulturen har nådd en OD 600 avlesning på 0,8-1,2, endre temperaturen i inkubatoren til 18 ° C og tilsett IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactosid) til en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Tillat proteinekspresjon til å foregå i 16 timer.
  5. Spinn ned E. coli ved 6000 xg i 15 min ved 4 ° C for å pelletere bakteriene. Etter fjerning av rørene fra sentrifugen, holder bakteriene på is for de gjenværende av fremgangsmåten. Resuspender bakteriene i 36 ml buffer A med 0,25 mM fenylmetansulfonylfluorid (PMSF).
  6. Sonicate resuspendert bakterier på isen ved hjelp av en flat bolt i 5-10 min, alternerende mellom 30 sek "på" og 30 sek "off" ved høy effekt.
  7. Sentrifuger ved 12000 x g i 15 min ved 4 ° C. Sentrifuger for ytterligere 15 minutter hvis den overliggende væske er ikke klart ennå.
  8. Anvende supernatanten på en kolonne av 2 ml Ni-NTA perler. Inkuber i 60 min ved 4 ° C med milde rocking.
  9. Tillat den ubundne materialet til å strømme gjennom kolonnen og vaskes med 500 ml av buffer A.
  10. Vask kolonnen med 250 ml buffer B.
  11. Vask kolonnen med 125 ml buffer A supplementert med 5 mM imidazol.
  12. Eluere protein from kolonnen med 20 ml elueringsbuffer.
  13. Legg det eluerte protein til en dialyse kassett (molekylvekt cutoff - 10 kDa) ved hjelp av en sprøyte. Dialyser proteinet i 60 min i 4 liter kaldt fosfatbufret saltvann (PBS) ved 4 ° C.
  14. Flytt dialyse kassetten inn i en ny 4 L bøtte med kaldt PBS. Dialyser protein i 16 timer ved 4 o C.
  15. Neste morgen, sjekk proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en Coomassie protein assay kit, etter produsentens anvisninger. Konsentrer protein ved hjelp av et protein konsentrator, etter produsentens anvisninger, hvis en konsentrasjon under 40 mikrometer er observert. Alikvot og fryse ved -80 ° C for lagring.

2. småskala FluorescencePolarization analysen for å karakterisere Interaksjon av de to proteinfragmenter

  1. Tine 200 ul 40 mikrometer TRIP8b (241-602) og legge den til en 1,5 ml tube. Tilsett 100 ul PBS for å 11 ytterligere 1,5 ml rør.
  2. Utføre serielle fortynninger ved å overføre 100 ul TRIP8b (241-602) fra det opprinnelige rør til det neste rør i rekken, å pipettere opp og ned, og gjenta prosessen. Dette vil gi en 12-punkts serie av to-gangers fortynninger av TRIP8b (241-602) i området 0,01 til 40 pM.
  3. Forbered en 650 mL mester blanding av 0,1 mikrometer HCN1 FITC (6,5 mL av en 10 mm delmengde) og 2 mM ditiotreitol (DTT) i PBS.
    Merk: Hoved mix er 2x.
  4. Sett opp 12 nye 1,5 ml rør. Tilsett 50 pl av den konsentrat-blanding inneholdende HCN1 FITC til hvert rør, og deretter legge til 50 ul fra hver av de 12 serielle fortynninger.
    Merk: Dette vil generere 12 rør som hver inneholder 0,05 mikrometer HCN1 FITC og halvparten av konsentrasjonen av TRIP8b (241-602) fra den opprinnelige serie fortynning.
  5. Tilsett fortynningsserie til en analyseplate, 30 ul per brønn, i tre eksemplarer. Bruk en lav bindings solid svart 384-brønners plate.
  6. Spinn plate feller 2 min ved 900 x g ved romtemperatur.
  7. Les platen ved hjelp av en mikroplateleser, etter produsentens anvisninger. Måle fluorescens polarisering ved hjelp av følgende måleparametrene: 485 nm eksitasjon, 530 nm emisjon, 505 nm dikroisk speil, 100 ms integrasjonstid.
  8. Plott polarisering (MP) verdier versus TRIP8b (241-602) konsentrasjon på en logaritmisk skala. Monter data med Hill ligningen for å bestemme affinitet (Kd) av TRIP8b (241-602) for den merkede HCN1 peptid.
    Merk: For å fremstille serie-fortynninger, kan en multi-brønn plate også brukes i stedet for rørene.

