Summary
이 프로토콜은, 리스테리아의 EGD 균주 (L. 모노 사이토 겐)을 C57BL / 6J 마우스에 접종하고, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포에 의한 인터페론 - γ (IFN-γ) 응답을 측정하는 방법을 설명 적응 T 포스트 감염 림프구. 이 프로토콜은 또한 병원균의 수정 된 LD (50) 투여로 감염 후 쥐에서 생존 연구를 수행하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
L. 모노 사이토 인간 식품 매개 질환의 원인이되는 그람 양성 세균이다. 이 병원체와 쥐의 실험 감염은 세포 내 병원체에 대한 숙주의 면역 타고난 및 적응 면역 세포와 특정 사이토 카인의 역할에 매우 유익하고있다. 리스테리아 모노 사이토 겐과 치사 감염시 타고난 세포에 의한 IFN-γ의 생산은 대 식세포 및 병원균 1-3의 초기 제어 활성화를위한 중요합니다. 또한, 적응 메모리 림프구에 의한 IFN-γ 생산에 재감염 4 선천성 세포의 활성화를 프라이밍 중요하다. L. 따라서 감염 모델 모노 사이토 겐 IFN-γ 생산을 증가시키기 위해 설계된 새로운 치료법은 생체 내 IFN-γ 반응에 영향을 미치는 등과 같은 세균 간극을 증가 또는 마우스의 생존을 개선 생산적 생물학적 효과가 있는지 여부를 조사하기위한 훌륭한 도구 역할 ...에서감염. 리스테리아 모노 사이토 겐의 EGD 균주 C57BL / 6J 마우스의 복강 내 감염을 수행하고, 유동 세포 계측법에 의한 NK 세포, NKT 세포, 및 적응 림프구에 의한 IFN-γ 생산을 측정하는 방법의 기본 프로토콜이 여기에서 설명한다. (1) 성장하고 접종에 대한 박테리아를 준비 (2) 엔드 포인트로 비장과 간, 그리고 (3) 측정 동물의 생존에 박테리아 부하를 측정 : 또한, 절차에 설명되어 있습니다. 대표 데이터는이 감염 모델 L. 모노 사이토 겐이 감염 마우스의 생존에 대한 IFN-γ 반응의 특정 제제의 효과를 테스트 할 수있는 방법을 예시하기 위해 제공된다.
Introduction
IFN-γ는 세포 내 병원체에 대한 면역 매개 종양 성장을 제어하기위한 5 중요 사이토킨이다. 박테리아 내성이 사이토 카인의 중요성은 IFN-γ의 신호 전달 경로에서의 돌연변이는 마이코 박테리아 및 살모넬라 6 감염에 매우 민감하여 인간 관찰에 분명하다. 마찬가지로, 마우스, IFN-γ 또는 L.는 10, 11 모노 사이토 겐을 포함 마이코 박테리아 7-9 및 기타 세포 내 병원균에 저항의 IFN-γ 수용체 전시 결함 중 하나에 슈만 편모충 주요 12, 살모넬라 티피 무리 움 (13), 특정 바이러스 (11) 결핍. 맞서 싸우는 병원균뿐만 아니라, IFN-γ 종양 (14)에 대한 호스트 방어에 중요한 역할을한다. IFN-γ의 높은 생산은 감염 또는 암의 맥락에서 유용하지만, 이러한 사이토 카인의 생산을 장기간 t 연계 된비 - 비만 당뇨 마우스 모델 (18) 전신성자가 면역 15-17의 발전 형 가속도 O I 당뇨병.
IFN-γ의 주요 소스는 NK 세포, NKT 세포, γδ T 세포, T 헬퍼 1 (받은 Th1) 세포 및 세포 독성 T 림프구 (CTL)를 포함 5,19,20. IFN-γ에 의해 선천성 및 후천성 면역을 모두 향상 (1)를 조절 (3) 강화 식세포, (2) 항원 제시 세포상의 공동 - 자극 분자의 발현을 증가시키는 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 및 II 발현 식세포 작용 및 염증성 사이토 카인의 생산 및 살균 요인 (예를 들면, 일산화 질소 및 활성 산소 종), (4) (5) (면역 글로불린 항체 클래스 스위칭을 촉진하는 Th1 효과기 세포로의 나이브 CD4 + T 세포의 분화를 촉진 IG) 2a 및 마우스에서 IgG3 ()는 (6) 케모카인의 생성을 유도하는 난 부위로 면역 세포를 모집nfection 및 (7) NK 세포 및 CTL 반응을 향상 5,19. 병원균과 종양 호스트 응답 IFN-γ의 결정적인 중요성을 감안할 때, 재조합 IFN-γ는 (19에서 검토) 다양한 감염과 악성 종양에 대한 치료로 테스트되었습니다. IFN-γ 또는받은 Th1 촉진 사이토킨 인터루킨 -12 (IL-12)의 전신 투여는 부작용과 연관 투여 량 관련 독성 (19, 21)가되기 때문에, 의한 IFN-γ 생산을 증가시키기 위해 대안적인 전략의 개발에 대한 관심이있다 면역 세포. 새로운 바이오 작은 분자의 개발은 에이전트가 면역 반응 중 IFN-γ의 생산을 증가 여부를 테스트하기 위해 생체 검사 도구의 필요 여부이는 동물의 생존의 증가로 의미있는 생물학적 효과로 변환합니다.
그램 양성 세균 리스테리아 모노 사이토 겐 쥐의 실험 감염에 대한 쓸모있는 모델이었다세포 내 병원균 1,22에 대한 호스트 면역 IFN-γ의 역할을 해독. 병원균 정맥 또는 복강 (IP)와 쥐의 감염은이 일 포스트 (3) 사이에 4를 발생하는 비장의 피크 세균 부하 주민 대식 세포 및 간세포에 의해 내면화 될 비장과 간,에 박테리아의 급속한 보급에 이르게 감염 1,3,22. NK 세포에 의한 IFN-γ의 생산은 대 식세포의 활성화 및 병원체 3에 대한 초기 저항 중요하다; 그러나 높은 전염성 투여 량, IFN-γ의 생산은 병원균 통관 (23)에 유해 할 수 있습니다. NKT 세포는 병원균 2,24 초기 제어시 비장, 간에서 IFN-γ의 공급원이며, 이러한 제조는 NK 세포를 포함하는 다른 2 종류의 세포에 의한 IFN-γ 생산을 증폭하는 것으로 나타났다. 이상적 상대있는 반면, 적응 형 T 림프구 이상 작용, CD8 + T 세포큘라은 병원균의 간극을 매개하고 다시 감염 1,4,22에 대한 보호를 제공하기위한 중요하다.
이 감염 모델 (1 검토) 이유에서 연구자 매력적인왔다. 우선, 병원체 감염이 높은 재현성과 강한받은 Th1 세포 성 면역 반응을 유도한다. 둘째, 치사 감염시 세균 부하가 쉽게 측정 될 수있는 간 및 비장에서 농축된다. 셋째, 병원체 안전하게 바이오 레벨 2 (BSL2) 조건 하에서 처리 될 수있다. 넷째, 생물 및 면역 반응이 광범위하게 특성화되었다 생성있다. 마지막으로, 돌연변이와 유전자 변형 종자의 다양한 사용할 수 있습니다 개발되었다.
L.의 EGD 균주와 C57BL / 6J 마우스의 접종을위한 기본 프로토콜은 여기에 25 모노 사이토 겐입니다 설명 및 IFN 측정 - γ 다시NK, NKT, 적응 림프구 후 감염에 의해 sponses. 또한 설명 치사 감염 후에 박테리아 비장, 간 부하를 측정하고, 병원체의 변형 LD 50 복용량 감염 후 생존 연구를 수행하는 방법이다. 마지막으로, 대표 데이터는이 프로토콜은 감염 L. 모노 사이토 겐에서 IFN-γ 반응과 마우스의 생존에 대한 새로운 치료법의 효과를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있는지 나타낸다.
