Abstract
Som med liten molekyl läkemedelsutveckling, screening för peptidagonister kräver serieutspädning av peptider för att producera koncentration-responskurvor. Screening peptider ger ett extra lager av komplexitet som konventionella provhanteringsmetoder spetsbaserade utsätta peptider till en stor yta av plasten, vilket ger en ökad möjlighet för peptidförlust via adsorption. Förhindra överdriven exponering för plasten minskar peptidförlust via anslutning till plast och därmed minimerar felaktigheter i styrka förutsägelse, och vi har tidigare beskrivit fördelarna med beröringsfri akustisk utmatning för in vitro-high-throughput screening av peptid agonister 1. Här diskuterar vi en helt integrerad automatisering lösning för beröringsfri akustiska beredning av peptid serieutspädningar i mikrotiterplattor med användning av exemplet med screening för peptidagonister vid mus glukagonliknande peptid-1-receptor (GLP-1 R). Våra metoder gör det möjligt för hög-throughput cellbaserade analyser för att screena för agonister och är skalbar för att stödja ökad provkapacitet, eller för att möjliggöra ett ökat antal analysplattkopior (t.ex. för en panel av flera mål cellinjer).
Introduction
GLP-1R är en etablerad läkemedelsmål för behandling av typ 2-diabetes 2. Den nativa peptiden agonist för denna receptor, GLP-1, har en in vivo-halveringstid på 2-3 min tre. Bindningen av GLP-1 till dess G-proteinkopplade mål-receptor resulterar i nedströms produktionen av den andra budbäraren cAMP genom nativt G proteinkoppling till aktivering av adenylylcyklas. Mätning av den ackumulerade cAMP ger en robust analys för att övervaka receptoraktivering och för att screena för aktiva GLP-1-analoger med önskad fysikalisk-kemiska egenskaper. en sådan analys kräver serieutspädning av testprover för att konstruera koncentration-responskurvor, och detta är särskilt komplicerat när handing peptidprover. Potentiella fel från spets baserade serieutspädnings beredning har beskrivits tidigare 1,4,5. Peptider bindas till plasten, vilket resulterar i otillförlitliga uppskattningar potens. Peptid förlust kan minimeras genom than inkludering av bovint serumalbumin (BSA) i buffertar och användningen av silikoniserade plasticware, men ändå protein bindning förblir oförutsägbar. I synnerhet, har den variation i bindning av GLP-1 till försöksbehållare beskrivits sex. Det finns en ytterligare komplikation i att stabiliseringsmedel som används i laboratorieplastartiklar kan läcka från tips och mikrotiterplattor i vattenanalysbuffertar och störa proteiners funktion 7, 8. Därför metoder för att minska exponeringen för plasten är nödvändiga för att öka noggrannheten i mätningarna.
Akustiska vätskemätare fokusera en högfrekvent akustisk signal på ytan av ett vätskeprov, vilket resulterar i utstötning av exakta nanoliterdroppar in i ett angränsande analysplatta 9. Användningen av akustiska utstötning är standard inom läkemedelsindustrin för framställning och screening av stora syntetiska substansbibliotek, och tekniken har väl validerade för små molecules 10. Så vitt vi vet är vi den första gruppen för att beskriva akustisk utmatning för framställning av rekombinanta och syntetiska peptider och vi har tidigare rapporterat förbättrad noggrannhet jämfört med konventionella spetsbaserade metoder 1.
I den här artikeln beskriver integrationen av beredningen av peptidserie och direkta späd av beröringsfri akustisk överföring till en helt automatiserad plåthantering robotsystem. Ett antal metoder som omfattar akustisk överföring av prover har beskrivits tidigare 11. Vi använder en två-stegsmetod för framställning av mellanliggande förrådskoncentrationer och för att seriellt späda peptidanaloger för generering av den fullständiga dos-responskurva. De framställda peptider inkuberas med celler som uttrycker målet mus GLP-1R, och vi använder en kommersiellt tillgänglig homogen tidsupplöst fluorescens (HTRF) analys för att mäta cAMP-ackumulering i dessa celler som en avläsning av peptidagonist activheten. Analysen är robust och mottaglig för en hög genomströmning 384 brunnar och rutinmässigt appliceras på både metodutveckling och läkemedelsscreening projekt 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Peptid serieutspädning
- Förbereda analysbuffert: Hanks buffrade saltlösning (HBSS) med tillsats av 25 mM HEPES, 0,1% BSA och 0,5 mM 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX), pH 7,4.
- Använda en bulkreagensfördelaren att systematiskt lägga 5 | il av analysbuffert till varje brunn i fem 384-brunnars låga volym analysplattor.
- Använd intern programvara för att skapa en dispenseringsprogram för 5 l volym utöver varje brunn i en 384-brunnar enligt tillverkarens anvisningar.
- Sänk dispense kassett rör i analysbuffert och prime vätska.
- Placera 384 brunnar låg volym analysplatta på hållaren.
- Tryck start.
- Späd alla peptidprover, oavsett fordonets lagrings, i analysbuffert för att producera en 100x peptid lager.
OBS: Peptider som kräver screening kan tillhandahållas i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller dimetylsulfoxid (DMSO) som bedöms lämpligt (t.ex. DMSO wsjuka har en skadlig effekt på peptider med sekundära modifieringar såsom PEGylering). - Fördela 25 pl 100x peptid lager i kolumner 1-5 av ett akustiskt kvalificerad 384 brunnar polypropylen mikro. Denna platta betecknas "källplattan A". Se till att källplattor, men inte destinationsplattor, är flatbottnade och uppfylla specifika akustiska toleranser som definierats av tillverkaren av akustiska instrument.
- Fördela 25 pl 100x referens kontroll i brunnar A23 och A24 av källplattan A.
- Fördela 10 pl analysbuffert i kolumner 11-15 och 30 pl analysbuffert i kolumner 21-22 av källplattan A.
- Fördela 10 pl analysbuffert i kolumner 6-10 och kolumner 16-20 av ett andra akustiskt kvalificerad 384 brunnar polypropylen mikro. Denna platta betecknas "källplatta B".
- Centrifugkällplattor A och B vid 300 xg under 1 min. Inkludera en lämplig balans platta.
- Använda akustiska fluid automater integreras i ett automatiserat robotsystem att förbereda tre sekventiella 1: 100 mellanliggande späd (i analysbuffert) av 100x peptid lager från kolumn 1 i käll A.
OBS: Programmering kräver platta omformatering och dos-respons programvara (som tillhandahålls av tillverkaren av den akustiska vätska dispenser) för att tillåta tre akustiska överföringar mellan källa A och källa B (se figur 1 för platt layouter). Steg 1,9 detaljer specifikt användningen av flytande automater som används i detta laboratorium under automatiserad robotstyrning (se Material tabell):- Belastningskällplattor och analysplattorna i platthotelldelen av robotteknik.
- Öppna automatiserad robotprogram och lastplattan omformatering och dos-responsexpansionsprogram protokoll. Klicka på "Kör".
OBS: Automation instruerar en akustisk vätska dispenser för att överföra 250 nl från kolumnerna 1-5 av källplattan A i kolumner 6-10 av källplattan B, och en andra ACOUSTIc vätska dispenser kan hantera större vätskevolymer för att återfylla med 15 pl analysbuffert för att blanda. Automation överför sedan källplattan B till integrerade centrifug och centrifuger vid 300 xg under 1 minut (en lämplig balans platta ingår för alla centrifugeringssteg). Källplatta B återförs till den akustiska fluiddispenser för överföring av 250 nl från kolumnerna 6-10 av källplattan B i kolumner 11-15 av källplattan A och återfyllning med 15 | j, l analysbuffert för att blanda. Automation överför källplatta A till integrerade centrifug och centrifuger vid 300 xg under 1 minut. Källplattan A återförs sedan till den akustiska vätska dispenser för överföring av 250 nl från kolumnerna 11-15 av källplattan A i kolumner 16-20 av källplattan B och återfyllning med 15 pl analysbuffert för att blanda. Automation överför sedan källplattan B till integrerade centrifug och centrifuger vid 300 xg under en minut.
OBS: Slutligen dos-respons-protokollet dirigerar akustisk utmatning att överföraerforderlig volym från var och en av de 4 serieutspädda källa plattbrunnar (i både källplatta A och källplattan B) för att konstruera en fullständig 11-punktskurvan i två exemplar på analysplattor (förfylld med 5 | j, l analysbuffert i steg 1.2 ovan ). Automation överför analysplatta till integrerade centrifug och centrifuger vid 300 xg under 1 minut.
2. Cellberedning
- Tö kryokonserverade kinesisk hamsterovarie (CHO) celler som uttrycker målet mus GLP-1-receptom snabbt i ett 37 ° C vattenbad och återsuspendera i 20 ml analysbuffert.
- Centrifugera cellsuspensionen i 5 min vid 200 xg vid rumstemperatur (RT). Inkludera en lämplig balans.
- Kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 10 ml analysbuffert.
- Späd cell lager 1: 1 i trypanblått och fastställa livskraftiga celltäthet med hjälp av en automatiserad cellräknare. Resuspendera celler i analysbuffert vid 1,6 x 10 6 celler per ml (motsvarar 8000 celler per well av analysplattor).
- Använda en bulkreagensdoseranordningen för att lägga till 5 | j, l av cellsuspension till varje brunn i analysplattorna (innehållande serieutspädda peptider i 5 | il analysbuffert) och inkubera vid RT i 30 min.
3. HTRF cAMP Detection Assay
- Föra HTRF cAMP analyskit till RT under 30 minuter före användning.
- Förbered varje HTRF reagens (kryptat och d2) separat vid 1:20 utspädning i lysbuffert (patenterad formula, som tillhandahålls av tillverkaren av cAMP detektionsanalys).
OBS: VARNING: Lysis buffert innehåller kaliumfluorid (KF) som är giftig och en teratogen 13. För bortskaffande bör analysplattor innehållande KF tätas och förbrännas, och varje flytande avfall måste spädas till <1 mmol / L med vatten innan det bortskaffas i vasken. - Använda en bulkreagensdoseranordningen för att lägga till 5 | j, l kryptat reagens till alla brunnar i analysplattorna.
- Använd en bulkreagens dispenser för att lägga till 5 l d2 reagens till Columns 1-22 av analysplattorna.
- Omedelbart pipett manuellt 5 | il lysbuffert i brunnar A23-D24 av analysplattorna för att ge icke-specifik bindning (NSB) kontrollbrunnarna, och 5 | il av d2 reagens i brunnar E23-P24.
- Centrifugera analysplattorna under 1 min vid 200 xg vid RT för att blanda brunnarna.
- Täck analysplattorna för att minimera avdunstning och foto-blekning och inkubera vid RT i 1 h.
- Mäta fluorescensresonansenergiöverföringssignal (FRET) med användning av excitation vid 320 nm och emission vid 620 nm och 665 nm med användning av en plattläsare.
4. Dataanalys
- Använd betyder NSB att subtrahera bakgrund från alla brunnar.
- Beräkna% Delta F från 665 nm / 620 nm-förhållande enligt följande:
Förhållande = (A 665 nm / A 620 nm) x 10 4
Delta F = ((provkvot - Ratio NSB) / Ratio NSB)) x 100
där Ratio NSB = brunnar utan d2 reagens. - Beräkna% activation mellan ostimulerade celler och celler stimulerade med maximal GLP-1-ligand enligt följande:
% Aktivering = (% Delta Fsample -% DeltaFunstimulated celler) / (% DeltaFGLP-1 stimulerade celler -% deltaF ostimulerade celler) x 100 - Analysera koncentration-responskurvor via 4-parameter logistisk analys och diagram som% aktivering som definieras med hänvisning kontroll 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi använder rutinmässigt en två-stegsmetod för att späda peptider via akustisk överföring. För det första steget, är en akustisk dispenser inriktad med automatisering som används för att skapa fyra lager peptidmellan utspädningar tvärsöver två källplattor (Figur 1a, b). För det andra steget använder vi en akustisk dispenser för att ytterligare späda aktie utspädningar från källplattor A och B för att skapa en 11-punkters koncentrationsintervallet för varje testpeptid (figur 1c). Varje peptidkoncentrationsintervall bränns i två exemplar, från vänster till höger över analysplattan, vilket gör att 16 olika peptider som screenas per 384 brunnar analysplatta (figur 1c). Analysbuffert återfyllning utförs för att säkerställa en konstant volym per brunn över analysplattan (figur 1d). Referenspeptid positiva kontroller också överförs till destinationsplattor vid maximal effektiv koncentration.
ent. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Plattorna avläses med hjälp av en fluorescerande plattläsare och en värmekarta för ett exempel platta innehållande 16 peptider i duplikat visas (Figur 2a) cAMP-ackumulering analys som användes är en inverterad kompetitiv analys, därmed låga värden (visade som lila) representerar en hög koncentration av cAMP. Reproducerbarhet av duplikatpunkter är uppenbar när data uttrycks som koncentration-responskurvor (figur 2b). Prov 1 (rad A, figur 2a) representerar en positiv kontroll för analysen. Prov 2, 3 och 4 (raderna B, C och D respektive figur 2a) var inaktiva och motsvara de platta linjer i figur 2b. Prover 5-16 (rader E till P) representerar aktiv testpeptider. metoden möjliggör generering av fullständiga koncentration-responskurvor inom ett brett potens intervall. Ett flödesschema med uppgifter om hela arbetsflödet visas i 
Figur 1:. Plate layouter Beskrivning av den akustiska utmatning serieutspädningsmetoden. (A, b) Layout av en 384 brunnar källplattor A och B innehållande 25 pl 100x förrådskoncentration av varje peptid (t.ex. med 80 peptider möjliga per källa platta), 100x positiv kontroll, analysbuffert endast brunnar för återfyllning, och tre 1: 100 serieutspädningar av varje peptid framställd genom automatiserad akustisk överföring och återfyllning mellan de båda källplattor. (C) En enda analysplatta layout som visar 11-punkters koncentrationsintervallet för 16 peptider i duplikat över plattan. (D) Typisk dispenseringsprotokoll för en 11-punkters koncentrationsområde i en 10 pl slutlig analysvolym. Alla destinations brunnar har en analysbuffert återfyllning för att tillhandahålla en konstant slutliga överföringen vo Lume av 100 nl per brunn. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 2: Värme karta och dosresponskurvor Heat karta visar fluorescens vid A665 nm.. (A) 11-punkters koncentrationsintervallet för 16 peptider i duplikat över plattan. Lila indikerar en hög koncentration av cAMP (max), indikerar rött en låg koncentration av cAMP (min). (B) Representativa peptidkoncentration-responskurvor från en enda plattanalys visar en rad av GLP-1-receptoragonist peptid aktiviteter mot mus GLP-1R uttryckande celler (16 föreningar). Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 3:.. Flödesschema över urvalsförfarandet Detalj av hela arbetsflödet Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en framgångsrik tillämpning av automatiserad akustisk serveringen seriellt späda peptidprov över ett koncentrationsintervall av 3 x 10 6 kräver mindre än 1 pl prov. Den stora fördelen med denna metod är att öka datakvaliteten genom minimering peptid adsorption till plasten genom reducerad exponering av prover till experimentella behållare och plasticware (såsom pipettspetsar) som normalt krävs för reagensöverföring och blandning. Även akustisk utmatning inte helt utesluter användningen av plasten, det minskar avsevärt. Vidare borttagandet av spetsen baserade pipettering eliminerar också smitta mellan prover, och felen inte fortplantas genom hela seriespädning, vilket möjliggör både tillförlitlig och reproducerbar framställning av koncentration-responskurvor 14,15.
Andra grupper har rapporterat direkt akustisk överföring av testföreningar löses i DMSO tillceller för långsiktiga analyser (> 48 h) utan blandningssteg som krävs annat än inversion av analysplattan och inkubation över tiden 16,17. DMSO är mycket polär och är mycket mer mottaglig för blandning med vattenlösningar än biologiska prover som ska upprättas och lagras i PBS. Därför vid antagandet av en automatiserad metod för akustisk överföring av peptidprover, har vi använt ytterligare återfyllning och centrifugeringssteg för att säkerställa noggrann blandning, vilket möjliggör noggrann prov serieutspädning. Vår erfarenhet visar att enbart centrifugering är inte tillräcklig för att säkerställa fullständig blandning av vattenprover, och därmed en "våt överföring metoden utvecklades bestående av akustisk överföring till en befintlig 10 pl volym vattenbaserad buffert, följt av en 15 l återfyllning av samma vattenhaltiga buffert. Det är inte möjligt att avfyra peptider till ett torrt källplattan och sedan tillbaka fyll som en styrka för små molekyler, såsom den vattenhaltiga peptidlösningen kommer snabbt evatags och peptiden kommer irreversibelt adsorbera till det torra plastplattan. Även om det inte underlätta blandning av vattenprover är centrifugering fortfarande krävs för att säkerställa en prov nivå menisk för akustisk överföring. Införandet av flera mellanliggande överförings, återfyllning och centrifugeringssteg är något tidskrävande, men mindre så än manuell beredning av ett stort antal prover och användningen av automatisering möjliggör oövervakad genomströmning. Andra har rapporterat behovet av manuell förening blandning i 96-brunnsplattor 17. Här har vi automatiserat processen och avlägsnas behovet av manuellt ingripande när användningen av DMSO är inte möjlig. Kostnaden för instrumentering och förbrukningsvaror kommer att begränsa användningen av denna process i vissa inställningar. Om så är fallet rekommenderar vi spetsbaserade serieutspädningar utförs alltid i DMSO, om naturen av testprovet är mottaglig för denna (t.ex. syntetiska peptider). Om proverna inte kan behandlas med DMSO (t.ex.Pegylerat peptider) försiktighet bör användas vid tolkningen potensdata eftersom vi tidigare har visat även införandet av ökande koncentrationer av BSA inte helt förhindra adsorption 1.
Akustisk, har spets mindre överföring ytterligare fördelar i samband med analys miniatyrisering som är en förutsättning för att proverna är knappa / ändliga som ofta är fallet för djur eller människor biologiska prover, och vi har tidigare beskrivit potentialen för att minska volymen av djurprover som leder till ett krav på färre djur per studie 1. Det är viktigt att komma ihåg att peptider är biologiska prover och bör hanteras som sådan; för att bibehålla deras integritet upprepade frysnings-upptiningscykler bör undvikas. Biologics är ett snabbt växande område av nya läkemedel, och vår automatiserade hög genomströmning metod för framställning av peptider kan lätt appliceras på andra biologiska medel inklusive rekombinanta proteiner och antikroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100x peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
References
- Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
- Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).
- Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects. Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments. J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses. PLoS ONE. 8 (5), 62325 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- McDonald, G. R., et al. Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware. Science. 322 (5903), 917 (2008).
- Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I. Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).
- Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).
- Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).
- Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology. J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).
- Butler, R., et al. Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery. J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).
- Panchal, S., Verma, R. J. Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration. Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).
- Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies. J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments. J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing. J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).
- Roberts, K., et al. Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays. J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).