3. Undersøk Protein-protein Interaksjon Ved hjelp av en positiv kontroll

  1. Tilsett 200 ul umerket HCN1 peptid (200 pM) i et 1,5 ml rør. Tilsett 100 ul PBS for å 11 ytterligere 1,5 ml rør. Utføre serielle fortynninger ved å overføre 100 ul fra røret inneholdende 200 ul av peptid til den første tubepå 100 ul PBS. Gjenta prosessen for å generere 12 rør med 2 fold fortynninger av umerket HCN1 peptid.
  2. Forbered en 650 mL mester blanding av 0,2 mikrometer HCN1 FITC og 4 mikrometer TRIP8b (241-602).
    Merk: Dette er en 2x løsning.
  3. Tilsett 50 ul masterblanding til 12 nye 1,5 ml rør.
  4. Tilsett 50 ul av hver seriefortynning til et 1,5 ml rør.
  5. Installering av sorte 384-brønners mikrotiterplate i tre eksemplarer, tilsetning av 30 ul per brønn.
  6. Sentrifuger plate i 2 minutter ved 900 xg ved romtemperatur.
  7. Avles platen ved hjelp av en mikroplateleser som kan FP. Bruk samme innstillinger som beskrevet i trinn 2.7.
  8. Beregn affiniteten av umerket peptid for TRIP8b (241-602) ved hjelp av Cheng-Prusoff-ligningen: K d 1 = IC 50 / (1 + [L] / Kd 2), hvor K d 1 representerer affiniteten av den umerkede peptid for TRIP8b (241-602), IC 50 er bestemt i foregående trinnog representerer evnen av umerket ligand for å forskyve den merkede liganden, [L] er konsentrasjonen av den merkede liganden i trinn 3.2, og Kd 2 er affiniteten av TRIPb (241-602) for den merkede liganden.

4. Evaluere analyseytelse (Beregn Z Factor)

  1. Forbered en mester blanding ved å lage en 12 ml løsning av FP buffer med 2 mikrometer TRIP8b (241-602), 50 nM HCN1 FITC, og 1 mM DTT i FP Buffer.
    Merk: Dette vil kreve 60 mL 40 mM TRIP8b (241-602), 60 mL av 10 mm HCN1 FITC og 1,080 mL av FP buffer.
  2. Tilsett 30 ul av konsentrat-blanding til hver brønn av en svart 384-brønners mikrotiterplate.
  3. Tilsett 1 pl 1 mM umerket HCN1 peptid til 192 brønner for å tjene som en positiv kontroll.
  4. Tilsett 1 mL av FP-buffer til 192 brønner for å tjene som en negativ kontroll.
  5. Sentrifuger plate i 2 minutter ved 900 xg ved romtemperatur.
  6. Les platen ved hjelp av en microplate leser.
  7. Beregn Z faktor for analysen ved hjelp av følgende formel: Z = 1 - 3 * (σ pos -σ neg) / (μ neg -μ pos) hvor σ pos neg og σ er standardavvikene til de positive og negative kontrollbrønner og μ pos og μ neg representerer de gjennomsnittlige signaler i de positive og negative kontrollbrønner.

5. Høy gjennomstrømning Screen

  1. Tine prøver av TRIP8b (241-602) og HCN1 FITC og holde dem på is.
  2. Forbered 10 ml TRIP8b (2 mm) og HCN1 FITC (50 nM) i FP buffer.
  3. Dispensere 25 ul av blandingen i hver brønn av en lav bindings 384-brønners sorte mikrotiterplate ved hjelp av en pipette.
  4. For bibliotek screening, tilsett forbindelser i hver brønn av kolonnene 3-22 (40 pM sluttkonsentrasjon for hver) ved hjelp av en akustisk væskebehandler.
    Merk: På grunn av relatively lav søkbarhet observert med denne analysen, ble to forskjellige forbindelser samlet i en enkelt brønn. De to forbindelser fra hver aktiv vel ble deretter testet individuelt for å identifisere hvilke dratt aktiviteten.
  5. Tilsett 100 nl dimetylsulfoksid (DMSO) i hver brønn av kolonnene 1 og 23 av hver plate som negative kontroller.
  6. Legg umerket HCN1 peptid i hver brønn i kolonnene 2 og 24 av hver plate som positive kontroller.
  7. Inkuber platene ved romtemperatur i 2 timer. Les plater eller inkuberes ved 4 ° C i 16 timer før du leser.
  8. Måle fluorescens polarisering på en plateleser. Bruk samme innstillinger som beskrevet i trinn 2.7.
  9. Beregne prosent inhibering ved å normalisere signalene ved hjelp av den gjennomsnittlige positive og negative kontroller fra hver plate som 100%. Bruk ligning XN = 100% * ((X neg - X) / (X neg - X pos)) hvor X N er den normaliserte prosentvise inhibering som tilsvarer det signal X, X pos neg er signalet fra de negative kontrollbrønnene.

6. Bekreftelse på Hits Bruke TAMRA-merket HCN Peptide

  1. Valider treff med over 50% inhibisjon ved hjelp TAMRA-merket HCN1 peptid (HCN1 TAMRA).
    1. Forbered en mester blanding av 12 ml 2 mikrometer TRIP8b (241-602) og 50 nM HCN1 TAMRA i FP buffer.
    2. Dispensere 25 ul av masterblandingen i hver brønn av en svart 384-brønners mikrotiterplate.
    3. Overføre serielle fortynninger av hver av de aktive forbindelser i de respektive brønner. Lag to gangers fortynninger, slik at konsentrasjonen av hver skjøt i området fra 0,2 uM til 200 uM.
    4. For de negative kontroll reaksjoner, overføre 100 nl av DMSO i hver brønn. For den positive kontrollen tilsett 100 nl av seriefortynnet umerket HCN1 peptid med endelig konsentrasjon som strekker seg fra 200 uM til 0,1 gM.
    5. Inkuber platen ved RTi 2 timer. Les plater eller inkuberes i 16 timer ved 4 ° C før du leser.
    6. Mål fluorescens polarisering (MP) ved hjelp av følgende måleparametre: 535 nm Eksitasjon; 580 nm stråling; 535 nm dichroic speil, 20 ms integrasjon tid.
    7. Beregn IC 50-verdier ved hjelp av de konsentrasjonsavhengige FP data for hver forbindelse ved anvendelse av en fire-parameter ikke-lineær regresjonsmodell 23.