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Protocol
안전 정책
이 프로토콜은 라이브 리스테리아 모노 사이토 겐 쥐의 감염을 설명합니다. 병원균은 면역 저하되지 않는 훈련을받은 사람이 BSL2 조건에서 안전하게 처리됩니다. 면역 사람들은 HIV 감염 또는 면역 억제 요법 치료를 필요로 만성 질환이 임신 여성, 노인과 개인을 포함한다. 감염된 샘플을 처리하는 동안 작업자는 보호 실험실 코트 또는 가운, 장갑, 마스크, 눈 보호를 돈합니다. 여기에 설명 된 작품은 대학 건강 네트워크에 의해 (UHN) 바이오 안전성 사무실을 발급 한 인증서 (# 32876)에서 BSL2 조건에서 수행 하였다. 감염된 마우스 또는 사용하지 않는 조직에서 시체는 두 번 싸서 및 생물 학적 폐기물 처분했다. 감염된 마우스에서 케이지는 고압 증기 멸균에 의해 오염 제거 하였다.
윤리 정책
마우스를 유지하고 quara에 감염ntine UHN 동물 시설 내 방은 동물 관리에 캐나다위원회가 설정 한 지침에 따라 마음에 든다고했다. 마우스의 모든 절차는 UHN 동물 관리위원회에 의해 승인 된 동물 사용 프로토콜 # 3214에 따라 수행 하였다. 때문에 윤리적 고려 사항, 죽음은 생존 연구를위한 엔드 포인트로 사용되지 않았습니다. L. 여기에보고 된 수정 된 LD (50) 투여 량은 감염 마우스의 50 %가 20 %의 체중 감소, 또는 다음의 임상 징후의 적어도 두개를 나타내는 구성의 특정 종점에 도달하는 투여 량으로 결정 하였다 모노 사이토 겐 : 혼수, 프릴 모피, 구부리고 자세, 호흡 곤란, 무딘 또는 침몰 한 눈. 그들은 UHN 설비 지침에 따라 이산화탄소에 대한 노출을 통해 엔드 포인트 (CO 2)에 도달 할 때 마우스를 안락사시켰다.
장기 저장을위한 글리세롤 주식의 1. 준비
참고 :이 절차는 얼마나 글리세롤 주식을 설명합니다리스테리아 모노 사이토 겐의 EGD 균주는 원래 글리세롤 재고에서 제조된다. 에어로졸을 생성 할 가능성이 단계는 인증 바이오 안전성 캐비닛 (BSC) 내에서 수행되어야한다.
- 세균의 성장을위한 뇌 심장 주입 (BHI) 한천 플레이트를 준비합니다. 이 3.8 %를 추가 들어 BHI 국물 1.5 % (/ V w) 한천 증류 두 배 (/ V 승) H 2 O (DDH 2 O). 오토 클레이브 액체. 한천은 50 ° C로 냉각되면, 세균 배양 접시에 액체를 분배 (25 ㎖ / 요리) 1 시간의 BSC에 건조 플레이트 (발견) 할 수 있습니다.
참고 : 고압 증기 멸균 후 50 ° C의 물을 욕조에 전송 BHI 한천 이전 판을 붓는에 응고를 방지 할 수 있습니다. 거꾸로 (상단에 미디어면)를 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 보관 BHI 판. - 액체 BHI 미디어를 준비합니다. 이를 위해, DDH 2 O. 오토 클레이브에서 BHI 국물 (/ V w) 3.8 %를 섞는다.
- 로부터의 리스테리아 모노 사이토 겐 EGD 균주의 냉동 글리세롤 주식을 제거 -80 C 동결 °R 실온으로 해동.
- BHI 판의 섹션에 걸쳐 앞뒤로 멸균 피펫 해동 글리세롤 재고 팁과 즉시 행진 끝을 찍어. 이는 일차 연속이다.
- (이 보조 행진이다) 90 ° C에서 접시를 켜고 신선한 피펫 팁을 사용하여 첫 번째 행진을 통해 끌어 플레이트의 다음 ¼로 확산. 고등 행진을 한 번 더 반복합니다.
- 거꾸로 판을 켜고 밤새 37 ° C에서 품어. 하나의 균일 한 식민지는 줄무늬의 마지막 세트에서 얻은 16과 24 시간 사이에 표시되어야한다.
- 멸균 배출 50 ㎖ 튜브에 멸균 BHI 배지 10 ㎖를 분배. 멸균 피펫 팁을 사용하여 판에서 리스테리아 모노 사이토 겐의 한 식민지를 선택하고 국물을 접종. 하룻밤 또는 OD 600 = 분 (RPM) 당 225 회전에서 설정을 1.0까지 37 ° C 궤도 진탕 배양기에서 문화를 품어.
참고 : 유리 또는 일회용 놀이터STIC 삼각 플라스크는 문화 박테리아로 사용할 수 있습니다. 사용과 관계없이 용기의 종류, 그 배기 멸균 것을 문화의 용적이 박테리아의 적절한 통기를 보장하기 위해 용기의 총 부피의 20 %를 초과하지 않도록. - 1 비율 : 1에서 밤새 세균의 액체 배양과 멸균 100 % 글리세롤을 혼합하여 글리세롤 주식을 준비합니다. 저장 -80 ° C 냉장고에 2 ml의 극저온 튜브 (500 μL / 유리 병) 및 전송 유리 병에 세균 / 글리세롤 혼합물을 배포합니다.
주 : 비드 스톡 방법은 박테리아를 저장 글리세롤 주식 대신에 사용될 수있다. 이 방법으로, 다공성 마이크로 비드는 리스테리아 모노 사이토 겐의 순수 배양 접종하고, -80 ° C에 저장됩니다. 각 비드 필요한 신선한 배양에 접종 할 수있다. 자세한 내용은 자료의 목록을 참조하십시오.
L.의 성장 곡선 2. 결정은 주 문화에 모노 사이토 겐 주 :이 절차는 감염 연구에 대한 집락 형성 단위 (CFU)를 추정하는 데 사용되는 리스테리아 모노 사이토 겐의 성장 곡선을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 에어로졸을 생성 할 가능성이있는 모든 단계는 인증 BSC에서 수행되어야한다.
- 배출 한 50 ML 튜브에 10 ML의 BHI 미디어에 단계 1.7에서 생성 하룻밤 문화의 100 μl를 타고 (45 ° 각도로 기울어 진 225 rpm으로) 진탕 배양기에서 37 ° C에서 성장한다. 대조군으로 비 접종 된 튜브를 사용한다.
- 매시간 간격으로 배양액 0.5 ml의 샘플을 취 (등 1, 2, 3, 4, 5, 6 인사.). 플라스틱 큐벳에 BHI 매체와 함께 1 (v / v)로 각각 나누어지는 1을 희석. 최대 피펫 아래로 혼합. 분광기를 사용하여 600 nm의 (OD 600)에서 광학 밀도 (OD)를 측정한다. OD 600 = 1 일까지 박테리아를 배양 계속합니다.
- 동시에, 배양액 100 μL 샘플을 취하여 멸균 된 1.5 ㎖의 MICR 900 ㎕의 BHI 배지로 희석ocentrifuge 튜브 (이 10 -1 희석)입니다. 5 분 동안 6,000 XG에서 박테리아를 원심 분리하고, 상등액을 흡인.
- , BHI 배지 1 ㎖의 펠렛을 재현 탁 6,000 XG에서 5 분 동안 원심 분리 한 후 상층 액을 흡입에 의해 두 번 박테리아를 씻으십시오. 1 ml의 BHI 미디어에서 펠렛을 재현 탁. BHI 미디어 (10-2 -9 10)이 샘플의 10 배 희석 시리즈를 준비합니다. 별도의 BHI 한천 플레이트에 각 희석 100 μl를 확산. 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 번호판을 품어.
- 300 식민지 - 다음 날, 30 사이가 판을 선택합니다. 나머지를 폐기하십시오. 이 판에 식민지를 계산합니다. 표 1에 경우에 OD 600 = 0.84 찍은 분취에서 얻어진 계수의 예를 도시한다. 이 예에서, 상기 플레이트 중 하나 (즉, 10-6 희석) (30) 사이에 집락을 가지고 - (300) 및 CFU / ㎖ 계산에 사용 하였다.
참고 : 더와 플레이트300 식민지는 인구 과잉이 박테리아의 성장을 방해 할 수 있기 때문에, 사용도 어려운 식별 및 개별 식민지를 열거 할 수 없습니다. 희석 방법 또는 오염 물질의 존재 하에서 작은 오차 범위의 하단 계수의 정밀도에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에 카운트 <30 플레이트는 사용되지 않는다. - 도금 체적 콜로니 수를 분할 한 후, 특정의 희석에 대한 CFU / ml의 값을 획득하기 위해, 희석 배수를 곱하여. 표 1의 예에서, 10-6 희석 카운트는 70 나누기 희석 배양에 대한 CFU / ml의 값을 얻을 수있는 0.1 ml로이 값이었다. 이어서 원액을 배양 (7.0 × 10 8)의 CFU / ml의 값을 획득하기 위해 상기 희석 계수 (106)로이 값을 곱한다.
- 성장 (26)의 대수의 위상을 식별하도록 시간의 시간 대 OD (600) (y 축) (x 축)을 그린다.
참고 :이 성장 CURV특정 OD 독서로 성장 할 때 전자는 일 문화의 CFU / ㎖의 추정치를 제공합니다. 일 배양의 성장에 대한 목표 OD (600)로서 사용될 수있다 대수 성장 단계에서 600 인 OD 판독을 선택. 지금 접종원 제조 문화의 CFU를 추정하는데 사용될 수있는 이러한 데이터 (순서 3).
리스테리아 모노 사이토 겐과 실험 감염에 대한 접종 3. 준비
주 :이 절차는 하룻밤 문화에서 시작된 일 문화에서 감염 접종의 준비에 대해 설명합니다 (순서 2에서 제조). 달리 지시되지 않는 한 모든 단계는 BSC에서 수행된다.
- 마우스 및 연구 실험 설계의 수에 따라 감염에 필요한 CFU의 수를 계산한다. 멸균 배출 삼각 플라스크 또는 문화 튜브에 BHI 매체의 적절한 볼륨을 추가합니다.
참고 : 박테리아 (P)의 CFUrepared 수행 실험의 유형에 의존 할 것이다. 감염 중에 NK와 NKT 세포 반응 연구를위한 각 마우스의 세균 105 CFU (순서 6)로 접종한다. 세균 부하를 감염 적응 T 세포 반응을 연구하거나 측정하는 경우, 각 마우스 박테리아 2 × 104 CFU (순서 8)로 접종한다. 엔드 포인트에 생존을 공부하는 경우 각 마우스 (남성 105 CFU, 여자 1.5 × 105 CFU, 절차 9 참조입니다) 병원체의 LD 50 량을 접종한다. - 하룻밤 문화 100 ㎕로 BHI 매체를 포함하는 튜브를 접종한다. 대상 OD (600)까지 37 ° C 궤도 떨고 인큐베이터 (225 RPM)에서 문화를 품어 것은 도달한다. 멸균 원심 분리기 튜브에 문화 콘텐츠를 전송합니다.
- 원심 분리기를 사용하여 6,000 XG에 5 분을위한 펠릿에 원심 분리기 박테리아. 표백제를 함유하는 트랩을 플라스크에 부착 된 진공을 이용하여 상등액을 흡인.
- 워시 사이 (6000 XG에서 5 분), 원심 분리, 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 두 번 펠릿.
- 두 번째 세척을 기음과 200 μl의 볼륨에서 각 마우스에 관심있는 CFU를 제공하는 1X PBS의 적절한 농도에서 박테리아를 희석.
주 : 실험실 유리는 리포 폴리 사카 라이드 등의 면역 학적 오염 물질을 소개 할 수 있기 때문에, 세척 세균과 접종의 준비를 위해 멸균 1X PBS의 상용 소스를 사용하는 것이 가장 좋습니다.
리스테리아 모노 사이토 겐와 마우스 4. 실험 감염
참고 :이 절차는 절차 3 방법과 접종에 전달 CFU를 확인하는 방법으로 제조 접종으로 쥐를 감염하는 방법을 설명합니다. 마우스와 주사의 처리는 BSC에서 수행된다.
- 실험에 대한 남성 또는 여성 C57BL / 6J 마우스의 충분한 수의 주문. 또한 마우스로 감염되지 않은 컨트롤을 제공하기 위해 주문한다.
- 에 마우스를 허용세균 접종 이전에 1 주간 순응.
주 : 동물의 전송과 관련된 응력이 응력 호르몬 생산 및 림프구 27,28의 일시적인 증가를 유발할 수 있기 때문이다. - 접종 일에, 각각의 마우스에 대한 기준선 체중 구하여 실험 노트에 기록한다.
- BSC에에서 최대 박테리아가 고르게 분포되어 있는지 확인 후 25 G 바늘 장착 된 1 ml의 안전 설계 주사기로 접종의 200 μl를 차지하기 위해 멸균 피펫을 사용하여 아래로 세균 현탁액을 섞는다.
- 준비 접종의 200 μL와 마우스 IP를 주입한다 (예를 들어, NK 세포 감염 10 5 CFU, 절차 6). 이 절차를 들어, 마우스의 어깨 주위의 느슨한 피부를 잡아 덜 지배적 인 손으로 마우스를 목덜미. 마우스가 잘 억제 것을 확인한 후 m 단지 횡 복부의 하부 사분면에 마우스를 주입idline은 방광을 방지 할 수 있습니다.
- 생물 학적 날카로운 물건 용기에 바늘과 주사기 폐기하십시오.
- 모든 쥐가 주입 될 때까지 4.6 - 반복 4.3 단계를 반복합니다. 1X PBS와 유사한 단계를 수행 쥐 (감염되지 않은 컨트롤)을 주입.
주 : CFU가 성장 곡선에 기초하여 추정하므로,이 균액의 실제 CFU를 확인하는 것이 좋다도이다. 당신이 셀 수 식민지가 발생할 것으로 예상 (10 배 희석 시리즈를 사용하여) 준비된 접종의 4 가지 희석 -이를 위해, 3을 준비합니다. BHI 한천 플레이트에 각 희석 100 μl를 확산하고 밤새 37 ° C를 품어. 콜로니를 카운트하고 절차 2에서 설명한 바와 같이 실제 CFU / ㎖를 계산한다.
면역 연구 5. 준비 열 사망 리스테리아 모노 사이토 겐
주 : 에어로졸은 BSC에서 수행되는 생성 할 가능성이있는 모든 단계.
- OD 600 값 a를 때까지 일 문화를 성장대수 위상 내에 도달 할 다시. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 문화를 분배.
- 박테리아를 죽일 1 시간 동안 수욕에서 70 ° C에서 튜브를 품어.
- 단계 3.3 및 3.4에서와 같이 1X PBS로 두 번 박테리아를 씻으십시오. 소 태아 혈청 (FCS)을 함유하는 멸균 된 완전한 RPMI 배지에 재현 탁 4 × 106 / ml의 농도 (레시피 기업 파일 1 참조). 나누어은 -80 ° C에서 2 ml의 살균 극저온 튜브 및 저장소에 박테리아를 죽였다.
- BHI 한천 플레이트에 열 살해 박테리아 준비 100 μl를 확산하고 37 ° C에서 하룻밤 배양하여 세균의 죽음을 확인합니다.
참고 : BHI 한천 플레이트에 성장하는 식민지가있는 경우이 열 살해 박테리아 절차 8에 문화의 림프구를 자극에 대한 준비가되어 있어야는 열 살인 절차를 반복합니다.
감염 중 NK와 NKT 세포에 의한 IFN-γ 응답 6. 측정
참고 :이 절차는 리스테리아 모노 사이토 겐의 10 5 CFU 감염 후 24 시간에서 생쥐에서 NK와 NKT 세포에 의한 IFN-γ 응답을 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 이 비장 24 NK와 NKT 세포에 의한 강력한 IFN-γ 반응을 유도하기 때문에 용량이 사용된다. BSC에의 모든 단계를 실시한다. , 세포 생존을 유지 가능한 얼음에 세포를 유지하고 얼음처럼 차가운 버퍼를 사용하는 데 도움합니다.
- 리스테리아 모노 사이토 겐의 10 5 CFU과 절차 4에서 설명한대로 마우스를 접종한다. 동시에, 감염되지 않은 대조군은 1X PBS 동량 ip가 주입.
- 제도적 지침에 따라 CO에 의해 2 흡입을 24 시간 후 접종에서 쥐를 안락사.
- 그 오른쪽에 각 마우스 거짓말과 스퀴즈 병을 사용하여 70 % 에탄올로 피부를 젖은.
- 무균 또는 멸균 집게 힘든 컷 가위를 사용하여, 바로 흉곽의 바닥 아래 피부를 절개.
- 아래 스프레이70 % 에탄올로 노출 근육층. 비장은 근육 층 (그림 1에서 열려 화살표 머리) 아래에 표시되어야합니다.
- 무균 핀셋 미세 가위를 사용하여 비장을 공개하는 근육층 절개. 부드럽게 집게로 비장을 잡아 결합 조직을 주변에서 멀리 비장을 잘라 미세 가위를 사용합니다.
- 멸균 1X PBS를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브의 비장를 놓습니다.
- 멸균 1X PBS로 무균 배양 접시를 반 입력합니다. 멸균 3 ML의 주사기의 평평한 끝을 사용하여 배양 접시에 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 비장을 떼어 놓다.
- 멸균 10 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 깨끗한 무균 15 ML 원뿔 튜브에 비장 세포 현탁액을 전송합니다.
- 4 ℃에서 10 분 동안 335 XG에 원심 분리기 샘플.
- 표백제가 포함 된 트랩 플라스크에 뜨는을 대기음. 손가락으로 튜브를 쓸어 넘겨 또는 하단 튜브를 드래그하여 세포 펠렛을 풉니 다앞뒤로 요철면을 따라 (예를 들어, 공기 흐름은 BSC에서 배출).
- 암모늄 염화 칼륨 (ACK) 용해 완충액 1.5 ml를 첨가하여를 Lyse 적혈구 각 비장 (레서피위한 기업 파일 1 참조). 정확히 1 분 15 초 후, 세포 용해를 중지 1X PBS와 함께 관을 채운다.
- 원심 분리 세포는 6.10 단계에서 설명. 상층 액을 흡인하고 (FACS) 완충액 (멸균 PBS 1X 2 % FCS 함유) 정렬 형광 - 활성화 된 세포의 10 ml의 세포 펠렛을 재현 탁.
- 혈구 세포를 사용하여 계산. 이를 위해 카운트 세포 현탁액의 두 분취 량을. (DDH 2 O에서 0.4 % 트리 판 블루 용액을 희석하여 만든 0.04 %) 트리 판 블루의 동일한 볼륨 각 세포 현탁액의 15 μl를 추가합니다. 로드 혈구의 챔버로 각 셀 / 트리 판 블루 현탁액 15 μL (즉, 상부 챔버에 하나, 하단 챔버의 하나).
- 현미경을 사용하여, 모든 비 블루 셀 카운트각 챔버의 중앙 그리드의 5 큰 사각형 (그림 2). 이 계수를 취하여 106 / ml의 세포 수를 얻기 위해 10으로 나눈다. 도 2의 예에서, 수는 5 개 사각형 셀 (215)이고; 따라서, 세포 농도는 21.5 × 106 / ㎖이다. 두 샘플로부터 얻은 세포 농도를 평균.
- 염색 유동 세포 계측법에 대한 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 잘 / 얼룩 당 종자 1 × 10 6 세포. 또한 흠 형광을 뺀 (FMO) 컨트롤에 대한 세포를 배정해야합니다. 표 2에 염색 패널 세포 계측법 권장 흐름을 참조하십시오.
참고 : 다음 단계를 들면, 얼음 또는 4 ° C에서 세포를 유지하고 형광 색소가 존재하는 경우 호일로 빛으로부터 세포를 보호하는 것이 좋습니다. 멀티 채널 피펫을 처리 속도를 96 웰 플레이트로 염색 액체를 분배하기 위해 사용될 수있다. 때 세포 펠렛을 방해하는 조심하지 수원심 분리 판의 상층 액을 흡입. 원심 분리기는 플레이트 어댑터를 장착하지 않은 경우 염색은 FACS 튜브에서 수행 할 수있다. 이 시점부터 모든 원심 분리기 단계는 4 ℃에서 5 분 동안 456 XG에서 수행됩니다. - 접시를 원심 분리 한 후 FACS 버퍼로 두 번 세포를 씻으십시오. 하나의 세척은 각 웰에 FACS 완충액 200 μL를 추가 플레이트를 원심 분리 한 후 상등액을 흡입에 의해 행해진 다.
- 50 μL / 웰의 항 - 마우스 CD16 / CD32 (정제 된 Fc 블록) (0.5 μg의)를 포함 FACS 버퍼를 추가하여 차단 단계를 수행합니다. 15 분 동안 4 ° C에서 세포를 품어. 상술 한 바와 같이 1X PBS에 한 번 세포를 씻으십시오.
- 세포에 100 ㎕의 생존 염료를 (1X PBS에서 1,000 고칠 가능성 염료 1 희석)를 추가합니다. 30 분 동안 (냉장고에) 어둠 속에서 4 ° C에서 얼룩 세포. 상술 한 바와 같이 FACS 버퍼에 두 번 세포를 씻으십시오.
- 두 번째 세척 후에, 각 웰에 따른 t 100 세포 표면 항체 또는 사량 μL를 추가O 염색 패널은 표 2에 기재된. 30 분 동안 (냉장고에) 어둠 속에서 4 ° C에서 얼룩 세포. 이 때, 또한 하나의 긍정적 인 FMO 컨트롤을 염색에 대한 항체를 추가합니다.
참고 : 하나의 긍정적 인 컨트롤에 관해서는, 그것은 패널에 사용되는 항체로 염색 된 CD4 항체 또는 상업적 보상 구슬의 다양한 형광 색소 버전으로 염색 중 하나를 사용하여 비장 세포에 좋습니다. 종래 이러한 염색 과정을 수행으로 모든 FACS 염색 항체는 최적 농도를 결정하기 위해 시험 연구에서 적정한다. - 전술 한 바와 같이 FACS 완충액으로 두 번 세포를 씻어 준 후 4 % 파라 포름 알데히드 (DDH 2 O로 희석하고, 16 % 파라 포름 알데히드 주식) 50 μL에이를 재현 탁하고 실온에서 10 분 동안 배양하여 세포를 고정한다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 독성이 만 흄 후드에서 처리되어야한다.
- 난 두 번 세포를 씻으십시오N FACS 완충액 사이에 원심. FACS 완충액에 세포를 재현 탁. 최대 사흘 동안 빛으로부터 보호 냉장고에서 다음 단계 또는 저장 세포에 계속.
- 원심 분리기 세포 사이에 원심 분리, 상층 액을 제거하고 1 배 Permeabilization / 워시 버퍼 (파마 / 워시 버퍼) 150 μL로 두 번 세포를 씻으십시오. 9 (v / v)의 DDH 2 O. : 파마 / 워시 버퍼 1을 희석하여 10 배 재고에서 준비
- 두 번째 세척 후, 파마 / 워시 버퍼 150 μL의 세포를 재현 탁하고 어두운 4 ° C에서 15 분 동안 품어.
- 원심 분리기 세포는 다시 다음 뜨는을 대기음. 안티 IFN-γ를 포함하고 어둠 속에서 4 ° C에서 1 시간 동안 품어 1 배 파마 / 워시 버퍼의 50 μL에 재현 탁 세포.
- 사이에서 원심 분리, 1 배 파마 / 워시 버퍼로 두 번 세포를 씻으십시오. FACS 버퍼의 250 μl의 세포를 재현 탁하고 FACS 튜브에 세포를 전송합니다.
- 흐름 cytomet를 사용하여 수집 유동 세포 계측법로 진행어 그 표 2 (29)에 설명 된 염색 패널에 사용되는 형광 색소를 구별 할 수있는 적절한 레이저 구성 및 필터 세트가 있습니다. 샘플 당 최소 20 만 이벤트와 보상 컨트롤 만 이벤트를 수집합니다.
- 보상 매트릭스를 적용하고 유세포 분석 소프트웨어 (30)를 사용하여 데이터를 분석한다.
피크 감염시 비장과 간에서 세균 부하 7. 측정
참고 : 별도의 표시가없는 한, 모든 단계는 BSC 내에서 수행된다.
- 마우스 절차 4에 기재된 절차를 이용하여 병원체의 2 × 104 CFU로 ip가 접종한다.
- 3 일 후 감염에, 멸균 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브를 준비, 각 포함 1X PBS에서 얼음처럼 차가운 멸균 0.1 % 트리톤 X-100의 500 μl를 0.2 - 2mm의 산 세척 멸균 유리 구슬 - 1.5 0.3 g. 각 튜브의 무게를.
참고 : 유리 구슬은 산 인큐에 의해 세척1 시간 동안 자기 교반기에 비이커에 10 % 아세트산와 싸우는. 이들 비드는 광범위하게 공기 건조 산을 제거 DDH 2 O로 세척 한 다음 사용 전에 멸균한다. - CO 2 노출로 쥐를 안락사.
- 장기의 해부를 들어, 해부 보드의 뒷면에있는 동물을 놓고 25 G 바늘을 사용하여 보드에 마우스의 사지를 고정. 70 % 에탄올로 습윤에 의해 피부를 소독.
- 멸균 거친 절단 가위를 사용하여, 각각의 무릎으로 각 팔꿈치를 향해 중반 가슴에서 중반 사타구니에서 다음 중반 가슴 사타구니에서 피부의 중간 선 절개를합니다. 블런트 해부는 25 G 바늘을 사용하여 열 고정, 피부를 다시 반영.
- 멸균 미세 가위 복막 벽 정중선 절개를 사용 후 70 % 에탄올로 습윤 의해 근육층 소독. 집게와 칼 모양의 프로세스를 잡아. 그런 다음, 같은 미세 가위를 사용하여 칼 모양의 proce을에서 복막 벽에 상처를 만들바로 다이어프램 아래 흉곽 다음과 같은 측면 양쪽에 SS는 간을 공개합니다.
- 멸균 가위를 사용하여 간장의 ~ 100 mg의 조각 (모든 마우스에 대해 같은 로브를 사용) 잘라 미리 무게 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 넣습니다.
- 부드럽게 비장 시각화 복강 왼쪽의 장기를 따로 밀어 집게를 사용한다. 부드럽게 포셉 한 쌍의 비장을 잡고 주위의 결합 조직을 멀리 절단하여 복강에서 분리합니다.
- 구슬이 들어있는 미리 무게 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 비장를 놓습니다. 운송은 누출 방지 용기 포함 얼음에 실험실 풀 때 티슈. 밀리그램의 조직 가중치를 결정하기 위해 장기를 포함하는 튜브를 다시 무게.
- 30 헤르츠의 주파수에서 3 분 동안 비드 밀을 균질기를 사용하여 튜브를 흔들어 조직 균질화.
주 : 비드 밀 방법 균질화 바람직하다은 처리 용 의무 그대로샘플의 큰 숫자를 노래하고 덜 혼란과 병원균에 노출을 만듭니다. 그러나, 자동 또는 수동 균질 유리 조직 균질이 대안으로 사용될 수있는 2 mL의 멸균. - (희석에서 10-7까지)에 이르기까지, 1X PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100의 균질의 10 배 희석 시리즈를 준비합니다.
- 멸균 스프레더를 사용하여 (중복 단위) BHI 한천 플레이트에 각 희석 균질의 100 μl를 확산. 37 ° C를 인큐베이터로 전송 접시와 하룻밤 품어.
- 나머지는 폐기, 30, 300 식민지 / 플레이트 사이에 들어있는 판을 보관하십시오. 각각의 접시에 식민지를 카운트 중복 스프레드에 대한 식민지의 평균 수를 결정합니다.
- 하기 식에 따라 CFU / mg의 계산 :
균질 조직의 mg의 중량으로 나눈 값의 제조 파쇄 ㎖, 곱의 파쇄는 CFU / Mg가 CFU / ㎖.
참고 : 30 (COL)의 예를 들면, 평균onies은 같은 것 계산은 다음 0.5 ml의 균질화 간 120 mg의 조각으로부터 제조 10-2 희석 균질의 100 μl를 도금 후 계수 하였다 :
CFU / ㎖ = 30 식민지 × 100 (희석 배수) / 0.1 ㎖ (볼륨 스프레드) = 30,000 CFU / ㎖.
CFU / mg의 = 30,000 CFU / ㎖ X 0.5 ml의 균질 / 120 mg의 조직 = 125 CFU / mg의.
8. CD4 +와 CD8하여 IFN-γ 응답에 리스테리아 모노 사이토 겐의 효과 + 세포
주 : (1) 유량 :이 절차는 두 가지 방법을 사용하여 적응성 면역 반응 (~ 7 일 이내의 감염 후)의 피크시 수확 비장 CD4 + 및 CD8 + T 이펙터 세포에 의한 IFN-γ 생산을 측정하는 방법을 설명 세포 내 사이토 카인 염색으로 CD4 + 및 CD8 + 세포에 의해 IFN-γ을 측정하고, (2) ELISA는 비장 세포 (전체 T 세포를 포함)에 의해 생성 된 총 IFN-γ 수준을 측정하기 위해. 절차BSC에 내에서 수행된다.
- 절차 4에 기재된 절차를 이용하여 병원체의 2 × 104 CFU로 IP를 주사하여 마우스를 감염.
- 7 일 후 감염에서 제도적 지침에 따라 CO에 의해 2 흡입 쥐를 안락사.
- 멸균 1X PBS를 함유하는 15ml의 원뿔형 튜브 비장 (전술 한 바와 같이)과 장소를 해부. 누출 방지 용기 포함 얼음에 실험실에 튜브를 전송.
- 단일 세포 현탁액으로 비장을 처리 (6)에 기재된 적혈구 용균 후, 10 % FCS를 함유하는 완전 RPMI 배지에서 세포를 재현 탁. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
- IFN-γ 응답의 측정을위한 설정 문화. 이 분사 셀 (1에서 4 × 106 ㎖ / 웰)과 함께 24 웰 플레이트와 동수로 (4 × 106 또는 1 ㎖ / 웰) 해동 열 살해 L. 모노 사이토 (순서 5에서 제조) . 37 세포를 전송C 배양기를 °.
- 배양 20 시간 후 웰에 단백질 수송 억제제 0.66 μL / ㎖를 추가하고 배양을 계속한다.
- 네 시간 후, 상용 효소 면역 분석법 (ELISA) 키트 (31)를 사용하여 IFN-γ 수준의 이상 측정을위한 전송 BSC에 플레이트 (-80 ° C에서) 배양 상층 액과 동결의 500 μl를 수집합니다. 그런 다음 멸균 15 ML 튜브에 세포를 수집합니다. 1X PBS로 우물을 세척하고 수집 된 세포와 함께이 세척 수영장.
- 표 3에 기재된 염색 패널을 사용하는 것을 제외하고 절차 6에 따라 CD4 + 및 CD8 + 세포에 IFN-γ에 대한 세포 표면 염색 및 세포 염색을 실시한다. 인수 사이토 (20 만 이벤트 / 샘플을 수집) 흐름 및 분석 소프트웨어 (30) 유동 세포 계측법을 사용하여 데이터 (29)를 분석하기 위해 진행합니다.
9. 리스테리아 모노 사이토 겐 인 감염 후 엔드 포인트에 마우스 생존을 측정기
참고 :이 절차는 병원체의 수정 된 LD (50) 투여와 엔드 포인트에 마우스 생존에 에이전트의 효과 후 감염에 대해 설명합니다. 이 모든 절차는 동물 시설에서 BSC로 진행됩니다.
- 절차 4에 설명 된 바와 같이 마우스는 리스테리아 모노 사이토 겐의 변형 LD 50 복용량 ip가 주입이 (수컷) 105 CFU 또는 (암컷) 1.5 × 105 CFU (31)로 측정되었다.
- 회 임상 증상에 대한 마우스를 따라 실험실 노트북에서 이러한 징후와 동물의 체중을 기록한다. 그들은 20 %의 체중 또는 리스테리아 증의 두 가지 임상 증상 손실 (혼수, 주름 장식 모피, 구부리고 자세, 호흡 곤란, 무딘 또는 침몰 눈)를 표시하더라도 쥐를 안락사.
- 십사일 후, CO 2 흡입을 통해 마우스 생존 안락사.
- 시간 (32)에 대해 각 그룹의 %의 생존을 플로팅하여 데이터의 카플란 - 마이어 플롯을 준비합니다.
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Representative Results
그림 3은 병원균의 10 5 CFU와 24 시간 후 감염에 비장 NK와 NKT 세포에서 IFN-γ의 염색 세포 계측법 몇 가지 일반적인 흐름을 제공합니다. 이 도면은 또한 표 2에 기재된 염색 패널 게이팅 전략을 예시한다. 그림 4는 105 CFU 리스테리아 모노 사이토 겐에 감염된 수컷 마우스는 PPARα 길항제 IS001 또는 차량 제어로 처리 한 실험에서 얻을 수 있었다 몇 가지 대표적인 데이터를 표시 한 후 24 시간 후 NK와 NKT 세포에서 IFN-γ에 대한 분석 . 이 그림은 IS001 치료는 병원체와 감염 후 IFN-γ의 NKT 세포에 의한 반응,하지만 NK 세포를 밀어 것을 알 수있다. 그림 5는 열 살해 아빠와 다시 자극 생체 후 7 일 후 감염에 비장 CD4 +와 CD8 + T 세포에서 IFN-γ에 대한 대표적인 얼룩을 보여줍니다thogen. 이 도면은 또한 표 3에 기재된 염색 패널 게이팅 전략을 보여준다. 그림 6은 감염 후 칠일에, 수컷 마우스는 PPARα 길항제 IS001 또는 차량 제어 매일 처리 한 한 실험에서 얻어진 리스테리아 모노 사이토 겐의 치사 선량에 감염, 분석 하였다 대표 데이터를 보여줍니다. 이 실험은 IS001 치료는 CD4 +와 CD8가 + 림프구 모두에 의해 IFN-γ 응답을 향상 보여줍니다. 그림 7은 병원균의 수정 된 LD (50) 복용량 감염 후 엔드 포인트에 마우스 생존에 PPARα 길항제 IS001의 효과를 조사 연구 대표 데이터를 보여줍니다. 플롯 시간 후 감염에 대한 마우스의 생존율 %이다. 이 그림은 IS001 치료 엔드 포인트에 수컷 마우스의 생존을 증가 보여줍니다. 함께 이러한 데이터는이 모델 연구에 적용 할 수있는 방법을 보여이러한 면역 변화는 감염 동물의 생존에 미치는 영향을 IFN-γ 응답 생체 내 및 새로운 약물이나 치료의 효과를 탐구한다.
감염된 마우스에서 비장을 해부 그림 1. 사진의이 시리즈는 죽은 마우스에서 비장을 해부하는 방법을 보여줍니다. (a)는 우측 마우스 거짓말하고 70 % 에탄올로 피부를 스프레이. (b)는 무균 또는 멸균 집게 힘든 컷 가위를 사용하여, 바로 흉곽의 바닥 아래 피부를 절개. (c) 70 % 에탄올로 노출 근육층을 분무. 비장은 근육 층 (오픈 화살표 머리) 아래에 표시되어야합니다. 무균 핀셋 미세 가위를 사용하여 (d)는 비장 공개 근육층 절개. (e)는 조심스럽게 집게와 유와 비장을 잡아자체 미세 가위는 결합 조직을 주변에서 멀리 비장을 잘라. (바) 멸균 1X PBS를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 비장를 놓습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 혈구를 사용하여 2. 계수의 비장 세포. (a)는 혈구의 중앙 그리드를 도시한다. (b) (각각 16 개의 작은 사각형을 포함하는 것이) 25 큰 사각형을 포함하는 그리드 중심부의 확대도를 나타낸다. 계산에 사용 된 5 큰 사각형 회색 (4 모서리 사각형 플러스 중앙 그리드의 중앙 광장)에서 강조 표시됩니다. (c)는 큰 회색 사각형 중 하나의 확대도를 나타낸다. 106 개 / ㎖, 1 회째의 카운트 값의 셀 체적을 결정다섯 개의 큰 회색 사각형 내의 모든 가능한 세포. 도시 된 예에서,이 수는 215 계산하면 만 그리드의 오른쪽과 아래쪽에 이중 라인을 터치 된 것을 포함하여 클리어 (비 파란색) 모든 셀을 계산해야합니다입니다. 그리드의 왼쪽 상단에 이중 라인을 터치 셀을 계산하지 마십시오. 총 다섯 사각형 카운트를 취하여 106 / ml의 세포 수를 얻기 위해 10으로 나눈다. 이 예에서 10으로 나눈 215 21.5 × 106 세포 / ml이다. 트리 판 블루 1 : 이러한 계산은 강조 당신은 큰 사각형의 5를 계산하는 경우 작동하고 세포 1을 희석합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
IFN-γ의 검출 그림 3. 게이팅 전략NK와 NKT 세포에서 γ 생산. SSC-A 음모에 의해 FSC-A에 림프구에 제 1 게이트. 그런 다음 FSC-H / FSC-A 플롯에 대각선에있는 해당 이벤트에 문입니다. 이들은 단일 선이다. 그런 다음 라이브 (AmCyan -)의 게이트와 CD8 - 세포. 그런 다음 TCRβ에 대한 사량 염색을 플롯. NKT 세포는 이중 양성 집단 내이며 NK 세포는 이중 네거티브 집단 내에있다. 이중 양성 세포에 게이트 및 FSC 대 음모 NKp46. NKT 세포 인 NKp46 부정적인 인구에 게이트 (이 게이트는 NK 세포 플롯에서 두 집단으로 구분 점을 찾아 설정할 수 있습니다). TCRβ - - + NKp46 인구 자연 살해 세포는 테트라 머이다. NK와 NKT 세포 게이트 내에서, PE 채널 내의 IFN-γ + 세포 FMO 제어에 기초하여 게이트의 설정 후에 확인된다. 를 클릭하십시오여기이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 4. 대표 데이터는 24 시간 후 감염에서 IFN-γ + NK와 NKT 세포의 주파수에 대한 획득. 이 실험에서, 남성 C57BL / 6J 마우스 (N = 3-4 / 그룹) 10 5 CFU L.의 모노 사이토에 감염 IP를했다 또는 취소 감염 남았다. 마우스는 접종 후 12 시간과 동일한 시간에 약 IS001 또는 비히클 (0.5 % 카르복시 메틸 셀룰로오스)를 투여 하였다. 24 시간 접종 후, 마우스를 안락사시키고, 비장을 제거하고, 개별적으로 처리하고 유동 세포 계측법에 대해 염색 하였다. IFN-γ +를 NK 세포의 SEM 주파수 평균 ±가 제시된 (a) 또는 NKT 세포 게이트 (b) 차량 또는 약물 IS001 치료 후 감염되지 않은 또는 감염된 마우스이다. *가리키다양측 T-시험에 의한 차량 제어에서 사 차이 (P <0.05). 데이터는 면역학 저널 (용량 195 쪽. 5189-5202, 2015)의 허가 (31)로부터 다시 인쇄됩니다. 저작권 2015 년 면역학의 미국 협회, Inc.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. CD4 및 CD8 세포에서 IFN-γ 생산의 검출을위한 게이팅 전략. SSC-A 플롯에 의해 FSC-A에 림프구에 제 1 게이트. 그런 다음 FSC-H / FSC-A 플롯에 대각선에있는 해당 이벤트에 문입니다. 이들은 단일 선이다. 이 게이트 내에서, 라이브 (AmCyan -)의 게이트 CD45 + 세포. 그런 다음 CD8 + 또는 CD4 + 어느 집단에 문입니다. 각 게이트 내에서의 IFN-γ +체육 채널에서 세포는 FMO 컨트롤에 염색을 비교하여 식별됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 대표 데이터는 리스테리아 모노 사이토 겐 7 일 후 감염 (EGD 균주)에서 IFN-γ + CD4 +와 CD8 + T 세포의 주파수에 대한 획득. 이 실험에서, 남성 C57BL / 6J 마우스는 2 × 104 CFU 리스테리아 모노 사이토 겐 (N = 7 / 그룹)와 IP를 감염 또는 감염되지 않은 (N = 3 / 그룹) 남았다. 마우스는 접종 당일 IS001 약물 또는 비히클 (0.5 % 카르복시 메틸 셀룰로스) 회 투여 개시 하였다. 일곱 일 후에 마우스를 안락사시키고, 비장을 제거하고, 각각에 대한 처리 된세포 배양. 비장의 단핵 세포 배양의 마지막 4 시간 동안 추가 억제제 단백질 수송과 열 살해 L. 모노 사이토 겐으로 24 시간 동안 자극 하였다. 세포를 유동 세포 계측법에 대해 염색 하였다. IFN-γ는 차량 (0.5 % 카르복시 메틸 셀룰로오스)로 처리 한 후 CD4 + (a) 또는 감염되지 않은 또는 감염된 마우스에서 CD8 + 세포 게이트 (b)에서는 + 세포 또는 약물 IS001의 SEM 주파수 ± 평균이 제시된. *는 양측 T 시험에 의해 결정되는 차량 제어 상대방과의 차이 (P <0.05)를 나타낸다. 데이터는 면역학 저널 (용량 195 쪽. 5189-5202, 2015) .Copyright 2015 년 면역학의 미국 협회의 허가 (31)로부터 재 인쇄, Inc.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 대표 데이터는 리스테리아 모노 사이토 겐과 남성 C57BL / 6J 마우스 (EGD 균주)의 감염 후 엔드 포인트에 마우스 생존에 PPARα 길항제 1S001의 효과를 비교 실험시 획득. 이 실험에서, 수컷 C57BL / 6J 마우스 (N = 10 마우스 / 그룹) 리스테리아 모노 사이토 겐의 병원체의 변형 LD 50 용량 (105 CFU) 감염 IP 하였다. 마우스는 접종 당일 IS001 약물 또는 비히클 (0.5 % 카르복시 메틸 셀룰로스) 회 투여 개시 하였다. 마우스는 임상 증상 매일 따라하고 인도적인 엔드 포인트가 충족 된 경우 안락사시켰다. 로그 - 랭크 테스트 (P <0.05)에 의해 결정되는 시간 * 이상의 엔드 포인트에 마우스의 생존율 % 군간 생존율 차이를 나타낸다 도시. 데이터는 저널 오의 허가 (31)로부터 재 인쇄F 면역학 (볼륨 195 쪽. 5189-5202, 2015). 저작권 2015 년 면역학의 미국 협회, Inc.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 일 문화의 나누어지는에서 CFU 결정에 대한 몇 가지 대표적인 계산을 표시합니다. 이 예에서 하루 배양 분취 량 용해시키고 : 1 희석 BHI 배지로 1. 희석 된 샘플의 OD (600)는 0.84로 측정되었다. 또한, 100 ㎕의 분취 량은 CFU 판으로했다. 이 샘플 BHI 배지 900 μL (10-1)로 희석시키고, 세척하고, 1 ㎖의 BHI에 재현 탁 하였다. 이 샘플을 10 배 희석 시리즈 (10-2 -13 내지 10)를 제조하고, 희석 된 샘플의 BHI 아가에 도말R 플레이트 (10-4 -9 10 만 값이 표시됩니다). 다음날 콜로니를 계수 하였다. 30-300 사이에 식민지 번호를 가지고 만 플레이트 (즉, 10-6 판은 노란색으로 강조) 계산에 고려되었다. 이 판 (70)에 식민지의 수는 다음 희석 시료의 CFU / ㎖를 얻기 위해 0.1 (도금 용액에 볼륨)으로 분할되었다. 이 값은 원액 배양 CFU / ㎖의 판독을 획득하기 위해 희석 계수 (106)에 의해 승산한다. TMTC는 계산이 너무 많은 =.
표 2 : NK와 NKT 세포의 탐지 IFN-γ의에 대한 염색 패널. 패널이나 CD4 항체 클론 GK1.1 다양한 형광 색소로 염색 버전 비장에서 사용되는 유동 항체로 염색 보상 비드 중 하나는 하나의 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다.
표 3 : CD4 +와 CD8가 + 세포의 탐지 IFN-γ의에 대한 염색 패널. 패널이나 CD4 항체 클론 GK1.1 다양한 형광 색소로 염색 버전 비장에서 사용되는 유동 항체로 염색하거나 보상 비드 단일 포지티브 컨트롤로서 사용될 수있다.
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Discussion
여기에서 우리는 L.의 EGD 균주가 남성 또는 여성 C57BL / 6J 마우스에서 25 모노 사이토 기본 실험 감염을 수행하는 방법에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 생체 (31)에 타고난 및 적응 림프구에 의한 IFN-γ 생산에 새로운 작은 분자 IS001의 효과를 연구하기위한 목적으로 설립되었다. 세균 통관과 생존 후 감염을 모니터링함으로써, 통찰력 IFN-γ의 이러한 변화는 감염을 제어 할 수있는 호스트의 능력에 영향을 방법으로 획득 하였다.
의정서에 중요한 고려 사항
연구의이 유형의 디자인에서 중요한 고려 사항은 각 실험 적절히 구동하고 적절하게 제어 될 수 있다는 것이다. 때문에 감염에 대한 면역 반응의 생물학적 변화에 (그림 4 참조 6), 그것은 N = 4 것이 좋습니다 - 그룹 당 5 마우스는 초기 면역 연구에 사용되어야한다. 만약따고 데이터 내의 트렌드 있지만 군간 명백 유의 한 차이가 이러한 연구는, 전력 계산 통계적 유의성을 달성하기 위해 후속 연구에 필요한 동물의 최소 수를 결정하기 위해 수행 될 수있다. 제어 관해서는 면역 시험 차량 치료 투여와 관련된 스트레스 치료의 효과를 구별 할 수 있도록하는 컨트롤 기준선 IFN-γ 반응의 측정에 감염되지 않은 제어를 포함하는 것이 중요하다. 또 다른 중요한 고려 사항은 처리의 타이밍이다. L. 모노 사이토 타고난 반응이 매우 신속하기 때문에, 제 처리 또는 시약의 치료 수준을 보장하기 위하여 접종과 동시에 이전에 달성 될 이전의 날에 투여하는 것을 추천 선천성 면역 반응의 시작.
또 다른 중요한 고려 사항은 병원체의 복용량 infectio 위해 사용되는엔. 이 병원체는 세균의보다 정확한 열거 허용, 비장과 간에서 집중 될 가능성이 증가 보낸 치사 선량은 박테리아 부하를 측정하는 것이 좋습니다. 치사 용량은 동물 피크 T 세포 확장의 시간 이전에 리스테리아 증에 굴복하지 않도록 적응 림프구에 의한 IFN-γ 응답을 열거하는 것이 좋습니다. 대조적으로, 더 높은 감염성 투여 량은 이들 세포에 의한 IFN-γ 생산을 최대화하기 위해 24 시간에 이른 NK와 NKT 세포 반응의 측정에 사용하는 것이 권장된다.
고전 LD 50은 쥐의 50 % 치사를 초래 병원체의 용량이다. 리스테리아 증의 여러 증상이 동물이 감염에 굴복 할 가능성이 있는지 여부를 예측할 수 있기 때문에 죽음이 우리의 교육 기관에서 수용 가능한 엔드 포인트 않았고 때문에, 우리는 우리의 연구에서 엔드 포인트로 정의 된 임상 증상의 목록 대신 죽음을 사용했다. USI이 방법 NG, 상기 개질 된 LD (50)는 8 주령의 수컷 105 CFU, 8 주령의 암컷 C57BL / 6J 마우스 (31) 1.5 × 105 CFU 것으로 확인되었다. 이 LD (50) 용량은 각 군당 N은 = 8 생쥐를 함유하는 것으로 (N = 총 5 시험) 단계적 투여 량 단계적 확대 연구 끝점 마우스의 생존율 %를 측정하여 결정 하였다 (예를 들어, 마우스는 10,000 CFU 먼저 감염 다음 20,000 CFU 등)을 갖는 제 2 일괄. userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit 다음 LD 50 계산 생존율 % 값 (y 축) (웹 사이트의 빗 대 로그 회귀 곡선 (CFU) (X 축)으로부터 결정 하였다 /ProbitAnalysis.pdf).
리스테리아 모노 사이토 겐의 동일한 균주로 쥐를 감염시키는 경우에도 우리가 실험실에서 결정된 수정 LD (50) 투여 량은 다른 실험실에서이 다를 수 있습니다. 이 변화의 일부는 주관적 자연 O 관련 될F 죽음의 더 절대 엔드 포인트에 비해 리스테리아 증의 임상 증상을 모니터링. 추가 변동은 마우스 다이어트 또는 미생물 또는 실험실 간의 접종의 준비의 차이와 같은 환경 적 요인의 차이에서 발생할 수 있습니다. 따라서, 암컷 마우스가 (N = 8 마우스 / 그룹) 리스테리아 모노 사이토 겐의 동일한 변형률 1.5 × 105 CFU로 감염되는 곳에서 사용 전에 모든 생존 연구에 착수하기 위해, 시험 연구를 수행 할 것을 권장 공부하고이 용량이 실제로 엔드 포인트에 50 %의 생존율을 초래하는 경우 모니터링 증상 확인합니다. 생존이 CFU에서 낮거나 50 %보다 높은 경우, 단계적인 투여 량 상승 또는 용량 드 에스컬레이션 연구가 빠르게 LD (50) 복용량에 좁힐 수행 할 수 있습니다.
또 다른 중요한 고려 사항은 감염 연구에 사용되는 마우스의 변형 또는 substrain이다. 이 프로토콜은 일반적으로 사용되는 근친 마우스 변형 C57BL / 6J의 감염을 설명합니다. 이 변형이 마우스 균주 33받은 Th1 발생하기 쉬운 것으로 간주되기 때문에, IFN-γ 반응의 측정에 적합하고, 결과적으로 L. 비교적 내성 등 BALB / 등 TH2하기 쉬운 마우스 균주에 비해 감염 (모노 사이토 겐되고 다) (34, 35). 다른 마우스 변종이 프로토콜을 적응하는 것은 특정 균주에 대한 병원균의 감염 량에 대한 지식이 필요합니다. 또한, 모델 설정에 관련된 문제 해결의 양을 줄이기 위해,이 프로토콜에 설명 된 것과 같은 연령, 성별의 마우스와 벤더를 사용하도록 권장한다. 예를 들어, C57BL / 6 마우스 (예를 들어, C57BL / 6NTac) 다른 벤더 (36)에서 주문 C67BL / 6 마우스에 비해 유전 적 차이를 나타낼 수있는 하나의 공급 업체 (예를 들어, C57BL / 6J)에서 주문. 또한 장내 미생물은 사이 C57BL 마우스 (37)와 Th17받은 Th1 반응의 균형에 영향을 미칠 수있는 다른 벤더로부터 획득 / 6 substrains 다르다.
기술에 ove_title "> 잠재적 인 수정위장관을 통해 인간의 자연 감염 경로 반대로 마우스는 가장 일반적으로 정맥 내 또는 IP를 접종한다. 리스테리아 모노 사이토 겐의 표준 균주가 비효율적으로 마우스 (38)의 장 상피 세포를 감염 때문에 구강 감염은 덜 일반적이다. listerial 침입 단백질에 의해 E-cadherin의 인식의 상실을 초래 인간 E 헤린로부터 마우스 E-cadherin의 시퀀스의 단일 아미노산 변화가 A ((IN1a)을) 39 internalin 존재하기 때문이다. 이 장벽을 극복하기 위해, 연구자들은 인간의 E-cadherin의 단백질에 대한 유전자 변형 또는 WT EGD와 같은 친 화성으로 마우스 E-cadherin의 결합 (IN1a)을 ((IN1a)을의 MUT)의 돌연변이 서열을 발현하도록 유전자 조작 된 리스테리아를 사용하여 마우스를 사용 인간의 E-cadherin의 40. 따라서, 본 기술의 하나의 잠재적 인 변형은 경구 경로를 통해 마우스를 감염이며. 독자는 경구 접종 방법 (38)에 대해 설명 다른 조브 간행물라고합니다. 감염의 모드를 변경하면 감염 용량뿐만 아니라 병원균의 전파의 반응 속도에 영향을 미치지 않습니다.
이 프로토콜은 CD4 + 및 CD8 + T 세포에 의한 IFN-γ 생성을 유도하는 열을 이용 살해 리스테리아 설명한다. 열 사망 리스테리아 모노 사이토 겐이 항원이 저렴하기 때문에, 우리의 연구에 자극으로 선정되었다 우리의 실험실은 병원체에 CD4 + T 세포 반응에 주로 관심이 있기 때문이다. 하나의 제한은 열 살해 박테리아가 효율적으로 체외 (41) 또는 생체 42,43 감염 중 프라임 CD8 + T 세포 반응을하지 않는 것입니다. 따라서, 우리는 감염의 피크 수확 된 비장 세포에 의해 관찰 된 CD8 + T 세포의 IFN-γ 생산 (즉,도 6) 가능성 잔류에 응답이며비장 세포 배양에 존재 또는 사이토 카인 유도 사이토 카인의 결과로 도출 된 살아있는 박테리아 (41)를 놓습니다. 대안은 리스테리아를 죽인 열로하는 바와 같이, 하나는 listerial 단백질상의 에피토프를 코딩하는 펩타이드에 T 세포를 노출시킴으로써 IFN-γ 반응 생체를 유도 할 수있다. 실제로, 면역 MHC 클래스리스 테리 오라 O와 P60의 가수 분해 효소에 대한 에피토프를 II는 제한 및 BALB / C (44)에 대해 기술 된 C57BL / 6, BALB / C 마우스와 면역 MHC 클래스 I 에피토프에 대해 설명 하였다. 또 다른 방법은 항원 특이적인 열거 MHC 클래스 I- 및 MHC 클래스 II-테트라 시약의 존재를 이용하기 위해서 예컨대 알부민 또는 바이러스 항원으로서 모델 항원을 발현하도록 유전자 조작 된 리스테리아 모노 사이토 겐 균주 쥐를 감염이며 감염된 마우스 45, 46에서 T 세포.
의정서의 기타 제한
이 모델의 또 다른 한계는 그 O 형비장 면역 세포에 의한 할수 있답니다 조치 IFN-γ 생산. 여기에 설명 된 염색 패널 유동 세포 계측법 (난 알부민을 발현하는 리스테리아 모노 사이토 겐의 변형들) 항원 특이 T 세포를 열거 사량의 사용에 더하여 쉽게 TNF 또는 IL-2와 같은 다른 사이토 카인의 생성을 측정하기 위해 수정 될 수있다 CD8 T 세포 또는 또 퍼포 나 그랜 자임 B와 병원체의 NK 매개 된 사멸에 참여할 이펙터 분자가이 프로토콜은 또한 간에서의 면역 세포에 의해 생성 된 IFN-γ를 검사하도록 구성 될 수있다.
미래의 응용 프로그램
이 프로토콜은 마스터되면 그것을받은 Th1 세포 성 면역과 다양 제 또는 유전자의 효과를 스크리닝 생체 내 모델에 간단하게 제공 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1x PBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaldehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS |
| 10x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 1x in ddH2O |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Use one drop per stain |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 ml vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL/6J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 weeks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0 - 300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnostics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
References
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