Abstract
Tal como acontece com a descoberta de drogas de molécula pequena, o rastreio de agonistas peptídicos requer a diluição em série de péptidos para a produção de curvas de concentração-resposta. Rastreio péptidos proporciona um nível adicional de complexidade como métodos de manuseamento de amostras ponta baseada convencionais expor péptidos a uma grande área de superfície de utensílios de plástico, proporcionando uma maior oportunidade para a perda de péptido através de adsorção. Evitar a exposição excessiva aos utensílios de plástico reduz a perda de péptido através de aderência a plásticos e, portanto, minimiza a imprecisões na previsão de potência, e que descrevemos anteriormente os benefícios de acústica não-contacto para distribuir in vitro de rastreio de alto rendimento de agonistas peptídicos 1. Aqui nós discutimos uma solução de automação totalmente integrado para a preparação de não-contacto acústico de diluições em série de péptidos em placas de microtitulação, utilizando o exemplo de rastreio de péptidos agonistas no receptor de peptídeo-1 semelhante ao glucagon de ratinho (GLP-1R). Nossos métodos permitem em altaOs ensaios para o rastreio de agonistas -throughput célula com base e são facilmente escalável para suportar aumento de produção da amostra, ou para permitir o aumento do número de cópias da placa de ensaio (por exemplo, por um painel de mais linhas de células-alvo).
Introduction
O GLP-1R é um alvo de droga estabelecida no tratamento de diabetes tipo 2 2. O agonista do péptido nativo para este receptor, o GLP-1, tem uma semi-vida in vivo de 2-3 min 3. A ligação do GLP-1 aos seus receptores alvo resultados acoplados a proteína G na produção a jusante do segundo mensageiro cAMP através do acoplamento à proteína G nativa para a activação da adenilil-ciclase. A medição do AMPc acumulado proporciona um ensaio robusto para monitorizar a activação do receptor e para o rastreio de activos análogos de GLP-1 com propriedades físico-químicas preferidas. Um tal ensaio requer a diluição em série de amostras de ensaio para a construção de curvas de concentração-resposta, e isto é particularmente complicado quando distribui amostras de péptidos. Possíveis erros de preparação diluição em série ponta baseada foram previamente descritos 1,4,5. Peptídeos será adsorvido pelas plasticware, resultando em estimativas de potência não confiáveis. perda de peptídeo pode ser minimizado através de tele inclusão de albumina de soro bovino (BSA) em tampões e a utilização de utensílios de plástico siliconizado, ainda de ligação da proteína permanece imprevisível. Em particular, a variação na ligação de GLP-1 para recipientes experimentais foi descrito 6. Há uma complicação adicional em que os agentes de estabilização utilizados na plasticware laboratório podem contaminar a partir de dicas e placas de microtitulação em buffers de ensaio aquosas e interferir com a função da proteína 7, 8. Portanto, métodos para reduzir a exposição a plasticware são necessárias para aumentar a precisão das medições.
Acústicos dispensadores de líquidos concentrar um sinal acústico de alta frequência sobre a superfície de uma amostra de fluido, o que resulta na ejecção de gotículas nanolitros precisos em uma placa de ensaio adjacente 9. O uso de ejeção acústica é padrão na indústria farmacêutica para a preparação e triagem de grandes bibliotecas de compostos sintéticos, ea tecnologia tem sido bem validada para pequenas molecules 10. Para o nosso conhecimento, nós somos o primeiro grupo a descrever distribuição acústico para a preparação de péptidos recombinantes e sintéticos e temos relatado anteriormente a precisão melhorada em comparação com métodos baseados em ponta convencionais 1.
Este artigo descreve a integração da preparação de peptídeos diluições em série e diretas por transferência acústica sem contato para um manuseamento placa sistema robótico totalmente automatizado. Um número de métodos que englobam transferência acústica de amostras foram descritos anteriormente 11. Nós utilizamos um método de dois passos para preparar as concentrações de banco de intermediários e para diluir em série análogos de péptidos para a geração da curva de dose-resposta completa. Os péptidos assim preparados são incubados com células que expressam o rato alvo de GLP-1R, e usamos um ensaio disponível comercialmente homogénea de fluorescência resolvida no tempo (HTRF) para medir a acumulação de cAMP dentro destas células como uma leitura de Activ agonistas peptídicosdade. O ensaio é robusto e propícios a um formato de alto rendimento de 384 poços e rotineiramente aplicada tanto para o desenvolvimento e ensaio de rastreio de fármacos projecta 12.
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Protocol
1. Peptide Diluição Serial
- Preparar tampão de ensaio: Hanks tamponado com solução de sal (HBSS), suplementado com HEPES 25 mM, 0,1% de BSA e 3 mM-isobutil-1-metilxantina 0,5 (IBMX), pH 7,4.
- Usar um distribuidor de reagente de grandes quantidades para adicionar sistematicamente 5 uL de tampão de ensaio a cada poço de cinco placas de 384 poços de baixo volume de ensaio de.
- Use software interno para criar um programa de distribuição de 5 ul volume de adição a cada poço de uma placa de 384 poços de acordo com as instruções do fabricante.
- Mergulhe distribuição tubagem de caixa em tampão de ensaio e fluida prime.
- Coloque 384 poços placa de ensaio de baixo volume no porta-placa.
- Pressione começar.
- Dilui-se todas as amostras de péptidos, independentemente do veículo de armazenamento, em tampão de ensaio para produzir um péptido da 100x.
NOTA: Os peptídeos que necessitam de rastreio pode ser fornecida em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou o dimetilsulfóxido (DMSO) como for considerado apropriado (por exemplo, DMSO Wdoente ter um efeito deletério sobre a péptidos com modificações secundárias, tais como a PEGuilação). - Dispense 25 ul stocks peptídicas 100x em colunas 1-5 de uma microplaca de polipropileno de 384 poços acusticamente qualificado. Esta placa é designada "fonte placa A '. Assegurar que as placas de origem, mas não placas de destino, são de fundo plano e em conformidade com as tolerâncias acústicos específicos como definido pelo fabricante de instrumentos acústicos.
- Dispense 25 ul de controlo de referência 100x em poços A23 e A24 de placa fonte A.
- Pipetar 10 ul de tampão de ensaio em colunas 11-15 e 30 ul de tampão de ensaio em colunas 21-22 de placa fonte A.
- Dispense tampão de ensaio de 10 mL em colunas 6-10 e 16-20 colunas de um segundo de 384 poços de microplacas de polipropileno acusticamente qualificado. Esta placa é designada 'placa fonte B'.
- Centrifugar as placas de origem A e B a 300 xg durante 1 min. Incluir uma placa de equilíbrio adequado.
- Use Flui acústicad dispensadores integrado num sistema robotizado e automatizado para preparar três sequenciais 1: 100 diluições intermédias (em tampão de ensaio) de os estoques de péptidos 100x de uma coluna na fonte A.
NOTA: A programação requer reformatação placa e software de dose-resposta (como fornecido pelo fabricante do distribuidor de fluido acústico) para permitir que três transferências acústicas entre Source A e Source B (veja a Figura 1 para layouts de placas). Passo 1.9 detalhes especificamente a utilização de distribuidores de fluidos usados neste laboratório sob controlo robotizado e automatizado (ver Materiais Tabela):- placas origem de carregamento e placas de ensaio em hotel seção placa da robótica.
- Abra o software automatizado robótico e de carga da placa reformatar e os protocolos de expansão programa de resposta à dose. Clique em "Executar".
NOTA: Automation instrui um distribuidor de fluidos acústica para transferir 250 nl de colunas 1-5 da fonte placa Um em colunas 6-10 da placa fonte B, e um segundo acoustiDistribuidor de fluido c capaz de lidar com volumes de fluido maiores para aterrar com tampão de ensaio de 15 mL para misturar. Automation, em seguida, transfere placa fonte de B para centrífuga e centrífugas em 300 g durante 1 min integrado (uma placa de equilíbrio adequado está incluído para todas as etapas de centrifugação). Fonte placa B é devolvido para o distribuidor de fluido acústico para a transferência de 250 nl de colunas 6-10 de chapa B de origem em colunas 11-15 de fonte placa A e preencher com tampão de ensaio 15 uL de mistura. Automation fonte transferências placa A para centrifugar e centrífugas a 300 xg durante 1 min integrado. Uma placa de fonte é então retornado para o distribuidor de fluido acústico para a transferência de 250 nl de colunas 11-15 de fonte Um prato em colunas 16-20 de chapa B Fonte e preencher com tampão de ensaio 15 uL de mistura. Automation, em seguida, transfere placa fonte de B para centrífuga e centrífugas integrado a 300 g durante 1 min.
NOTA: Finalmente, o protocolo de resposta à dose dirige distribuição acústico para transferiro volume necessário de cada um dos 4 poços da placa de fonte diluídas em série (em ambas placa de origem A e placa fonte B) para construir uma curva de 11 pontos completo, em duplicado, em placas de ensaio (pré-cheia com tampão de ensaio 5 ul no passo 1.2 supra ). transferências de automação da placa de ensaio para centrífuga integrado e centrífugas em 300 g durante 1 min.
2. Preparação de células
- Descongelar as células criopreservadas de ovário de hamster chinês (CHO) que expressam o receptor de rato alvo de GLP-1 rapidamente num banho de água 37 ° C e ressuspender em 20 ml de tampão de ensaio.
- suspensão de células Centrifugar durante 5 minutos a 200 xg à temperatura ambiente (RT). Incluir um equilíbrio adequado.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender sedimento celular em 10 ml de tampão de ensaio.
- Diluir estoque célula de 1: 1 em Trypan azul e determinar a densidade de células viáveis utilizando um contador de células automatizado. Ressuspender as células em tampão de ensaio a 1,6 x 10 6 culas por ml (equivalente a 8.000 células por WELl de placas de ensaio).
- Usar um distribuidor de reagente de grandes quantidades para adicionar 5 uL de suspensão de células a cada poço das placas de ensaio (contendo péptidos diluídos em série em tampão de ensaio 5 ul) e incubar à TA durante 30 min.
Ensaio 3. HTRF Detecção de cAMP
- Traga o kit de ensaio de HTRF AMPc até à TA durante 30 min antes da utilização.
- Prepare cada reagente HTRF (cryptate e d2) separadamente a diluição de 1:20 em tampão de lise (formulação proprietária, fornecido pelo fabricante do ensaio de detecção cAMP).
NOTA: CUIDADO: O tampão de lise contém fluoreto de potássio (KF), que é tóxico e teratogênico 13. Para descarte, placas de ensaio contendo KF deve ser selado e incinerados, e qualquer resíduo líquido deve ser diluído na posição <1 mmol / L com água antes de serem eliminados na pia. - Usar um distribuidor de reagente de grandes quantidades para adicionar reagente de criptato de 5 ul em todos os poços das placas de ensaio.
- Use um distribuidor de reagente em massa para adicionar reagente d2 5 mL de ColumNS 1-22 das placas de ensaio.
- Imediatamente pipetar manualmente tampão de lise 5 ul nos poços A23-D24 das placas de ensaio para dar uma ligação não específica poços de controlo (NSB), e 5 ul de reagente de D2 em poços E23-P24.
- Centrifugar as placas de ensaio durante 1 minuto a 200 xg à temperatura ambiente para misturar os poços.
- Cobrir as placas de ensaio para minimizar a evaporação e foto-branqueamento e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
- Medir sinal de fluorescência de transferência de energia de ressonância (FRET) utilizando excitação a 320 nm e emissão a 620 nm e 665 nm utilizando um leitor de placas.
Análise 4. Dados
- Use significa NSB para subtrair fundo de todos os poços.
- Calcular a% de delta F a partir da razão nm 665 nm / 620 como se segue:
Rácio = (A 665 nm / 620 nm A) x 10 4
Delta F = ((Taxa de Amostra - Rácio NSB) / Proporção NSB)) x 100
onde Rácio NSB = poços com nenhum reagente D2. - Calcular a% de activatiónica entre as células não estimuladas e estimuladas com células máximo de GLP-1 o ligando como se segue:
activação% = (% Delta Famostra -% células DeltaFunstimulated) / (% de células DeltaFGLP-1 estimulou% - células não estimuladas) x 100 deltaF - Analisar curvas de concentração-resposta por 4-parâmetros logísticos de análise, e o gráfico de activação%, tal como definido por um controlo de referência.
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Representative Results
Rotineiramente usar um método de duas etapas para diluir péptidos por via de transferência acústica. Para a primeira etapa, um distribuidor acústico alinhada com a automação é usado para criar quatro peptídicos intermediários da diluições através de duas placas de código (Figura 1a, b). Para o segundo passo, utiliza-se um distribuidor acústico para diluir ainda mais diluições imagens de placas de origem A e B para criar um intervalo de concentração de 11 pontos para cada péptido de teste (Figura 1C). Cada gama de concentração de peptídeo é disparado em duplicado, para a esquerda para a direita na placa de ensaio, permitindo que 16 péptidos diferentes para ser exibido por 384 poços placa de ensaio (Figura 1c). Aterro tampão de ensaio é realizado para assegurar um volume constante por poço ao longo da placa de ensaio (Figura 1D). os controlos positivos de péptido de referência, também são transferidos para placas de destino para uma concentração eficaz máxima.
ent. "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Ler as placas utilizando um leitor de placas fluorescente, e um mapa de calor para uma placa de exemplo contendo 16 peptídeos em duplicata é mostrado (Figura 2a) O ensaio de acumulação de cAMP usado é um ensaio invertido concorrência, os valores assim baixa (mostrado como roxo) representam uma elevada concentração de cAMP. Reprodutibilidade dos pontos duplicados é evidente quando os dados são expressos como curvas de concentração-resposta (Figura 2b). Amostra 1 (linha a, Figura 2a) representa um controlo positivo para o ensaio. as amostras 2, 3 e 4 (linhas B, C e D, respectivamente, Figura 2A) eram inativos e equiparar às linhas planas na figura 2B. Amostras 5-16 (linhas de e a P) representam ativa péptidos de teste. o método permite a geração de curvas de concentração-resposta completa ao longo de uma ampla gama de potência. Um diagrama de fluxo detalhando todo o fluxo de trabalho é mostrado na 
Figura 1:. Layouts de placa Descrição da dispensa acústico método de diluição em série. (A, b) Disposição de um 384 poços placas de fonte A e B contendo 25 ul de 100x concentração de estoque de cada peptídeo (exemplo com 80 peptídeos possíveis por placa source), 100x controlo positivo, Tampão de Ensaio só de poços para aterro e três 1: 100 diluições em série de cada péptido preparado por transferência acústico automatizado e preenchimento entre ambas as placas de origem. (C) Uma disposição placa de ensaio única, mostrando gama de concentrações de 11 pontos para 16 péptidos em duplicado ao longo da placa. (D) o protocolo de distribuição típica para um intervalo de concentração de 11 pontos em um ul volume de ensaio 10 final. Todos os poços de destino tem um aterro tampão de ensaio para fornecer uma vo transferência definitiva constante lume de 100 por nl bem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 2: Mapa de Calor e de dose-resposta curvas mapa de calor mostrando fluorescência a nm A665.. (A) gama de concentrações de 11 pontos para 16 péptidos em duplicado ao longo da placa. Roxo indica uma alta concentração de cAMP (max), o vermelho indica uma baixa concentração de AMPc (min). (B) curvas peptídeo Representante de concentração-resposta de um ensaio de placa única que mostra uma série de atividades peptídeo agonista do receptor de GLP-1 contra o rato GLP-1R células (16 compostos) expressando. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 3:.. Fluxograma da triagem processo Detalhe de todo o fluxo de trabalho Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve a aplicação bem sucedida de distribuição automatizada acústico para diluir em série amostras de péptido ao longo de um intervalo de concentrações de 3 x 10 6 necessitando de menos de 1 ml de amostra. A principal vantagem deste método é o de aumentar a qualidade dos dados através de minimizar a adsorção de péptidos para utensílios de plástico através da exposição reduzida das amostras experimentais para recipientes e utensílios de plástico (tais como pontas de pipeta) que são normalmente necessários para a transferência de reagente e de mistura. Enquanto distribuição acústico não exclui completamente o uso de utensílios de plástico, ele não reduzi-lo significativamente. Além disso, a remoção de pipetagem ponta baseada também elimina a mistura de amostras, e os erros não são propagadas ao longo de toda a diluição em série, permitindo tanto para a preparação fiável e reprodutível de curvas de concentração-resposta 14,15.
Outros grupos relataram a transmissão acústica directa dos compostos de ensaio solubilizado em DMSO acélulas para os ensaios a longo prazo (> 48 h) sem passos de mistura necessários com excepção de inversão da placa de ensaio e com o tempo de incubação 16,17. DMSO é altamente polar e é muito mais favorável da mistura com soluções aquosas do que as amostras biológicas que deve ser preparada e armazenada em PBS. Portanto, ao adoptar um método automatizado para a transferência acústica de amostras peptídicas, nós empregamos etapas de preenchimento e centrifugação adicionais para assegurar uma mistura completa, permitindo a diluição em série da amostra precisa. A nossa experiência mostra que a centrifugação por si só não é suficiente para assegurar a mistura completa de amostras aquosas, e, assim, um método "húmido transferência" foi desenvolvido consistindo de transferência acústica num volume de 10 ul existente de tampão aquoso, seguido por um aterro 15 ul do mesmo tampão aquoso. Não é possível disparar péptidos numa placa de fonte seco e, em seguida, de volta preencher como uma força para moléculas pequenas, como a solução aquosa péptido á rapidamente evaporados e o péptido irá adsorver irreversivelmente para a placa de plástico secar. Embora não ajudar a misturar de amostras aquosas, centrifugação continua a ser necessária para assegurar um menisco da amostra nível para transferência acústica. A inclusão de múltiplas etapas de transferência intermédia, de preenchimento e de centrifugação é um pouco demorado, embora menos do que a preparação manual de grande número de amostras, bem como a utilização da automação permite transferência sem supervisão. Outros relataram a necessidade para o composto manual de mistura em placas de 96 poços 17. Aqui temos totalmente automatizado o processo e eliminou a necessidade de intervenção manual quando o uso de DMSO não é possível. O custo da instrumentação e consumíveis irá limitar a utilização deste processo em algumas configurações. Se este for o caso, é recomendável diluições em série à base da ponta está sempre realizada em DMSO, se a natureza da amostra de teste é passível de isso (por exemplo, péptidos sintéticos). Se as amostras não pode ser tratada com DMSO (por exemplo,Peptídeos peguilado) recomenda-se precaução ao interpretar os dados de potência, uma vez que já haviam demonstrado até mesmo a inclusão de concentrações crescentes de BSA não impedirá completamente adsorção 1.
Acústica, transferência de ponta-less tem benefícios adicionais relativos à miniaturização de ensaio que é essencial se as amostras são escassos / finita como é frequentemente o caso para os animais ou amostras biológicas humanas, e já anteriormente descrito o potencial para reduzir o volume de amostras de animais que levam a um requisito para menos animais por estudo 1. É importante lembrar que os péptidos são amostras biológicas e deve ser manuseado como tal; a fim de manter os seus ciclos de congelamento e descongelamento repetidos integridade deve ser evitada. Biologics é uma área de rápido crescimento de novos agentes terapêuticos, e o nosso método automatizado de elevado rendimento para a preparação de péptidos pode ser facilmente aplicada a outros agentes biológicos, incluindo proteínas e anticorpos recombinantes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100x peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
References
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