Protocol
1. Bereiding van reagentia en buffers
- 0,5 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)
- In een 2 L beker, voeg 186,1 g EDTA tot 800 ml gedeïoniseerd-gedestilleerd water (DDH 2 O). Stel de pH van de oplossing op 8,0 met behulp NaOH pellets. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 1,0 L en breng de oplossing een autoclaveerbare glazen fles voor autoclaaf en bewaar bij 4 ° C.
- 10 × Tris-boraat EDTA (10x TBE)
- In een 4 L kunststof beker, voeg 432 g Tris-base, 200 g boorzuur, 80 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) en DDH 2 O tot een eindvolume van 4 L. Mix met een roerstaafje totdat alle componenten opgelost. Breng de oplossing 1 L glazen flessen voor autoclaaf en bewaar bij 4 ° C.
- 10% Denaturing Polyacrylamide Stock
- In een 4 L plastic beker, voeg 1681,7 g ureum, 400 ml 10x TBE, 1 liter van 40% acrylamide / bisacrylamide (29: 1) oplossing en DDH 2 O tot de fspronkelijke volume 4 L. Meng met behulp van een roerstaafje totdat het ureum wordt opgelost. Breng de oplossing 1 L amberkleurige glazen flessen en bewaar bij 4 ° C.
- 2x Gel laadbuffer (2x GLB)
- In een 200 ml bekerglas, voeg 44 g ureum, 8 g sucrose, 10 mg broomfenol blauw, 10 mg xyleencyanol FF, 400 ui 10% natriumdodecylsulfaat en 4 ml 10 x TBE. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 40 ml en los de bestanddelen met milde verwarming bij 50 ° C onder mengen met een magnetische roerstaaf. Breng 1 ml aliquot 1,5 ml microfuge buizen en bewaar bij 4 ° C.
OPMERKING: Voor gebruik vereist momentane verhitting op 90 ° C om alle vaste stof opnieuw op te lossen.
- In een 200 ml bekerglas, voeg 44 g ureum, 8 g sucrose, 10 mg broomfenol blauw, 10 mg xyleencyanol FF, 400 ui 10% natriumdodecylsulfaat en 4 ml 10 x TBE. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 40 ml en los de bestanddelen met milde verwarming bij 50 ° C onder mengen met een magnetische roerstaaf. Breng 1 ml aliquot 1,5 ml microfuge buizen en bewaar bij 4 ° C.
- 1 M Tris-hydrochloride (Tris-HCl) (pH 7,5)
- In een glazen fles, voeg 12,1 g Tris-base en 70 ml DDH 2 O en meng totdat de vaste stof is opgelost. Op pH 7,5 onder toepassing van 1 M zoutzuur (HCl). Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 100 ml autoclaaf en store bij 4 ° C
- 5 M natriumchloride (NaCl)
- In een glazen fles, los 58,4 g NaCl in 150 ml van DDH 2 O. Stel het volume tot 200 ml met DDH 2 O. Bewaren bij 4 ° C.
- DNA Elution Buffer
- In een glazen fles, meng 2,0 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,0 ml van 5 M NaCl en 0,4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). Stel het volume tot 200 ml met DDH 2 O, autoclaaf en bewaar bij 4 ° C.
- 1 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) (pH 7,4)
- In een glazen fles, los 2,38 g HEPES in 80 ml DDH 2 O. Op pH 7,4 onder toepassing van 5 N NaOH en voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 100 ml.
- 1 M magnesiumchloride (MgCl2)
- In een glazen fles, voeg 2,03 g MgCl 6H 2 O 2 en breng het volume op 100 ml met DDH 2 O.
- Reaction Buffer (RB)
- In een 50 ml conische buis, voeg 500 ul van 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,8 g NaCl, 50 pl 1 M MgCl2 en 5 ul Tween 20. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 50 ml. Meng de oplossing en filtreer in een conische buis met een injectiespuit aangedreven filter (0,22 pm) en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
- In een 50 ml conische buis, voeg 5,8 g NaCl, 3 ml 1 M MgCl2, 1,5 g ureum en 40 ml DDH 2 O. Stel de pH van de oplossing op 5,0 onder toepassing van 10 mM HCl. Omdat de oplossing niet wordt gebufferd, aan te passen pH met behulp van HClvoorzichtig door de toevoeging van kleine hoeveelheden HCl. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 50 ml.
- Meng de oplossing en filtreer in een conische buis met een injectiespuit aangedreven filter (0,22 pm) en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
- In een beker, los 20,0 g LB poeder in 1 L van DDH 2 O. Transfer naar een glazen fles, autoclaaf, en bewaar bij 4 ° C.
- In een 250 ml kolf, voeg 1,5 g agar en 100 ml LB-bouillon. Autoclaaf en bewaar bij 4 ° C.
- Los het LB agar in een magnetron en koel de oplossing tot -50 ° C. Giet de oplossing in petrischalen, waardoor ~ 5 platen en laten stollen.
2. Synthese en zuivering van E. coli- responsieve DNAzym EC1
- Synthese van EC1 door Template Mediated enzymatische Ligatie
- Zuiver commercially gesynthetiseerde oligonucleotiden BS1, DE1 en T1 (sequenties gegeven in tabel 1) met 10% denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (dPAGE) volgens standaardprotocollen.
- Bereid een 100 uM voorraad BS1, DE1, en T1. Bewaren bij -20 ° C tot gebruik.
- In een 1,5 ml microfugebuis, voeg 38,5 ul van DDH 2 O, 5 pl DE1 en 5 ui 10 x T4 polynucleotide kinase reactiebuffer geleverd met enzym leverancier (500 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM MgCl2, 50 mM dithiothreïtol (DTT), 1,0 mM spermidine).
- Voeg 1 pl adenosine trifosfaat (ATP) (100 mM). Voeg 5 eenheden T4 polynucleotidekinase (10 U / pl). Meng door voorzichtig pipetteren het reactiemengsel.
- Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Schrik de reactie af door verwarming tot 90 ° C gedurende 5 minuten.
- Voeg 118 ul van DDH 2 O, 5 pl BS1 en 5 ui T1. Verwarm de reactie op 90 ° C gedurende 2 min en daarna afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Voeg 20 ul van 10 x T4 DNA ligase reactiebuffer geleverd door de leverancier enzym (400 mM Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP). Voeg 10 eenheden T4 DNA ligase (5 U / pl) en meng voorzichtig door pipetteren.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Voeg 20 pl 3 M natriumacetaat (NaOAc) (pH 5,2), 500 ul koude 100% ethanol. Meng de oplossing door vortexen en plaatst de buis in een -20 ° C vriezer gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer de microfuge bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig door pipetteren.
- Was de pellet met koude 70% ethanol en centrifugeer opnieuw bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Opnieuw verwijder het supernatant en droog de pellet onder vacuüm gedurende 10 min.
- Resuspendeer de DNA met 15 ul van DDH 2 O en voeg dan 15 ul van 2x GLB.
- Vortex krachtig en verhit tot 90 ° C2 min. Zuiver het volledige DNA met 10% dPAGE zoals hieronder beschreven.
- Opstellen 10% dPAGE
- Clean twee glasplaten (een vol bord en een getande), twee 0,75 mm dik spacers, en een 12-well kam. Leg één glasplaat op een vlakke ondergrond met twee afstandhouders aan elke kant en de schuine plaat op de top. Clip de twee platen samen met behulp van de vier clips van de leverancier.
- In een 150 ml plastic beker, giet 40 ml 10% dPAGE, 40 gl tetramethylethyleendiamine (TEMED) en 400 gl 10% ammoniumpersulfaat (APS). Meng de componenten en giet de oplossing tussen de platen langzaam.
- Plaats de kam en laat de gel gedurende 10 minuten polymeriseren. Zodra de gel is gepolymeriseerd, langzaam verwijderen van de kam en spoel de putten met DDH 2 O.
- Monteer de platen op de gel-elektroforese apparaat. Gebruik een metalen plaat om warmte gegenereerd om oververhitting te voorkomen verdrijven.
- Giet 1x TBE op de bovenste en onderste kamersen zorgen dat de putjes goed ondergedompeld in de buffer. Spoel de putjes met 1x TBE met behulp van een pipet of spuit.
- Stel het apparaat te draaien op 35 mA en pre-run voor 15 minuten vóór het laden samples.
- Elutie van Geligeerd EC1 van 10% dPAGE
- Na stap 2.2.6, voert u de gel op 35 mA totdat de onderste kleurstof (broomfenolblauw) de bodem van het glas plaat is gekomen. Dit duurt ongeveer 1,5 uur duren. Schakel de stroom uit en verwijder de platen uit het apparaat.
- Leg de platen op een paar vellen papier handdoeken en zorgvuldig de afstandhouders verwijderen uit de glasplaten. Verwijder voorzichtig de bovenste glasplaat en wikkel de gel met plasticfolie.
- Flip de gel over naar de tweede glasplaat te verwijderen en behandel met plastic omslag opnieuw. Zorg ervoor dat de rimpels van de plastic verpakking te vermijden.
- Visualiseer de geligeerde product met behulp van UV-shadowing (260 nm), die zal produceren 4 verschillende DNA-banden (Volledig geligeerde EC1, DE1, BS1 en T1).
- Centrifugeer de geloplossing bij 20.000 xg gedurende 5 min voorzichtig overdracht 400 ul van de supernatant aan een andere 1,5 ml microfugebuis. Vermijd het onttrekken gel stukken tijdens pipetteren.
- De microfuge buis met de supernatant overgebracht voeg 40 pl 3 M NaOAc (pH 5,2) en 1,0 ml koude 100% ethanol. Meng de oplossing door vortexen en plaatst de buis in een -20 ° C vriezer gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer de microfuge bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig door pipetteren.
- Was de pellet met koude 70% ethanol en centrifugeer opnieuw bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Nogmaals, verwijder desupernatant en droog de pellet onder vacuüm gedurende 10 min.
- Bepaal de concentratie van EC1 door het meten van UV-absorptie bij 260 nm. Wordt 10 uM voorraad- en bewaar het monster bij -20 ° C tot gebruik.
3. Conjugatie van urease DNA
- Bereiding van succinimidyl 4- (N-maleïmidomethyl) cyclohexaan-1-carboxylaat (SMCC) Stock
- Los 1 mg SMCC in 676 ui DMSO. Vortex en plaats op ijs tot gebruik.
- Bereiding van urease Stock
- Los 1 mg urease in 1 ml 1 x PBS (zonder Mg2 + of Ca2 +). Plaats op ijs tot gebruik.
LET OP: De gekristalliseerde urease is traag om op te lossen en voorzichtig mengen is nodig om denaturatie te voorkomen.
- Los 1 mg urease in 1 ml 1 x PBS (zonder Mg2 + of Ca2 +). Plaats op ijs tot gebruik.
- Synthese urease-DNA (UrDNA)
- Voeg 10 ul van 100 uM LD1 een 2,5 ml microfugebuis. Voeg 140 ul van DDH 2 O, 40 ui 10X PBS en vortex.
- Voeg 80,5 ul van SMCC stock, 159,5 pl DMSO, vortex, en in het kort centrifuge met behulp van een benchtop centrifuge.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten. Vermijd condensatie onder de microfuge dop.
- Voeg 200 ul van 1 x PBS, 60 gl 3 M NaOAc (pH 5,2) en 1,5 ml koude 100% ethanol. Meng de oplossing door vortexen en incuberen bij -20 ° C gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer de oplossing bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en droog de pellet onder vacuüm. Vermijd over-drogen.
- De gedroogde pellet voeg 400 pl urease voorraad en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 uur.
- Transfer 200 ul van ruwe conjugaat een voorgewassen 100K MWCO centrifugale filterkolom. Centrifugeer de kolom bij 14.000 xg gedurende 5 minuten.
- Draagt de resterende 200 pl van ruwe conjugaat aan de kolom en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de kolom en plaats hem ondersteboven in een nieuwe 2,0 ml microfugebuis ( "collectie tube").
- CENTRIFUGE de verzamelbuis (met omgekeerde kolom) bij 1000 g gedurende 2 min. Verwijder de verzamelbuis en voeg 30 ul van 1 x PBS om de centrifugale kolom membraan wassen extra terugwinning van conjugaten.
- Opnieuw keren de kolom en zet terug in de verzamelbuis. Centrifugeer de verzamelbuis (met omgekeerde kolom) bij 1000 g gedurende 2 min. Verwijder en gooi de kolom.
- Bewaar de UrDNA bij 4 ° C tot gebruik.
4. Montage van de EC1 en UrDNA op Magnetic Beads
- Meng de magnetische bead (MB) stock goed en breng 100 ui MB suspensie tot een 1,5 ml microfugebuis. Plaats de microfugebuis op een magnetische rek houder voor het isoleren van de MB.
- Verwijder het supernatant door pipetteren en voeg 150 ul bindingsbuffer (BB) naar de buis. Haal de buis uit de houder en tik voorzichtig de tube naar MB mengen om een homogene oplossing. Vermijd spatten van de schorsing van de top van de buis of pet. Als dit gebeurt, gebruik dan een benchtop centrifuge kort draaien de rest terug naar de opschorting.
- Herhaal stap 4.2 nog twee keer.
- Aan deze suspensie voeg 10 ul van 10 uM EC1. Zorgvuldig mengen door te tikken op de buis.
- Incubeer de oplossing met milde schudden gedurende 30 minuten. Tik de buis om de 2-3 minuten om het neerslaan van de MB te voorkomen.
- Plaats de microfugebuis terug op de magnetische rek aan de MB te isoleren en verwijder het supernatant door pipetteren. Was de MB driemaal met 150 ui BB (zoals beschreven in stap 4.2).
- Zodra het wassen is voltooid, schorten de MB in een totaal van 150 ul van BB. Aan deze oplossing, voeg 15 ul UrDNA en verwarm de oplossing tot 45 ° C gedurende 2 minuten. Koel de oplossing af tot kamertemperatuur en incubeer gedurende 2 uur.
- Plaats de microfugebuis terug op de magnetische rek aan de MB te isoleren en verwijder het supernatant door pipetteren.
- Voeg 100 ul van de reactie buffer (RB). Verwijder tHij microfugebuisje uit de magnetische rek en voorzichtig resuspendeer de MB.
- Was de MB meer drie keer, herhaalt u stap 4.9.
OPMERKING: De gewassen supernatant kan snel worden getest om te bepalen of gehybridiseerde UrDNA aanhoudt, hetgeen kan leiden tot een vals positief signaal. De test kan worden uitgevoerd door het toevoegen van 10 ui 50 mM ureum en 10 pl 0,04% fenolrood aan het wassop. Blijf de MB wassen totdat de wasoplossing een kleurverandering veroorzaakt. De 100 gl suspensie wordt opgeslagen bij 4 ° C tot gebruik.
5. Bereiding van bacteriële cellen 20
- Kweken E. coli van Voorraden
- Plate E. coli K12 (MG1655) op LB agarplaten uit een glycerol voorraad onder een vlam of in een biologisch veiligheidskabinet.
- Met behulp van een steriele pipet tip, zachtjes aanraken de glycerol voorraad en licht streak het oppervlak van een agarplaat om te voorkomen dat aanprikken van de LB-agar.
- Keren de weggeschotenplaat en incubeer bij 37 ° C gedurende 14 uur.
- Verzegel de plaat met Parafilm en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 3 weken.
- Kweken E. coli for Cell Counting
- In een steriele 14 ml cultuur buis, afzien van 2 ml LB-bouillon.
- Met behulp van een steriele pipet tip, kies een enkele kolonie van de uitgestreken agarplaat bereid in stap 5.1 en over te dragen aan de cultuur buis.
- Incubeer de kweek bij 37 ° C en schudden bij 230 rpm gedurende 14 uur.
- Serieel verdunnen de bacteriecultuur in 10-voudige intervallen.
- Voor elk verdund monster gelijkmatig plaat vijf 100 ul aliquots op afzonderlijke LB agarplaten. De platen om en incubeer bij 37 ° C gedurende 14 uur.
- Tel de cellen van elk monster met het gemiddelde celconcentratie van elke verdunning te verkrijgen.
LET OP: 10 7 cellen worden vaak gebruikt voor het opzetten van een verwijzing lakmoesproef voor E. coli als dit niveau van E. coli kan een snelle kleur chan triggerenge. Toch kan een goed uitgevoerde lakmoesproef detecteren vanaf 500 cellen, zoals besproken bij de Resultaten.
- Het voorbereiden van E. coli cellen voor het testen
- Voor een gewenste celsuspensie overdracht 1 ml van gekweekte bouillon aan een 1,5 ml microfugebuis.
- Centrifugeer de cellen bij 6000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof zonder de cel pellet.
- Voeg 10 ul reactiebuffer aan de cel pellet en resuspendeer de cellen. Ultrasone trillingen de celsuspensie gedurende 5 minuten. Breng de celsuspensie een ijs doos voor 5 min.
- Ultrasone trillingen de celsuspensie gedurende nog 5 min.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 13.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Met de bovenstaande vloeistof te testen (10 ui).
6. lakmoesproef
- In een 1,5 ml microfugebuis, voorwas de buis door het toevoegen en vortexen 100 gl reactiebuffer (RB) in de microfugebuis engooi de buffer.
- Overdracht 15 ul van geassembleerde EC1 (protocol 4) aan de gewassen microfugebuis.
- Was de magnetische korrels door het plaatsen van de microfugebuis op een magnetisch rek. Verwijder het supernatant door pipetteren. Verwijder de microfuge buis uit het rek, voeg 100 pl RB en voorzichtig resuspendeer de magnetische korrels.
- Was de MB meer twee keer door het herhalen van stap 6.3.
- Plaats de microfugebuis terug op de magnetische rek, de bovenstaande vloeistof en voeg de 10 ul E. coli monster bereid uit stap 5.3.
- Meng het monster en magnetische bolletjes zorgvuldig door zachtjes tikken op de microfugebuis.
- Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Aan het reactiemengsel, voeg 90 ul van DDH 2 O en plaats de microcentrifugebuis op een magnetisch rek.
- Na ongeveer 3 minuten van magnetische scheiding, zorgvuldig overdracht 85 ul van de supernatant aan een 0,5 ml microfugebuis. Trek de supernatant langzaam naarvoorkomen dat het verzamelen van alle magnetische bolletjes.
- Om het bovenstaande microfugebuis voeg 15 pl 0,04% fenolrood, en 100 pl substraatoplossing.
- Maak een foto op specifieke tijdstippen om kleurverandering te nemen.
OPMERKING: De verandering van de pH kan ook worden geanalyseerd met een pH-meter met een micro-elektrode. Het uitgangsmateriaal moet ongeveer pH 5,2-5,5 is (de oplossing is geel). Indien niet, kan de oplossing worden ingesteld door toevoeging van 1 mM acetaat buffer pH 5,0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het principe van de bacteriële lakmoesproef wordt toegelicht in figuur 1 de test gebruikt drie belangrijke materialen. Een RNA-splitsende DNAzym dat wordt geactiveerd door een specifieke bacterie, urease en magnetische korrels. De DNAzym wordt gebruikt als element moleculaire herkenning voor de specifieke detectie van een bacterie van belang te bereiken. Urease en magnetische korrels worden gebruikt om signaaltransductie van de RNA-splitsingsactiviteit van het DNAzym bereiken. Het gaat om het creëren van magnetische kralen die urease-DNAzym conjugaten bevatten. In aanwezigheid van de doelbacterie, het DNAzym splitst de RNA binding. Deze actie leidt tot de dissociatie van urease van magnetische korrels. De vrijgekomen urease kan gemakkelijk worden gescheiden van magnetische korrels en gebruikt om een kleurverandering in een reporter oplossing, die ureum en een pH-gevoelige kleurstof bevat genereren. Hydrolyseert urease ureum in ammoniak, vergezeld van de toename van de pH die de c triggersolor verandering van de kleurstof.
Figuur 2 geeft een bacteriële lakmoesproef, waar EC1, een E. coli RNA-splitsende reagerende DNAzym, werd gebruikt als DNAzym en fenolrood werd gebruikt als pH-rapporterende kleurstof. EC1 is eerder geïsoleerd door onze groep uit een willekeurige sequentie DNA verzameling met de techniek van in vitro selectie. 5 Onze vorige studies hebben aangetoond dat EC1 zeer specifiek voor E. coli en vertoont een minimale activiteit voor andere bacteriën. 5,19 Gevonden is dat EC1 wordt geactiveerd door een eiwitmolecuul van E. coli. Hoewel de identiteit van dit eiwit biomarker niet ontcijferd, de hoge specificiteit erkenning suggereert dat dit eiwit uniek is E. coli. De verslaggever oplossing is opgezet om aanvankelijk een pH van 5,5 te hebben. Bij deze pH fenolrood vertoont een gele kleur. Zoals hydrolyseert urease ureum in ammoniak, de basiciteit van de reporter solution toeneemt. Dit komt tot uiting door de geleidelijke verandering van kleur van geel naar roze. De diepte van kleurverandering afhankelijk van de volgende twee parameters, zoals geïllustreerd in figuur 2: het aantal E. coli-cellen worden gebruikt in de DNAzym activeringsstap en de termijn voor het ureum hydrolyse stap. Meer E. coli-cellen resulteerde in sterkere kleurveranderingen, weerspiegeld door de waarneming van een progressieve geel-to-roze kleur overgang wanneer E. coli-cellen werden serieel verhoogd 5-5 x 10 7 (10-voudig verhogen telkens). Ondertussen een langere tijd voor hydrolyse van ureum toegestaan voor de detectie van kleine aantallen E. coli-cellen (5000 cellen in 1 uur reactie en 500 cellen in 2 uur reactie).
De pH verandering van de bacteriële lakmoes test kan ook worden geanalyseerd met een handheld pH meter en de representatieve resultaten worden getoond in figuur 3. Het was dat de aanwezigheid van 10 7 E. coli cellen resulteerde in een geleidelijke toename van de pH van 3 eenheden binnen 10 minuten. Daarentegen Aangezien E. coli cellen niet detecteerbaar pH veranderingen die dezelfde instelling veroorzaken.
Figuur 1: Het ontwerp principe van bacteriële lakmoesproef (A) Activering van een RNA-klieven DNAzym door een specifieke biomarker van een bacterie van belang.. In aanwezigheid van de biomarker, de RNA-splitsende DNAzym geïmmobiliseerd op magnetische korrels splitst de RNA koppeling, wat resulteert in het vrijkomen van de gelabelde urease van magnetische kralen oplossing. (B) Drie-stap-test procedure. Stap 1: DNAzym activering, zoals beschreven in paneel A. Stap 2: Magnetische scheiding - de afgegeven urease wordt gescheiden van magnetische korrels. Stap 3: Ureum hydrolyse R12; het bezit urease wordt toegevoegd aan een reporter-ureumbevattende oplossing. Urease hydrolyseert ureum in ammoniak, wat resulteert in een verandering van de pH die door een pH-gevoelige kleurstof kan worden gemeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De test van Litmus met E. coli met behulp van E. coli reagerende DNAzym EC1. Vertegenwoordiger van kleur veranderende resultaten met wisselende aantallen E. coli cellen boven elke reageerbuis ontvangen. Fenolrood werd gebruikt als pH-gevoelige kleurstof. Een test zonder E. coli werd gebruikt als een negatieve controle. Meer E. coli-cellen wordt verwacht dat de afgifte van meer urease moleculen veroorzaken, gepaard by sterker kleur verandert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Monitoring pH verhoging met een pH-meter De verandering van de pH veroorzaakt door E. 10 7. coli-cellen werd geanalyseerd met een draagbare pH meter. Een test zonder E. coli werd gebruikt als een negatieve controle. De aanwezigheid van 10 7 E. coli-cellen in de testoplossing kan de basiciteit door ~ 3 pH-eenheden in 10 min te verhogen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam | Sequence (5'-3 ') | Notitie |
| BS1 | BTTTT TTTTT TTTAC TCTTC CTAGC FRQGG TTCGA TCAAG A | B: 5'-biotine; R: adenine ribonucleotide; F: fluoresceïne-dT; Q: DABCYL-dT |
| DE1 | GATGT GCGTT GTCGA GACCT GCGAC CGGAA CACTA CACTG TGTGG GGATG GATTT CTTTA CAGTT GTGTG TTGAA CGCTG TGTCA AAAAA AAAA | |
| T1 | GACAA CGCAC ATCTC TTGAT CGAAC C | |
| LD1 | XTTTT TTTTT TTTTT TTGAC ACAGC GTTCA A | X: 5'-NH2 |
Tabel 1: Sequenties van de synthetische oligonucleotiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vertaling van de werking van de RNA-splitsingsactiviteit van een bacterie-reagerend DNAzym een lakmoesproef wordt mogelijk gemaakt door het gebruik van urease en magnetische scheiding, zoals blijkt uit figuur 1. Hoewel de demonstratie van de gemodificeerde lakmoesproef voor bacteriële detectie uitgevoerd met E. coli afhankelijke RNA-klieven DNAzym, 5,19,20 het ontwerp kan worden over het algemeen uitgeschoven-RNA klieven DNAzym. Gezien de grote beschikbaarheid van RNA splitsende DNAzymen voor verschillende analyten en diverse methoden om nieuwe-RNA splitsende DNAzymen van willekeurige sequentiepools nieuwe targets isoleren we verwachten dat de gemodificeerde lakmoesproef platform kan worden uitgebreid tot de detectie van verschillende doelen plaats .
De lakmoesproef voor E. coli detectie kan detecteren 5000 en 500 cellen wanneer de rapportage reactietijd is ingesteld op 1 en 2 uur respectievelijk,. De populaire polymerasekettingreactie (PCR) ensandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) methoden detectiegrenzen van ongeveer 10 4 -10 5 E. verwezenlijken coli-cellen in vergelijkbare testtijden. 25,26 Zo is de bacteriële lakmoesproef biedt vergelijkbare detectiegevoeligheid.
Hoewel de bacteriële lakmoesproef is eenvoudig uit te voeren en kan levendige kleurveranderingen te produceren, kunnen verschillende factoren significante invloed op de testresultaten. Enerzijds de kwaliteit van urease is zeer belangrijk. We hebben gebruikt urease uit verschillende bronnen en vond de test resultaten kunnen aanzienlijk verschillen. Wij raden het gebruik van urease van de bron is opgegeven in de sectie Materials.
De assemblage van DNAzym / urease / magnetische bolletjes heeft speciale aandacht nodig. Grondig wassen van magnetische kralen om ongehybridiseerd UrDNA verwijderen moet vals-positieve resultaten te voorkomen. Zorg moet ook worden genomen om de accumulatie van residuale magnetische kralen op het binnenoppervlak van de l voorkomenid van de microfugebuis, die moeilijk te zien zijn. Daar worden de magnetische korrels niet langer onderworpen aan magnetische scheiding en dus kan een aantal gehybridiseerde UrDNA die kan leiden tot vals-positieve signalen in de reporter reactie dragen. Het is ook belangrijk om te voorkomen dat de microfugebuis op de magnetische rek voor langer dan 10 minuten in de magnetische scheidingsstap. De kralen kunnen aggregeren of zich aan de microcentrifugebuis die de wasefficiency kan verminderen en een batch-to-batch inconsistentie. Opneming van 0,01% Tween-20 in de wasoplossing kan batch-tot-batch consistentie te verbeteren en moeten worden uitgevoerd.
De magnetische bolletjes gecoat met streptavidine, dat werd gebruikt als anker voor DNAzym-urease conjugaten zodanig op de magnetische korrels. Zowel streptavidine en urease zijn eiwitmoleculen die kunnen worden gedenatureerd tijdens opslag. Wij slaan doorgaans de samengestelde DNAzym-urease-magnetische korrels bij 4 ° C gedurende maximaal 4 wekenen vers maken batches regelmatig consistentere resultaten.
Zorg moet ook worden genomen om te voorkomen dat per ongeluk magnetische korrels in de magnetische scheidingsstap (stap 6,9) na activering DNAzym. Vanuit onze ervaring, kunnen cellulaire puin en andere deeltjes in de oplossing van de magnetische scheiding efficiëntie te verminderen, en daarom kunnen sommige magnetische bolletjes kunnen onbedoeld afgesloten tijdens het pipetteren. Dit zal resulteren in vals-positieve resultaten. Wij raden de volgende maatregelen om het probleem aan te pakken: een langere scheiding tijd (zoals 5-10 minuten), een langzamere afgifte van de druk op de pipet om zachte terugtrekking van de bovenstaande mogelijk te maken, en het onderwerpen van de bovenstaande om een extra ronde van magnetische scheiding .
Tenslotte is het belangrijk om ongevallen verontreiniging van de reporter voorraadoplossing van urease in de loop van een experiment waarbij meerdere monsters getest voorkomen. Gezien de hoge reactiviteit van urease, verontreiniging van deze aard kan leiden tot een vals-positieve resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR AMRESCO | 0105 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | BIO BASIC CANADA INC. | SB6789 | |
| Tris-base | VWR AMRESCO | 0497 | |
| Boric acid | AMRESCO | 0588 | |
| Urea | VWR AMRESCO | M123 | |
| 40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution | BIO BASIC CANADA INC. | A0007 | |
| Sucrose | Bioshop Canada inc. | SUC507 | |
| Bromophenol blue | Bioshop Canada inc. | BRO777 | |
| Xylenecyanol FF | SIGMA-ALDRICH | X-4126 | |
| 10% sodium dodecyl sulfate | Bioshop Canada inc. | SDS001 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | CALEDON LABORATORIES LTD | 6026 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Bioshop Canada inc. | SOD001 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Bioshop Canada inc. | HEP001 | |
| Magnesium Chloride (II) hexahydrate | VWR AMRESCO | 0288 | |
| Tween 20 | Bioshop Canada inc. | TW508 | |
| Adenosine Triphospahte (ATP) | AMRESCO | 0220 | |
| Sodium Acetate trihydrate (NaOAc) | SIGMA-ALDRICH | S8625 | |
| Ethanol | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Tetramethyleneethylenediamine (TEMED) | AMRESCO | 0761 | |
| 10% Ammonium persulfate (APS) | BIO BASIC CANADA INC. | AB0072 | |
| Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 22360 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | CALEDON LABORATORIES | 803540 | |
| Urease | SIGMA-ALDRICH | U0251 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 70011-069 | |
| 0.04% Phenol red | SIGMA-ALDRICH | P3532 | |
| 10x T4 polynucleotide kinase reaction buffer | Lucigen | 30061-1 | |
| 10x T4 DNA ligase reaction buffer | Bio Basics Canada | B1122-B | |
| T4 DNA ligase (5 U/μl) | Thermo Fischer Scientific | B1122 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | AMRESCO | J106 | |
| Agar | AMRESCO | J637 | |
| T4 polynucleotide kinase (10 U/μl) | Lucigen | 30061-1 | |
| E. coli K12 (MG1655) | ATCC | ATCC700926 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 392187 | |
| Glass plates | CBS scientific | ngp-250nr | |
| 0.75 mm thick spacers | CBS scientific | VGS-0725r | |
| 12-well comb | CBS scientific | VGC-7512 | |
| UV Lamp | UVP | 95-0017-09 | |
| Spectrophotometer (NanoVue) | GE Healthcare | N/A | |
| Metal plate | CBS scientific | CPA165-250 | |
| Vortex | VWR International | 58816-123 | |
| Gel electrophoresis apparatus | CBS scientific | ASG-250 | |
| Petri dishes | VWR International | 25384-342 | |
| 100 kDa MWCO centrifugal filters | EMD Millipore | UFC510024 | |
| Magnetic Bead (BioMag) | Bangs Laboratories Inc | BM568 | |
| Magnetic Seperation Rack | New England BioLabs | S1506S | |
| Microfuge tubes | Sarstedt | 72.69 | |
| Syringe filter (0.22 μm) | VWR International | 28145-501 | |
| 14 ml culture tube | VWR International | 60818-725 | |
| Cell culture incubator | Eppendorf Scientific | M13520000 | |
| Branson Ultrasonic cleaner | Branson | N/A | |
| Camera (Canon Powershot G11) | Canon | N/A | |
| 50 ml conical tube | VWR International | 89004-364 |
References
- Daar, A. S., et al. Top ten biotechnologies for improving health in developing countries. Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).
- Newman, J. D., Turner, A. P. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective. Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).
- Turner, A. P.
- Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).
- Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
- Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Breaker, R. R.
- Liu, J., Cao, Z., Lu, Y.
- Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
- Li, J., Lu, Y. A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions. J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).
- Liu, J., Lu, Y. A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).
- Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
- Liu, J., et al. A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).
- Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides. Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).
- Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design. PLoS One. 2, e1224 (2007).
- Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).
- Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection. Biomolecules. 3, 563-577 (2013).
- Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961 (2012).
- Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).
- He, S., et al. Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe. Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).
- Sumner, J. B., Hand, D. B.
- Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. 70 Years of crystalline urease: What have we learned. Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).
- Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk. Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).
- Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef. J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).
- Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).
- Strachan, N. J., Ogden, I. D. A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom. FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).
- de Boer, E., Beumer, R. R. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).
- Gracias, K. S., McKillip, J. L. A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food. Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).