7. Dose-respons Validering av Bead-baserte Proximity Assay

  1. Tine en delmengde av His-tagget TRIP8b (241-602) (Hans-TRIP8b) og GST-tagget HCN1 (GST HCN1 C40) fusjonsproteiner og holde dem på is.
  2. Kombiner Hans-TRIP8b med GST-HCN1 C40 i analysebuffer ved konsentrasjoner på 400 nM Hans-TRIP8b og 40 nM GST HCN1 C40. Fremstille 300 pl av blandingen for hver forbindelse som skal testes.
    Merk: Forbindelser blir drevet i tre eksemplarer på 11 forskjellige konsentrasjoner pluss en DMSO-kontroll (ingen forbindelse).
  3. For kontrollbrønner, forberede 30 mL av Hans-TRIP8b (200 nM) uten GST-HCN1C40 og deretter separat forberede 30 mL av GST-HCN1C40 (20 nM) uten Hans-TRIP8b i analysebuffer.
  4. For hver forbindelse som skal testes, legge til 7 ul av His-TRIP8b: GST-HCN1 C40 blanding (fremstilt i trinn 7.2 ovenfor) i 36 brønner i en plate ved anvendelse av en 16-kanal pipette. For å teste en enkelt forbindelse arrangerer de 12 ulike konsentrasjoner i rader AL og de tre gjentak i kolonner 1-3. Legg 7 mL av His-TRIP8b oppløsning (fremstilt i 7,3) til kolonnene 1-3 av p M og 7 ul av GST-HCN1 C40-løsning (fremstilt i 7,3) til kolonnene 1-3 av p N. korthet Sentrifuger plate til at væskene er på bunnen av hver brønn, og for å fjerne eventuelle bobler.
  5. Tilsett treff forbindelsene som skal testes inn i platen slik at konsentrasjonen av hver skjøt i området fra 200 um (i rad A) ned til 0,1 um (i raden K). Tilsett et volum påDMSO i rader LN som samsvarer med mengden av forbindelsen avgis i rader AK.
  6. Rist platen i 2 minutter og inkuberes i 2,5 timer ved RT.
  7. Vanne ut anti-GST akseptor perler 1:50 med analysebuffer.
  8. Legg 3,5 ul av de fortynnede akseptor perlene til hver brønn på platen med en 16-kanals pipette og bland ved forsiktig pipettering for å unngå å skape bobler.
  9. Inkuber platen i 1 time ved romtemperatur i mørket.
  10. Fortynne Nickel chelat Donor perler 1:50 med analysebuffer. Ikke utsett blandingen til lys.
  11. Legg 3,5 ul av de fortynnede Donor perlene til hver brønn på platen med en 16-kanals pipette og bland ved forsiktig pipettering for å unngå å skape bobler.
  12. Inkuber platen i 1,5 timer ved romtemperatur i mørket.
  13. Les på et plateleser. Bruker en plateleser med følgende måleparametere: 40 msek eksitasjon tid, 100 msek utsendelsen, 0,1 mm deteksjon høyde.
  14. Beregn IC 50-verdier ved å montere data for each forbindelsen ved anvendelse av en fire-parameter ikke-lineær regresjonsmodell 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å unngå opphavsrettslige spørsmål med vår forrige publisering, ble en TAMRA-merket probe HCN1 TAMRA brukes til å generere figurene 2 og 3. Legg merke til at denne substitusjonen ikke gjør en vesentlig forskjell i resultatene, og protokoller er identiske med de som er beskrevet ovenfor med HCN1 FITC. For å undersøke interaksjonen med HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602) ble titrert til en fastsatt konsentrasjon av HCN1 TAMRA ved anvendelse av protokollen som er beskrevet i trinn 2 (figur 2). Deretter ble eksperimentet beskrevet i trinn 3 utføres og umerket HCN1 peptidet ble titrert inn i en fast konsentrasjon av TRIP8b (241-602) og HCN1 TAMRA (figur 3).

For å kontrollere at analysen var egnet for høy gjennomstrømming screening, ytelsen ble neste undersøkt av protokollen i trinn 4; og en Z faktor på 0.89 ble oppnådd, noe som indikerer at analysen var klar for high throughput screening (figur 4). Deretter ble en 20 000 Forbindelse lite molekyl bibliotek screenet ved fremgangsmåten beskrevet i trinn 5. Alle forbindelser som har prosentvis inhibering over 50% ble så testet i den andre FP analysen med HCN1 TAMRA (trinn 6). Til slutt ble bekreftet treff testet i kulebaserte nærhet assay (trinn 7, figur 5). En hit forbindelse, Kammerets-5953, ble identifisert som et resultat av disse eksperimentene.

Figur 1
Figur 1: HTS Arbeidsflyt Skjematisk beskriver arbeidsflyten for høy gjennomstrømming screening.. Diagram inntektene fra topp til bunn, med hver trekant representerer et skritt i protokollen. Klikk her for å vise enstørre versjon av dette tallet.

Figur 2
Fig. 2: K d av protein-protein interaksjon (A) Skjematisk viser eksperiment som er beskrevet i trinn 2. Som TRIP8b (241-602) titreres inn i en fast konsentrasjon av HCN1 TAMRA, TPR domener av TRIP8b (i grått) bind til 11 aminosyre peptid (i svart, med terminal 'SNL' uthevet). (B) Når konsentrasjonen av TRIP8b (241-602) øker, flere HCN1 TAMRA molekyler blir bundet og polariserings øker (K D = 0.320.01μM). Feilfelt betegne standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 Figur 3:. IC 50 av positiv kontroll (A) Skjematisk demonstrere eksperimentelle paradigmet for trinn 3. Som umerket HCN1 peptid titreres til en fast konsentrasjon av TRIP8b (241-602) og HCN1 TAMRA er merket peptid fortrengt. (B) Merk at signalet avtar når konsentrasjonen av umerkede HCN1 øker, noe som indikerer forskyvning av HCN1 TAMRA (IC 50 = 1.070.08μM). Feilfelt betegne standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4:. Representative Resultater fra HTS (A) Resultater fra høy gjennomstrømning sc rønn utført ved hjelp av protokollen beskrevet i trinn 5. Hvert punkt på grafen representerer en enkelt forbindelse. X- og y-koordinatene er bestemt av den prosentvise inhibering i hvert forsøk. (B) Resultater fra skjermen plottet med positive og negative kontroller (se forklaring). Hver forbindelse gjennomsnittlige prosent inhibering (over to kjøringer av analysen) er plottet på Y-aksen. (C) Resultater fra bekreftende FP eksperimenter med en TAMRA-merket HCN1 peptid. Forbindelser som viser mer enn 50% inhibering i trinn 5 ble deretter benyttet i trinn 6. Som i (A), X- og Y-koordinatene er bestemt av den prosentvise inhibering i to kjøringer av analysen. Gjengitt fra Han et al. 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

40 / 54540fig5.jpg "/>
Fig. 5: Bead-baserte Proximity Assay (A) Skjematisk viser kulebaserte nærhet analysen. TRIP8b (241-602) inneholder en N-terminal hexahistidine tag som binder nikkel chelat giver perler (sirkel med striper). HCN1 C40 inneholder en N-terminal GST tag som binder akseptorvesikler perler. Når de bringes i nærhet av et samspill av TPR domener av TRIP8b og den C-terminale tripeptidet av HCN1, magnetisering av donor vulsten ved nm bølgelengde lys 680 produserer singlett oksygen. Dette singlett oksygen overfører energi til akseptor perler innenfor et definert område og fører til emisjon av lys. (B) Titrering av økende konsentrasjoner av treffet forbindelsen (Kammerets-5953) i en fast konsentrasjon på TRIP8b (241-602) og HCN1 C40. Gjengitt fra Han et al. 3. Feilfelt betegne standardavvik.target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grunn av sitt potensial som et terapeutisk mål i MDD 24, har det vært betydelig interesse for farmakologiske tilnærminger som antagoniserer HCN kanalfunksjon i sentralnervesystemet 4. Imidlertid har dette arbeidet blitt stoppet av den viktige rollen HCN kanaler i hjerte pacemaking og risiko for arytmi 25. Vi tenkte at forstyrre samspillet mellom HCN og dens hjerne spesifikke hjelpe subenhet, TRIP8b 8, kan være tilstrekkelig til å produsere antidepressiv-lignende effekter uten å påvirke hjerte HCN kanaler 3. Denne hypotesen ble styrket av den observasjon at mus som manglet TRIP8b utviser antidepressiv-lignende oppførsel 7. Målrette dette samspillet kan bli et nytt paradigme for behandling av MDD.

En detaljert protokoll for å identifisere små molekyl hemmere av samspillet mellom TPR domener av TRIP8b og C-terminalen tripeptid av HCN1 erer presentert ovenfor. For å lette dets generelle anvendelse, vi her beskrive vår resonnement som førte til utviklingen av denne analysen. Selv TRIP8b binder seg til HCN subenheter på to steder, vi fokuserer på samspillet mellom TPR domener av TRIP8b og C-terminal hale av HCN. Den strukturelle belysning av denne interaksjonen ved røntgenkrystallografi avslørte en dyp lomme dannet av de TPR domener av TRIP8b rundt C-terminal av HCN 15. Den andre TRIP8b-HCN interaksjon finner sted mellom en 80 aminosyre strekning av TRIP8b (lokalisert N-terminalen til de TPR domener) og den cykliske nukleotid-bindende domene av HCN. Denne interaksjonen skjer over mange forskjellige aminosyrer av hvert protein og utgjør en diffus overflate med mindre godt definerte intermolekylære interaksjoner 26. Basert på disse strukturelle observasjoner, begrunnet vi at samspillet mellom TPR domener av TRIP8b og C-terminalen av HCN er mer utsatt for forstyrrelser av et lite molekyl inhibitor.

I første omgang ble et større fragment av TRIP8b brukt i analysen basert på antagelsen om at en lengre konstruksjon kan ha allosteriske regulatoriske områder og øke sjansen for å lykkes. Full lengde TRIP8b ble opprinnelig brukt, men denne tilnærmingen var begrenset av proteinaggregering, degradering, og følsomhet overfor fryse-tine-sykluser. Deretter to mellomliggende størrelse TRIP8b konstruerer, en lengre (rester 219-602) og en kortere (rester 259-602), ble testet før en mellom konstruksjon (rester 241-602) ble valgt. Selv om hver av de fire trunkeringer beskrevet ovenfor inneholder de TPR domenene er relevante for binding til C-terminalen av HCN, bare den mellomliggende lengde klon (241-602) var tilstrekkelig stabil for anvendelse i screeningsanalyser. Spesielt var vi i stand til å oppnå store mengder av proteinet etter rensing ved Ni2 + affinitetskromatografi uten ytterligere separasjonstrinn.

etter choosing et passende fragment av TRIP8b og HCN, ved fast vi affiniteten av det merkede peptid HCN1 for TRIP8b (241-602). Som en generell regel, kan en nøyaktig måling bare gjøres hvis konsentrasjonen av liganden er vesentlig under K D til bindingspartneren 28. I vårt tilfelle brukte vi 50 nM av merket HCN1 peptid for forsøket i trinn 2, og oppnådd et K D av 0.320.01μM. For mer eksperimentelle design hensyn angående protein-protein interaksjoner, blir leserne referert til en av flere gode anmeldelser om temaet 27-30.

Når vi bestemt K D av merket HCN1 peptid for TRIP8b (241-602), vi så bestemt om selve etiketten forstyrrer bindende. I trinn 3, erholdt vi en IC50-verdi på 1.070.08 pM ved å titrere en umerket HCN1 peptid til en fast konsentrasjon av TRIP8b (241-602) for å forskyve det merkede peptid. Kombinert med K D av merkede peptid for TRIP8b (241-602), og påføring av Cheng-Prusoff-ligningen, vi deretter beregnet affiniteten av umerket peptid for TRIP8b (241-602) som K D = 0.93μM. Dette er i nær overensstemmelse med affinitet TRIP8b (241-602) for det merkede peptid, og antyder at merking av peptidet ikke vesentlig påvirke dets affinitet til TRIP8b. Et viktig trekk ved fluorescens-polarisasjons-basert skjerm er den utmerkede signal-til-støy-forholdet som antydet med en Z-faktor på 0,89. Med andre parametre de samme, er størrelsen av endringen i FP signal diktert av størrelsen av bindingspartner (TRIP8b (241-602)), og størrelsen av fluorofor-merkede liganden. En endring i polarisasjon (44-224 mP) observert med det 11 aminosyrepeptid ligand mellom dens frie og bundne tilstander med ~ 42 kDa TRIP8b (241-602) protein er tilstrekkelig til å gjengi den målrettede interaksjon og gir et tilstrekkelig dynamisk område for bibliotek screening.

ntent "> En av utfordringene av alle high throughput screening analysen er å skille sant 'hit' forbindelser fra kunstig endringer i signalintensitet. I fluorescens polarisering-baserte skjermer, er det vanlig for mange forbindelser til enten å samhandle direkte med fluoroforen eller fluor på sin egen. for å omgå disse problemene, er en to-trinns screeningprosedyre ved å bruke to forskjellige fluoroforer er beskrevet ovenfor. Denne fremgangsmåten reduserer sannsynligheten for at fluorescerende forbindelser og forbindelser kommunisere direkte med fluoroforen vil gå videre gjennom screening prosessen. i tillegg til å binde fluoroforen enkelte forbindelser virker som "aggregat" in vitro og føre til ikke-spesifikke forandringer i fluorescens polarisering signal. disse forbindelser er antatt å danne detergent-sensitive micellære strukturer og hemmer protein-protein interaksjoner 31,32. for å motvirke disse effektene, er det viktig at fluorescens polarisering bufferen brukes i høythroughput screening protokoll skissert ovenfor inkluderer et vaskemiddel (Triton), selv om ytterligere kontroll med andre vaskemidler må vurderes.

Det bør bemerkes at det er flere viktige begrensninger av screening-fremgangsmåten beskrevet ovenfor. Selv TRIP8b binder seg til HCN på to steder, skjermen beskrevet ovenfor undersøker bare en interaksjon området og vil ikke identifisere små molekyler rettet mot CNBD interaksjon. Tilsvarende forbindelser som allosterisk modulerer TRIP8b binding til HCN ved å samhandle med TRIP8b i N-terminal regionen vil ikke bli identifisert som treff. Begge disse forhold er et resultat av å bruke en mindre TRIP8b fragment (se ovenfor), som sikrer reproduserbarhet i screeningsanalyser er beskrevet i prosedyren. For å unngå disse begrensninger, kan det videre arbeidet være rettet mot anvendelse av en celle-basert skjerm som omfatter full lengde HCN og TRIP8b konstruerer 33,34. Denne typen skjermen kan stole på høy throughput elektrofysiologiske fremgangsmåter for å identifisere forbindelser som kan forstyrre interaksjonen mellom HCN og TRIP8b, og begrenser ekspresjonen av HCN kanaler på celleoverflaten. Av notatet, tilnærminger som disse vil trenge for å inkludere counter-skjermene for å sikre at små molekyler ikke var direkte begrensende HCN kanal funksjon som antagonister, da dette kan føre til off target effekter in vivo.

Selv HCN1, HCN2, og HCN4 alle har en konservert 'SNL' C terminal peptid, rester N-terminal til dette tripeptide variere betydelig, og trolig påvirke TRIP8b bindende affinitet. Dette øker muligheten for at et lite molekyl av treff som oppnås ved skjerm eller designet basert på andre treff forbindelser kan tilveiebringe HCN isoform spesifisitet i forstyrre den TRIP8b-HCN interaksjon. I den opprinnelige skjermen, ble Kammerets-5953 identifisert som den første lille molekyl som kan forstyrre samspillet mellom TRIP8b og HCN1 tre. Future work med denne analysen kan identifisere ytterligere lavmolekylære inhibitorer med ønskelige kjemiske egenskaper for legemiddelutvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ni-NTA agarose  Qiagen 30210
Dialysis cassette  ThermoFisher 66456
Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside  Sigma-Aldrich I5502 - 1 gr
384-Well Black plate  Corning 3820
Proxiplate  Perkin-Elmer  6008289
Anti-GST Acceptor beads  Perkin-Elmer  6760603C
NiChelate Perkin-Elmer  AS101D
pGS21-a Genscript SD0121
PMSF Sigma-Aldrich 10837091001
Coomassie Kit ThermoFisher 23200
Protein concentrator ThermoFisher 88527
Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader Perkin-Elmer  #2300-001M
BL21 (DE3) Competent Cells Agilent 200131

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
  2. Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders? Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).
  3. Han, Y., et al. Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels. J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).
  4. Postea, O., Biel, M. Exploring HCN channels as novel drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).
  5. Stieber, J., Wieland, K., Stöckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors. Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).
  6. Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction. J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).
  7. Lewis, A. S., et al. Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice. J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).
  8. Heuermann, R. J., et al. Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy. Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).
  9. Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).
  10. Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity. Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).
  11. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice. Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  12. Han, Y., et al. Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites. J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).
  13. Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP. J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).
  14. Saponaro, A., et al. Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).
  15. Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).
  16. Gatto, G. J. Jr, Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5. Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).
  17. Owicki, J. C. Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer. J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).
  18. Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
  19. Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).
  20. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Eglen, R. M., et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).
  23. Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. , Worth Publishers. New York. (2000).
  24. Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors. Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).
  25. Wahl-Schott, C., Biel, M. HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function. Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).
  26. DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b. Structure. 23 (4), 734-744 (2015).
  27. Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).
  28. Prinz, H. Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms. J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).
  29. Pollard, T. D. A Guide to Simple and Informative Binding Assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  30. Rossi, A. M., Taylor, C. W. Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization. Nat Protoc. 6 (3), (2011).
  31. Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -W. Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors. J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).
  32. McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening. J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).
  33. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  34. Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).

Tags

Biokjemi High-throughput screening medisiner protein-protein interaksjoner fluorescens polarisering HCN TRIP8b
Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, Y., Lyman, K. A., Clutter, M.,… More

Han, Y., Lyman, K. A., Clutter, M., Schiltz, G. E., Ismail, Q. A., Cheng, X., Luan, C. H., Chetkovich, D. M. Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b. J. Vis. Exp. (117), e54540, doi:10.3791/54540 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter