Abstract
Come con la scoperta di nuovi farmaci piccola molecola, lo screening per agonisti peptidici richiede la diluizione di serie di peptidi per la produzione di curve concentrazione-risposta. Screening peptidi offre un ulteriore livello di complessità convenzionali metodi di trattamento del campione con punta a base espongono peptidi ad una grande superficie di plasticware, fornendo una maggiore possibilità di perdita peptide tramite adsorbimento. Prevenire l'eccessiva esposizione al plasticware riduce la perdita di peptide attraverso l'adesione alla plastica e, quindi, riduce al minimo le imprecisioni in potenza previsione, e abbiamo precedentemente descritto i vantaggi di non-contatto acustico erogazione in vitro high-throughput screening di agonisti peptidici 1. Qui si discute di una soluzione di automazione completamente integrata per la preparazione senza contatto acustico di diluizioni seriali peptide in piastre microtitolazione che utilizza l'esempio di screening per agonisti peptidici al glucagone-like peptide-1 del recettore del mouse (GLP-1R). I nostri metodi consentono per altatest per lo screening per agonisti -throughput cell-based e sono facilmente scalabile per supportare un aumento di campioni, o per consentire un aumento del numero di copie targa test (ad esempio, per un gruppo di più linee cellulari di destinazione).
Introduction
Il GLP-1R è un altro obiettivo stabilito nel trattamento del diabete di tipo 2 2. L'agonista peptide nativo per questo recettore, GLP-1, ha un in vivo emivita di 2-3 min 3. Il legame di GLP-1 ai suoi accoppiati alle proteine G risultati recettore bersaglio nella produzione a valle del secondo messaggero cAMP attraverso l'accoppiamento nativo proteina G per l'attivazione di adenilato ciclasi. Misura del campo accumulato fornisce un saggio robusto per monitorare l'attivazione del recettore e per lo screening attivi GLP-1 analoghi con proprietà fisico-chimiche preferite. Tale test richiede la diluizione seriale di campioni per costruire curve concentrazione-risposta, e questo è particolarmente complicato quando consegna campioni peptidici. I potenziali errori di preparazione diluizione in serie punta a base sono stati descritti in precedenza 1,4,5. Peptidi viene fortemente assorbito dalle plasticware, con conseguente stime potenza inaffidabili. perdita di peptidi può essere minimizzato attraverso tegli inclusione di albumina sierica bovina (BSA) in buffer e l'uso di plasticware siliconato, eppure proteina legante rimane imprevedibile. In particolare, la variazione nel legame di GLP-1 per contenitori sperimentali è stato descritto 6. C'è un ulteriore complicazione che gli agenti di stabilizzazione utilizzati in laboratorio plasticware può fuoriuscire dalle punte e piastre microtiter nel buffer dosaggio acquosi e interferire con la funzione della proteina 7, 8. Pertanto, i metodi per ridurre l'esposizione al plasticware sono necessari per aumentare la precisione delle misurazioni.
Acustici dosatori concentrano un segnale acustico ad alta frequenza sulla superficie di un campione di fluido, con conseguente espulsione delle goccioline precise nanolitri in una piastra di test adiacente 9. L'uso di eiezione acustica è standard nell'industria farmaceutica per la preparazione e lo screening di grandi librerie di composti sintetici, e la tecnologia è stata ben validata per piccole moleculES 10. A nostra conoscenza, siamo il primo gruppo a descrivere erogazione acustico per la preparazione di peptidi ricombinanti e sintetici e abbiamo precedentemente riportato la maggiore precisione rispetto ai metodi di punta a base convenzionale 1.
Questo articolo descrive l'integrazione della preparazione di peptidi diluizioni seriali e da trasferimento acustico senza contatto su un sistema di robotica movimentazione piatto completamente automatizzato. Un certo numero di metodi che comprendono trasferimento acustica di campioni sono stati descritti in precedenza 11. Utilizziamo un metodo in due fasi per preparare concentrazioni archivi intermedi e diluire serialmente analoghi peptidici per la generazione della curva dose-risposta completa. I peptidi preparati vengono incubate con cellule che esprimono il mouse bersaglio GLP-1R, e usiamo un test disponibile in commercio omogenea risolta nel tempo di fluorescenza (HTRF) per misurare l'accumulo di cAMP all'interno di queste cellule come una lettura di peptide activ agonistilità. Il test è robusto e suscettibili di un high-throughput formato 384-bene e regolarmente applicata sia sviluppo test e lo screening di stupefacenti progetti 12.
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Protocol
1. Peptide diluizione in serie
- Preparare tampone: Hanks tamponata soluzione salina (HBSS) supplementato con 25 mM HEPES, 0,1% BSA e 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), pH 7,4.
- Utilizzare un distributore di reagente di massa per aggiungere sistematicamente 5 ml di tampone in ciascun pozzetto di cinque piastre da 384 pozzetti a basso dosaggio di volume.
- Utilizzare software interno per creare un programma di erogazione di 5 ml di volume, oltre ad ogni pozzetto di una piastra a 384 pozzetti secondo le istruzioni del produttore.
- Immergere l'erogazione di tubi cassetta nel tampone e liquido Prime.
- Mettere a 384 pozzetti basso volume piastra di test sul supporto piatto.
- Premi start.
- Diluire tutti i campioni di peptidi, indipendentemente dal veicolo di stoccaggio, in tampone per produrre un peptide magazzino 100x.
NOTA: I peptidi che richiedono lo screening possono essere fornite in PBS (PBS) o Dimetilsolfossido (DMSO) come si ritiene opportuno (per esempio, DMSO will avere un effetto deleterio sulla peptidi con modifiche secondarie come PEGylation). - Dispensare 25 ml scorte peptide 100x in colonne 1-5 di acusticamente qualificato in polipropilene 384 pozzetti micropiastra. Questo piatto è designato 'piastra fonte A'. Assicurarsi che i piatti di origine, ma non piatti di destinazione, sono a fondo piatto e conformarsi alle tolleranze acustiche specifiche, come definito dal costruttore di strumenti acustici.
- Erogare controllo di riferimento 100x 25 ml in pozzi A23 e A24 della piastra fonte A.
- Dispensare 10 microlitri tampone in colonne 11-15 e tampone 30 microlitri in colonne 21-22 di targa fonte A.
- Dispensare 10 microlitri tampone in colonne e colonne 6-10 16-20 di secondo acusticamente qualificato 384 pozzetti in polipropilene micropiastra. Questo piatto è designato 'piastra sorgente B'.
- Centrifuga piastre sorgente A e B a 300 xg per 1 min. Include una piastra di giusto equilibrio.
- Utilizzare flui acusticod distributori integrati in un sistema robotico automatizzato per preparare tre sequenziali 1: 100 diluizioni intermedie (in tampone) degli stock peptidici 100x da colonna 1 in fonte A.
NOTA: La programmazione richiede piatto riformattazione e software dose-risposta (come fornito dal produttore del distributore di fluido acustico) per consentire tre trasferimenti acustici tra Source A e Source B (vedi Figura 1 per i layout piastra). Passo 1.9 dettagli specificamente l'uso di dispensatori di fluido utilizzato in questo laboratorio sotto controllo robotico automatizzato (vedi Materiali Tavolo):- piastre sorgente di caricamento e piastre di test in piastra sezione albergo della robotica.
- Aprire il software robot automatizzati e di carico piatto riformattazione e protocolli di espansione programma di dose-risposta. Fare clic su 'Esegui'.
NOTA: Automazione istruisce un distributore di fluido acustica per trasferire 250 nl dalle colonne 1-5 di piatto sorgente A in colonne 6-10 su piastra sorgente B, e un secondo Acoustidispenser fluido C in grado di gestire volumi di fluido più grandi per riempire con 15 microlitri tampone per mescolare. Automazione trasferisce poi piastra sorgente B a centrifuga integrato e centrifughe a 300 xg per 1 min (una piastra equilibrio adeguato è incluso per tutte le fasi di centrifugazione). piatto di origine B viene restituito al distributore di fluido acustica per il trasferimento di 250 nl dalle colonne 6-10 di provenienza piastra B in colonne 11-15 di targa sorgente A ed il riempimento con tampone 15 microlitri per mescolare. Automazione piatto trasferimenti fonte dalla A alla centrifuga e centrifughe a 300 xg per 1 min integrato. Piastra Source A viene quindi restituito al distributore di fluido acustica per il trasferimento di 250 nl dalle colonne 11-15 di targa sorgente A in colonne 16-20 di provenienza piastra B ed il riempimento con tampone 15 microlitri per mescolare. Automazione trasferisce poi piastra sorgente B a centrifuga e centrifughe integrato a 300 xg per 1 min.
NOTA: Infine, il protocollo di risposta alla dose dirige erogazione acustica per trasferireil volume richiesto a ciascuno dei 4 pozzetti della piastra sorgente diluite in serie (in entrambe piastra sorgente A e la piastra sorgente B) per costruire una curva di pieno 11 punti in duplicato in piastre di saggio (pre-riempito con tampone 5 microlitri al passo 1.2 ). trasferimenti di automazione piastra test a centrifuga integrato e centrifughe a 300 xg per 1 min.
2. Preparazione delle cellule
- crioconservati ovariche di criceto cinese (CHO), le cellule che esprimono Scongelare rapidamente il recettore del mouse bersaglio GLP-1 in un bagno d'acqua 37 ° C e risospendere in 20 ml di tampone.
- sospensione cellulare Centrifugare per 5 min a 200 xg a temperatura ambiente (RT). Includere un giusto equilibrio.
- Gettare il surnatante e risospendere pellet cellulare in 10 ml di tampone.
- Diluire cella stock 1: 1 in Trypan blu e determinare la densità di cellule vitali mediante un contatore di cellule automatizzato. Risospendere le cellule in tampone a 1,6 x 10 6 cellule per ml (equivalenti a 8.000 cellule per well di piastre del saggio).
- Utilizzare un dispensatore di reagente bulk aggiungere 5 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di piastre di saggio (contenenti peptidi serialmente diluiti in tampone 5 microlitri) e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
Assay 3. HTRF cAMP Detection
- Portare HTRF cAMP kit di analisi per RT per 30 minuti prima dell'uso.
- Preparare ogni reagente HTRF (criptato e d2) separatamente in diluizione 1:20 in tampone di lisi (formulazione proprietaria, fornito dal produttore del test di rilevamento cAMP).
NOTA: ATTENZIONE: Lysis buffer contiene fluoruro di potassio (KF), che è tossico e teratogeno 13. Per lo smaltimento, piastre di test contenenti KF devono essere sigillati e inceneriti, e qualsiasi rifiuto liquido devono essere diluiti a <1 mmol / L con acqua prima dello smaltimento nel lavandino. - Utilizzare un distributore di reagente di massa per aggiungere 5 ml di reagente criptato a tutti i pozzetti delle piastre test.
- Utilizzare un distributore di reagente di massa per aggiungere 5 ml di reagente D2 a Columns 1-22 delle piastre di saggio.
- Immediatamente pipetta manualmente tampone di lisi 5 ml in pozzi A23-D24 delle piastre di analisi per dare pozzetti di controllo (NSB) legame non specifico, e 5 ml di reagente D2 nei pozzetti E23-P24.
- Centrifugare le piastre test per 1 min a 200 xg a temperatura ambiente per mescolare i pozzetti.
- Coprire le piastre test per ridurre al minimo l'evaporazione e la foto-candeggio e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Misurare segnale di fluorescenza trasferimento di energia di risonanza (FRET) con eccitazione a 320 nm ed emissione a 620 nm e 665 nm usando un lettore di piastre.
Analisi 4. I dati
- Utilizzare significare NSB per sottrarre sfondo da tutti i pozzetti.
- Calcolare% Delta F dal / 620 rapporto di 665 nm nm come segue:
Rapporto = (A 665nm / A 620nm) x 10 4
Delta F = ((Rapporto Campione - Rapporto NSB) / Rapporto NSB)) x 100
dove Rapporto NSB = pozzi senza reagente D2. - Calcola% attivata siaion tra le cellule e le cellule non stimolate stimolati con massima GLP-1 ligando come segue:
attivazione% = (% Delta Fsample -% cellule DeltaFunstimulated) / (% di cellule DeltaFGLP-1 stimolato -% cellule non stimolate deltaF) x 100 - Analizzare curve concentrazione-risposta via a 4 parametri di analisi logistica e grafico come attivazione% come definito dal controllo di riferimento 1.
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Representative Results
Noi abitualmente uso di un metodo in due fasi per la diluizione peptidi tramite bonifico acustica. Per la prima fase, un erogatore acustica allineato con l'automazione viene usato per creare quattro diluizioni intermedie magazzino peptide attraverso due piastre sorgente (Figura 1a, b). Per la seconda fase, si usa un erogatore acustica per diluire ulteriormente archivi diluizioni dalle piastre sorgente A e B per creare un intervallo di concentrazione di 11 punti per ciascuna prova peptide (figura 1c). Ogni intervallo di concentrazione del peptide è sparato in duplice copia, da sinistra a destra attraverso la piastra test, permettendo 16 diversi peptidi per essere sottoposti a screening per 384 pozzetti test (Figura 1c). Saggio di riempimento del buffer viene eseguita al fine di garantire un volume costante per pozzetto attraverso la piastra test (Figura 1d). Riferimento peptide controlli positivi vengono anche trasferiti in piastre di destinazione a una concentrazione massima efficacia.
ent. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> piastre vengono lette con un lettore di piastre a fluorescenza, e una mappa di calore per esempio, una piastra contenente 16 peptidi in duplicato viene mostrato (Figura 2a) Il saggio di accumulo cAMP usato è un test invertito concorso, valori così bassi (indicato come viola) rappresentano un'alta concentrazione di cAMP. riproducibilità di punti duplicati è evidente quando i dati sono espressi come curve concentrazione-risposta (Figura 2b). Esempio 1 (riga a, figura 2a) rappresenta un controllo positivo per il test. campioni 2, 3 e 4 (righe B, C e D, rispettivamente, la figura 2a) erano inattivi e equivalgono alle linee piane in Figura 2b. campioni 5-16 (righe e a P) rappresentano attiva peptidi di prova. il metodo consente la generazione di curve concentrazione-risposta complete in una gamma di potenza ampia. Un diagramma di flusso dettagliato l'intero flusso di lavoro è mostrata in 
Figura 1:. Layout piastra descrizione acustica erogazione metodo di diluizione in serie. (A, b) Disposizione di un 384 pozzetti sorgente A e B contenente 25 ml di 100x magazzino concentrazione di ogni peptide (ad esempio con 80 peptidi possibili per piastra fonte), 100x controllo positivo, tampone del saggio soli pozzi per riempimento, e tre 1: 100 diluizioni seriali di ogni peptide predisposto dal trasferimento acustici automatizzati e di riempimento tra le due piastre di origine. (C) Un layout piatto unico test che mostra intervallo di concentrazione di 11 punti per 16 peptidi in duplicato attraverso la piastra. (D) tipico protocollo di erogazione per un range di concentrazione di 11 punti in un volume finale del dosaggio 10 ml. Tutti i pozzetti destinazione hanno un riempimento tampone per fornire un vo trasferimento finale costante lume di 100 per nl bene. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 2: mappa di calore e dose-risposta curve mappa di calore che mostra fluorescenza a A665 nm.. (A) range di concentrazione di 11 punti per 16 peptidi in duplicato attraverso la piastra. Viola indica un'alta concentrazione di cAMP (max), rosso indica una bassa concentrazione di cAMP (min). (B) le curve peptide Rappresentante concentrazione-risposta da un singolo test piatto che mostra una serie di GLP-1 del recettore attività agonista del peptide contro topo GLP-1R cellule che esprimono (16 composti). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 3:.. Diagramma di flusso della proiezione processo Particolare dell'intero flusso di lavoro Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive l'applicazione di successo di dispensazione acustica automatizzato per diluire serialmente campioni peptide su un intervallo di concentrazione di 3 x 10 6 richiede meno di 1 ml di campione. Il principale vantaggio di questo metodo è quello di aumentare la qualità dei dati riducendo al minimo peptide adsorbimento a plasticware via ridotta l'esposizione di campioni di contenitori sperimentali e plasticware (come ad esempio le punte delle pipette) che normalmente vengono richiesti per il trasferimento dei reagenti e la miscelazione. Mentre erogazione acustico non esclude completamente l'utilizzo di plasticware, riduce significativamente esso. Inoltre, la rimozione di pipettaggio tip-based elimina anche diffusione del campione, e gli errori non si propagano per tutta la diluizione seriale, consentendo sia la preparazione affidabile e riproducibile di curve concentrazione-risposta 14,15.
Altri gruppi hanno riportato il trasferimento acustica diretta di composti di prova solubilizzato in DMSO acellule per analisi a lungo termine (> 48 ore) senza passaggi di miscelazione necessarie diversa inversione della piastra di dosaggio e l'incubazione nel tempo 16,17. DMSO è altamente polare e molto più suscettibili di mescolamento con soluzioni acquose di campioni biologici devono essere preparate e conservate in PBS. Pertanto, al momento di adottare un metodo automatico per il trasferimento acustico di campioni peptide, abbiamo impiegato ulteriori fasi di recupero e di centrifugazione per permettere una miscelazione accurata, permettendo per la diluizione seriale del campione accurata. La nostra esperienza dimostra che centrifugazione sola non è sufficiente a garantire la completa miscelazione di campioni acquosi e, quindi, un metodo di 'wet transfer' stato sviluppato comprensivi di trasferimento acustica in un volume di 10 microlitri esistente di tampone acquoso, seguito da un recupero 15 microlitri della stesso tampone acquoso. Non è possibile sparare peptidi in un piatto di origine secco e poi di nuovo riempimento come si potrebbe per piccole molecole, come soluzione acquosa peptide sarà rapidamente evaporate e il peptide saranno irreversibilmente assorbire al piatto di plastica a secco. Anche se non aiuta la miscelazione di campioni acquosi, centrifugazione è ancora necessaria per garantire un menisco campione di livello per il trasferimento acustica. L'inclusione di molteplici fasi di trasferimento intermedio, di recupero e di centrifugazione è in qualche tempo, anche se minore rispetto preparazione manuale di un gran numero di campioni, e l'uso di automazione permette un throughput senza supervisione. Altri hanno segnalato la necessità di composti manuale miscelazione in piastre da 96 pozzetti 17. Qui abbiamo completamente automatizzato il processo e eliminato la necessità di intervento manuale quando l'uso di DMSO non è possibile. Il costo di strumentazione e di consumo limiterà l'uso di questo processo in alcune impostazioni. Se questo è il caso, si consiglia di diluizioni seriali tip-based sono sempre eseguite in DMSO se la natura del campione di prova è suscettibile di questo (per esempio, peptidi sintetici). Se i campioni non possono essere trattati con DMSO (ad esempio,Peptidi pegilato) deve essere usata prudenza nell'interpretazione dei dati di potenza, dal momento che abbiamo già dimostrato anche l'inserimento di concentrazioni crescenti di BSA non impedirà completamente adsorbimento 1.
Acoustic, il trasferimento in punta di meno ha benefici supplementari in materia di test miniaturizzazione che è essenziale se i campioni sono scarse / finito come spesso accade per gli animali o campioni biologici umani, e abbiamo descritto in precedenza la possibilità di ridurre il volume dei campioni di animali che portano a un requisito per un minor numero di animali per lo studio 1. È importante ricordare che i peptidi sono campioni biologici e devono essere trattati come tale; al fine di mantenere la loro integrità ripetere cicli di gelo-disgelo dovrebbe essere evitato. Biologics è un'area in rapida crescita di nuove terapie, e il nostro metodo high-throughput automatizzato per la preparazione di peptidi può essere facilmente applicato ad altri agenti biologici comprendenti le proteine ricombinanti e anticorpi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100x peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
References
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