Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Published: November 11, 2016 doi: 10.3791/54540
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1, 4, 1,5
1Davee Department of Neurology and Clinical Neurosciences, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Center for Molecular Innovation and Drug Discovery, Northwestern University, 3Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 4High Throughput Analysis Laboratory, Department of Molecular Biosciences, Northwestern University, 5Department of Physiology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University
* These authors contributed equally

Summary

Samspelet mellan HCN kanaler och deras hjälp subenhet har identifierats som ett terapeutiskt mål i egentlig depression. Här, en fluorescenspolariserings-baserad metod för att identifiera småmolekylära hämmare av detta protein-proteininteraktion, presenteras.

Abstract

Hyperpolarisation aktiverade cykliska nukleotid-gated (HCN) kanaler uttrycks ubiquitously i hela hjärnan, där de fungerar för att reglera retbarhet av nervceller. Subcellulära fördelningen av dessa kanaler i pyramidala nervceller i hippocampus område CA1 regleras av tetratricopeptide upprepad innehållande Rab8b interagerande protein (TRIP8b), en hjälpenhet. Genetisk knockout av HCN porbildande subenheter eller TRIP8b, båda leder till en ökning av antidepressiv-liknande beteende, vilket antyder att begränsa funktionen av HCN-kanaler kan vara användbara som en behandling för egentlig depression (MDD). Trots betydande terapeutiskt intresse är HCN kanaler också uttrycks i hjärtat, där de reglerar rhythmicity. För att kringgå off-target frågor i samband med att blockera hjärt HCN kanaler, har vårt labb nyligen föreslagit inriktning på protein-proteininteraktion mellan HCN och TRIP8b för att specifikt störa HCN-kanal funktion i hjärnan.TRIP8b binder till HCN porbildande subenheter vid två distinkta interaktionsställen, men här ligger fokus på samspelet mellan tetratricopeptide upprepa (RTB) domänerna av TRIP8b och den C-terminala svansen av HCN1. I detta protokoll ett expanderat beskrivning av en metod för att rena TRIP8b och exekvering av en hög genomströmning skärmen för att identifiera småmolekylära inhibitorer av interaktionen mellan HCN och TRIP8b, beskrivs. Metoden för high throughput screening utnyttjar en Fluorescence Polarization (FP) -baserad analys för att övervaka bindningen av en stor TRIP8b fragmentet till en fluorofor-märkta elva aminosyror lång peptid som motsvarar den HCN1 C-terminala svansen. Denna metod tillåter "träff" föreningar som skall identifieras baserat på förändringen i polarisationen av emitterat ljus. Validerings analyser utförs sedan för att se till att "slå" föreningar är inte artefakter.

Introduction

Hyperpolarisation aktiverade cykliska nukleotid-gated (HCN) kanaler uttrycks i hjärtat och centrala nervsystemet där de spelar en viktig roll i regleringen av membran retbarhet en. HCN kanaler har varit inblandade i patogenesen av egentlig depression (MDD) 2, vilket har lett flera grupper att föreslå att begränsa HCN kanalfunktionen farmakologiskt kan vara effektivt som en ny behandling för egentlig depression tre. Men direkt inriktning HCN kanaler är inte lönsamt på grund av deras viktiga roll i hjärtaktionspotentialen 4. Ivabradin godkände enda FDA HCN kanalantagonist, används för behandling av hjärtsvikt för att producera en Bradykardisk effekt 5. Som sådan, finns det ett behov av farmakologiska medel som begränsar HCN kanalfunktionen uteslutande i det centrala nervsystemet.

Tetratricopeptide upprepad innehållande Rab8b interagerande protein (TRIP8b) är en hjärna specific auxiliär subenhet av HCN kanaler som styr ytan uttryck och lokalisering av HCN kanaler 6,7. Genetisk knockout av TRIP8b orsakar en minskning av hjärn HCN kanaler 7 utan att påverka HCN uttryck i hjärtat åtta. Intressant TRIP8b knockoutmöss spendera mindre tid orörlig på tvångs simma uppgiften och svans fjädring uppgift 7, två vanliga screeningtest för antidepressiva effekten 9-11. Dessa resultat tyder på att i stället för direkt inriktning på HCN-kanaler med en liten molekyl antagonist av HCN-kanal funktion, störa interaktionen mellan TRIP8b och HCN kan vara tillräcklig för att producera antidepressiva-liknande beteende.

TRIP8b binder till HCN vid två distinkta bindningsställen. Den cykliska nukleotid bindande domän (CNBD) av HCN samverkar med en konserverad domän TRIP8b ligger N terminal till RTB domäner TRIP8b 12,13. Även om rester av CNBD som är involverade i dettainteraktion har karte 14, har regionen TRIP8b som är involverad inte har minskat ner förbi en-80-aminosyrafragment 13. En andra interaktion sker mellan tetratricopeptide upprepa (RTB) domänerna av TRIP8b och den C-terminala tripeptiden av HCN ( "SNL" i HCN1, HCN2 och HCN4, men "ANM" i HCN3) 3,12. Den nyligen löst kristallstrukturen 15 i denna C svans interaktion visade betydande strukturell likhet med interaktionen mellan peroxisomal import receptorn, peroxin 5 (PEX5), och dess samverkande partners, som innehåller typ 1 peroxisomala inriktning sekvenser (PTS1) 16.

Även om båda interaktionsställen krävs för HCN-kanal funktion, samspelet mellan TPR domänerna av TRIP8b och den C-terminala tripeptiden av HCN1 tjänar som det dominerande bindningsstället och reglerar HCN ytexpression. Därför var denna interaktion valdes som den målriktade plats i denna studie.För resten av manuskriptet, när det hänvisas till samverkan mellan TRIP8b och HCN, är det detta samspel som hänvisas till. Denna interaktion rekapituleras av en lättlöslig fragment av TRIP8b motsvarar dess bevarade C terminal innehållande TPR domäner som krävs för att binda den C-terminala svansen av HCN (resterna 241-602 av 1a-4 isoformer av TRIP8b) 3.

För att utveckla en hög genomströmning skärmen för att identifiera små molekyler med förmåga att störa denna växelverkan, ett fluorescenspolarisation (FP) -baserad analys användes 17. Fluorescenspolarisation är baserad på exciteringen av en fluorofor-märkt ligand med polariserat ljus, och att mäta graden av polarisation hos den emitterade fluorescensen 18. I närvaro av en bindningspartner, är den roterande rörelsen hos den fluorescerande liganden begränsas och polariserat ljus emitteras 19. I frånvaro av en bindningspartner, than rotationsrörelse av liganden leder till utsläpp av depolariserade ljus.

I den bifogade protokollet, är en metod för rening av N-terminala-taggade (6xHis) TRIP8b (241-602) med användning av nickel-nitrilotriättiksyra (Ni-NTA) pärlor presenteras. Ett liknande protokoll användes för att rena glutation-S-transferas (GST)-märkt C terminala 40 aminosyrorna i HCN1 (HCN1 C40) användes i steg 7 i protokollet. För utrymmesskäl, har en detaljerad beskrivning av detta förfarande utelämnas.

I steg 2 till 7 i protokollet, är en high throughput screening arbetsflöde presenteras (se figur 1). Protein-proteininteraktioner är ett notoriskt svårt mål för high throughput screening och läsare uppmanas att söka ytterligare resurser på ämnet 20.

Steg 2 och 3 i proceduren karakterisera affiniteten av det renade TRIP8b (241-602) in vitro konstruera fora fluorescein isotiocyanat (FITC)-märkt elva aminosyror lång peptid som motsvarar den C-terminala svansen av HCN1 (HCN1 FITC). Baserat på kristallstrukturen för den TRIP8b-HCN-komplex 15, detta elva aminosyrasegment är tillräcklig för att producera bindning med TRIP8b (241-602). I steg 2, är Kd för interaktionen mäts genom att titrera TRIP8b (241-602) till en fixerad koncentration av HCN1 FITC. I steg 3, är en omärkt version av HCN peptiden som används i steg 2 titreras till en fast koncentration av både TRIP8b (241-602) och HCN1 FITC att undersöka om FITC-tagg stör bindningen. Dessa experiment är viktigt att välja lämpliga koncentrationer av TRIP8b (241-602) och HCN1 FITC används i hög genomströmning skärm.

Utgångspunkten för hög genomströmning skärm är att en liten molekyl som kan störa interaktionen mellan TRIP8b (241-602) och HCN1 FITC kommer att producera en Decemberrease i polariserat ljus. I steg 4 är Z-faktorn hos analysen beräknad 21 för en given koncentration av TRIP8b (241-602) och HCN1 FITC att säkerställa att analysen är lämplig för högeffektiv screening (steg 5). Steg 6 och 7 är validerings analyser för att bekräfta att de träffar som identifierats i den primära hög genomströmning skärm agerar genom att störa växelverkan mellan TRIP8b (241-602) och HCN1 FITC snarare än genom en ospecifik mekanism. I steg 6, carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) -märkt HCN1 peptid (HCN1 TAMRA) används i en i övrigt identisk fluorescenspolarisationsanalys att filtrera fluorescerande föreningar som äventyrar FP-analys med hjälp av FITC-taggen. Steg 7 utnyttjar en större HCN1 C-terminala fragment (HCN1 C40) och sysselsätter en vulst baserad närhetsanalys, som är baserad på den "tunnling" av en singlett-syre från en donator vulst till en acceptor bead bringas nära varandra genom interagerande proteiner 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rening av TRIP8b (241-602) Protein

  1. Omvandla plasmiden innehållande TRIP8b (241-602) i den bakteriella proteinexpressionsvek pGS21 3 in i kompetenta E. coli för proteinuttryck enligt tillverkarens anvisningar. Plattan 300 ul av odlingen på Luria-buljong (LB) -agar med 5 | j, g / ml av kloramfenikol och ampicillin. Inkubera plattan vid 37 ° C under 16 h.
  2. Nästa dag, plocka en enda koloni för att ympa 50 ml LB med 50 | ig / ml kloramfenikol och ampicillin. Inkubera kulturen vid 37 ° C under 16 h (med skakning).
  3. Tillsätt 50 ml kultur till en L LB med 50 | j, g / ml ampicillin. Inkubera vid 37 ° C med skakning.
  4. När kulturen har nått en OD 600 läsning av 0,8-1,2, ändra temperaturen i inkubatorn till 18 ° C och tillsätt IPTG (isopropyl-beta-D-tiogalaktosid) till en slutlig koncentration av 1 mM. Medge proteinexpression fortgå under 16 h.
  5. Spinn ner E. coli vid 6000 xg under 15 min vid 4 ° C för att pelletera bakterierna. Efter avlägsnande av rören från centrifugen, hålla bakterierna på is för återstoden av förfarandet. Resuspendera bakterier i 36 ml av buffert A med 0,25 mM fenylmetansulfonylfluorid (PMSF).
  6. Sonikera resuspenderade bakterierna på is med hjälp av en platt skruv för 5-10 min, omväxlande mellan 30 sekunder "på" och 30 sekunder "av" med hög effekt.
  7. Centrifugera vid 12.000 xg under 15 min vid 4 ° C. Centrifugera under ytterligare 15 min om supernatanten är inte klart ännu.
  8. Tillämpa supernatanten till en kolonn av 2 ml Ni-NTA-pärlor. Inkubera i 60 min vid 4 ° C med försiktig skakning.
  9. Tillåt det obundna materialet att strömma genom kolonnen och tvätta med 500 ml buffert A.
  10. Tvätta kolonnen med 250 ml buffert B.
  11. Tvätta kolonnen med 125 ml buffert A kompletterad med 5 mM imidazol.
  12. Eluera proteinet from kolonnen med 20 ml elueringsbuffert.
  13. Lägga det eluerade proteinet till en dialyskassett (Molekylvikt cutoff - 10 kDa) med användning av en spruta. Dialysera protein för 60 min i 4 L av kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 4 ° C.
  14. Flytta dialyskassetten i en ny 4 L hink med kallt PBS. Dialysera protein under 16 timmar vid 4 ° C.
  15. Nästa morgon, ta proteinkoncentrationen med användning av en Coomassie-proteinanalyssats, enligt tillverkarens instruktioner. Koncentrera proteinet med användning av ett protein-koncentrator, enligt tillverkarens instruktioner, om en koncentration under 40 | iM observeras. Alikvot och frys vid -80 ° C för lagring.

2. Småskalig fluorescenspolarisationsanalys för att karaktärisera interaktionen av två protein Fragment

  1. Tina 200 pl 40 pM TRIP8b (241-602) och lägga till en 1,5 ml rör. Tillsätt 100 pl av PBS till 11 ytterligare 1,5 ml rör.
  2. Utför seriespädningar genom att överföra 100 pl TRIP8b (241-602) från den ursprungliga röret till nästa rör i serien, pipettera upp och ned och upprepning av processen. Detta kommer att producera en 12-punkters serie av två-faldiga spädningar av TRIP8b (241-602) som sträcker sig från 0,01 till 40 ^ M.
  3. Bered en 650 | il huvudblandning av 0,1 jiM HCN1 FITC (6,5 | il av en 10 pM alikvot) och 2 mM ditiotreitol (DTT) i PBS.
    Obs! Master Mix är 2x.
  4. Inrätta 12 nya 1,5 ml rör. Tillsätt 50 pl av masterblandning innehållande HCN1 FITC till varje rör, och sedan lägga till 50 l från vardera av de 12 seriespäd.
    Obs: Detta kommer att generera 12 rör, vardera innehållande 0,05 iM HCN1 FITC och hälften av koncentrationen av TRIP8b (241-602) från den ursprungliga seriespädning.
  5. Lägga utspädningsserien till en analysplatta, 30 ul per brunn, i triplikat. Använd en låg bindning fast svart 384-brunnar.
  6. Snurra plattan feller 2 min vid 900 xg vid RT.
  7. Läs plattan med användning av en mikroplattläsare, genom att följa tillverkarens instruktioner. Mät fluorescenspolarisationen med följande mätparametrar: 485 nm excitation, 530 nm emission, 505 nm dikroisk spegel, 100 ms integrationstiden.
  8. Plotta polarisering (mp) värden kontra TRIP8b (241-602) koncentration på en logaritmisk skala. Passar data med Hill-ekvationen för att bestämma affiniteten (Kd) av TRIP8b (241-602) för den märkta HCN1 peptiden.
    Anmärkning: För framställning av de serieutspädningar kan en platta med flera brunnar också användas i stället för rör.

3. Undersök protein-proteininteraktion med hjälp av en positiv kontroll

  1. Tillsätt 200 pl av omärkt HCN1 peptid (200 | iM) till ett 1,5 ml rör. Tillsätt 100 pl av PBS till 11 ytterligare 1,5 ml rör. Utför seriespäd genom att överföra 100 ul från röret innehållande 200 pl peptid till det första röretav 100 | il PBS. Upprepa processen för att generera 12 rör med 2-faldiga utspädningar av omärkt HCN1 peptid.
  2. Förbered en 650 pl mästare blandning av 0,2 iM HCN1 FITC och 4 iM TRIP8b (241-602).
    Notera: Detta är en 2 x lösning.
  3. Tillsätt 50 pl av masterblandning till 12 nya 1,5 ml rör.
  4. Tillsätt 50 fil av varje seriespädning till en 1,5 ml rör.
  5. Fyll den svarta 384 brunnar mikrotiterplatta i tre exemplar, lägga 30 ul per brunn.
  6. Centrifugera plattan under 2 min vid 900 xg vid RT.
  7. Läs plattan med hjälp av en mikroplattläsare kan FP. Använd samma inställningar som beskrivs i steg 2,7.
  8. Beräkna affiniteten hos omärkt peptid för TRIP8b (241-602) med användning av Cheng-Prusoff-ekvationen: K ^ 1 = IC50 / (1 + [L] / Kd 2), där K ^ 1 representerar affiniteten hos den omärkta peptid för TRIP8b (241-602), IC 50 bestäms i det föregående stegetoch representerar förmågan hos omärkt ligand för att undantränga den märkta liganden, [L] är koncentrationen av den märkta liganden i steg 3,2, och K ^ 2 är affiniteten hos TRIPb (241-602) för den märkta liganden.

4. Utvärdera Analysprestanda (Beräkna Z Factor)

  1. Förbered en mästare blandning genom att göra en 12 ml lösning av FP buffert med två iM TRIP8b (241-602), 50 nM HCN1 FITC, och 1 mM DTT i FP buffert.
    Obs: Detta kommer att kräva 60 pl 40 pM TRIP8b (241-602), 60 pl 10 pM HCN1 FITC och 1080 il FP buffert.
  2. Tillsätt 30 pl av mastermixen till varje brunn i en svart 384-brunnars mikrotiterplatta.
  3. Tillsätt 1 pl av 1 mM omärkt HCN1 peptid till 192 brunnar för att fungera som en positiv kontroll.
  4. Tillsätt 1 pl av FP-buffert till 192 brunnar för att fungera som en negativ kontroll.
  5. Centrifugera plattan under 2 min vid 900 xg vid RT.
  6. Läs plattan med användning av en microplate läsare.
  7. Beräkna Z faktor för analys med användning av följande formel: Z = 1 - 3 * (σ pos -σ neg) / (μ neg -μ pos) där σ pos och σ neg är standardavvikelserna för de positiva och negativa kontrollbrunnar och μ pos och μ neg representerar de genomsnittliga signalerna i de positiva och negativa kontrollbrunnar.

5. hög genomströmning skärm

  1. Tina portioner av TRIP8b (241-602) och HCN1 FITC och hålla dem på is.
  2. Förbered 10 ml TRIP8b (2 M) och HCN1 FITC (50 nM) i FP-buffert.
  3. Dispensera 25 | il av blandningen i varje brunn i en låg bindnings 384-brunnars svart mikrotiterplatta med hjälp av en pipett.
  4. För biblioteksscreening, lägga till föreningar i varje brunn i kolumnerna 3-22 (40 pM slutlig koncentration för varje) med användning av en akustisk vätskehanterare.
    Obs: På grund av relatively låg träff observerats med denna analys, användes två olika föreningar poolades i en enda brunn. De båda föreningarna från varje aktiv brunn testades därefter individuellt för att identifiera vilka tilldelats aktiviteten.
  5. Tillsätt 100 nl av dimetylsulfoxid (DMSO) i varje brunn i kolumnerna 1 och 23 hos varje platta som negativa kontroller.
  6. Lägga omärkt HCN1 peptid i varje brunn i kolumnerna 2 och 24 hos varje platta som positiva kontroller.
  7. Inkubera plattorna vid RT under 2 h. Läs plattor eller inkubera vid 4 ° C under 16 timmar innan behandlingen.
  8. Mäta fluorescenspolarisationen på en plattläsare. Använd samma inställningar som beskrivs i steg 2,7.
  9. Beräkna procentuell inhibering genom att normalisera signalerna genom att använda den genomsnittliga positiva och negativa kontroller från varje platta som 100%. Använd ekvationen XN = 100% * ((X neg - X) / (X neg - X pos)) där X N är den normaliserade procentuella inhibitionen motsvarande signal X, X pos neg är signalen från de negativa kontrollbrunnarna.

6. Bekräftelse av Hits Använda TAMRA-märkta HCN peptid

  1. Validate träffar med över 50% hämning med hjälp av TAMRA-märkt HCN1 peptid (HCN1 TAMRA).
    1. Förbered en mästare blandning av 12 ml 2 ^ M TRIP8b (241-602) och 50 nM HCN1 TAMRA i FP-buffert.
    2. Dispensera 25 pl av mastermixen i varje brunn i en svart 384-brunnars mikrotiterplatta.
    3. Överför serieutspädningar av varje aktiva föreningar i respektive brunnar. Gör två-faldiga spädningar så att koncentrationen av varje träff varierar från 0,2 pM till 200 pM.
    4. För de negativa kontrollreaktioner, överföra 100 nl av DMSO i varje brunn. För den positiva kontrollen tillsätt 100 nl av seriellt utspätt omärkt HCN1 peptid med slutlig koncentration som sträcker sig från 200 pM till 0,1 pM.
    5. Inkubera plattan vid RTunder 2 h. Avläs plattorna eller inkubera i 16 timmar vid 4 ° C innan behandlingen.
    6. Mät fluorescenspolarisation (mp) med följande mätparametrar: 535 nm excitation; 580 nm emission; 535 nm dikroisk spegel, 20 ms integrationstid.
    7. Beräkna IC 50-värden genom att montera den koncentrationsberoende FP data för varje förening med användning av en fyra-parameter olinjär regressionsmodell 23.

7. Dos-svars Validering av Bead-baserade Proximity Assay

  1. Tina en alikvot av His-märkt TRIP8b (241-602) (His-TRIP8b) och GST-märkt HCN1 (GST HCN1 C40) fusionsproteiner och hålla dem på is.
  2. Kombinera His-TRIP8b med GST-HCN1 C40 i analysbuffert vid koncentrationer av 400 nM His-TRIP8b och 40 nM GST HCN1 C40. Förbereda 300 ul av blandningen för varje förening som skall testas.
    Obs: Föreningar körs i tre exemplar på 11 olika koncentrationer plus en DMSO kontroll (ingen förening).
  3. För kontrollbrunnarna, förbereda 30 pl His-TRIP8b (200 nM) utan GST-HCN1C40 och sedan separat framställa 30 pl GST-HCN1C40 (20 nM) utan His-TRIP8b i analysbuffert.
  4. För varje förening som skulle testas, tillsätt 7 pl av His-TRIP8b: GST-HCN1 C40-blandning (framställd i steg 7.2 ovan) till 36 brunnar i en platta med användning av en 16-kanals pipett. För provning av en enda förening, ställa upp de 12 olika koncentrationer i rader AL och de tre replikaten i kolumnerna 1-3. Lägg 7 pl av His-TRIP8b lösning (framställd i 7,3) kolumner 1-3 av rad M och 7 pl GST-HCN1 C40-lösning (framställd i 7,3) och kolonnerna 1-3 av rad N. centrifugera kort plattan säkerställa de vätskor är på botten av varje brunn och för att avlägsna eventuella bubblor.
  5. Dispensera träff föreningar som skall testas i plattan så att koncentrationen av varje träff varierar från 200 ^ M (i rad A) ned till 0,1 ^ M (i rad K). Dispensera en volym avDMSO i rader LN som matchar den mängd förening som dispenseras i rader AK.
  6. Skaka plattan under 2 min och inkubera i 2,5 h vid RT.
  7. Späd anti-GST acceptor pärlor 1:50 med analysbuffert.
  8. Tillsätt 3,5 pl av den utspädda acceptor pärlor till varje brunn i plattan med en 16-kanals pipett och blanda genom att försiktigt pipettera att undvika att skapa bubblor.
  9. Inkubera plattan under 1 timme vid RT i mörker.
  10. Späd Nickel Chelate givar pärlor 1:50 med analysbuffert. Utsätt inte blandningen för ljus.
  11. Tillsätt 3,5 pl av den utspädda givar pärlor till varje brunn i plattan med en 16-kanals pipett och blanda genom att försiktigt pipettera att undvika att skapa bubblor.
  12. Inkubera plattan under 1,5 h vid RT i mörker.
  13. Avlästes på en plattläsare. Använd en plattläsare med följande mätparametrar: 40 ms excitation tid, 100 ms tid utsläpp, 0,1 mm höjd upptäckt.
  14. Beräkna IC 50-värden genom att montera data för EACh föreningen med användning av en fyra-parameter nonlinear regression model 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att undvika upphovsrättsfrågor med vår tidigare publikation, var en TAMRA-märkt sond HCN1 TAMRA används för att generera figurerna 2 och 3. Observera att denna substitution inte göra en märkbar skillnad i resultaten, och protokollen är identiska med de som beskrivs ovan med HCN1 FITC. För att bedöma interaktionen med HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602) titrerades till en fast koncentration av HCN1 TAMRA använder det protokoll som beskrivs i steg 2 (Figur 2). Härnäst tillsattes experimentet beskrivs i steg 3 utförs och omärkt HCN1 peptid titrerades in i en fixerad koncentration av TRIP8b (241-602) och HCN1 TAMRA (Figur 3).

För att verifiera att analysen var lämplig för höghastighetsscreening, dess prestanda var nästa granskats av protokollet i steg 4; och en Z faktor på 0.89 erhölls, vilket indikerar att analysen var redo för högeffektiv screening (Figur 4). Därefter tillsattes en 20.000 förening liten molekyl bibliotek screenades genom det förfarande som beskrivs i steg 5. Alla föreningar, som har procentuella inhiberingen över 50% testades sedan i den andra FP-analys med HCN1 TAMRA (steg 6). Slutligen var de bekräftade träffar testas i pärlan baserade Proximity Assay (steg 7, fig 5). En träff förening, NUCC-5953, identifierades som ett resultat av dessa experiment.

Figur 1
Figur 1: HTS arbetsflöde Schematisk beskriver arbetsflödet för högkapacitetstestning.. Diagram intäkterna från topp till botten, med varje triangel representerar ett steg i protokollet. Klicka här för att se enstörre version av denna siffra.

figur 2
Figur 2:. Kd av protein-proteininteraktion (A) Schematisk visar experimentet som beskrivs i steg 2. Som TRIP8b (241-602) titreras in i en fixerad koncentration av HCN1 TAMRA, RTB domänerna av TRIP8b (i grått) binder till 11 aminosyrapeptid (i svart, med terminal "SNL" markerat). (B) När koncentrationen av TRIP8b (241-602) ökar, fler HCN1 TAMRA molekyler bli bundna och polarisering ökar (Kd = 0.320.01μM). Felstaplar betecknar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 Figur 3:. IC50 av positiv kontroll (A) Schematisk demonstrera experimentella paradigm för steg 3. Såsom omärkt HCN1 peptid titreras in i en fixerad koncentration av TRIP8b (241-602) och HCN1 TAMRA, är den märkta peptiden förskjuts. (B) Notera att signalen minskar då koncentrationen av omärkta HCN1 ökar, vilket indikerar förskjutning av HCN1 TAMRA (IC50 = 1.070.08μM). Felstaplar betecknar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4:. Representativa resultat från HTS (A) Resultat från hög genomströmning sc reen utfördes med användning av protokoll som beskrivs i steg 5. Varje punkt i diagrammet representerar en enda förening. X- och Y-koordinater bestäms av den procentuella hämningen i varje körning. (B) Resultat från skärmen ritas med positiva och negativa kontroller (se legenden). Varje förening genomsnittliga procentuella hämningen (över två körningar av analysen) plottas på Y-axeln. (C) Resultat från bekräftande FP experiment med hjälp av en TAMRA-märkt HCN1 peptid. Föreningar som visar större än 50% inhibition i steg 5 användes sedan i steg 6. Som i (A), X- och Y-koordinaterna bestäms av den procentuella hämningen i två körningar av analysen. Reproduceras från et al. Han 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

40 / 54540fig5.jpg "/>
Figur 5:. Bead-baserade Proximity Assay (A) Schematisk visar vulsten baserade närhetsanalys. TRIP8b (241-602) innehåller en N-terminala hexahistidinmarkör som binder Nickel Chelate donator pärlor (cirkel med ränder). HCN1 C40 innehåller en N-terminala GST tagg som binder acceptor pärlor. När de bringas i närhet genom samverkan av de TPR domänerna av TRIP8b och den C-terminala tripeptiden av HCN1, excitation av donator vulsten med 680 nm våglängd ljus producerar singlettsyre. Detta singsyre överför energi till acceptorn pärlor inom en definierad radie och leder till utsläpp av ljus. (B) Titrering av ökande koncentrationer av träffen föreningen (NUCC-5953) till en fixerad koncentration av TRIP8b (241-602) och HCN1 C40. Reproduceras från Han et al. 3. Felstaplar betecknar standardavvikelse.target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grund av dess potential som ett terapeutiskt mål i MDD 24, har det funnits ett stort intresse för farmakologiska metoder som motverkar HCN-kanal funktion i det centrala nervsystemet 4. Emellertid har dessa ansträngningar har stannat av den viktiga roll som HCN kanaler i hjärtPaceMaking och risken för arytmi 25. Vi resonerade att störa interaktionen mellan HCN och dess hjärna specifik auxiliär subenhet, TRIP8b 8, kan vara tillräcklig för att producera antidepressiva-liknande effekter utan att påverka hjärt HCN kanalerna 3. Denna hypotes förstärks av observationen att möss som saknar TRIP8b uppvisar antidepressiv-liknande beteende 7. Targeting denna interaktion kan bli ett nytt paradigm för behandling av MDD.

En detaljerat protokoll för att identifiera småmolekylära inhibitorer av interaktionen mellan TPR domänerna av TRIP8b och den C-terminala tripeptiden av HCN1 ärpresenterats ovan. För att underlätta dess allmän giltighet, här beskriver vi våra resonemang som ledde till utvecklingen av denna analys. Även TRIP8b binder till HCN subenheter på två platser, har vi fokuserat på samspelet mellan RTB domäner TRIP8b och den C-terminala svansen av HCN. Den strukturella klarläggande av denna interaktion genom röntgenkristallografi avslöjade en djup ficka som bildas av de TPR domänerna av TRIP8b runt den C-terminala av HCN 15. Den andra TRIP8b-HCN samverkan sker mellan en 80 aminosyrasträcka TRIP8b (finns N terminal till RTB domäner) och cykliska nukleotid bindande domän av HCN. Denna interaktion inträffar över många olika aminosyror av varje protein och utgör en diffus yta med färre väl definierade intermolekylära interaktioner 26. Baserat på dessa strukturella observationer, resonerade vi att interaktionen mellan TPR domänerna av TRIP8b och den C-terminala av HCN är mer mottagliga för störningar genom en liten molekyl inhiutställaren.

Inledningsvis var ett större fragment av TRIP8b användes i analysen baseras på antagandet att en längre konstruktionen kan ha allosteriska regulatoriska platser och öka chansen till framgång. Fullängds TRIP8b ursprungligen användes, men detta tillvägagångssätt har begränsats av protein aggregering, nedbrytning och känslighet för frysupptiningscykler. Därefter två mellanstora TRIP8b konstruerar, en längre (resterna 219-602) och en kortare (resterna 259-602), testades innan en mellanliggande konstruktion (rester 241-602) valdes. Även om var och en av de fyra trunkeringar som beskrivs ovan innehåller de TPR områden av betydelse för bindning till den C-terminala av HCN, endast den mellanliggande längd klonen (241-602) var tillräckligt stabila för användning i screeningsanalyser. I synnerhet, har vi kunnat erhålla stora kvantiteter av proteinet efter rening genom Ni2 + affinitetskromatografi utan ytterligare separationssteg.

efter choosing en lämplig fragment av TRIP8b och HCN, nästa bestämmas vi affiniteten hos den märkta HCN1 peptid för TRIP8b (241-602). Som en allmän regel, kan en noggrann mätning endast göras om koncentrationen av liganden är väsentligen under den K D i bindningspartner 28. I vårt fall har vi använt 50 nM märkt HCN1 peptid för experimentet i steg två, och fick en Kd 0.320.01μM. För mer experimentell design överväganden rörande protein-proteininteraktioner, är läsarna hänvisas till ett av flera utmärkta recensioner på ämnet 27-30.

När vi bestämde Kd för den märkta HCN1 peptid för TRIP8b (241-602), vi sedan bestämmas om själva etiketten stör bindningen. I steg 3, erhöll vi ett IC50-värde av 1.070.08 pM genom att titrera en omärkt HCN1 peptid till en fast koncentration av TRIP8b (241-602) för att undantränga den märkta peptiden. Kombinerat med K D i märkt peptid för TRIP8b (241-602), och med tillämpning av Cheng-Prusoff-ekvationen, då uppskattade vi affiniteten hos omärkt peptid för TRIP8b (241-602) som K D = 0.93μM. Detta är i nära samförstånd med affinitet TRIP8b (241-602) för den märkta peptiden, och föreslår att märka peptiden inte väsentligt påverkade dess affinitet till TRIP8b. Ett viktigt särdrag hos fluorescenspolarisation-baserad skärm är dess utmärkta signal-brusförhållande som indikeras av en Z faktor på 0,89. Med andra parametrar lika, är magnituden av förändringen i FP-signalen bestäms av storleken av bindningspartner (TRIP8b (241-602)) och storleken av fluoroforen-märkt ligand. En förändring av polarisering (44-224 mp) observerades med 11 aminosyror peptidligand mellan dess fria och bundna tillstånd med ~ 42 kDa TRIP8b (241-602) protein är tillräcklig för att återskapa den riktade interaktion och ger en tillräcklig dynamiskt omfång för biblioteksscreening.

ntent "> En av utmaningarna i alla high throughput screening analys skilja sant träff föreningar från artefaktuella förändringar i signalstyrka. I fluorescenspolarisation baserade skärmar, är det vanligt att många föreningar antingen interagera direkt med fluoroforen eller fluorescerar på sina egna. för att kringgå dessa frågor, en tvåstegs screeningförfarande med två olika fluoroforer beskrivs ovan. Detta förfarande minskar sannolikheten för att fluorescerande föreningar och föreningar interagerar direkt med fluoroforen kommer att avancera genom screening process. Förutom att binda fluoroforen vissa föreningar verkar som "sammanställare" in vitro och leda till ospecifika förändringar i fluorescenspolarisationen signalen. dessa föreningar tros bilda tvättmedelskänsliga micellära strukturer och hämmar protein-proteininteraktioner 31,32. för att mildra dessa effekter, är det viktigt att fluorescenspolarisationen buffert som används i det högathroughput screening protokoll som beskrivs ovan innefattar en detergent (Triton), även om ytterligare verifiering med andra rengöringsmedel bör övervägas.

Det bör noteras att det finns flera viktiga begränsningar av screeningsförfarandet som beskrivits ovan. Även TRIP8b binder till HCN i två platser, skärmen som beskrivs ovan undersöker bara en interaktion plats och kommer inte att identifiera små molekyler som riktar sig CNBD interaktion. På samma sätt kommer föreningar som allosteriskt modulera TRIP8b bindning till HCN genom att interagera med TRIP8b i den N-terminala regionen inte identifieras som träffar. Båda dessa överväganden är resultatet av att använda en mindre TRIP8b fragmentet (se ovan), som säkerställer reproducerbarheten i screeningsanalyserna som beskrivs i förfarandet. För att undvika dessa begränsningar kan framtida insatser riktas på att använda en cellbaserad skärm som innehåller fullängds HCN och TRIP8b konstruktioner 33,34. Denna typ av skärm kan åberopa hög throughput elektrofysiologiska metoder för att identifiera föreningar med förmåga att störa interaktionen mellan HCN och TRIP8b, och begränsa uttrycket av HCN-kanaler vid cellytan. Notera närmar som dessa skulle behöva innefatta kontra skärmar för att säkerställa att små molekyler inte direkt begränsande HCN-kanal funktion som antagonister, eftersom detta skulle kunna leda till off mål effekter in vivo.

Även HCN1, HCN2 och HCN4 alla har en konserverad "SNL" C-terminala peptid, resterna N terminal till denna tripeptid varierar avsevärt och sannolikt påverkar TRIP8b bindningsaffiniteten. Detta ökar möjligheten att en liten molekyl hit erhållits genom skärmen eller utformas baserat på andra drabbade föreningar kan ge HCN isoform specificitet i att störa TRIP8b-HCN interaktion. I den ursprungliga skärmen, var NUCC-5953 identifierats som den första lilla molekyl som kan störa växelverkan mellan TRIP8b och HCN1 3. framtida work med denna analys kan identifiera ytterligare småmolekylinhibitorer med önskvärda kemiska egenskaper för läkemedelsutveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ni-NTA agarose  Qiagen 30210
Dialysis cassette  ThermoFisher 66456
Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside  Sigma-Aldrich I5502 - 1 gr
384-Well Black plate  Corning 3820
Proxiplate  Perkin-Elmer  6008289
Anti-GST Acceptor beads  Perkin-Elmer  6760603C
NiChelate Perkin-Elmer  AS101D
pGS21-a Genscript SD0121
PMSF Sigma-Aldrich 10837091001
Coomassie Kit ThermoFisher 23200
Protein concentrator ThermoFisher 88527
Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader Perkin-Elmer  #2300-001M
BL21 (DE3) Competent Cells Agilent 200131

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
  2. Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders? Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).
  3. Han, Y., et al. Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels. J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).
  4. Postea, O., Biel, M. Exploring HCN channels as novel drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).
  5. Stieber, J., Wieland, K., Stöckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors. Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).
  6. Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction. J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).
  7. Lewis, A. S., et al. Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice. J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).
  8. Heuermann, R. J., et al. Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy. Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).
  9. Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).
  10. Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity. Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).
  11. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice. Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  12. Han, Y., et al. Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites. J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).
  13. Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP. J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).
  14. Saponaro, A., et al. Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).
  15. Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).
  16. Gatto, G. J. Jr, Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5. Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).
  17. Owicki, J. C. Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer. J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).
  18. Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
  19. Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).
  20. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Eglen, R. M., et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).
  23. Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. , Worth Publishers. New York. (2000).
  24. Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors. Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).
  25. Wahl-Schott, C., Biel, M. HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function. Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).
  26. DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b. Structure. 23 (4), 734-744 (2015).
  27. Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).
  28. Prinz, H. Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms. J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).
  29. Pollard, T. D. A Guide to Simple and Informative Binding Assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  30. Rossi, A. M., Taylor, C. W. Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization. Nat Protoc. 6 (3), (2011).
  31. Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -W. Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors. J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).
  32. McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening. J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).
  33. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  34. Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).

Tags

Biokemi High-throughput screening läkemedelsutveckling protein-proteininteraktioner fluorescenspolarisation HCN TRIP8b
Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, Y., Lyman, K. A., Clutter, M.,… More

Han, Y., Lyman, K. A., Clutter, M., Schiltz, G. E., Ismail, Q. A., Cheng, X., Luan, C. H., Chetkovich, D. M. Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b. J. Vis. Exp. (117), e54540, doi:10.3791/54540 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter