Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Published: November 11, 2016 doi: 10.3791/54540
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1, 4, 1,5
1Davee Department of Neurology and Clinical Neurosciences, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Center for Molecular Innovation and Drug Discovery, Northwestern University, 3Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 4High Throughput Analysis Laboratory, Department of Molecular Biosciences, Northwestern University, 5Department of Physiology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University
* These authors contributed equally

Summary

Samspillet mellem HCN kanaler og deres ekstra subunit er blevet identificeret som en terapeutisk mål i depression. Her, en fluorescenspolarisering-baseret fremgangsmåde til identifikation af småmolekylære inhibitorer af dette protein-protein-interaktion, er præsenteret.

Abstract

Hyperpolarisationsaktiveret cykliske nukleotid-gatede (HCN) kanaler udtrykkes ubikvitært i hele hjernen, hvor de fungerer til at regulere ophidselse af neuroner. Den subcellulære fordeling af disse kanaler i pyramideformede neuroner i hippocampale område CA1 reguleres af tetratricopeptide gentagelser og Rab8b interagerende protein (TRIP8b), en ekstra underenhed. Genetisk knockout af HCN poredannende underenheder eller TRIP8b, både føre til en stigning i antidepressiv-lignende opførsel, hvilket antyder, at begrænse funktionen af ​​HCN-kanaler kan være nyttigt som en behandling for depression (MDD). Trods betydelig terapeutisk interesse, er HCN-kanaler også til udtryk i hjertet, hvor de regulerer rytme. For at omgå off-target spørgsmål i forbindelse med blokering kardiale HCN-kanaler, har vores laboratorium for nylig foreslået målretning af protein-protein-interaktion mellem HCN og TRIP8b for specifikt afbryde HCN-kanal funktion i hjernen.TRIP8b binder sig til HCN pore danner underenheder på to forskellige interaktion sites, selvom her er fokus på samspillet mellem tetratricopeptide gentagelse (TPR) domæner af TRIP8b og C-terminal hale på HCN1. I denne protokol, en udvidet beskrivelse af en fremgangsmåde til oprensning TRIP8b og udføre en høj produktion skærmen for at identificere småmolekylære inhibitorer af interaktionen mellem HCN og TRIP8b, beskrives. Fremgangsmåden til screening med højt gennemløb anvender en fluorescenspolarisering (FP) -baseret assay til overvågning af binding af et stort TRIP8b fragment til en fluorofor-mærket elleve aminosyre peptid svarende til HCN1 C-terminale hale. Denne metode giver "hit" forbindelser, der skal identificeres på grundlag af ændringen i polariseringen af ​​udsendt lys. Validation analyser udføres derefter for at sikre, at "hit" forbindelser er ikke kunstig.

Introduction

Hyperpolarisationsaktiveret cykliske nukleotid-gatede (HCN) kanaler udtrykkes i hjertet og centralnervesystemet, hvor de spiller en vigtig rolle i reguleringen af membranen ophidselse 1. HCN kanaler har været impliceret i patogenesen af depression (MDD) 2, hvilket har ført flere grupper til at foreslå, at en begrænsning HCN-kanal funktion farmakologisk kan være effektiv som en ny behandling af MDD 3. Men direkte rettet mod HCN-kanaler ikke er levedygtig på grund af deres vigtige rolle i hjertets handling potentiale 4. Ivabradin, den eneste FDA-godkendte HCN-kanal antagonist, anvendes til behandling af hjertesvigt for at frembringe en bradycardiske virkning 5. Som sådan er der et behov for farmakologiske midler, der begrænser HCN kanalfunktion udelukkende i centralnervesystemet.

Tetratricopeptide gentage-holdige Rab8b interagerende protein (TRIP8b) er en hjerne speciFIC medhjælper underenhed af HCN-kanaler, der styrer overfladeekspression og lokalisering af HCN-kanaler 6,7. Genetisk knockout af TRIP8b forårsager en reduktion af hjernens HCN kanaler 7 uden at påvirke HCN udtryk i hjertet 8. Interessant, TRIP8b knockout-mus bruger mindre tid immobil på tvungen svømme opgaven og hale suspension opgave 7, to almindeligt anvendte screeningstest for antidepressiv effekt 9-11. Disse resultater antyder, at i stedet for direkte målretning HCN-kanaler med et lille molekyle antagonist af HCN-kanal funktion, forstyrrer interaktionen mellem TRIP8b og HCN kan være tilstrækkelig til at frembringe antidepressiv-lignende opførsel.

TRIP8b binder sig til HCN ved to forskellige bindingssteder. Den cykliske nukleotid bindingsdomæne (CNBD) af HCN interagerer med et konserveret domæne af TRIP8b placeret N-terminal til TPR domæner af TRIP8b 12,13. Selv om rester af CNBD, der er involveret i denneinteraktion er blevet kortlagt 14, har regionen TRIP8b som er involveret ikke blevet indsnævret over en-80-aminosyre fragment 13. En anden vekselvirkning opstår mellem tetratricopeptide gentagelse (TPR) domæner af TRIP8b og C-terminal tripeptid af HCN ( 'SNL' i HCN1, HCN2, og HCN4, men 'ANM' i HCN3) 3,12. Den nyligt løst krystalstruktur 15 i denne C hale interaktion afslørede betydelig strukturel lighed med interaktionen mellem peroxisomal import-receptoren, peroxin 5 (PEX5), og dens interagerende partnere, som indeholder type 1 peroxisomale målrettet sekvenser (PTS1) 16.

Selvom begge interaktionssteder er nødvendige for HCN-kanal funktion, samspillet mellem de TPR-domænerne af TRIP8b og den C-terminale tripeptid HCN1 tjener som den dominerende bindingssted og regulerer HCN overfladeekspression. Derfor blev denne interaktion valgt som målrettende sted i denne undersøgelse.For resten af ​​manuskriptet, når der henvises til samspillet mellem TRIP8b og HCN, det er denne interaktion, der bliver henvist til. Denne interaktion rekapituleres af en yderst opløseligt fragment af TRIP8b svarende til sin konserverede C-terminale indeholdende TPR domæner er nødvendige for binding af C-terminale hale af HCN (resterne 241-602 af 1A-4 isoformer af TRIP8b) 3.

For at udvikle en høj produktion skærmen for at identificere små molekyler, der kan forstyrre denne interaktion, en fluorescenspolarisering (FP) -baseret assay blev anvendt 17. Fluorescenspolarisering er baseret på excitation af en fluorofor-mærket ligand med polariseret lys og måle graden af polarisering af den udsendte fluorescens 18. I nærvær af en bindingspartner, er den roterende bevægelse af det fluorescerende ligand begrænset og polariseret lys udsendes 19. I mangel af en bindingspartner, than roterende bevægelse af liganden fører til emission af depolariserede lys.

I vedlagte protokol, er en metode til rensning af N-terminal-mærket (6xHis) TRIP8b (241-602) ved hjælp af nikkel-Nitrilotrieddikesyre (Ni-NTA) perler præsenteres. En lignende protokol blev anvendt til at rense Glutathion-S-transferase (GST) tagged C terminal 40 aminosyrer af HCN1 (HCN1 C40), der anvendes i trin 7 i protokollen. For pladshensyn, blev en detaljeret beskrivelse af denne procedure udeladt.

I trin 2 til 7 i protokollen, er en high throughput screening workflow præsenteret (se figur 1). Protein-protein interaktioner er en notorisk vanskeligt mål for high throughput screening og læsere rådes til at opsøge yderligere ressourcer om emnet 20.

Trin 2 og 3 i proceduren karakterisere in vitro affiniteten af det oprensede TRIP8b (241-602) konstruere fora fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket elleve aminosyrer peptid svarende til den C-terminale hale af HCN1 (HCN1 FITC). Baseret på krystalstrukturen af TRIP8b-HCN-kompleks 15, dette elleve aminosyrer segment er tilstrækkelig til at frembringe binding med TRIP8b (241-602). I trin 2 er Kd af interaktionen måles ved titrering TRIP8b (241-602) til en fast koncentration af HCN1 FITC. I trin 3 er en umærket version af HCN peptid anvendt i trin 2 titreret til en fast koncentration af både TRIP8b (241-602) og HCN1 FITC at undersøge, om den FITC-tag forstyrrer binding. Disse eksperimenter er afgørende for at vælge passende koncentrationer af TRIP8b (241-602) og HCN1 FITC anvendes i high throughput skærmen.

Udgangspunktet for high throughput skærm er, at et lille molekyle stand til at forstyrre interaktionen mellem TRIP8b (241-602) og HCN1 FITC vil producere en decemberrease i polariseret lys. I trin 4 er Z faktor assayet beregnet 21 for en given koncentration af TRIP8b (241-602) og HCN1 FITC at sikre, at analysen er egnet til high throughput screening (trin 5). Trin 6 og 7 er validering analyser for at bekræfte, at de hits identificeret i den primære high throughput skærm handler ved at forstyrre interaktionen mellem TRIP8b (241-602) og HCN1 FITC snarere end gennem en uspecifik mekanisme. I trin 6, carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) -mærket HCN1 peptid (HCN1 TAMRA) er anvendt i en ellers identisk fluorescens polarisering assay at filtrere fluorescerende forbindelser, der kompromitterer FP-analysen ved hjælp af FITC-tag. Trin 7 anvender et større HCN1 C-terminale fragment (HCN1 C40) og beskæftiger en perle-baseret nærhed assay, som er baseret på "tunnelering" af en singlet oxygen fra en donor bead til en acceptor bead bragt tæt på hinanden ved interagerende proteiner 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rensning af TRIP8b (241-602) Protein

  1. Transformer plasmid indeholdende TRIP8b (241-602) i den bakterielle protein ekspressionsvektoren pGS21 3 ind kompetent E. coli til proteinekspression i overensstemmelse med producentens anvisninger. Plade 300 pi kulturen på Luria Broth (LB) -agar med 5 ug / ml chloramphenicol og ampicillin. Inkubér pladen ved 37 ° C i 16 timer.
  2. Den næste dag, vælge en enkelt koloni til at pode 50 ml LB med 50 ug / ml chloramphenicol og ampicillin. Inkuber kulturen ved 37 ° C i 16 timer (under omrystning).
  3. Der tilsættes 50 ml kultur til 1 I LB med 50 ug / ml ampicillin. Der inkuberes ved 37 ° C under omrystning.
  4. Når kulturen har nået en OD600 aflæsning på 0,8-1,2, ændre temperaturen af inkubatoren til 18 ° C og tilsæt IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactosid) til en slutkoncentration på 1 mM. Tillad proteinekspression at forløbe i 16 timer.
  5. Spin ned E. coli ved 6.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C for at pelletere bakterierne. Efter fjernelse af rørene fra centrifugen, holde bakterierne på is for resten af ​​proceduren. Resuspendere bakterierne i 36 ml puffer A med 0,25 mM phenylmethansulfonylfluorid (PMSF).
  6. Sonikeres de resuspenderede bakterier på is ved hjælp af en flad bolt i 5-10 min, vekslende mellem 30 sek 'på' og 30 sek 'off' ved høj effekt.
  7. Centrifuger ved 12.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Centrifugeres i yderligere 15 minutter, hvis supernatanten står endnu ikke klart.
  8. Påfør supernatanten på en søjle af 2 ml Ni-NTA perler. Inkuber i 60 minutter ved 4 ° C under forsigtig vipning.
  9. Tillad det ubundne materiale til at strømme gennem søjlen og vaskes med 500 ml puffer A.
  10. Kolonnen udvaskes med 250 ml puffer B.
  11. Kolonnen udvaskes med 125 ml puffer A suppleret med 5 mM imidazol.
  12. Eluering af proteinet from søjlen med 20 ml elueringsbuffer.
  13. Tilsæt eluerede protein til en dialyse kassette (molekylvægtudelukkelsesgrænse - 10 kDa) med en injektionssprøjte. Dialysere proteinet i 60 minutter i 4 I koldt phosphatbufret saltvand (PBS) ved 4 ° C.
  14. Flyt dialyse kassetten i en ny 4 L spand kold PBS. Dialysere protein i 16 timer ved 4 ° C.
  15. Den næste morgen, kontrollere proteinkoncentrationen ved anvendelse af et Coomassie-protein-assay kit, ifølge producentens instruktioner. Koncentrer proteinet under anvendelse af et protein koncentrator, efter fabrikantens anvisninger, hvis der observeres en koncentration under 40 uM. Alikvot og fryse ved -80 ° C til opbevaring.

2. Small Scale fluorescenspolarisering Assay at karakterisere Interaktion af de to proteinfragmenter

  1. Optø 200 pi 40 pM TRIP8b (241-602), og føje den til en 1,5 ml rør. Tilsæt 100 pi PBS til 11 yderligere 1,5 ml rør.
  2. Udfør seriefortyndinger ved at overføre 100 pi TRIP8b (241-602) fra den oprindelige rør til det næste rør i serien, pipettering op og ned, og gentage processen. Dette vil frembringe en 12-punkts serie af 2-folds fortyndinger af TRIP8b (241-602) i området fra 0.01-40 uM.
  3. Der fremstilles en 650 pi mester blanding af 0,1 uM HCN1 FITC (6,5 pi af en 10 pM aliquot) og 2 mM dithiothreitol (DTT) i PBS.
    Bemærk: Føreren mix er 2x.
  4. Opsæt 12 nye 1,5 ml rør. Der tilsættes 50 ul af master-blanding indeholdende HCN1 FITC til hvert rør, og derefter tilsættes 50 pi fra hver af de 12 serielle fortyndinger.
    Bemærk: Dette genererer 12 rør, der hver indeholder 0,05 uM HCN1 FITC og halvdelen af koncentrationen af TRIP8b (241-602) fra den oprindelige seriefortynding.
  5. Tilføj fortyndingsrækken til en analyseplade, 30 pi per brønd i tre eksemplarer. Bruge en lav binding solid sort plade med 384 brønde.
  6. Spin pladen feller 2 minutter ved 900 xg ved stuetemperatur.
  7. Aflæs pladen ved anvendelse af en mikropladelæser, i overensstemmelse med producentens anvisninger. Mål fluorescenspolarisering ved anvendelse af følgende måleparametre: 485 nm excitation, 530 nm emission, 505 nm dikroisk spejl, 100 msek integration tid.
  8. Plot polarisering (MP) værdier versus TRIP8b (241-602) koncentration på en logaritmisk skala. Passer til dataene med Hill-ligningen for at bestemme affinitet (Kd), i TRIP8b (241-602) for det mærkede HCN1 peptid.
    Bemærk: Til fremstilling af serielle fortyndinger, kan en multi-brønds plade også anvendes i stedet for rør.

3. Undersøg Protein-protein interaktion Ved hjælp af en positiv kontrol

  1. Tilsæt 200 pi umærket HCN1 peptid (200 uM) til et 1,5 ml rør. Tilsæt 100 pi PBS til 11 yderligere 1,5 ml rør. Udfør seriefortyndinger ved at overføre 100 pi fra røret indeholdende 200 pi peptid til det første rør100 pi PBS. Gentag processen for at generere 12 rør med 2 gange fortyndinger af umærket HCN1 peptid.
  2. Forbered en 650 pi mester mix af 0,2 uM HCN1 FITC og 4 uM TRIP8b (241-602).
    Bemærk: Dette er en 2x løsning.
  3. Tilsæt 50 ul mester mix til 12 nye 1,5 ml rør.
  4. Der tilsættes 50 ul af hver seriel fortynding til et 1,5 ml rør.
  5. Indlæse den sorte 384-brønds mikrotiterplade i tre eksemplarer, tilsætte 30 pi per brønd.
  6. Centrifugeres pladen i 2 minutter ved 900 xg ved stuetemperatur.
  7. Aflæs pladen ved anvendelse af en mikropladelæser stand til FP. Brug de samme indstillinger som beskrevet i trin 2.7.
  8. Beregn affiniteten af umærket peptid til TRIP8b (241-602) ved anvendelse af Cheng-Prusoff-ligningen: K d 1 = IC50 / (1 + [L] / Kd 2), hvor Kd 1 repræsenterer affiniteten af umærket peptid til TRIP8b (241-602), IC50 bestemmes i det foregående trinog repræsenterer evnen hos den umærkede ligand til at fortrænge den mærkede ligand, [L] er koncentrationen af den mærkede ligand i trin 3.2, og Kd 2 er affiniteten af tripb (241-602) for den mærkede ligand.

4. Evaluer analysepræstation (Beregn Z Factor)

  1. Forbered en master mix ved at lave en 12 ml opløsning af FP buffer med 2 pM TRIP8b (241-602), 50 nM HCN1 FITC, og 1 mM DTT i FP Buffer.
    Bemærk: Det kræver 60 pi 40 pM TRIP8b (241-602), 60 pi 10 pM HCN1 FITC og 1.080 pi FP Buffer.
  2. Tilsæt 30 pi af master mix til hver brønd i en sort 384-brønds mikrotiterplade.
  3. Tilsæt 1 pi 1 mM umærket HCN1 peptid til 192 brønde til at fungere som en positiv kontrol.
  4. Tilsæt 1 pi FP puffer til 192 brønde til at fungere som en negativ kontrol.
  5. Centrifugeres pladen i 2 minutter ved 900 xg ved stuetemperatur.
  6. Aflæs pladen ved anvendelse af en microplate læser.
  7. Beregn Z faktor for analysen ved hjælp af følgende formel: Z = 1 - 3 ud * (σ pos -σ neg) / (μ neg -μ pos) hvor σ pos og σ neg er standardafvigelser af de positive og negative kontrol brønde og μ pos og μ neg repræsenterer de gennemsnitlige signaler i de positive og negative kontrol brønde.

5. High Throughput Screen

  1. Optø portioner af TRIP8b (241-602) og HCN1 FITC og holde dem på is.
  2. Forbered 10 ml TRIP8b (2 uM) og HCN1 FITC (50 nM) i FP buffer.
  3. Dispensere 25 pi af blandingen i hver brønd i en lav bindende 384-brønds sorte mikrotiterplade ved anvendelse af en pipette.
  4. For biblioteksscreening, tilføje forbindelser i hver brønd i kolonne 3 til 22 (40 uM slutkoncentration for hver) under anvendelse af en akustisk væskehåndteringsudstyr.
    Bemærk: På grund af relatively lav hit rate observeret med dette assay blev to forskellige forbindelser samlet i en enkelt brønd. De to forbindelser fra hver aktiv brønd blev efterfølgende testet individuelt for at identificere, hvilke tillagt aktiviteten.
  5. Tilsæt 100 nl dimethylsulfoxid (DMSO) i hver brønd i kolonne 1 og 23 af hver plade som negative kontroller.
  6. Tilføj umærket HCN1 peptid i hver brønd i kolonne 2 og 24 af hver plade som positive kontroller.
  7. Pladerne inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer. Læs plader eller inkuberes ved 4 ° C i 16 timer før aflæsning.
  8. Mål fluorescenspolarisering på en pladelæser. Brug de samme indstillinger som beskrevet i trin 2.7.
  9. Beregn procent inhibering ved normalisering af signalerne ved anvendelse af de gennemsnitlige positive og negative kontroller fra hver plade som 100%. Brug ligningen XN = 100% * ((X neg - X) / (X neg - X POS)), hvor X N er den normaliserede procentvise inhibering svarer til signalet X, X pos neg er signalet fra de negative kontrolbrønde.

6. Bekræftelse af Hits Brug TAMRA-mærkede HCN peptid

  1. Godkend hits med over 50% hæmning ved anvendelse af TAMRA-mærket HCN1 peptid (HCN1 TAMRA).
    1. Forbered en master mix af 12 ml 2 uM TRIP8b (241-602) og 50 nM HCN1 TAMRA i FP buffer.
    2. Dispensere 25 pi master mix i hver brønd af en sort 384-brønds mikrotiterplade.
    3. Overfør serielle fortyndinger af hver aktive forbindelser i de respektive brønde. Lav to gange fortyndinger, således at koncentrationen af ​​hver ramme er i området fra 0,2 uM til 200 uM.
    4. For de negative kontrolreaktioner, overføre 100 nl DMSO i hver brønd. For den positive kontrol tilsættes 100 nl af seriefortyndet umærket HCN1 peptid med den endelige koncentration i intervallet fra 200 uM til 0,1 uM.
    5. Inkubér pladen ved stuetemperaturi 2 timer. Læs plader eller inkuberes i 16 timer ved 4 ° C, før du læser.
    6. Mål fluorescenspolarisering (MP) ved anvendelse af følgende måleparametre: 535 nm Excitation; 580 nm emission; 535 nm dikroisk spejl, 20 msek integration tid.
    7. Beregn IC50-værdier ved at tilpasse koncentrationsafhængige FP data for hver forbindelse under anvendelse af en fire-parameter-lineær regressionsmodel 23.

7. Dosis-respons Validering af Bead-baserede Proximity Assay

  1. Optø en portion af His-mærket TRIP8b (241-602) (His-TRIP8b) og GST-mærket HCN1 (GST HCN1 C40) fusionsproteiner og holde dem på is.
  2. Kombiner His-TRIP8b med GST-HCN1 C40 i assaypuffer ved koncentrationer på 400 nM His-TRIP8b og 40 nM GST HCN1 C40. Forbered 300 pi af blandingen for hver forbindelse, der skal testes.
    Bemærk: Forbindelser kørt tre gange ved 11 forskellige koncentrationer plus en DMSO kontrol (ingen forbindelse).
  3. For kontrol brønde, forberede 30 pi af His-TRIP8b (200 nM) uden GST-HCN1C40 og derefter separat forberede 30 pi GST-HCN1C40 (20 nM) uden His-TRIP8b i assaybuffer.
  4. For hver forbindelse, der skal testes, tilsættes 7 pi af His-TRIP8b: GST-HCN1 C40-blanding (fremstillet i trin 7.2 ovenfor) til 36 brønde i en plade under anvendelse af en 16-kanals pipette. For at teste et enkelt stof, arrangere de 12 forskellige koncentrationer i rækker AL og de tre gentagelser i kolonne 1-3. Tilføj 7 ul af His-TRIP8b opløsning (udarbejdet i 7.3) til kolonner 1-3 af rækken M og 7 ul af GST-HCN1 C40-opløsning (udarbejdet i 7.3) til kolonner 1-3 af rækken N. kortvarigt centrifugeres pladen til sikre væskerne er i bunden af ​​hver brønd, og for at fjerne eventuelle bobler.
  5. Dispensere hit forbindelser, der skal testes ind i pladen, således at koncentrationen af ​​hver ramme er i området fra 200 um (i række A) ned til 0,1 um (i række K). Dispensere et volumen påDMSO i rækker LN der matcher mængden af ​​forbindelse afgives i rækker AK.
  6. Ryst pladen i 2 minutter og inkuberes i 2,5 timer ved stuetemperatur.
  7. Fortynd de anti-GST Acceptorvesikler perler 1:50 med assaybuffer.
  8. Tilføj til 3,5 pi af de fortyndede Acceptorvesikler perler til hver brønd i pladen med en 16-kanals pipette og bland ved forsigtigt at pipettere at undgå at skabe bobler.
  9. Inkubér pladen i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
  10. Fortynde nikkelchelatperler Donor perler 1:50 med assaybuffer. blandingen må ikke udsættes for lys.
  11. Tilføj til 3,5 pi af de fortyndede Donor perler til hver brønd i pladen med en 16-kanals pipette og bland ved forsigtigt at pipettere at undgå at skabe bobler.
  12. Inkubér pladen i 1,5 timer ved stuetemperatur i mørke.
  13. Aflæst på en pladelæser. Brug en plade-læser med følgende måleparametre: 40 ms excitation tid, 100 ms emission tid, 0,1 mm afsløring højde.
  14. Beregn IC 50 værdier ved at montere data for each Forbindelse anvendelse af en fire-parameter-lineær regressionsmodel 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at undgå ophavsretlige spørgsmål med vores tidligere publikation blev en TAMRA-mærket probe HCN1 TAMRA bruges til at generere figur 2 og 3. Bemærk, at denne substitution ikke gøre en mærkbar forskel i resultaterne, og protokollerne er identiske med dem beskrevet ovenfor med HCN1 FITC. At evaluere samspillet med HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602) blev titreret til en fast koncentration af HCN1 TAMRA anvendelse af protokollen beskrevet i trin 2 (figur 2). Dernæst blev eksperimentet skitseret i trin 3 udføres, og umærket HCN1 peptid blev titreret til en fast koncentration af TRIP8b (241-602) og HCN1 TAMRA (figur 3).

For at verificere, at analysen var egnet til high throughput screening, dens præstationer blev næste undersøgt af protokollen i trin 4; og en Z faktor på 0.89 blev opnået, hvilket indikerer, at assayet var klar til high throughput screening (Figur 4). Derefter blev et 20.000 forbindelse lille molekyle-bibliotek screenet ved proceduren i trin 5. Alle forbindelser, der har procentvis inhibering over 50% blev derefter testet i den anden FP assay med HCN1 TAMRA (trin 6). Endelig blev de bekræftede hits testes i perle-baserede nærhed assay (trin 7, figur 5). Et hit sammensatte, NUCC-5953, blev identificeret som et resultat af disse forsøg.

figur 1
Figur 1: HTS Workflow Skematisk beskriver arbejdsgangen for high throughput screening.. Diagram provenuet fra top til bund, med hver trekant repræsenterer et skridt i den protokol. Klik her for at se enstørre version af denne figur.

Figur 2
Figur 2:. Kd af protein-protein-interaktion (A) Skematisk viser eksperimentet beskrevet i trin 2. Som TRIP8b (241-602) titreres til en fast koncentration af HCN1 TAMRA, de TPR domæner af TRIP8b (i grå) binder til 11 aminosyrer peptid (i sort, med terminal 'SNL' fremhævet). (B) Som koncentrationen af TRIP8b (241-602) stiger, flere HCN1 TAMRA molekyler bliver bundne og polarisering stigninger (K D = 0.320.01μM). Fejl barer betegne standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 Figur 3:. IC 50 af positiv kontrol (A) Skematisk demonstrerer eksperimentelle paradigme for trin 3. Så umærket HCN1 peptid titreres til en fast koncentration af TRIP8b (241-602) og HCN1 TAMRA, er det mærkede peptid fordrevne. (B) Bemærk, at signalet falder, når koncentrationen af umærkede HCN1 stiger, hvilket indikerer forskydning af HCN1 TAMRA (IC50 = 1.070.08μM). Fejl barer betegne standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Repræsentative resultater fra HTS (A) Resultater fra high throughput sc Reen udført under anvendelse af protokollen beskrevet i trin 5. Hvert punkt på grafen repræsenterer en enkelt forbindelse. X- og y-koordinater bestemmes af den procentvise inhibering ved hver kørsel. (B) Resultater fra skærmen afbildet med positive og negative kontroller (se legenden). Hver forbindelses gennemsnitlige procentvise inhibering (på tværs af to kørsler af assayet) er afbildet på Y-aksen. (C) Resultater fra genfremsatte FP forsøg med en TAMRA-mærket HCN1 peptid. Forbindelserne udviser mere end 50% inhibering i trin 5 blev derefter anvendt i trin 6. Som i (A), X og Y koordinater bestemmes af den procentvise inhibering i to kørsler i assayet. Gengivet fra Han et al. 3. Klik her for at se en større version af dette tal.

40 / 54540fig5.jpg "/>
Figur 5:. Bead-baserede Proximity Assay (A) Skematisk viser perle-baserede nærhed assay. TRIP8b (241-602) indeholder en N-terminal hexahistidinmærke der binder nikkelchelatperler donor perler (cirkel med striber). HCN1 C40 indeholder en N-terminal GST-tag, der binder acceptor-perler. Når den bringes i nærhed af interaktionen af ​​TPR domæner af TRIP8b og den C-terminale tripeptid af HCN1, excitation af donor bead ved 680 nm bølgelængde producerer singlet oxygen. Dette singlet-oxygen overfører energi til acceptoren perler inden for et defineret radius og fører til udsendelse af lys. (B) Titrering af stigende koncentrationer af hit forbindelse (NUCC-5953) til en fast koncentration af TRIP8b (241-602) og HCN1 C40. Gengivet fra Han et al. 3. Fejl barer betegne standardafvigelse.target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grund af dens potentiale som et terapeutisk mål i MDD 24, har der været betydelig interesse for farmakologiske tilgange, som antagoniserer HCN kanal funktion i centralnervesystemet 4. Imidlertid har disse bestræbelser blevet bremset af den vigtige rolle, HCN-kanaler i hjertets pacemaking og risikoen for arytmi 25. Vi ræsonnerede, at forstyrre vekselvirkningen mellem HCN og dens hjerne specifik medhjælper underenhed, TRIP8b 8, kan være tilstrækkelig til at producere antidepressiv-lignende effekter uden at ændre kardiale HCN kanalerne 3. Denne hypotese blev styrket af den iagttagelse, at mus, der mangler TRIP8b udviser antidepressiv-lignende opførsel 7. Målretning denne interaktion kunne blive et nyt paradigme til behandling af depression.

En detaljeret protokol til at identificere småmolekylære inhibitorer af interaktionen mellem TPR domæner af TRIP8b og den C-terminale tripeptid HCN1 erpræsenteret ovenfor. For at lette almengyldig, vi her beskrive vores ræsonnement, der førte til udviklingen af ​​denne analyse. Selv TRIP8b binder til HCN underenheder på to steder, vi fokuserede på samspillet mellem TPR domæner TRIP8b og C-terminal hale af HCN. Den strukturelle belysning af denne interaktion ved røntgenkrystallografi afslørede en dyb lomme dannet af TPR domæner af TRIP8b omkring C-terminalen af HCN 15. Den anden TRIP8b-HCN interaktion forekommer mellem en 80 aminosyre strækning af TRIP8b (placeret N-terminal til TPR domæner) og det cykliske nukleotid bindingsdomæne af HCN. Denne interaktion forekommer på tværs af mange forskellige aminosyrer i hvert protein og udgør en diffus overflade med færre veldefinerede intermolekylære vekselvirkninger 26. Baseret på disse strukturelle observationer, vi ræsonnerede, at interaktionen mellem de TPR-domænerne af TRIP8b og C-terminalen af ​​HCN er mere modtagelig for forstyrrelser af et lille molekyle inhibitor.

Indledningsvis blev et større fragment af TRIP8b anvendes i assayet baseret på den antagelse, at en længere konstruktion kan have allosteriske regulatoriske sites og øge chancen for succes. Fuld længde TRIP8b blev oprindeligt anvendt, men denne fremgangsmåde var begrænset af proteinaggregering, nedbrydning og følsomhed over for fryse-tø-cykler. Efterfølgende to mellemliggende størrelse TRIP8b konstruerer, en længere en (rester 219-602) og en kortere (resterne 259-602), blev testet før en mellemliggende konstruktion (rester 241-602) blev valgt. Selvom hver af de fire trunkeringer ovenfor beskrevne indeholder TPR domæner relevante for binding til C-terminalen af ​​HCN, kun den mellemliggende længde klon (241-602) var tilstrækkelig stabil til anvendelse ved screeningsassays. Især var vi i stand til at opnå store mængder af proteinet efter oprensning ved Ni2 + affinitetskromatografi uden yderligere separationstrin.

efter choosing en egnet fragment af TRIP8b og HCN, vi næste bestemmes affiniteten af ​​det mærkede HCN1 peptid til TRIP8b (241-602). Som en generel regel, kan kun foretages en nøjagtig måling, hvis koncentrationen af liganden er væsentligt under K D i bindende partner 28. I vores tilfælde har vi brugt 50 nM af mærket HCN1 peptid til eksperimentet i trin 2, og opnåede en K D fra 0.320.01μM. For mere eksperimenterende design overvejelser om protein-protein interaktioner, er læsere henvises til en af flere gode anmeldelser om emnet 27-30.

Når vi bestemt KD af det mærkede HCN1 peptid til TRIP8b (241-602), vi derefter bestemmes, hvis etiketten selv forstyrrer binding. I trin 3, opnåede vi en IC50 værdi på 1.070.08 uM ved at titrere en umærket HCN1 peptid til en fast koncentration af TRIP8b (241-602) til at forskyde det mærkede peptid. Kombineret med K D i mærket peptid til TRIP8b (241-602), og anvendelse af Cheng-Prusoff-ligningen, så skønnede vi affiniteten af umærket peptid til TRIP8b (241-602) som KD = 0.93μM. Dette er i nær overensstemmelse med affinitet TRIP8b (241-602) for det mærkede peptid, og foreslår, at mærkning af peptid ikke i væsentlig grad påvirker dets affinitet til TRIP8b. Et vigtigt træk ved den fluorescenspolarisering-baseret skærm er dens fremragende signal-støjforhold som angivet ved en Z faktor på 0,89. Med andre parametre de samme, er størrelsen af ​​ændringen i FP signal dikteret af størrelsen af ​​den bindingspartner (TRIP8b (241-602)) og størrelsen af ​​fluoroforen-mærkede ligand. En ændring i polarisering (44-224 MP) observeret med 11 aminosyrer peptidligand mellem dets frie og bundne tilstande med ~ 42 kDa TRIP8b (241-602) protein er tilstrækkelig til at gengive den målrettede interaktion og giver et tilstrækkeligt dynamikområde for biblioteksscreening.

ntent "> En af udfordringerne i enhver high throughput screening analysen skelne ægte" hit "forbindelser fra artefakt ændringer i signal intensitet. I fluorescens polarisering-baserede skærme, er det almindeligt for mange forbindelser til enten interagere direkte med fluorophoren eller fluorescerer på deres egne. for at omgå disse problemer, en to-trins screening procedure under anvendelse af to særskilte fluoroforer er beskrevet ovenfor. Denne procedure reducerer sandsynligheden for, at fluorescerende forbindelser og forbindelser interagerer direkte med fluorophoren vil forhånd gennem screeningsprocessen. Ud over at binde fluoroforen nogle forbindelser virker som "nyhedslæsere" in vitro og føre til uspecifikke ændringer i fluorescenspolarisering signal. disse forbindelser menes at danne detergent-følsomme micellære strukturer og inhibere protein-protein interaktioner 31,32. for at afbøde disse virkninger, er det vigtigt at fluorescenspolarisering puffer anvendes i den højethroughput screening forskrift ovenfor skitserede indbefatter et detergent (Triton), selv om der bør overvejes yderligere validering med andre detergenter.

Det skal bemærkes, at der er flere vigtige begrænsninger i screening beskrevet ovenfor. Selv TRIP8b binder sig til HCN i to steder, skærmen er beskrevet ovenfor undersøger kun én interaktion sted og vil ikke identificere små molekyler rettet mod CNBD interaktion. Tilsvarende vil forbindelser, som allosterisk modulerer TRIP8b binding til HCN ved at interagere med TRIP8b i den N terminale område ikke identificeres som hits. Begge disse overvejelser er resultatet af at anvende en mindre TRIP8b fragment (se ovenfor), hvilket sikrer reproducerbarhed i screeningsanalyserne beskrevet i proceduren. For at undgå disse begrænsninger, kan fremtidige indsats rettes mod at bruge en celle baseret skærm indarbejde fuld længde HCN og TRIP8b konstruerer 33,34. Denne form for skærm kan påberåbe sig høj throughput elektrofysiologiske metoder for at identificere forbindelser, der kan forstyrre vekselvirkningen mellem HCN og TRIP8b, og begrænse ekspressionen af ​​HCN-kanaler på celleoverfladen. Notatet tilgange som disse skulle omfatte counter-skærme til at sikre, at små molekyler ikke var direkte begrænsende HCN-kanal funktion som antagonister, da dette kan føre til forbi mål virkninger in vivo.

Selvom HCN1, HCN2, og HCN4 har alle en bevaret 'SNL' C terminale peptid, resterne N terminal til dette tripeptid varierer betydeligt og sandsynligvis påvirke TRIP8b bindende affinitet. Dette rejser muligheden for, at et lille molekyle hit opnås ved skærmen eller designet baseret på andre hit forbindelser kan give HCN isoformspecificitet i at forstyrre TRIP8b-HCN interaktion. I den oprindelige skærm, blev NUCC-5953 identificeret som den første lille molekyle stand til at forstyrre interaktionen mellem TRIP8b og HCN1 3. Fremtidig work med denne analyse kan identificere yderligere småmolekyleinhibitorer med ønskelige kemiske egenskaber for lægemiddeludvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ni-NTA agarose  Qiagen 30210
Dialysis cassette  ThermoFisher 66456
Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside  Sigma-Aldrich I5502 - 1 gr
384-Well Black plate  Corning 3820
Proxiplate  Perkin-Elmer  6008289
Anti-GST Acceptor beads  Perkin-Elmer  6760603C
NiChelate Perkin-Elmer  AS101D
pGS21-a Genscript SD0121
PMSF Sigma-Aldrich 10837091001
Coomassie Kit ThermoFisher 23200
Protein concentrator ThermoFisher 88527
Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader Perkin-Elmer  #2300-001M
BL21 (DE3) Competent Cells Agilent 200131

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
  2. Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders? Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).
  3. Han, Y., et al. Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels. J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).
  4. Postea, O., Biel, M. Exploring HCN channels as novel drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).
  5. Stieber, J., Wieland, K., Stöckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors. Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).
  6. Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction. J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).
  7. Lewis, A. S., et al. Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice. J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).
  8. Heuermann, R. J., et al. Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy. Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).
  9. Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).
  10. Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity. Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).
  11. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice. Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  12. Han, Y., et al. Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites. J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).
  13. Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP. J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).
  14. Saponaro, A., et al. Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).
  15. Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).
  16. Gatto, G. J. Jr, Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5. Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).
  17. Owicki, J. C. Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer. J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).
  18. Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
  19. Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).
  20. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Eglen, R. M., et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).
  23. Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. , Worth Publishers. New York. (2000).
  24. Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors. Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).
  25. Wahl-Schott, C., Biel, M. HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function. Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).
  26. DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b. Structure. 23 (4), 734-744 (2015).
  27. Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).
  28. Prinz, H. Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms. J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).
  29. Pollard, T. D. A Guide to Simple and Informative Binding Assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  30. Rossi, A. M., Taylor, C. W. Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization. Nat Protoc. 6 (3), (2011).
  31. Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -W. Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors. J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).
  32. McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening. J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).
  33. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  34. Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).

Tags

Biochemistry High-throughput screening drug discovery protein-protein interaktioner fluorescenspolarisering HCN TRIP8b
Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, Y., Lyman, K. A., Clutter, M.,… More

Han, Y., Lyman, K. A., Clutter, M., Schiltz, G. E., Ismail, Q. A., Cheng, X., Luan, C. H., Chetkovich, D. M. Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b. J. Vis. Exp. (117), e54540, doi:10.3791/54540 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter