Abstract
Som med lille molekyle lægemiddelforskning, screening for peptidagonister kræver seriefortynding af peptider til fremstilling koncentration-respons kurver. Screening peptider giver et ekstra lag af kompleksitet som konventionelle prøvehåndtering metoder tip-baserede udsætte peptider til et stort areal af plastvarer, hvilket giver en øget mulighed for peptid tab via adsorption. Forebyggelse overdreven udsættelse for plastvarer reducerer peptid tab via tilslutning til plast og dermed minimerer unøjagtigheder i styrke forudsigelse, og vi har tidligere beskrevet fordelene ved berøringsfri akustisk afgivelse til in vitro high-throughput screening af peptid agonister 1. Her diskuterer vi en fuldt integreret automation løsning til berøringsfri akustisk Fremstilling af peptid seriefortyndinger i mikrotiterplader under anvendelse af eksemplet med screening for peptidagonister på muse glucagonlignende peptid-1-receptor (GLP-1 R). Vores metoder tillader høj-throughput cellebaserede assays til screening for agonister og er let skaleres til at understøtte forøgede stikprøve gennemløb, eller at tillade øget antal assaypladen kopier (fx til et panel af flere mål-cellelinier).
Introduction
GLP-1R er en etableret lægemiddelmål i behandlingen af type 2 diabetes 2. Den native peptid agonist for denne receptor, GLP-1, har en in vivo halveringstid på 2-3 min 3. Bindingen af GLP-1 til dets G-protein koblet target receptor resulterer i nedstrøms produktion af second messenger cAMP gennem nativt G-protein kobling til aktivering af adenylylcyclase. Måling af den akkumulerede cAMP giver en robust analysen til overvågning receptoraktivering og at screene for aktive GLP-1-analoger med foretrukne fysisk-kemiske egenskaber. Et sådant assay kræver seriel fortynding af prøver til konstruktion koncentration-respons-kurver, og det er særligt kompliceret, når uddele peptidprøver. Potentielle fejl fra tip-baserede seriefortynding forberedelse er tidligere 1,4,5 blevet beskrevet. Peptider vil adsorbere til plastvarer, hvilket resulterer i upålidelige potens skøn. Peptid tab kan minimeres gennem than medtagelse af bovint serumalbumin (BSA) i buffere og anvendelsen af silikoniseret plastvarer, endnu protein binding, er uforudsigeligt. Især har variationen i binding af GLP-1 til eksperimentelle beholdere blevet beskrevet 6. Der er en yderligere komplikation i at stabilisering, der anvendes i laboratoriet plasticware kan udvaskes fra tips og mikrotiterplader i vandige assay buffere og forstyrre protein-funktion 7, 8. Derfor metoder til at reducere eksponeringen for plastvarer er nødvendige for at øge nøjagtigheden af målingerne.
Akustiske flydende dispensere fokusere en højfrekvent akustisk signal på overfladen af en fluidprøve, hvilket resulterer i udstødning af præcise nanoliter dråber i et tilstødende assayplade 9. Brugen af akustiske udslyngning er standard i den farmaceutiske industri til forberedelse og screening af store syntetiske sammensatte biblioteker, og teknologien er blevet godt valideret for små molecules 10. Så vidt vi ved, er vi de første gruppe til at beskrive akustisk afgivelse til fremstilling af rekombinante og syntetiske peptider, og vi har tidligere rapporteret den forbedret nøjagtighed i forhold til konventionelle tip-baserede metode 1.
Denne artikel beskriver integrationen af udarbejdelsen af peptid serielle og direkte fortyndinger af ikke-kontakt akustisk overførsel på en fuldt automatiseret plade håndtering robotteknologi system. Et antal fremgangsmåder, der omfatter akustisk overførsel af prøver er tidligere blevet 11 beskrevet. Vi anvender en to-trins metode til fremstilling af mellemprodukter stamkoncentrationer og serielt fortyndet peptidanaloger til generering af den fulde dosis-respons kurve. De fremstillede peptider inkuberes med celler, der udtrykker mål-muse GLP-1R, og vi bruger et almindeligt homogen tidsopløst fluorescens (HTRF) assay til måling cAMP-akkumulering i disse celler som en udlæsning af peptidagonist aktivitet. Assayet er robust og modtagelig for en high-throughput 384-brønds format og rutinemæssigt anvendt til både assay udvikling og lægemiddelscreening projekter 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Peptid seriefortynding
- Forbered assaypuffer: Hanks pufrede saltopløsning (HBSS) suppleret med 25 mM HEPES, 0,1% BSA og 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), pH 7,4.
- Brug en bulk reagens dispenser til systematisk tilsættes 5 pi assaypuffer til hver brønd i fem 384-brønds lave volumen assayplader.
- Brug intern software til at skabe en dispenseringsprogram i 5 pi volumen tillæg til hver brønd i en plade med 384 brønde i henhold til producentens anvisninger.
- Fordyb dispensering kassette slanger i assaybuffer og prime væske.
- Placer 384 brønde lavt volumen assayplade på plade bærer.
- Tryk start.
- Fortynd alle peptidprøver, uanset oplagring køretøj, i analysebuffer til fremstilling af en 100x peptid lager.
BEMÆRK: Peptider, der kræver screening kan tilvejebringes i phosphatbufret saltvand (PBS) eller dimethylsulfoxid (DMSO) som anses for passende (f.eks DMSO wsyg har en skadelig virkning på peptider med sekundære modifikationer, såsom PEGylering). - Dispenser 25 pi 100x peptid lagre i kolonner 1-5 af en akustisk kvalificeret 384-godt polypropylen mikroplade. Denne plade er betegnet 'source plade A'. Sørg for, at kilde plader, men ikke destination plader, er fladbundet og i overensstemmelse med specifikke akustiske tolerancer som defineret af fabrikanten af akustiske instrumenter.
- Dispenser 25 pi 100x henvisning kontrol i boringer A23 og A24 af kilde plade A.
- Dispensere 10 pi assaypuffer i spalter 11-15 og 30 pi assaypuffer i søjler 21-22 af kildeplade A.
- Dispenser 10 pi assay buffer ind kolonner 6-10 og søjler 16-20 af et sekund akustisk kvalificeret 384-brønd polypropylen mikroplade. Denne plade er betegnet 'source plade B'.
- Centrifuge source plader A og B ved 300 xg i 1 min. Medtag en passende balance plade.
- Brug akustisk bomuld, lid dispensere integreret i et automatiseret robotsystem til at forberede tre sekventielle 1: 100 mellemliggende fortyndinger (i assay buffer) for de 100x peptid lagre fra kolonne 1 i kilde A.
BEMÆRK: programmering kræver plade omformatere og dosis-respons-software (som fastsat af fabrikanten af den akustiske væske dispenser) for at tillade tre akustiske overførsler mellem kilden A og kilde B (se figur 1 for plade layout). Trin 1.9 detaljer specifikt brugen af flydende dispensere, der anvendes i dette laboratorium under automatiseret robot kontrol (se Materialer tabel):- Load source plader og assay plader i plade hotel sektion af robotteknologi.
- Open automatiseret robot software og belastningsplade omformatere og dosis-respons-program ekspansion protokoller. Klik på 'Kør'.
BEMÆRK: Automatisering instruerer en akustisk væske dispenser til at overføre 250 nl fra søjlerne 1-5 af kilde plade A i søjler 6-10 af kilde plade B, og en anden acoustic fluiddispenser kan håndtere større væskemængder at fylde op med 15 pi assaypuffer at blande. Automation overfører derefter kilde plade B til integreret centrifuge og centrifuger ved 300 xg i 1 min (en passende balance plade er inkluderet for alle centrifugeringstrin). Kilde plade B returneres til den akustiske væske dispenser til overførsel af 250 nl fra søjler 6-10 af kilde plade B i søjler 11-15 af kilde plade A og efterfylde med 15 pi assay buffer til at blande. Automation overførsler kilde plade A til integreret centrifuge og centrifuger ved 300 xg i 1 min. Kilde plade A returneres derefter til den akustiske væske dispenser til overførsel af 250 nl fra søjler 11-15 oprindelsesbetegnelser plade A i søjler 16-20 af kilde plade B og efterfylde med 15 pi assay buffer til at blande. Automation overfører derefter kildeplade B til integreret centrifuge og centrifuger ved 300 xg i 1 min.
BEMÆRK: Endelig dosis respons protokollen dirigerer akustisk dispensering at overføreden ønskede mængde fra hvert af de 4 serielt fortyndede kilde brønde (i begge kildepladen A og kilde plade B) at konstruere en fuld 11-punkts kurve i to eksemplarer på assayplader (fyldt med 5 pi assaypuffer i trin 1.2 ovenfor ). Automation overfører assay plade til integreret centrifuge og centrifuger ved 300 xg i 1 min.
2. Cell Fremstilling
- Optø kryopræserverede ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO) celler, der udtrykker mål-muse GLP-1-receptor hurtigt i et 37 * C vandbad og resuspender i 20 ml assaypuffer.
- Centrifuge cellesuspension i 5 minutter ved 200 xg ved stuetemperatur (RT). Medtag en passende balance.
- Supernatanten kasseres og resuspender cellepelleten i 10 ml assaypuffer.
- Fortynd celle stamopløsning 1: 1 i Trypan blå og bestemme levedygtige celledensitet anvendelse af en automatiseret celletæller. Resuspender celler i assaypuffer ved 1,6 x 10 6 celler pr ml (svarende til 8000 celler pr well assayplader).
- Brug en bulk reagens dispenser at tilføje 5 pi cellesuspension til hver brønd i assay-plader (indeholdende serielt fortyndede peptider i 5 pi assaypuffer) og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter.
Assay 3. HTRF cAMP Detection
- Bring HTRF cAMP assay kit til stuetemperatur i 30 minutter før anvendelse.
- Forbered hver HTRF reagens (cryptat og d2) separat på 1:20 fortynding i lysisbuffer (proprietære formulering, som leveres af producenten af cAMP afsløring assay).
BEMÆRK: ADVARSEL: Lysis buffer indeholder kaliumfluorid (KF), som er giftigt og teratogent 13. Ved bortskaffelse bør assay plader indeholdende KF forsegles og forbrændes, og enhver flydende affald skal fortyndes til <1 mmol / l med vand før bortskaffelse ned i vasken. - Brug en bulk reagens dispenser at tilføje 5 pi cryptat reagens til alle brøndene i assaypladerne.
- Brug en bulk reagens dispenser at tilføje 5 pi d2 reagens til Columns 1-22 af assaypladerne.
- Umiddelbart manuelt afpipetteres 5 pi lysepuffer i brønde A23-D24 af assaypladerne at give ikke-specifik binding (NSB) kontrolbrønde, og 5 pi d2 reagens i boringer E23-P24.
- Centrifugeres assaypladerne i 1 min ved 200 xg ved stuetemperatur at blande brøndene.
- Dæk assayplader at minimere fordampning og foto-blegning og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
- Mål fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) signal ved hjælp excitation ved 320 nm og emission ved 620 nm og 665 nm under anvendelse af en pladelæser.
4. Data Analysis
- Brug betyde NSB at fratrække baggrund fra alle brønde.
- Beregn% Delta F fra 665 nm / 620 nm forhold som følger:
Ratio = (A 665 nm / A 620 nm) x 10 4
Delta F = ((Prøve Ratio - Ratio NSB) / Ratio NSB)) x 100
hvor Ratio NSB = brønde uden d2 reagens. - Beregn% activation mellem ustimulerede celler og celler stimuleret med maksimal GLP-1-ligand som følger:
% Aktivering = (% Delta Fsample -% DeltaFunstimulated celler) / (% DeltaFGLP-1 stimulerede celler -% DeltaF stimulerede celler) x 100 - Analyser koncentration-respons-kurver via 4-parameter logistisk analyse, og graf som% aktivering som defineret under henvisning kontrol 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi anvender rutinemæssigt en totrins-metode til at fortynde peptider via akustisk overførsel. For det første trin, er en akustisk dispenser linje med automatisering bruges til at oprette fire lager peptid mellemliggende fortyndinger tværs to source plader (figur 1a, b). For det andet trin, bruger vi en akustisk dispenser til yderligere fortynde lager fortyndinger fra kilde plader A og B for at skabe en 11-punkts koncentrationsinterval for hver test peptid (figur 1c). Hvert peptid koncentrationsområde er fyret i to eksemplarer, venstre mod højre på tværs af assaypladen, hvilket tillader 16 forskellige peptider, der skal screenes pr 384-brønds assayplade (figur 1c). Assaypuffer udfyldning udføres for at sikre et konstant volumen per brønd på tværs assaypladen (figur 1d). Henvisning peptid positive kontroller er også overført til destination plader ved maksimal effektiv koncentration.
ent. "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Pladerne aflæses ved hjælp af en fluorescerende plade-læser, og et zonekort for et eksempel plade indeholdende 16 peptider i to eksemplarer vises (figur 2a) cAMP akkumulation assay anvendte er en omvendt kompetitivt assay, således lave værdier (vist som lilla) repræsenterer en høj koncentration af cAMP. Reproducerbarhed af dobbelte punkter er indlysende når data er udtrykt som koncentration-respons kurver (figur 2b). Prøve 1 (række a, figur 2a) repræsenterer en positiv kontrol for assayet. prøverne 2, 3 og 4 (række B, C og D henholdsvis figur 2a) var inaktiv og svare til de flade linier i figur 2b. prøver 5-16 (række E til P) repræsenterer aktive testpeptider. fremgangsmåden muliggør generering af fuld koncentration-respons-kurver tværs af en bred vifte potens. En Flow Chart beskriver hele arbejdet flow vist i 
Figur 1:. Plate Layout Beskrivelse af den akustiske dispensering seriel fortyndingsmetode. (A, b) Indretning af en 384-brønds source plader A og B indeholdende 25 pi 100x stock koncentration af hvert peptid (eksempel med 80 peptider mulige pr kildeplade), 100x positiv kontrol, Assaypuffer kun for brønde til udfyldning, og tre 1: 100 seriefortyndinger af hvert peptid fremstilles ved automatiseret akustisk overførsel og opfyldning mellem begge source plader. (C) En enkelt assayplade layout viser 11-punkts koncentrationsinterval i 16 peptider i to eksemplarer hen over pladen. (D) Typisk dispense protokol for en 11-punkts koncentrationsinterval i en 10 pi endeligt assayvolumen. Alle destination brønde har en assay buffer opfyldning til at give et konstant endeligt transfer vo Lume på 100 nl per brønd. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 2: Heat map og dosis-respons kurver Heat kort viser fluorescens ved A665 nm.. (A) 11-punkts koncentrationsinterval i 16 peptider i to eksemplarer hen over pladen. Purple indikerer en høj koncentration af cAMP (max), rød indikerer en lav koncentration af cAMP (min). (B) Repræsentant peptidkoncentration-respons kurver fra en enkelt plade assay viser en række af GLP-1 receptor agonist peptid aktiviteter mod muse GLP-1R udtrykkende celler (16 forbindelser). Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 3:.. Flow Chart af screeningsprocessen Detalje af hele arbejdsgangen Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver den vellykkede anvendelse af automatiseret akustisk afgivelse til serielt fortynde peptidprøver over et koncentrationsområde på 3 x 10 6 kræver mindre end 1 pi prøve. Den største fordel ved denne fremgangsmåde er at øge datakvaliteten gennem minimering peptid adsorption til plastvarer via reduceret eksponering af prøver til eksperimentelle beholdere og plasticware (såsom pipettespidser), der normalt kræves til reagensopløsning og blanding. Mens akustisk dispensering ikke helt udelukke brugen af plastvarer, betyder det reducere det. Endvidere er fjernelsen af tip-baserede pipettering eliminerer også prøve fremførsel, og fejl kan derfor ikke dyrkes hele seriel fortynding, der giver mulighed for både pålidelig og reproducerbar fremstilling af koncentration-respons kurver 14,15.
Andre grupper har rapporteret den direkte akustiske overførsel af testforbindelser solubiliseret i DMSO tilceller til langsigtede assays (> 48 t) uden blande- nødvendige skridt andet end inversion af assaypladen og inkubation over tid 16,17. DMSO er stærkt polært og er meget mere modtagelig for blanding med vandige opløsninger end biologiske prøver, der skal fremstilles og opbevares i PBS. Derfor, når vedtagelse af et automatiseret metode til akustiske overførsel af peptid prøver, har vi ansat yderligere udfyldningsannoncer og centrifugering skridt til at sikre grundig blanding, der giver mulighed for nøjagtig prøve seriel fortynding. Vores erfaring viser, at centrifugering alene ikke er tilstrækkelig til at sikre fuldstændig blanding af vandige prøver, og dermed en 'våd overførsel «metode blev udviklet bestående af akustisk overførsel til en eksisterende 10 pi volumen af vandig buffer, efterfulgt af en 15 pi opfyldning af samme vandige puffer. Det er ikke muligt at fyre peptider i en tør kilde plade og derefter tilbage fylde, som man kunne for små molekyler, som den vandige peptidopløsning vil hurtigt evaselskabsledelse og peptidet vil irreversibelt adsorbere til den tørre plastplade. Selv om det ikke støtte blande vandige prøver er centrifugering stadig forpligtet til at sikre et niveau prøve menisken til akustisk overførsel. Inddragelsen af flere mellemliggende transfer, udfyldningsannoncer og centrifugeringstrin er noget tidskrævende, men i mindre grad end manuel tilberedning af et stort antal prøver, og brugen af automatisering tillader uovervåget gennemløb. Andre har rapporteret behovet for manuel forbindelse blanding i 96-brønds plader 17. Her har vi automatiseret proces og fjernet behovet for manuel indgriben, når brugen af DMSO ikke er mulig. Udgifterne til instrumentering og hjælpematerialer vil begrænse anvendelsen af denne proces i visse miljøer. Hvis dette er tilfældet, anbefaler vi tip-baserede serielle fortyndinger udføres altid i DMSO, hvis arten af testprøven er modtagelig for dette (fx, syntetiske peptider). Hvis prøverne ikke kan behandles med DMSO (fxPegyleret peptider) forsigtighed bør anvendes ved fortolkning potens data, da vi tidligere har vist, selv inddragelsen af stigende koncentrationer af BSA vil ikke fuldstændig forhindre adsorption 1.
Akustisk, tip-mindre overførsel har yderligere fordele vedrørende assay miniaturisering hvilket er afgørende, hvis prøverne er knappe / finite som det ofte er tilfældet for dyr eller mennesker biologiske prøver, og vi har tidligere beskrevet mulighederne for at reducere mængden af animalske prøver, der fører til et krav om færre dyr pr undersøgelse 1. Det er vigtigt at huske, at peptider er biologiske prøver og bør håndteres som sådan; for at bevare deres integritet gentagne fryse-tø cykler bør undgås. Biologics er en hastigt voksende område af hidtil ukendte terapeutiske midler, og vores automatiserede high-throughput fremgangsmåde til fremstilling af peptider kan let anvendes på andre biologiske midler, herunder rekombinante proteiner og antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100x peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
References
- Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
- Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).
- Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects. Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments. J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses. PLoS ONE. 8 (5), 62325 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- McDonald, G. R., et al. Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware. Science. 322 (5903), 917 (2008).
- Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I. Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).
- Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).
- Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).
- Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology. J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).
- Butler, R., et al. Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery. J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).
- Panchal, S., Verma, R. J. Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration. Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).
- Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies. J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments. J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing. J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).
- Roberts, K., et al. Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays. J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).
