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Biochemistry

HCN1 और TRIP8b बीच प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के छोटे अणु inhibitors की पहचान के लिए विधि

Published: November 11, 2016 doi: 10.3791/54540
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1, 4, 1,5
1Davee Department of Neurology and Clinical Neurosciences, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Center for Molecular Innovation and Drug Discovery, Northwestern University, 3Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 4High Throughput Analysis Laboratory, Department of Molecular Biosciences, Northwestern University, 5Department of Physiology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University
* These authors contributed equally

Summary

HCN चैनलों और उनके सहायक सबयूनिट के बीच बातचीत मेजर अवसाद विकार में एक चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में पहचान की गई है। इधर, इस प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के छोटे अणु अवरोधकों की पहचान करने के लिए एक प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण आधारित पद्धति, प्रस्तुत किया है।

Abstract

Hyperpolarization सक्रिय चक्रीय न्यूक्लियोटाइड-गेटेड (HCN) चैनलों मस्तिष्क, जहां वे न्यूरॉन्स की उत्तेजना को विनियमित करने के लिए समारोह के दौरान सर्वत्र व्यक्त कर रहे हैं। हिप्पोकैम्पस क्षेत्र सीए 1 के पिरामिड न्यूरॉन्स में इन चैनलों की subcellular वितरण tetratricopeptide दोहराने युक्त Rab8b बातचीत प्रोटीन (TRIP8b), एक सहायक उप-इकाई द्वारा विनियमित है। HCN की जेनेटिक पीटकर सब यूनिटों या TRIP8b, एंटी-तरह के व्यवहार में वृद्धि करने के लिए दोनों के नेतृत्व गठन ताकना, सुझाव है कि HCN चैनलों के समारोह में सीमित मेजर अवसाद विकार (MDD) के लिए एक इलाज के रूप में उपयोगी हो सकता है। महत्वपूर्ण चिकित्सीय रुचि होने के बावजूद, HCN चैनलों को भी दिल है, जहां वे rhythmicity विनियमित में व्यक्त कर रहे हैं। हृदय HCN चैनलों को अवरुद्ध करने के साथ जुड़े बंद लक्ष्य मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला हाल ही में आदेश विशेष रूप से मस्तिष्क में HCN चैनल समारोह को बाधित करने में HCN और TRIP8b के बीच प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को निशाना बनाने का प्रस्ताव किया है।TRIP8b, HCN ताकना दो अलग-अलग बातचीत स्थलों पर सब यूनिटों के गठन को बांधता है, हालांकि यहां ध्यान देने के tetratricopeptide दोहराने (TPR) TRIP8b के डोमेन और HCN1 के सी टर्मिनल पूंछ के बीच बातचीत पर है। इस प्रोटोकॉल, TRIP8b सफ़ाई और HCN और TRIP8b के बीच बातचीत के छोटे अणु अवरोधकों की पहचान करने के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन को क्रियान्वित करने के लिए एक विधि की एक विस्तृत विवरण में वर्णित है। उच्च throughput प्रदर्शन के लिए विधि एक प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण (एफपी) एसिड पेप्टाइड HCN1 सी टर्मिनल पूंछ को इसी एमिनो एक fluorophore टैग ग्यारह के लिए एक बड़ा टुकड़ा TRIP8b के बंधन की निगरानी के लिए परख आधारित का इस्तेमाल करता है। इस विधि की अनुमति देता है 'हिट' यौगिकों उत्सर्जित प्रकाश का ध्रुवीकरण में परिवर्तन के आधार पर पहचान की जा सके। मान्यकरण assays तो यह सुनिश्चित करें कि 'हिट' यौगिकों artifactual नहीं हैं प्रदर्शन कर रहे हैं।

Introduction

Hyperpolarization सक्रिय चक्रीय न्यूक्लियोटाइड-गेटेड (HCN) चैनलों दिल और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, जहां वे झिल्ली excitability 1 विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा में व्यक्त कर रहे हैं। HCN चैनलों मेजर अवसाद विकार (MDD) 2, जो प्रस्ताव है कि सीमित HCN चैनल समारोह औषधीय MDD 3 के लिए एक उपन्यास उपचार के रूप में प्रभावी हो सकता है कई समूहों के लिए प्रेरित किया है के रोगजनन में फंसाया गया है। हालांकि, सीधे HCN चैनलों को लक्षित हृदय की संभावित कार्रवाई 4 में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका की वजह से व्यवहार्य नहीं है। Ivabradine, केवल एफडीए HCN चैनल प्रतिपक्षी को मंजूरी दे दी, दिल की विफलता एक bradycardic प्रभाव 5 का उत्पादन करने के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है। जैसे, pharmacologic एजेंटों कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में HCN चैनल समारोह में विशेष रूप से सीमा के लिए एक की जरूरत है।

Tetratricopeptide दोहराने युक्त Rab8b बातचीत प्रोटीन (TRIP8b) एक मस्तिष्क विशिष्ट हैएफआईसी HCN चैनलों कि सतह अभिव्यक्ति और HCN चैनलों 6.7 के स्थानीयकरण नियंत्रण के सहायक सबयूनिट। TRIP8b की जेनेटिक पीटकर दिल 8 में HCN अभिव्यक्ति को प्रभावित किए बिना मस्तिष्क HCN चैनलों 7 की कमी का कारण बनता है। दिलचस्प बात यह है TRIP8b पीटा चूहों मजबूर तैरना कार्य और पूंछ निलंबन कार्य 7, एंटी प्रभावकारिता 9-11 के लिए दो आमतौर पर इस्तेमाल किया स्क्रीनिंग परीक्षणों पर कम समय स्थिर खर्च करते हैं। इन परिणामों के सीधे HCN चैनल समारोह का एक छोटा सा अणु प्रतिपक्षी के साथ HCN चैनलों को लक्षित, TRIP8b और HCN के बीच बातचीत में खलल न डालें एंटी-तरह व्यवहार का निर्माण करने के लिए पर्याप्त हो सकता है बजाय कि सुझाव देते हैं।

TRIP8b दो अलग बाध्यकारी साइटों पर HCN को बांधता है। HCN की चक्रीय न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी डोमेन (CNBD) TRIP8b 12,13 के TPR डोमेन के लिए TRIP8b स्थित एन टर्मिनल के एक संरक्षित डोमेन के साथ सूचना का आदान प्रदान। हालांकि CNBD के अवशेषों कि इस में शामिल कर रहे हैंबातचीत 14 मैप किया गया है, कि इसमें शामिल है TRIP8b के क्षेत्र में एक-80-एमिनो एसिड टुकड़ा 13 परे नीचे संकुचित नहीं किया गया है। एक दूसरा बातचीत TRIP8b की tetratricopeptide दोहराने (TPR) डोमेन और HCN के सी टर्मिनल tripeptide (HCN1, HCN2, और HCN4 में 'एसएनएल', लेकिन HCN3 में 'एएनएम') 3,12 के बीच होता है। इस सी पूंछ बातचीत की हाल ही सुलझ क्रिस्टल संरचना 15, peroxisomal आयात रिसेप्टर के बीच बातचीत के लिए पर्याप्त संरचनात्मक समानता का पता चला peroxin 5 (PEX5), और उसके सहयोगियों बातचीत के दौरान, टाइप 1 peroxisomal को निशाना दृश्यों (PTS1) 16 से युक्त।

हालांकि दोनों बातचीत साइटों HCN चैनल समारोह के लिए आवश्यक हैं, TRIP8b की TPR डोमेन और HCN1 के सी टर्मिनल tripeptide के बीच बातचीत के प्रमुख बाध्यकारी साइट के रूप में कार्य करता है और नियंत्रित करता है HCN सतह अभिव्यक्ति। इसलिए, इस बातचीत के इस अध्ययन में लक्ष्य-निर्धारण स्थल के रूप में चुना गया था।पांडुलिपि, जब एक संदर्भ TRIP8b और HCN के बीच बातचीत के लिए किया जाता है के शेष के लिए, यह इस बातचीत है कि करने के लिए भेजा जा रहा है। इस बातचीत TRIP8b के एक उच्च घुलनशील टुकड़ा युक्त इसकी संरक्षित सी टर्मिनल के लिए इसी TPR सी टर्मिनल HCN के 3 पूंछ (अवशेषों 1 ए -4 TRIP8b की isoforms की 241-602) बाइंडिंग के लिए आवश्यक डोमेन के द्वारा recapitulated है।

आदेश छोटे इस बातचीत में खलल न डालें करने में सक्षम अणुओं की पहचान करने के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन विकसित करने के लिए, एक प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण (एफपी) आधारित परख 17 कार्यरत था। प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण ध्रुवीकृत प्रकाश, और उत्सर्जित प्रतिदीप्ति 18 के ध्रुवीकरण की डिग्री को मापने के साथ एक fluorophore टैग ligand की उत्तेजना पर आधारित है। एक बाध्यकारी साथी की उपस्थिति में, फ्लोरोसेंट ligand की घूर्णी गति विवश है और ध्रुवीकरण प्रकाश 19 उत्सर्जित होता है। एक बाध्यकारी साथी, टी के अभाव मेंवह ligand की घूर्णी गति depolarized प्रकाश का उत्सर्जन होता है।

संलग्न प्रोटोकॉल में, एन टर्मिनल टैग (6xHis) TRIP8b की शुद्धि (241-602) निकल Nitrilotriacetic एसिड (नी NTA) मनकों का उपयोग के लिए एक विधि प्रस्तुत किया है। इसी तरह की एक प्रोटोकॉल Glutathione-S-ट्रांसफेरेज़ (जीएसटी) -tagged सी HCN1 के टर्मिनल 40 अमीनो एसिड (HCN1 C40) प्रोटोकॉल के 7 चरण में इस्तेमाल किया शुद्ध करने के लिए नियुक्त किया गया था। अंतरिक्ष विचार के लिए, उस प्रक्रिया का विस्तृत विवरण छोड़ा गया था।

प्रोटोकॉल के माध्यम से 7 कदम 2 में, एक उच्च throughput स्क्रीनिंग कार्यप्रवाह प्रस्तुत किया जाता है (चित्रा 1 देखें)। प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत उच्च throughput प्रदर्शन के लिए एक बेहद मुश्किल लक्ष्य कर रहे हैं और पाठकों के विषय पर 20 अतिरिक्त संसाधनों की तलाश करने के लिए सलाह दी जाती है।

2 कदम और प्रक्रिया के 3 शुद्ध TRIP8b (241-602) की इन विट्रो समानता की विशेषताएँ के लिए निर्माणरा fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) -tagged ग्यारह एमिनो एसिड पेप्टाइड HCN1 (HCN1 FITC) के सी टर्मिनल पूंछ के लिए इसी। TRIP8b-HCN जटिल 15, क्रिस्टल संरचना के आधार पर इस ग्यारह एमिनो एसिड खंड TRIP8b (241-602) के साथ बंधन का निर्माण करने के लिए पर्याप्त है। चरण 2 में, बातचीत का कश्मीर घ HCN1 FITC की एक निश्चित एकाग्रता में TRIP8b (241-602) titrating द्वारा मापा जाता है। चरण 3 में, चरण 2 में इस्तेमाल किया HCN पेप्टाइड का एक लेबल हटाया गया संस्करण है, तो FITC टैग बंधन के साथ हस्तक्षेप की जांच के लिए दोनों TRIP8b (241-602) और HCN1 FITC की एक निश्चित एकाग्रता में titrated है। इन प्रयोगों TRIP8b (241-602) और HCN1 FITC की उचित सांद्रता उच्च throughput स्क्रीन में इस्तेमाल के चयन के लिए आवश्यक हैं।

उच्च throughput स्क्रीन के आधार यह है कि एक छोटा सा अणु TRIP8b (241-602) और HCN1 FITC के बीच बातचीत में खलल न डालें एक दिसम्बर उत्पादन होगा करने में सक्षमध्रुवीकृत प्रकाश में rease। चरण 4 में, परख के Z कारक TRIP8b (241-602) और HCN1 FITC का एक दिया एकाग्रता के लिए 21 गणना की जाती है कि यह सुनिश्चित करने परख उच्च throughput प्रदर्शन (5 कदम) के लिए उपयुक्त है। चरण 6 और 7 पुष्टि करने के लिए कि हिट प्राथमिक उच्च throughput स्क्रीन में पहचान TRIP8b (241-602) और HCN1 FITC के बीच के बजाय एक अविशिष्ट तंत्र के माध्यम से बातचीत में खलल न डालें से अभिनय कर रहे हैं सत्यापन assays हैं। चरण 6 में, carboxytetramethylrhodamine (Tamra) HCN1 पेप्टाइड (HCN1 Tamra) एक अन्यथा समान प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण परख में इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट यौगिकों कि FITC टैग का उपयोग कर एफपी परख समझौता फिल्टर करने के लिए है -labeled। चरण 7 एक बड़ा HCN1 सी टर्मिनल टुकड़ा (HCN1 C40) का इस्तेमाल करता है और एक मनका-आधारित निकटता परख, जो प्रोटीन बातचीत के द्वारा एक दूसरे के करीब लाया एक स्वीकर्ता मनका के लिए एक दाता मनका से एक स्वेटर ऑक्सीजन की 'टनलिंग' पर आधारित है को रोजगार 22।

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Protocol

1. TRIP8b (241-602) प्रोटीन की शुद्धि

  1. सक्षम ई में बैक्टीरियल प्रोटीन अभिव्यक्ति वेक्टर pGS21 3 में TRIP8b (241-602) से युक्त प्लाज्मिड रूपांतरण निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए कोलाई। प्लेट Luria शोरबा (पौंड) पर संस्कृति के 300 μl chloramphenicol और एम्पीसिलीन के 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर के साथ -agar। 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
  2. अगले दिन, chloramphenicol और एम्पीसिलीन के 50 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ 50 मिलीलीटर लेग टीका लगाना एक भी कॉलोनी उठाओ। 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते (झटकों के साथ)।
  3. एम्पीसिलीन के 50 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ लेग के 1 एल के लिए 50 मिलीलीटर संस्कृति जोड़ें। झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. एक बार जब संस्कृति 0.8-1.2 के एक आयुध डिपो के 600 पढ़ने पर पहुँच गया है, 18 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के तापमान में परिवर्तन और 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए IPTG (इसोप्रोपाइल-बीटा-D-Thiogalactoside) जोड़ें। प्रोटीन अभिव्यक्ति 16 घंटे के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें।
  5. स्पिन ई 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 6000 XG पर कोलाई बैक्टीरिया गोली। सेंट्रीफ्यूज से ट्यूबों को हटाने के बाद, प्रक्रिया के शेष के लिए बर्फ पर बैक्टीरिया रहते हैं। phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड की 0.25 मिमी (PMSF) के साथ बफर के 36 मिलीलीटर में बैक्टीरिया Resuspend।
  6. 5-10 मिनट के लिए एक फ्लैट बोल्ट का उपयोग कर बर्फ पर resuspended बैक्टीरिया Sonicate, और 30 सेकंड के उच्च शक्ति में 'बंद' 'पर' 30 सेकंड के बीच बारी।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र। एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र यदि सतह पर तैरनेवाला अभी तक स्पष्ट नहीं है।
  8. 2 मिलीलीटर नी NTA मोतियों की एक स्तंभ के लिए सतह पर तैरनेवाला लागू करें। कोमल कमाल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
  9. अपार सामग्री स्तंभ के माध्यम से प्रवाह और बफर ए के 500 मिलीलीटर के साथ धोने के लिए अनुमति दें
  10. बफर बी के 250 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धो लें
  11. स्तंभ धो बफर के 125 मिलीलीटर के साथ 5 मिमी imidazole के साथ पूरक।
  12. प्रोटीन इधर-उधर Elute20 मिलीलीटर क्षालन बफर के साथ स्तंभ हूँ।
  13. एक सिरिंज का उपयोग - एक डायलिसिस कैसेट (10 केडीए आण्विक वजन कटऑफ) को eluted प्रोटीन जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंड फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 4 एल में 60 मिनट के लिए प्रोटीन Dialyze।
  14. ठंड पीबीएस की एक नई 4 एल बाल्टी में डायलिसिस कैसेट ले जाएँ। 4 ओ सी पर 16 घंटे के लिए प्रोटीन Dialyze
  15. अगली सुबह, एक Coomassie प्रोटीन परख किट का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता की जांच, निर्माता के निर्देशों का पालन। एक प्रोटीन concentrator का उपयोग निम्नलिखित निर्माता के निर्देशों, अगर 40 माइक्रोन के नीचे एक एकाग्रता मनाया जाता है प्रोटीन ध्यान लगाओ। अशेष और भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।

2. लघु प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण परख दो प्रोटीन टुकड़े की बातचीत विशेषताएँ

  1. 40 माइक्रोन के TRIP8b (241-602) के 200 μl गला लें और एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें। 11 अतिरिक्त 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए पीबीएस के 100 μl जोड़ें।
  2. TRIP8b (241-602) के 100 μl, श्रृंखला में अगले ट्यूब करने के लिए मूल ट्यूब से स्थानांतरित ऊपर और नीचे pipetting, और इस प्रक्रिया को दोहराते हुए धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करना। इस 0.01-40 सुक्ष्ममापी से लेकर TRIP8b (241-602) के 2 गुना dilutions की एक 12 सूत्री श्रृंखला का उत्पादन होगा।
  3. 0.1 माइक्रोन के HCN1 FITC (एक 10 माइक्रोन के विभाज्य के 6.5 μl) और पीबीएस में 2 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) के एक 650 μl मास्टर मिश्रण तैयार करें।
    नोट: मास्टर मिश्रण 2x है।
  4. 12 नए 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों सेट करें। प्रत्येक ट्यूब HCN1 FITC युक्त मास्टर मिश्रण के 50 μl जोड़ें, और उसके बाद 12 धारावाहिक dilutions में से प्रत्येक से 50 μl जोड़ें।
    नोट: यह 12 नलियों उत्पन्न होगा, प्रत्येक युक्त 0.05 सुक्ष्ममापी HCN1 FITC और TRIP8b (241-602) की एकाग्रता के आधे मूल सीरियल कमजोर पड़ने से।
  5. कमजोर पड़ने श्रृंखला एक परख थाली करने के लिए तीन प्रतियों में अच्छी तरह से प्रति 30 μl जोड़ें,। एक कम बाध्यकारी ठोस काले 384 अच्छी तरह से थाली का प्रयोग करें।
  6. स्पिन प्लेट चया आरटी पर 900 XG पर 2 मिनट।
  7. , एक microplate रीडर का उपयोग निर्माता के निर्देशों का पालन प्लेट पढ़ें। उपाय प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण निम्नलिखित माप मानकों का उपयोग: 485 एनएम उत्तेजना, 530 एनएम उत्सर्जन, 505 एनएम dichroic दर्पण, 100 मिसे एकीकरण का समय है।
  8. TRIP8b (241-602) एक लघुगणकीय पैमाने पर एकाग्रता बनाम ध्रुवीकरण (मध्य प्रदेश) मूल्यों प्लॉट। हिल समीकरण लेबल HCN1 पेप्टाइड के लिए TRIP8b (241-602) की आत्मीयता (कश्मीर घ) निर्धारित करने के साथ डेटा फिट।
    नोट: धारावाहिक dilutions की तैयारी के लिए, एक बहु अच्छी तरह से थाली भी ट्यूबों के बजाय प्रयोग किया जा सकता है।

3. एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का परीक्षण करें

  1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब लेबल हटाया गया HCN1 पेप्टाइड (200 माइक्रोन) के के 200 μl जोड़ें। 11 अतिरिक्त 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए पीबीएस के 100 μl जोड़ें। पहले ट्यूब के लिए पेप्टाइड के 200 μl युक्त ट्यूब से 100 μl के हस्तांतरण से धारावाहिक dilutions प्रदर्शन100 μl पीबीएस की। प्रक्रिया लेबल हटाया गया HCN1 पेप्टाइड का 2 गुना dilutions के साथ 12 नलियों उत्पन्न करने के लिए दोहराएँ।
  2. 0.2 माइक्रोन HCN1 FITC और 4 माइक्रोन के TRIP8b (241-602) के एक 650 μl मास्टर मिश्रण तैयार करें।
    नोट: यह एक 2x समाधान है।
  3. 12 नए 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए मास्टर मिश्रण के 50 μl जोड़ें।
  4. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए प्रत्येक धारावाहिक कमजोर पड़ने के 50 μl जोड़ें।
  5. तीन प्रतियों में काला 384 अच्छी तरह से microtiter प्लेट लोड करें, अच्छी तरह से प्रति 30 μl जोड़ने।
  6. आरटी पर 900 XG पर 2 मिनट के लिए थाली अपकेंद्रित्र।
  7. प्लेट एक microplate पाठक एफपी में सक्षम का उपयोग कर पढ़ें। कदम 2.7 में वर्णित के रूप में एक ही सेटिंग का प्रयोग करें।
  8. कश्मीर डी 1 = आईसी 50 / (1 + [एल] / कश्मीर डी 2), जहां कश्मीर डी 1 लेबल हटाया गया की आत्मीयता का प्रतिनिधित्व करता है: TRIP8b के लिए लेबल हटाया गया पेप्टाइड (241-602) चेंग Prusoff समीकरण का उपयोग करने का आत्मीयता की गणना TRIP8b (241-602), आईसी 50 के लिए पेप्टाइड पिछले चरण में चुना गया हैऔर लेबल ligand विस्थापित करने के लिए लेबल हटाया गया ligand की क्षमता है, [एल] 3.2 चरण में लेबल ligand की एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है, और कश्मीर डी 2 लेबल ligand के लिए TRIPb (241-602) की आत्मीयता है।

4. मूल्यांकन परख प्रदर्शन (गणना जेड फैक्टर)

  1. 2 माइक्रोन TRIP8b (241-602), 50 एनएम HCN1 FITC, और एफपी बफर में 1 मिमी डीटीटी के साथ एफपी बफर के एक 12 मिलीलीटर समाधान बनाने के द्वारा एक मास्टर मिश्रण तैयार करें।
    नोट: यह 40 माइक्रोन के TRIP8b (241-602) के 60 μl, 10 माइक्रोन के HCN1 FITC के 60 μl, और एफपी बफर के 1,080 μl की आवश्यकता होगी।
  2. एक काले रंग की 384 अच्छी तरह से microtiter थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए मास्टर मिश्रण के 30 μl जोड़ें।
  3. 192 कुओं के लिए 1 मिमी लेबल हटाया गया HCN1 पेप्टाइड का 1 μl जोड़ें सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए।
  4. 192 कुओं के लिए एफपी बफर के 1 μl जोड़ें नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए।
  5. आरटी पर 900 XG पर 2 मिनट के लिए थाली अपकेंद्रित्र।
  6. प्लेट एक मील का उपयोग कर पढ़ेंcroplate पाठक।
  7. निम्न सूत्र का उपयोग परख के लिए जेड कारक की गणना: जेड = 1 - 3 * (σ पीओएस -σ neg) / (μ neg -μ पीओएस) जहां σ स्थिति और σ neg सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कुओं का मानक विचलन कर रहे हैं और μ स्थिति और μ neg सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कुओं में औसत संकेतों प्रतिनिधित्व करते हैं।

5. उच्च Throughput स्क्रीन

  1. TRIP8b (241-602) और HCN1 FITC की aliquots गला लें और उन्हें बर्फ पर रहते हैं।
  2. एफपी बफर में TRIP8b (2 माइक्रोन) और HCN1 FITC (50 एनएम) के 10 मिलीलीटर की तैयारी।
  3. एक कम से बाध्यकारी एक पिपेट का उपयोग कर 384 अच्छी तरह से काले microtiter प्लेट के प्रत्येक कुएं में मिश्रण के 25 μl बांटना।
  4. पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए, प्रत्येक के कॉलम में अच्छी तरह से 3 22 (प्रत्येक के लिए 40 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता) के लिए एक ध्वनिक तरल हैंडलर का उपयोग करने में यौगिकों जोड़ें।
    नोट: relativel के कारणY कम मारा इस परख के साथ मनाया दर, दो अलग अलग यौगिकों एक भी अच्छी तरह से में जमा थे। प्रत्येक सक्रिय अच्छी तरह से दो यौगिकों बाद में जो गतिविधि प्रदत्त की पहचान करने के लिए व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किया गया।
  5. डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के 100 nl कॉलम 1 और प्रत्येक थाली के 23 के रूप में नकारात्मक नियंत्रण के प्रत्येक कुएं में जोड़ें।
  6. कॉलम 2 और एक थाली के 24 के रूप में सकारात्मक नियंत्रण के प्रत्येक कुएं में लेबल हटाया गया HCN1 पेप्टाइड जोड़ें।
  7. 2 घंटे के लिए आरटी पर प्लेटें सेते हैं। प्लेटों पढ़ें या पढ़ने से पहले 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  8. उपाय के एक प्लेट रीडर पर प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण। कदम 2.7 में वर्णित के रूप में एक ही सेटिंग का प्रयोग करें।
  9. 100% के रूप में प्रत्येक थाली से औसत सकारात्मक और नकारात्मक संकेतों नियंत्रण का उपयोग कर सामान्य से प्रतिशत निषेध की गणना। जहां एक्स एन सामान्यीकृत प्रतिशत निषेध संकेत एक्स के लिए इसी है, एक्स पीओएस समीकरण XN = 100% * - (- x) / (एक्स एक्स neg पीओएस) (एक्स neg) का प्रयोग करें neg नकारात्मक नियंत्रण कुओं से संकेत है।

6. हिट की पुष्टि Tamra टैग HCN पेप्टाइड का उपयोग

  1. मान्य 50% से अधिक निषेध Tamra लेबल HCN1 पेप्टाइड (HCN1 Tamra) का उपयोग कर के साथ हिट।
    1. 2 माइक्रोन TRIP8b (241-602) और 50 एनएम HCN1 Tamra एफपी में बफर के 12 मिलीलीटर की एक मास्टर मिश्रण तैयार करें।
    2. एक काले रंग की 384 अच्छी तरह से microtiter प्लेट के प्रत्येक कुएं में मास्टर मिश्रण के 25 μl बांटना।
    3. संबंधित कुओं में प्रत्येक सक्रिय यौगिकों के धारावाहिक dilutions स्थानांतरण। दो गुना dilutions ऐसी है कि प्रत्येक की एकाग्रता 200 माइक्रोन के लिए 0.2 माइक्रोन से पर्वतमाला मारा बनाओ।
    4. नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के लिए, प्रत्येक कुएं में DMSO के 100 nl हस्तांतरण। सकारात्मक नियंत्रण के लिए 200μM से 0.1μM को लेकर अंतिम एकाग्रता के साथ क्रमानुसार पतला लेबल हटाया गया HCN1 पेप्टाइड के 100 nl जोड़ें।
    5. आरटी पर थाली सेते2 घंटे के लिए। प्लेटों पढ़ें या 4 में 16 घंटे के लिए सेते पढ़ने से पहले सें।
    6. उपाय प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण (मध्य प्रदेश) के बाद माप मानकों का उपयोग: 535 एनएम उत्तेजना; 580 एनएम उत्सर्जन; 535 एनएम dichroic दर्पण, 20 मिसे एकीकरण का समय है।
    7. एक चार पैरामीटर nonlinear प्रतिगमन मॉडल 23 का उपयोग कर प्रत्येक यौगिक की एकाग्रता निर्भर एफपी डेटा फिटिंग द्वारा आईसी 50 मूल्यों की गणना।

7. मनका-आधारित निकटता परख की खुराक-प्रतिक्रिया का सत्यापन

  1. उनकी टैग TRIP8b (241-602) (उनकी TRIP8b) और जीएसटी टैग HCN1 (GST- HCN1 C40) संलयन प्रोटीन की 1 विभाज्य गला लें और उन्हें बर्फ पर रहते हैं।
  2. 400 एनएम उनकी TRIP8b और 40 एनएम जीएसटी HCN1 C40 की सांद्रता में परख बफर में जीएसटी HCN1 C40 के साथ उनका-TRIP8b जुडा है। प्रत्येक परिसर के लिए मिश्रण के 300 μl तैयार परीक्षण किया जाना है।
    नोट: यौगिकों 11 विभिन्न सांद्रता के साथ साथ एक डीएम पर तीन प्रतियों में चलाए जा रहे हैंतो नियंत्रण (कोई यौगिक)।
  3. नियंत्रण कुओं के लिए, अपने-TRIP8b (200 एनएम) जीएसटी HCN1C40 बिना के 30 μl तैयार करने और फिर अलग से परख बफर में उनकी TRIP8b बिना जीएसटी HCN1C40 (20 एनएम) के 30 μl तैयार करते हैं।
  4. एक 16-चैनल पिपेट का उपयोग कर एक थाली के 36 कुओं के लिए जीएसटी HCN1 C40 मिश्रण (ऊपर कदम 7.2 में तैयार): प्रत्येक यौगिक परीक्षण किया जाना है, उनकी TRIP8b के 7 μl जोड़ें। एक भी यौगिक परीक्षण के लिए, पंक्तियों अल में 12 विभिन्न सांद्रता और स्तंभों 1-3 में तीन प्रतिकृति की व्यवस्था। कॉलम पंक्ति एम के 1-3 और जीएसटी HCN1 C40 समाधान (7.3 में तैयार) के 7 μl कॉलम पंक्ति एन 1-3 करने के लिए उनकी TRIP8b समाधान (7.3 में तैयार) के 7 μl जोड़े संक्षेप में थाली करने के लिए अपकेंद्रित्र सुनिश्चित तरल पदार्थ प्रत्येक कुएं के तल पर हैं और किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए।
  5. बांटना हिट यौगिकों की थाली में परीक्षण किया जा करने के लिए इस तरह की है कि प्रत्येक की एकाग्रता 200 सुक्ष्ममापी (पंक्ति) में 0.1 सुक्ष्ममापी (पंक्ति में कश्मीर) के लिए नीचे पर्वतमाला से मारा। की एक मात्रा बांटनापंक्तियों एल.एन. कि पंक्तियों एके में तिरस्कृत यौगिक की राशि मैचों में DMSO।
  6. 2 मिनट के लिए थाली हिला और आरटी पर 2.5 घंटे के लिए सेते हैं।
  7. परख बफर के साथ विरोधी जीएसटी अपनाने मोती 01:50 पतला।
  8. एक 16-चैनल पिपेट के साथ थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से पतला अपनाने मोतियों की 3.5 μl जोड़ें और धीरे बुलबुले बनाने से बचने के लिए pipetting द्वारा मिश्रण।
  9. अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
  10. परख बफर के साथ निकल Chelate डोनर मोती 01:50 पतला। प्रकाश करने के मिश्रण का खुलासा नहीं करते।
  11. एक 16-चैनल पिपेट के साथ थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से पतला डोनर मोतियों की 3.5 μl जोड़ें और धीरे बुलबुले बनाने से बचने के लिए pipetting द्वारा मिश्रण।
  12. अंधेरे में आरटी पर 1.5 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
  13. एक प्लेट रीडर पर पढ़ें। 40 मिसे उत्तेजना समय, 100 मिसे उत्सर्जन समय, 0.1 मिमी का पता लगाने में ऊंचाई: निम्नलिखित माप मानकों के साथ एक प्लेट रीडर का प्रयोग करें।
  14. पूर्वी वायु कमान के लिए फिटिंग डेटा द्वारा आईसी 50 मूल्यों की गणनाज यौगिक एक चार पैरामीटर nonlinear प्रतिगमन मॉडल 23 का उपयोग कर।

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Representative Results

हमारे पिछले प्रकाशन के साथ कॉपीराइट मुद्दों से बचने के लिए, एक Tamra टैग जांच HCN1 Tamra आंकड़े 2 और 3 उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ध्यान दें कि यह प्रतिस्थापन परिणामों में एक प्रशंसनीय फर्क नहीं पड़ा, और प्रोटोकॉल HCN1 FITC के साथ ऊपर उल्लिखित उन लोगों के लिए समान हैं। HCN1 Tamra, TRIP8b (241-602) के साथ बातचीत का आकलन करने के HCN1 Tamra की एक निश्चित एकाग्रता प्रोटोकॉल चरण 2 (चित्रा 2) में उल्लिखित का उपयोग करने में titrated किया गया था। अगले, प्रयोग चरण 3 में उल्लिखित प्रदर्शन किया गया था और लेबल हटाया गया HCN1 पेप्टाइड TRIP8b (241-602) और HCN1 Tamra (चित्रा 3) की एक निश्चित एकाग्रता में titrated किया गया था।

सत्यापित करें कि परख उच्च throughput प्रदर्शन के लिए उपयुक्त था, इसके प्रदर्शन को अगले चरण 4 में प्रोटोकॉल द्वारा जांच की गई थी; और 0 से जेड कारक है।89 प्राप्त किया गया था, यह दर्शाता है कि परख उच्च throughput स्क्रीनिंग (चित्रा 4) के लिए तैयार किया गया था। फिर, एक 20,000 यौगिक छोटे अणु पुस्तकालय प्रक्रिया चरण 5 में उल्लिखित सभी यौगिकों है कि 50% से ऊपर प्रतिशत निषेध तो HCN1 Tamra (चरण 6) के साथ दूसरे एफपी परख में परीक्षण किया गया द्वारा दिखाई गई। अंत में, इस बात की पुष्टि हिट मनका-आधारित निकटता परख (चरण 7, चित्रा 5) में परीक्षण किया गया। एक हिट यौगिक, NUCC-5953, इन प्रयोगों के परिणाम के रूप में पहचान की थी।

आकृति 1
चित्रा 1: उच्च throughput प्रदर्शन के लिए कार्यप्रवाह का वर्णन कार्यप्रवाह HTS योजनाबद्ध।। नीचे से ऊपर, प्रत्येक त्रिकोण प्रोटोकॉल में एक कदम का प्रतिनिधित्व करने के साथ से आरेख आय। एक देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का बड़ा संस्करण।

चित्र 2
चित्रा 2:। प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की कश्मीर डी (ए) योजनाबद्ध प्रयोग चरण 2 में वर्णित TRIP8b के रूप में दिखा (241-602) HCN1 Tamra की एक निश्चित एकाग्रता में titrated है, TRIP8b की TPR डोमेन (ग्रे) में बाँध 11 एमिनो एसिड पेप्टाइड करने के लिए (काले रंग में, टर्मिनल 'एसएनएल' के साथ प्रकाश डाला)। (बी) TRIP8b की एकाग्रता के रूप में (241-602) बढ़ जाती है, और अधिक HCN1 Tamra अणुओं बाध्य और ध्रुवीकरण बढ़ जाती है (कश्मीर डी = 0.320.01μM) हो जाते हैं। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन निरूपित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन चित्रा 3:। सकारात्मक नियंत्रण के आईसी 50 (ए) चरण 3 के रूप में लेबल हटाया गया HCN1 पेप्टाइड के लिए योजनाबद्ध प्रदर्शन प्रयोगात्मक प्रतिमान TRIP8b (241-602) और HCN1 Tamra की एक निश्चित एकाग्रता में titrated है, लेबल पेप्टाइड विस्थापित है। (बी) ध्यान दें कि संकेत लेबल हटाया गया HCN1 बढ़ जाती है की एकाग्रता के रूप में कम हो जाती है, HCN1 Tamra के विस्थापन (आईसी 50 = 1.070.08μM) का संकेत है। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन निरूपित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। एचटीएस से प्रतिनिधि परिणाम (ए) उच्च throughput सुप्रीम कोर्ट से परिणाम रीन प्रोटोकॉल चरण 5 ग्राफ पर प्रत्येक बिंदु एक ही परिसर का प्रतिनिधित्व करता है में उल्लिखित का उपयोग कर प्रदर्शन किया। एक्स और वाई निर्देशांक प्रत्येक रन में प्रतिशत निषेध द्वारा निर्धारित कर रहे हैं। (बी) के स्क्रीन से परिणाम सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण (किंवदंती देखें) के साथ साजिश रची। प्रत्येक यौगिक का औसत प्रतिशत निषेध (परख के दो रन के पार) वाई अक्ष पर साजिश रची है। (सी) एक Tamra लेबल HCN1 पेप्टाइड का उपयोग कर पुष्टि एफपी प्रयोगों से परिणाम। चरण 5 में 50% से अधिक निषेध दिखा यौगिकों तो, चरण 6 में इस्तेमाल किया गया में (ए) के रूप में एक्स और वाई निर्देशांक परख के दो रन में प्रतिशत निषेध द्वारा निर्धारित कर रहे हैं। हान एट अल। 3 से reproduced। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 5:। मनका-आधारित निकटता परख (ए) योजनाबद्ध मनका-आधारित निकटता परख दिखा। TRIP8b (241-602) एक एन टर्मिनल hexahistidine टैग कि निकल Chelate दाता मोती बांधता (धारियों के साथ वृत्त) शामिल हैं। HCN1 C40 एक एन टर्मिनल जीएसटी टैग कि स्वीकर्ता मोती बांधता शामिल हैं। जब TRIP8b की TPR डोमेन और HCN1 के सी टर्मिनल tripeptide की बातचीत से निकटता में लाया, 680 एनएम तरंगदैर्ध्य के प्रकाश से दाता मनका की उत्तेजना स्वेटर ऑक्सीजन पैदा करता है। यह स्वेटर ऑक्सीजन स्थानान्तरण ऊर्जा एक निर्धारित दायरे में मोती अपनाने और प्रकाश का उत्सर्जन की ओर जाता है। (बी) TRIP8b (241-602) और HCN1 C40 की एक निश्चित एकाग्रता में मारा यौगिक (NUCC-5953) की सांद्रता में वृद्धि का अनुमापन। हान एट अल। 3 से reproduced। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन निरूपित।लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

MDD 24 में एक चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में अपनी क्षमता की वजह से, वहाँ औषधीय दृष्टिकोण है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में 4 HCN चैनल समारोह के विरोध में काफी रुचि रही है। हालांकि, इन प्रयासों हृदय pacemaking में HCN चैनलों की महत्वपूर्ण भूमिका और अतालता 25 के जोखिम से ठप कर दिया है। हम तर्क है कि HCN और उसके मस्तिष्क विशिष्ट सहायक सबयूनिट, TRIP8b 8, के बीच बातचीत में खलल न डालें हृदय HCN चैनलों 3 को प्रभावित किए बिना एंटी-तरह प्रभाव का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त हो सकता है। इस परिकल्पना अवलोकन है कि चूहों TRIP8b दिखा रहे एंटी-तरह व्यवहार 7 कमी से बल मिला था। इस बातचीत का लक्ष्य निर्धारण MDD के उपचार के लिए एक नए प्रतिमान बन सकता है।

TRIP8b की TPR डोमेन और HCN1 के सी टर्मिनल tripeptide है के बीच बातचीत के छोटे अणु अवरोधकों की पहचान करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉलऊपर प्रस्तुत किया। इसके सामान्य आवेदन की सुविधा के लिए, हम हमारे यहाँ तर्क है कि इस परख के विकास के लिए नेतृत्व का वर्णन है। TRIP8b दो स्थानों पर HCN सब यूनिटों को बांधता है, हम TRIP8b की TPR डोमेन और HCN के सी टर्मिनल पूंछ के बीच बातचीत पर ध्यान केंद्रित किया। एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा इस बातचीत के संरचनात्मक व्याख्या एक गहरी जेब HCN 15 के सी टर्मिनल के आसपास TRIP8b की TPR डोमेन द्वारा गठित पता चला। दूसरी TRIP8b-HCN बातचीत TRIP8b के एक 80 एमिनो एसिड खिंचाव (TPR डोमेन के लिए एन टर्मिनल स्थित) और HCN की चक्रीय न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी डोमेन के बीच होता है। इस बातचीत प्रत्येक प्रोटीन के कई अलग अलग अमीनो एसिड भर में होता है और कम अच्छी तरह से परिभाषित intermolecular बातचीत 26 के साथ एक फैलाना सतह का गठन किया। इन संरचनात्मक टिप्पणियों के आधार पर, हम तर्क है कि TRIP8b की TPR डोमेन और HCN के सी टर्मिनल के बीच बातचीत एक छोटा सा अणु inhi द्वारा विघटन करने के लिए अतिसंवेदनशील हैbitor।

प्रारंभ में, TRIP8b का एक बड़ा टुकड़ा धारणा एक लंबे समय तक निर्माण allosteric नियामक साइटों है और सफलता के लिए मौका वृद्धि हो सकती है कि आधार पर परख में इस्तेमाल किया गया था। पूर्ण लंबाई TRIP8b शुरू में इस्तेमाल किया गया था, लेकिन इस दृष्टिकोण फ्रीज पिघलना चक्र से प्रोटीन एकत्रीकरण, क्षरण और संवेदनशीलता ही सीमित था। इसके बाद दो intermediately आकार TRIP8b का निर्माण, एक लंबे समय तक एक (अवशेषों 219-602) और एक छोटे से एक (अवशेषों 259-602), एक मध्यवर्ती निर्माण से पहले परीक्षण किया गया (अवशेषों 241-602) का चयन किया गया। हालांकि ऊपर वर्णित चार truncations के प्रत्येक HCN के सी टर्मिनल के लिए बाध्य करने के लिए प्रासंगिक TPR डोमेन होते हैं, केवल मध्यवर्ती लंबाई क्लोन (241-602) स्क्रीनिंग assays में उपयोग के लिए पर्याप्त रूप से स्थिर था। विशेष रूप से, हम अतिरिक्त जुदाई कदम के बिना नी 2 + आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्धि के बाद प्रोटीन की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने में सक्षम थे।

choos के बादTRIP8b और HCN का एक उपयुक्त टुकड़ा हैैं, हम अगले TRIP8b (241-602) के लिए लेबल HCN1 पेप्टाइड की आत्मीयता चुना गया। एक सामान्य नियम के रूप में, एक सटीक माप ही अगर ligand की एकाग्रता काफी बाध्यकारी साथी 28 की कश्मीर डी नीचे है बनाया जा सकता है। हमारे मामले में, हम चरण 2 में प्रयोग के लिए लेबल HCN1 पेप्टाइड का 50 एनएम इस्तेमाल किया, और 0.320.01μM की एक कश्मीर डी प्राप्त की। प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के बारे में अधिक प्रयोगात्मक डिजाइन विचार के लिए, पाठकों विषय 27-30 पर कई उत्कृष्ट समीक्षा से एक के लिए भेजा जाता है।

एक बार जब हम TRIP8b के लिए लेबल HCN1 पेप्टाइड (241-602) की कश्मीर डी चुना गया है, हम तो निर्धारित करता है, तो लेबल खुद को बंधन के साथ हस्तक्षेप। चरण 3 में, हम TRIP8b (241-602) की एक निश्चित एकाग्रता में एक लेबल हटाया गया HCN1 पेप्टाइड titrating लेबल पेप्टाइड को विस्थापित करने से 1.070.08 माइक्रोन की आईसी 50 मूल्य प्राप्त की। कश्मीर डी के साथ संयुक्त TRIP8b (241-602), और चेंग Prusoff समीकरण को लागू करने के लिए लेबल पेप्टाइड, हम तो कश्मीर डी = 0.93μM रूप TRIP8b (241-602) के लिए लेबल हटाया गया पेप्टाइड की आत्मीयता का अनुमान है। इस लेबल पेप्टाइड के लिए TRIP8b (241-602) की आत्मीयता के साथ बंद समझौते में है, और पता चलता है कि पेप्टाइड लेबलिंग काफी TRIP8b करने के लिए अपने संबंध को प्रभावित नहीं किया। प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण आधारित स्क्रीन की एक महत्वपूर्ण विशेषता के रूप में 0.89 की एक जेड कारक ने संकेत शोर अनुपात करने के लिए अपने उत्कृष्ट संकेत है। अन्य मानकों के साथ ही, एफपी संकेत में परिवर्तन की भयावहता बाध्यकारी साथी (TRIP8b (241-602)) और fluorophore लेबल ligand के आकार के आकार के द्वारा निर्धारित होता है। ध्रुवीकरण (44 से 224 सांसद) में एक परिवर्तन के साथ अपनी स्वतंत्र और राज्यों के बीच 11 एमिनो एसिड पेप्टाइड ligand के साथ मनाया ~ 42 केडीए TRIP8b (241-602) प्रोटीन को निशाना बनाया बातचीत पुन: पेश करने के लिए पर्याप्त है और एक पर्याप्त गतिशील रेंज प्रदान करता है पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए।

ntent "> किसी भी उच्च throughput स्क्रीनिंग परख की चुनौतियों में से एक सच्चा भेद है प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण आधारित स्क्रीन में संकेत तीव्रता में परिवर्तन से artifactual यौगिकों 'हिट'।, यह आम है के लिए कई यौगिकों या तो fluorophore के साथ सीधे बातचीत या पर प्रतिदीप्ति के लिए अपने स्वयं के। इन मुद्दों, एक दो चरण स्क्रीनिंग दो अलग fluorophores का उपयोग कर ऊपर वर्णित प्रक्रिया है नाकाम करने के लिए। यह प्रक्रिया fluorophore बाध्यकारी करने की संभावना है कि फ्लोरोसेंट यौगिकों और यौगिकों fluorophore स्क्रीनिंग प्रक्रिया के माध्यम से अग्रिम जाएगा के साथ सीधे बातचीत के दौरान कम कर देता है। इसके अलावा , कुछ यौगिकों इन विट्रो में 'एग्रीगेटर्स' के रूप में कार्य और प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण संकेत में अविशिष्ट बदलाव के लिए नेतृत्व। इन यौगिकों डिटर्जेंट के प्रति संवेदनशील micellar संरचनाओं फार्म और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत 31,32 को बाधित करने के लिए लगा रहे हैं। इन प्रभावों को कम करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण उच्च में इस्तेमाल किया बफरहालांकि अन्य डिटर्जेंट के साथ अतिरिक्त सत्यापन विचार किया जाना चाहिए throughput स्क्रीनिंग ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल, एक डिटर्जेंट (ट्राइटन) शामिल हैं।

यह ऊपर वर्णित स्क्रीनिंग प्रक्रिया के कई महत्वपूर्ण सीमाओं देखते हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए। TRIP8b दो स्थानों में HCN को बांधता है, स्क्रीन के ऊपर वर्णित केवल एक बातचीत साइट की जाँच और CNBD बातचीत को निशाना छोटे अणुओं की पहचान नहीं होंगे। इसी तरह, यौगिकों कि allosterically एन टर्मिनल क्षेत्र में TRIP8b के साथ बातचीत से TRIP8b HCN के लिए बाध्य मिलाना हिट के रूप में पहचान नहीं की जाएगी। इन विचारों के दोनों एक छोटे TRIP8b टुकड़ा (ऊपर देखें) है, जो प्रक्रिया में उल्लिखित स्क्रीनिंग assays में reproducibility सुनिश्चित करता है का उपयोग करने का परिणाम है। आदेश में इन सीमाओं से बचने के लिए, भविष्य के प्रयासों पूरी लंबाई HCN को शामिल करने के लिए एक सेल आधारित स्क्रीन का उपयोग कर के निर्देश पर किया जा सकता है और TRIP8b constructs 33,34। स्क्रीन के इस तरह के उच्च टी पर भरोसा कर सकते हैंआदेश HCN और TRIP8b के बीच बातचीत में खलल न डालें, और कोशिका की सतह पर HCN चैनलों की अभिव्यक्ति को सीमित करने में सक्षम यौगिकों की पहचान करने में electrophysiological तरीकों hroughput। ध्यान से, इस तरह के रूप में इन के रूप में इस विवो में बंद लक्ष्य प्रभाव को ले जा सकता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि छोटे अणुओं सीधे विरोधी के रूप में HCN चैनल समारोह सीमित नहीं थे जवाबी स्क्रीन शामिल करने की आवश्यकता होगी दृष्टिकोण।

हालांकि HCN1, HCN2, और HCN4 सब एक संरक्षित 'एसएनएल' सी टर्मिनल पेप्टाइड है, अवशेषों इस tripeptide के लिए एन टर्मिनल में काफी भिन्नता है और संभावना TRIP8b बंधन आत्मीयता प्रभावित करते हैं। यह संभावना है कि एक छोटा सा अणु स्क्रीन के द्वारा प्राप्त या अन्य हिट यौगिकों के आधार पर तैयार TRIP8b-HCN बातचीत में खलल न डालें में HCN isoform विशिष्टता प्रदान कर सकता मारा उठाती है। मूल स्क्रीन में, NUCC-5953 पहली बार छोटे TRIP8b और HCN1 3 के बीच बातचीत में खलल न डालें करने में सक्षम अणु के रूप में पहचान की थी। भविष्य Worइस परख के साथ कश्मीर दवा के विकास के लिए वांछनीय रासायनिक गुणों के साथ अतिरिक्त छोटे अणु अवरोधकों की पहचान हो सकती है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ni-NTA agarose  Qiagen 30210
Dialysis cassette  ThermoFisher 66456
Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside  Sigma-Aldrich I5502 - 1 gr
384-Well Black plate  Corning 3820
Proxiplate  Perkin-Elmer  6008289
Anti-GST Acceptor beads  Perkin-Elmer  6760603C
NiChelate Perkin-Elmer  AS101D
pGS21-a Genscript SD0121
PMSF Sigma-Aldrich 10837091001
Coomassie Kit ThermoFisher 23200
Protein concentrator ThermoFisher 88527
Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader Perkin-Elmer  #2300-001M
BL21 (DE3) Competent Cells Agilent 200131

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References

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