Summary
HCN通道和其辅助亚基之间的相互作用已被确定为在抑郁症的治疗靶点。这里，用于识别这种蛋白质 - 蛋白质相互作用的小分子抑制剂荧光基于偏振的方法，提出。
Abstract
超极化激活环核苷酸门控（HCN）频道整个大脑，在那里它们起作用来调节神经元的兴奋遍在表达。海马CA1区锥体细胞这些通道的亚细胞分布由三十四肽含有重复-Rab8b相互作用蛋白（TRIP8b），辅助亚基调节。 HCN的遗传敲除孔形成亚基或TRIP8b，既导致增加抗抑郁样行为，这表明限制HCN通道的功能可以是作为用于抑郁症（MDD）的治疗是有用的。尽管显著治疗意义，HCN通道也都在心脏，在那里它们调节节律性表达。规避与阻断心脏HCN通道相关联的脱靶的问题，我们的实验室最近提出靶向为了专门破坏HCN通道功能在大脑HCN和TRIP8b之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用。TRIP8b结合HCN孔形成在两个不同的相互作用位点亚基，尽管这里的重点是TRIP8b的三十四肽重复（TPR）结构域和HCN1的C-末端尾部之间的相互作用。在这个协议中，一种方法的用于纯化TRIP8b并执行高通量筛选，以鉴定HCN和TRIP8b之间的相互作用的小分子抑制剂的扩展的说明中，进行说明。用于高通量筛选的方法，利用荧光偏振（FP）为基础的测定以监测大TRIP8b片段荧光团标记十一结合氨基酸对应于HCN1 C端尾酸肽。基于在发射的光的偏振的变化，以确定该方法允许'命中'的化合物。然后进行验证试验，以确保'打'的化合物不是人为的。
Introduction
超极化激活环核苷酸门控（HCN）频道在心脏和中枢神经系统，其中它们起到调节膜兴奋1中起重要作用表示。 HCN通道有牵连抑郁症（MDD）2，这导致几个组提议限制性HCN通道功能的药理学可以有效地作为一种新型治疗MDD 3的发病机制。然而，直接针对HCN通道是因为它们在心脏动作电位4重要的作用并不可行。伊伐布雷定，唯一的FDA批准的HCN通道拮抗剂，用于心脏衰竭，以产生一个心动过缓作用5的治疗。因此，有必要为限制HCN通道在中枢神经系统专门功能的药理学试剂。
Rab8b相互作用蛋白（TRIP8b）三十四肽重复含，是一种大脑特定FIC HCN通道控制HCN通道6,7的表面表达和定位的辅助亚基。 TRIP8b基因敲除导致而不影响心脏HCN 8表达降低大脑HCN通道7。有趣的是，TRIP8b基因敲除小鼠花强迫游泳任务，尾吊任务7，两种常用的筛选试验的抗抑郁疗效9-11时间少动。这些结果表明，而不是直接靶向HCN通道与HCN通道功能的小分子拮抗剂，扰乱TRIP8b和HCN之间的相互作用可以是足以产生抗抑郁样行为。
TRIP8b结合氰化氢在两个不同的结合位点。 HCN的环核苷酸结合结构域（CNBD）与TRIP8b位于N端的到的TRIP8b 12,13的TPR结构域的保守结构域相互作用。虽然所涉及在此CNBD的残相互作用已经映射14，即所涉及的TRIP8b的区域还没有被缩小之外的80个氨基酸的片段13。 TRIP8b的三十四肽重复（TPR）结构域和HCN的C末端三肽（'SNL'在HCN1，HCN2和HCN4，而是“ANM”在HCN3）3,12之间发生的第二交互作用。本C尾相互作用的最近解析晶体结构15揭示实质结构相似性的过氧化物酶体导入受体之间的相互作用，peroxin 5（PEX5），和其相互作用伙伴，含有1型的过氧化物酶体靶向序列（PTS1）16。
虽然两者相互作用位点所必需的HCN通道功能，TRIP8b的TPR结构域和HCN1的C-末端三肽之间的相互作用作为主导结合位点和调节HCN表面表达。因此，这种相互作用被选为本研究中的定位点。为原稿，当提及到TRIP8b和HCN之间的相互作用制成的其余部分，它是这种相互作用正在提及。这种相互作用是由TRIP8b的对应于含有它的保守C端结合的HCN的C-末端尾部（残基的第1a-4同种型TRIP8b的241-602）3所需的TPR结构域的高可溶性片段概括。
为了开发高通量筛选，以确定能够破坏这种互动的小分子，荧光偏振（FP）为基础的测定采用17。荧光偏振是基于与偏振光，并测量发射的荧光18的偏振度的荧光团标记的配体的激励。在结合伴侣的存在，所述荧光配体的旋转运动被约束和偏振光发射19。在没有一个结合伴侣，T他的配位体的旋转运动导致去极化光的发射。
在封闭的协议，提出了N末端标记（的6xHis）TRIP8b使用镍氮基三乙酸（的Ni-NTA）珠粒纯化（241-602）的方法。一个类似的协议是用来净化该协议的步骤7中使用的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）-taggedçHCN1端40个氨基酸（HCN1 C40）。出于空间考虑，省略该步骤的详细描述。
在步骤2到协议的7，高通量筛选工作流提出了（ 见图1）。蛋白质-蛋白质相互作用的高通量筛选出了名的困难的目标，并建议读者去寻找关于这个专题的20个额外的资源。
步骤2和步骤3表征纯化TRIP8b（241-602） 的体外构建亲和力FO岭异硫氰酸荧光素（FITC）-tagged对应HCN1（HCN1 FITC）的C-末端尾部11个氨基酸的肽。基于所述TRIP8b-HCN络合物15的晶体结构该11氨基酸片段是足以产生与TRIP8b（241-602）的结合。在步骤2中，相互作用的K个d由滴定TRIP8b（241-602）插入HCN1 FITC的固定浓度测定。在步骤3，在步骤2中使用的氰化氢肽的未标记的版本滴定到两个TRIP8b（241-602）和HCN1 FITC的固定浓度如果FITC标记具有结合干扰检查。这些实验都是在选择高通量筛选使用TRIP8b（241-602）和HCN1 FITC的适当浓度是必不可少的。
高通量筛选的前提是能够扰乱TRIP8b（241-602）和HCN1 FITC之间的相互作用将产生一个分解的小分子rease在偏振光。在步骤4中，测定的Z因子计算21 TRIP8b（241-602）和HCN1 FITC的给定浓度，以确保该测定是适当的高通量筛选（步骤5）。步骤6和7是验证实验，以确认在初级高通量筛选中鉴定的命中通过破坏TRIP8b（241-602）和HCN1 FITC之间，而不是通过非特异性机制的交互作用。在步骤6中，carboxytetramethylrhodamine（TAMRA）标记的HCN1肽（HCN1 TAMRA）是在其它方面相同的荧光偏振测定法用于筛选危及使用FITC标记的FP试验的荧光化合物。步骤7使用较大HCN1 C端片段（HCN1 C40）并采用基于珠子的亲近测定，这是基于从供体珠子单线态氧的“隧道”由相互作用的蛋白质带到彼此接近的受体珠22。
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Protocol
1. TRIP8b（241-602）蛋白的纯化
- 变换含TRIP8b（241-602）中的细菌蛋白表达载体pGS21 3到感受态质粒大肠杆菌用于根据制造商的说明蛋白的表达。板300微升上卢里亚肉汤（LB）文化 - 琼脂用5微克/毫升氯霉素和氨苄西林。孵育在37℃的板16小时。
- 第二天，挑取单个菌落接种50毫升LB用50微克/毫升氯霉素和氨苄西林。孵育在37℃下培养16小时（振荡）。
- 50ml培养添加到1升的LB用50微克/毫升氨苄青霉素的。在37℃孵育振荡。
- 一旦培养达到的OD 600读数的0.8-1.2，培养箱的温度改变到18℃，并添加IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）至1mM的终浓度。允许蛋白质表达进行16小时。
- 降速E.大肠杆菌在4℃6000×g离心15分钟以沉淀细菌。从离心机取出管后，保持细菌在冰上的过程的剩余。重悬于36毫升缓冲液A的细菌与0.25毫米的氟苯甲（PMSF）。
- 超声处理用扁平螺栓在冰上再悬浮细菌5-10分钟，“上”在高功率和30秒“关”30秒之间交替。
- 离心机以12,000 xg离心在4℃下15分钟。离心额外15分钟，如果上清液尚不清楚。
- 适用上清液至2ml的Ni-NTA珠的柱。孵育在4℃下轻轻摇动60分钟。
- 使未结合的材料通过柱流动并用500ml缓冲液A洗
- 用250毫升缓冲液B洗柱
- 洗柱用125毫升缓冲液A中添加5 mM咪唑。
- 洗脱蛋白质来回回米，20毫升洗脱缓冲液的柱。
- 洗脱的蛋白添加至透析盒（分子量截留值 - 10 kDa）的使用注射器。透析的蛋白质在4℃下在4升冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的60分钟。
- 移动透析盒冷PBS的一个新的4升一桶。在4℃透析蛋白16小时
- 第二天早上，检查用Coomassie蛋白质检测试剂盒中的蛋白质浓度，按照制造商的说明进行操作。使用蛋白浓缩，按照制造商的说明，如果观察到低于40μM的浓度浓缩蛋白质。等分试样并冷冻在-80℃下贮存。
2.小型荧光偏振检测，以表征两个蛋白片段相互作用
- 解冻将200μl40μM的TRIP8b（241-602），并把它添加到1.5ml管中。加入100微升的PBS至11追加15毫升管。
- 通过从原始管中的一系列转印100μl的TRIP8b（241-602）的下管，上下吹打，并重复该过程执行连续稀释。这将产生从0.01-40微米，12点系列TRIP8b（241-602）的2倍稀释的。
- 制备0.1μMHCN1 FITC（6.5微升10μM的等分试样的）和2mM二硫苏糖醇（DTT）在PBS中的650微升主混合物。
注：主结构为2倍。 - 设立了12个新的1.5 mL管。加入50μl含HCN1 FITC每个管的主混合物，然后从每个12系列稀释的加入50微升。
注意：这将产生12管，各含0.05微米HCN1 FITC和TRIP8b（241-602）的浓度的一半从原来的连续稀释。 - 稀释系列加入测定板，30微升每孔，一式三份。使用低结合实心黑色384孔板。
- 旋转的托盘f或在RT 900 xg离心2分钟。
- 用酶标仪，按照制造商的指示读板。使用以下测量参数测量荧光偏振：485nm激发，530nm处发射，在505nm分色镜，100毫秒的积分时间。
- 绘制极化（MP）的值相对于TRIP8b对数标度（241-602）的浓度。与希尔方程来确定亲和力（K D）TRIP8b（241-602）的用于标记的HCN1肽拟合数据。
注意：为了制备系列稀释液，多孔板也可以用来代替管。
3.检查蛋白质相互作用使用阳性对照
- 加入200μl未标记HCN1肽（200μM）的到1.5ml管中。加入100微升的PBS至11追加15毫升管。通过从含有200μl的肽以在第一管的管转移100μl的执行连续稀释液的100微升PBS中。重复这个过程，产生12管与未标记HCN1肽的2倍稀释。
- 准备0.2μMHCN1 FITC和4μMTRIP8b（241-602）的650μl反应混合液。
注：这是一个2倍的解决方案。 - 加入50μl反应混合液到12新的1.5 mL管。
- 加入50μl的每个系列稀释的到1.5ml管中。
- 装载在一式三份的黑色384孔微量滴定板，每孔加入30微升。
- 离心板在室温900 XG 2分钟。
- 阅读使用能够FP的酶标仪板。如步骤2.7中所述使用相同的设置。
- 计算使用Cheng-Prusoff方程为TRIP8b未标记的肽（241-602）的亲和力：K d 1 的 = IC 50 /（1+ [L] / K D 2），其中K d 1 的代表未标记的亲和肽为TRIP8b（241-602），IC 50是在前面的步骤确定的并代表未标记的配位体的置换标记的配体的能力，[L]为标记的配体的在步骤3.2的浓度，和K D 2是TRIPb（241-602）的该标记配体的亲和力。
4.评估分析性能（计算Z参数）
- 通过使FP缓冲的12 ml溶液与2微米TRIP8b（241-602），50nM的HCN1 FITC，和1mM DTT中的FP缓冲制备主混合物。
注：这将需要60微升40μMTRIP8b（241-602）的60微升10μMHCN1 FITC，而1080微升FP缓冲。 - 添加30微升主混合物到一个黑色384孔微量滴定板的每个孔中。
- 加入1微升1毫米未标记HCN1肽对192口井作为阳性对照。
- 加入1μlFP缓冲液至192孔充当阴性对照。
- 离心板在室温900 XG 2分钟。
- 阅读使用MI板croplate读卡器。
- 使用下列公式计算测定在Z因子Z = 1 - 3 *（σPOS-σ 负 ）/（μ 负 -μ 正 ）其中σPOS和σ 负是阳性和阴性对照孔的标准偏差，μPOS和μ 负表示在阳性和阴性对照孔的平均信号。
5.高通量筛选
- 解冻TRIP8b（241-602）和HCN1 FITC的等份，并保持他们在冰上。
- 在FP缓冲准备10毫升TRIP8b（2μM）和HCN1 FITC（50纳米）。
- 分配25微升混合物的进入低结合使用移液管384孔黑色微量滴定板的每个孔中。
- 用于文库筛选中，添加化合物成使用声液体处理器列的各孔3〜22（40μM终浓度为每）。
注：由于relativel与此法观察ý低命中率，两种不同的化合物被汇集成一个单一的孔。从每个活动以及这两种化合物随后单独进行测试，以确定哪些所赋予的活性。 - 添加100 NL二甲亚砜（DMSO）加入到1列和各板23作为阴性对照的每个孔中。
- 添加未标记HCN1肽成2列和各板24作为阳性对照的各孔中。
- 孵育在室温将板2小时。读板或阅读之前，在4℃孵育16小时。
- 测量酶标仪荧光偏振。如步骤2.7中所述使用相同的设置。
- 通过使用从每个平板为100％的平均阳性和阴性对照归一化信号计算抑制百分比。使用方程XN = 100％*（（X 负 - X）/（X 负 - X 正 ）），其中X，N是对应于信号X的归一化抑制百分率，X POS 负距离阴性对照孔的信号。
6.点击确认使用TAMRA标记肽HCN
- 验证命中使用TAMRA标记HCN1肽（HCN1 TAMRA）超过50％的抑制。
- 准备12×2微米TRIP8b（241-602）和50纳米HCN1 TAMRA在FP缓冲的主结构。
- 分配25微升主混合物的成黑色384孔微量滴定板的每个孔中。
- 转移的每个活性化合物的系列稀释液到相应的孔中。使两倍稀释，使得每个的浓度击中范围从0.2至200μm。
- 为阴性对照的反应，转移100 NL DMSO中到每个孔中。为阳性对照添加100 NL系列稀释未标记的HCN1肽的终浓度范围从200μM至0.1μM。
- 孵育在室温在板2小时。读板或在4孵育16小时 阅读前°以下。
- 使用以下测量参数测量荧光偏振（MP）：535毫微米激发; 580 nm发射; 535纳米分色镜，20毫秒的积分时间。
- 通过使用四参数非线性回归模型23拟合各化合物的浓度依赖的FP数据计算的IC 50值。
7.基于微珠的亲近试验的剂量 - 反应验证
- 解冻1等分试样His-标记TRIP8b（241-602）（他-TRIP8b）和GST标签HCN1（GST-HCN1 C40）融合蛋白的，并保持他们在冰上。
- 在400nm的His-TRIP8b和40纳米的GST HCN1 C40的浓度结合的His-TRIP8b与GST-HCN1 C40在测定缓冲液。制备300微升混合物的每种化合物进行测试。
注：化合物一式三份在11个不同浓度的加了DM运行SO控制（无化合物）。 - 对于对照孔，准备30微升他-TRIP8b（200纳米），而GST-HCN1C40，然后分别在分析缓冲液无他，TRIP8b准备30微升GST-HCN1C40（20纳米）。
- 使用16通道移液器的GST-HCN1 C40混合物（在上面的步骤7.2的方法制备）至36孔的板：为每个要测试的化合物中，添加7微升的His-TRIP8b的。为了测试单一化合物，安排行AL的12个不同浓度，并在列1-3三次重复。新增7微升了他的-TRIP8b溶液（7.3编写），以列排M的1-3和7微升GST-C40 HCN1溶液（7.3编写），以排N. 1-3列短暂离心板确保液体是在每个孔的底部，以除去任何气泡。
- 分配的命中化合物待测试入盘，使得每个的浓度击中范围为200微米（在A行）向下至0.1微米（在排K）。分配的体积DMSO中以行LN匹配化合物的行的AK分配的量。
- 摇板2分钟，在室温下孵育2.5小时。
- 稀释抗GST受体珠1:50用测定缓冲液。
- 添加3.5微升的稀释受体珠粒以16通道移液器板的各孔中，轻轻吹打，以避免产生气泡混合。
- 将培养板在室温在黑暗中1小时。
- 稀释镍螯合供体珠1:50与分析缓冲液。不要混合物置于阴暗处。
- 添加3.5微升的稀释供体珠以16通道移液器板的各孔中，轻轻吹打，以避免产生气泡混合。
- 将培养板在室温在黑暗中1.5小时。
- 阅读酶标仪。使用具有以下测量参数酶标仪：40毫秒激发时间，100毫秒发射时间为0.1mm检测高度。
- 由选管会数据拟合计算IC 50值使用四参数非线性回归模型23小时化合物。
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Representative Results
以避免与我们先前的出版物的版权问题，一个TAMRA标记的探针HCN1 TAMRA用于生成图2和3。需要注意的是，这种替代并没有使在结果有明显的差别，并且这些协议是相同的上述与HCN1 FITC。来评估与HCN1 TAMRA，TRIP8b（241-602）的相互作用滴定成使用在步骤2（ 图2）中概述的协议HCN1 TAMRA的固定浓度。接着，进行在步骤3中概述的实验和未标记HCN1肽滴定入TRIP8b（241-602）和HCN1 TAMRA（ 图3）的固定浓度。
要验证法是适合于高通量筛选，在步骤4中的协议是下一个考察其业绩;和0为Z因子。89获得，这表明该测定准备用于高通量筛选（ 图4）。然后，20000化合物小分子文库是通过在步骤5中概述的过程具有抑制百分比在50％以上所有化合物然后用HCN1 TAMRA（步骤6），第二FP测定中测试进行筛选。最后，确认命中的基于珠子的亲近测定（步骤7， 图5）进行了测试。一击化合物，NUCC-5953，被鉴定为这些实验的结果。
图1：HTS 流程示意图描述用于高通量筛选的工作流程。图所得款项从上到下，与代表在协议的一个步骤每一个三角形。 请点击这里查看更大的版本这个数字。
图 2： 蛋白-蛋白相互作用K个D（A） 的示意图示出在步骤2中描述的作为TRIP8b实验（241-602）滴定入HCN1 TAMRA的固定浓度，TRIP8b的TPR结构域（灰色）结合到11氨基酸肽（黑色，与终端“SNL”高亮显示）。 （B）作为TRIP8b的浓度（241-602）的增加，更HCN1 TAMRA分子成为约束和偏振增加（K D =0.320.01μM）。误差线表示标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3： 阳性对照的IC 50（A）的示意图示范实验范例为步骤3.未标记HCN1肽滴定入TRIP8b（241-602）和HCN1 TAMRA的固定浓度时，标记的肽被移位。 （B）另外，该信号作为未标记HCN1浓度的增加而减小，这表明HCN1 TAMRA的位移（IC 50 =1.070.08μM）。误差线表示标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4： 代表结果从HTS（A）从高吞吐量SC结果颖使用在步骤5中图上的每个点代表单个化合物概述的协议来执行。的X和Y坐标是由在每次运行的抑制百分比来确定。 （B）从屏幕结果与阳性和阴性对照（见图例）绘制。每个化合物的平均百分比抑制（通过测定两个运行）绘制在Y轴上。 （C）从用TAMRA标记HCN1肽确证FP实验的结果。示出在步骤5大于50％抑制的化合物然后在步骤6中使用如在（A）中 ，X和Y坐标是由抑制百分比在测定中的两分来确定。从汉等 3转载。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图 5： 基于珠子的亲近测定法 （A）的示意图示出了基于珠子的亲近测定。 TRIP8b（241-602）中包含的结合镍螯合供体珠的N末端组氨酸标签（条纹圆圈）。 HCN1 C40包含结合受体珠的N端GST标签。当由TRIP8b的TPR结构域和HCN1的C-末端三肽的相互作用使得接近，由680毫微米波长的光的供体珠的激发产生单线态氧。这种单重态氧将能量传递到接受或一个定义的半径内的珠子，并导致光的发射。命中化合物（NUCC-5953）的浓度的增加成TRIP8b（241-602）和HCN1 C40的固定浓度的（B）的滴定。从汉等 3转载。误差条表示标准偏差。目标=“_空白”> 点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
因为其在MDD 24的治疗目标电位的，出现了在拮抗HCN通道功能在中枢神经系统4药理学方法相当大的兴趣。然而，这些努力已经被HCN通道在心脏起搏中的重要作用和心律不齐25的风险停滞不前。我们推断，破坏HCN和其大脑特定辅助亚基，TRIP8b 8之间的相互作用可能是足以产生，而不会影响心脏HCN通道3抗抑郁样作用。这一假说是由缺乏的小鼠表现出TRIP8b抗抑郁样行为7观察提振。针对这种互动可以成为MDD的治疗提供了新的范例。
识别TRIP8b的TPR域和HCN1的C末端三肽是相互作用的小分子抑制剂的详细协议上面介绍。以促进其一般的应用中，我们在这里描述我们的推理导致该测定的发展。虽然TRIP8b在两个位置结合的HCN亚基，我们针对TRIP8b的TPR结构域和HCN的C-末端尾部之间的相互作用。通过X射线结晶这种相互作用的结构解析揭示TRIP8b的周围的HCN 15的C-末端的TPR结构域形成的深口袋。 TRIP8b的一个80氨基酸伸展（位于N端至TPR结构域）和HCN的环核苷酸结合结构域之间发生的第二TRIP8b-HCN相互作用。这种相互作用在每个蛋白的许多不同的氨基酸发生，并构成具有较少良好定义分子间相互作用26一漫射表面。基于这些结构的观察，我们推断TRIP8b的TPR结构域和HCN的C-末端之间的相互作用通过小分子INHI是破坏更敏感BITOR。
首先，在基于该较长构建体可具有变构调节位点，并增加成功的机会的假设的测定用于TRIP8b的一个较大的片段。全长TRIP8b最初使用的，但这种方法是由蛋白质聚集，降解，和灵敏度限于冻融循环。随后，两人的中等大小的TRIP8b构造，更长的（残基219-602）和较短的（残基259-602），是一个中间结构测试之前（残基241-602）被选中。虽然每个上述四个截短的包含相关的结合的HCN的C端的TPR结构域，仅在中间长度克隆（241-602）是在筛选测定使用足够稳定的。特别是，我们能够净化用Ni 2+亲和层析，无需额外的分离步骤后，得到大量的蛋白质。
之后Choo鞋子ING TRIP8b和HCN的适当的片段，接下来我们确定了标记HCN1肽为TRIP8b（241-602）的亲和力。作为一般规则，精确测量只能做成如果配体的浓度基本上低于结合配偶28的杀敌 。在我们的例子中，我们使用50纳米标记HCN1肽在步骤2中的实验，并获得0.320.01μM的杀敌 。有关蛋白质相互作用更多的实验设计考虑，读者可以参考的几个优秀的评论一个在话题27-30。
一旦我们确定了TRIP8b标记HCN1肽（241-602）的杀敌 ，我们这时如果标签本身具有约束力的干扰确定。在步骤3中，我们通过滴定未标记HCN1肽成TRIP8b（241-602）的固定浓度来置换标记的肽获得1.070.08μM的IC 50值。有关合同中杀敌结合标记的肽为TRIP8b（241-602），以及将Cheng-Prusoff方程，我们则估计TRIP8b（241-602）的未标记的肽的亲和以K D =0.93μM。这与TRIP8b（241-602）的用于标记肽的亲合性非常一致，并表明，标记该肽基本上不影响其TRIP8b亲和力。在基于偏振荧光屏幕的一个重要特征是其优异的信噪比由0.89为Z因子所指示的。与其他参数相同，在FP信号的变化的幅度是由结合伴侣（TRIP8b（241-602））和荧光团标记的配体的尺寸的大小决定。在极化（从44到224 MP）的变化与它的自由和束缚态之间的11个氨基酸肽配体观察到的〜42kDa的TRIP8b（241-602）蛋白是足以重现针对性的互动，并提供足够的动态范围文库筛查。
ntent“>一的任何高通量筛选测定法的挑战之一是区分真正的”击中“从信号强度人为的变化的化合物。在荧光基于偏振的屏幕，它是常见的许多化合物无论是与荧光团直接交互或发荧光的自己的。为了克服这些问题，使用两种不同的荧光团的两阶段的筛选过程如上所述。此过程减少了荧光化合物和化合物直接与荧光团将通过筛选过程前进相互作用的可能性。除了结合荧光团，一些化合物作为体外 “聚合”，并导致在荧光偏振信号的非特异性的变化。这些化合物被认为以形成洗涤剂敏感胶束结构和抑制蛋白-蛋白相互作用31,32。为了减轻这些影响，重要的是在高使用的荧光偏振缓冲上述通量筛选协议包括洗涤剂（海卫），虽然与其它洗涤剂附加验证应予以考虑。应当注意的是，有上述的筛选程序的几个重要的限制。虽然TRIP8b结合HCN在两个位置，上述的屏检查只有一个相互作用位点，并不会识别的小分子靶向CNBD相互作用。同样，变构调节由在N末端区域与TRIP8b相互作用TRIP8b结合HCN化合物将不会被识别为命中。这两个因素是使用较小TRIP8b片段（见上文），这确保在该过程中概述的筛选测定法的重现性的结果。为了避免这些限制，今后的努力可能会在使用基于细胞结合屏幕全长HCN定向和TRIP8b构建33,34。这种屏幕可以依靠高throughput以鉴定能够破坏HCN和TRIP8b之间的相互作用，并限制在细胞表面HCN通道的表达的化合物的电生理学方法。值得注意的是，方法，如这些需要包括反屏幕，以确保小分子没有直接限制性HCN通道功能的拮抗剂，因为这可能导致在体内脱靶效应。
虽然HCN1，HCN2，HCN4并都具有保守的“SNL”C端肽，其残留物N端这个三肽很大的差别，并有可能影响到TRIP8b结合亲和力。这就提出了一个小分子击中屏幕获得，或者基于其他化合物击中设计可以提供HCN亚型特异性破坏TRIP8b-HCN互动的可能性。在原来的画面，NUCC-5953被确定为能够破坏TRIP8b和HCN1 3之间的相互作用的第一小分子。未来WOR用这个方法K可以识别药物开发的理想的化学属性的其他小分子抑制剂。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Dialysis cassette | ThermoFisher | 66456 | |
| Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 - 1 gr | |
| 384-Well Black plate | Corning | 3820 | |
| Proxiplate | Perkin-Elmer | 6008289 | |
| Anti-GST Acceptor beads | Perkin-Elmer | 6760603C | |
| NiChelate | Perkin-Elmer | AS101D | |
| pGS21-a | Genscript | SD0121 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Coomassie Kit | ThermoFisher | 23200 | |
| Protein concentrator | ThermoFisher | 88527 | |
| Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader | Perkin-Elmer | #2300-001M | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | Agilent | 200131 |
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