Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

זיהום הניסיון עם Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54554
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute
* These authors contributed equally

Abstract

ל חיידקים הוא חיידק גראם חיובי כי הוא הגורם למחלה שמקורן במזון בבני אדם. זיהום ניסיוני של עכברים עם הפתוגן זה כבר אינפורמטיבי מאוד על עצם את התפקיד של תאי מערכת חיסון מולדים ובעלי כושר הסתגלות וציטוקינים ספציפי חסינות מארח נגד פתוגנים תאיים. הייצור-γ IFN ידי תאי מולד במהלך הדבקת sublethal עם חיידקי L. חשוב להפעלת מקרופאגים ובקר מוקדמים של הפתוגן 1-3. בנוסף, ייצור IFN-γ על ידי לימפוציטים זיכרון אדפטיבית חשוב תחול ההפעלה של תאי מולד על הדבקה חוזר 4. ל חיידקי מודל זיהום ובכך משמש כלי נהדר עבור חוקרת האם טיפולים חדשים אשר נועדו להגביר את ייצור IFN-γ להשפיע על תגובות IFN-γ in vivo ויש להם תופעות ביולוגיות פרודוקטיבי כגון הגדלת אישור חיידקים או שיפור הישרדות עכבר מהַדבָּקָה. המתואר כאן הוא פרוטוקול בסיסי איך לנהל זיהומים intraperitoneal של C57BL / 6J עם זן EGD של חיידקי L. וכדי למדוד ייצור IFN-γ על ידי תאי NK, תאי NKT, ו לימפוציטים אדפטיבית ידי cytometry הזרימה. בנוסף, הליכים מתוארים ל: (1) לגדול ולהכין את החיידקים עבור חיסון, (2) למדוד עומס חיידקים בטחול ובכבד, ו (3) הישרדות בעלי חי מידה לנקודות קצה. נציג נתונים ניתנים גם כדי להמחיש כיצד מודל זיהום זה יכול לשמש כדי לבחון את ההשפעה של סוכנים ספציפיים על התגובות IFN-γ כדי חיידקי L. והישרדות של עכברים מזיהום זה.

Introduction

IFN-γ הוא ציטוקין כי הוא חיוני בתיווך חסינות מפני פתוגנים תאיים לבקרת צמיחת גידול 5. חשיבותה של ציטוקינים זה עמיד החיידקים באה לידי ביטוי העובדה שבני האדם עם מוטציות מסלול איתות IFN-γ הן רגישות מאוד לזיהום עם mycobacteria ו salmonellae 6. בדומה לכך, עכברים שחסרים לו או IFN-γ או פגמי IFN-γ קולטן התערוכה העמיד mycobacteria 7-9 ופתוגנים תאיים אחרים לרבות ל חיידקי 10,11, שושנת יריחו מרכזי 12, סלמונלה typhimurium 13, וכן וירוסים מסוימים 11. בנוסף פתוגנים ללחום, IFN-γ ממלא תפקיד מכריע מארח הגנה מפני גידולים 14. למרות ייצור גבוה יותר של-γ IFN מועיל בהקשר של זיהום או סרטן, ייצור ממושך של ציטוקינים זה נקשר to להתפתחות אוטואימיוניות מערכתית 15-17 והאצת סוכרת מהסוג במודל העכבר הסוכר ללא השמנת היתר 18.

המקורות העיקריים של-γ IFN כוללים תאי NK, תאי NKT, γδ בתאי T, 1 T מסייעים (Th1) תאים, לימפוציטים T ציטוטוקסיים (CTL) 5,19,20. IFN-γ משפר הוא חסינות מולד אדפטיבית ידי: (1) עד ויסות histocompatibility הגדולה מורכב (MHC) אני בכיתה ו- II ביטוי, (2) להגדיל את הביטוי של מולקולות שיתוף גירוי על תאי מציגי אנטיגן, (3) מקרופאג שיפור phagocytosis ואת הייצור של ציטוקינים פרו-דלקתיים הגורמים microbicidal (למשל, תחמוצת החנקן מינים חמצן תגובתי), (4) לקדם את התמיינות של תאים מסוג CD4 + T נאיבי לתוך תאים מפעיל Th1, (5) קידום מיתוג בכיתה נוגדנים אימונוגלובולינים ( איג) 2a ו IgG3 (עכבר), (6) גרימת לייצור כמוקינים לגייס תאים חיסוניים לאתרים של infection, ו (7) שיפור תא NK ותגובות CTL 5,19. לאור החשיבות החיונית של γ IFN בתגובת מארח לפתוגנים וגידולים, IFN-γ רקומביננטי נבדק כטיפול זיהומים ומחלות ממאירות שונות (הנסקרת ב 19). עם זאת, כי ממשל מערכתי של IFN-γ או ציטוקינים קידום Th1 interleukin-12 (IL-12) קשור תופעות לוואי ומנה הקשורות רעיל 19,21, יש עניין בפיתוח אסטרטגיות חלופיות כדי להגביר את ייצור IFN-γ על ידי תאי מערכת החיסון. פיתוח התרופות ביולוגי חדשות ומולקולות קטנות דורש כלי הקרנת vivo כדי לבדוק אם סוכנים כאלה להגדיל את ייצור IFN-γ במהלך תגובה חיסונית והאם זה מיתרגם השפעות ביולוגיות משמעותיות, כגון העלאות הישרדות בעלי חיים.

זיהום ניסיוני של עכברים עם חיידקי L. חיידק גראם חיובי כבר מודל אינסטרומנטליפענוח את התפקיד של γ IFN ב-חסינות מארח נגד פתוגנים תאיים 1,22. זיהום של עכברים עם הפתוגן לוריד או intraperitoneally (IP) מוביל בהפצה המהירה של החיידקים אל הטחול והכבד, שם הם הופכים הפנימו ידי מאקרופאגים hepatocytes תושב עם המון חיידקי שיא בטחול המתרחשים בין 3 ל -4 ימים שלאחר זיהום 1,3,22. ייצור-γ IFN ידי תאי NK חשוב ההפעלה מקרופאג והתנגדות מוקדם כנגד הפתוגן 3; עם זאת במינונים גבוהים זיהומיות, הפקה-γ IFN יכולה גם להזיק אישור הפתוגן 23. תאים NKT הם גם מקור-γ IFN בטחול ובכבד במהלך מלאה מוקדם של פתוגנים 2,24 וייצור זו הוכח להגביר ייצור IFN-γ על ידי סוגי תאים אחרים, כולל תאי NK 2. מצד שני, לאחר מכן הפועל לימפוציטים מסוג T אדפטיבית, תאי CD8 + T ב Particular, חשוב לתיווך סליקת הפתוגן ומתן הגנה מפני 1,4,22 זיהום מחדש.

מודל זיהום זה כבר אטרקטיבי החוקר במשך מספר סיבות (הנסקרת ב 1). ראשית, זיהום עם הפתוגן הוא מאוד לשחזור ומשרת תגובה חיסונית חזקה Th1 וסלולר. שנית, במהלך ההדבקה sublethal, עומס חיידקי מרוכזת הכבד והטחול בו ניתן למדוד בקלות. שלישית, הפתוגן ניתן לטפל בבטחה תחת 2 רמת בטיחות ביולוגית (BSL2) תנאים. רביעית, האורגניזם ואת התגובה החיסונית כי היא יוצרת, מתאפיינת בהרחבה. לבסוף, מגוון של זנים מוטנטים ו-מהונדסים גנטית פותחו זמינים לשימוש.

המתואר כאן הוא פרוטוקול בסיסי עבור חיסון של C57BL / 6J עם זן EGD של ל חיידקי 25 ו למדידת IFN - γ מחדשsponses ידי NK, NKT, ו לימפוציטים אדפטיבית שלאחר זיהום. כמו כן הוא תאר כיצד למדוד עומס חיידקים בטחול ובכבד לאחר הדבקת sublethal ולבצע מחקרי הישרדות לאחר הדבקה עם מנת LD 50 שונה של הפתוגן. לבסוף, נציגי נתונים מוצגים כיצד פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להקרין את ההשפעה של טיפולים חדשים על תגובות IFN-γ והישרדות עכבר ל חיידקי זיהום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת בטיחות

פרוטוקול זה מתאר זיהום של עכברים עם חיידקים ל חיים. מחולל מטופל בבטחה בתנאי BSL2 ידי צוות מיומן אשר אינם בעלי דיכוי חיסוני. אנשים בעלי דיכוי חיסוני כולל נשים בהריון, קשישים ואנשים הנמצאים החיים עם HIV או מחלות כרוניות הדורשות טיפול בתרופות לדיכוי מערכת החיסון. אדם צריך ללבוש חלוק מעבדת מגן או חלוק, כפפות, מסכה, ומשקפי מגן בעת ​​טיפול דגימות נגועות. העבודה המתוארת במסמך זה בוצעה בתנאי BSL2 תחת תעודה (# 32,876) שהוצאה על ידי רשת בריאות האוניברסיטה (פתאום?) בטיחות ביולוגית משרד. פגרים מעכברים נגועים או כל רקמות בשימוש היו בשקיות כפולים ו מסולק פסול Biohazard. כלובים מעכברים נגועים גם היו לחטא על ידי מעוקר.

הצהרת אתיקה

עכברים היו מתוחזקים והדביקו בתוך quaraחדר ntine בתוך מתקנים חיה פתאום? וטופלו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי המועצה הקנדית על טיפול בבעלי החיים. כל הנהלים על עכברים בוצעו תחת # פרוטוקול חית שימוש 3214 שאושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים פתאום?. בשל שיקולים אתיים, מוות לא שמש נקודת סיום ללימודי הישרדות. מינון LD 50 השונה דיווח כאן L. חיידקי דלקת נקבעה להיות המנה שבה 50% מהעכברים הגיעו נקודות קצה ספציפיות, שכלל פסד 20% ממשקל גוף או מראה לפחות שתיים הסימנים הקליניים הבאים: עייפות, פרווה פרועה, יציבה כפופה, נשימה מאומצת, עיניים כבויות או שקועות. עכברים היו מורדמים כשהגיעו נקודות הקצה באמצעות חשיפה הפחמן הדו-חמצני (CO 2) על פי הנחיות מתקן פתאום?.

1. הכנת המניות גליצרול עבור אחסון לטווח ארוך

הערה: הליך זה מתאר כיצד מניות גליצרול שלזן EGD של חיידקים ל ערוך מתוך מלאה גליצרול מקורי. צעדים שיש בהם פוטנציאל ליצור אירוסולים צריכה להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית מוסמך (BSC).

  1. כן עירוי לב המוח (BHI) צלחות אגרו התפתחות חיידקים. לתוספת זו 3.8% (w / v) מרק BHI ו -1.5% (w / v) אגר להכפיל מזוקקים H 2 O (DDH 2 O). נוזל חיטוי. לאחר אגר מתקרר ל -50 מעלות צלזיוס, לוותר הנוזל לתוך בצלחות פטרי חיידקים (25 מיליליטר / תבשיל) ולתת צלחות יבשות (חשף) של BSC עבור שעה 1.
    הערה: העברה אגר BHI לתוך אמבט מים 50 מעלות צלזיוס לאחר מעוקר להימנע מיצוק לפני שוטף צלחות. BHI חנות צלחות ב 4 ° C במהופך (עם צד תקשורת על גבי) עד מוכן לשימוש.
  2. כן תקשורת BHI נוזלי. לשם כך, לערבב 3.8% (w / v) מרק BHI DDH 2 O. החיטוי.
  3. הסר מניות גליצרול קפוא של זן EGD ל החיידקים מ -80 מעלות הקפאת Cr ו להפשיר לטמפרטורת החדר.
  4. טובלים קצה פיפטה סטרילית במלאי גליצרול מופשר ומיד פס קצה הלוך ושוב על פני קטע של צלחת BHI. זהו פס העיקרי.
  5. הפעל את הצלחת על ידי 90 ° C ושימוש טיפ פיפטה טרי, לגרור באמצעות הפס הראשון ופרשת אותה אל ¼ הבא של הצלחת (זהו פס המשני). חזור פעם נוספת על מנת להפוך את הפס שליישונים.
  6. הפעל צלחת במהופך לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מושבות אחת אחידה להמחשה בלבד יש לקבל את הסט האחרון של פסים גלויים בין 16 ל 24 שעות.
  7. לוותר 10 מ"ל של מרק BHI סטרילי לתוך צינור מ"ל סטרילי פרקו 50. פיק מושבה אחת חיידקי L. מהצלחת באמצעות קצה פיפטה סטרילית ולחסן את המרק. דגירת תרבות חממה רועדת מסלולית 37 מעלות צלזיוס למשך לילה או עד OD 600 = 1.0 עם הגדרות ב 225 סיבובים לדקה (סל"ד).
    הערה: זכוכית או PLA הפנויהצלוחיות Erlenmeyer stic יכול לשמש גם כדי התרבות חיידקים. ללא קשר לסוג של מכל בשימוש, לוודא שזה סטרילי, פרק וכי היקף התרבות אינו עולה על 20% מכלל נפח המכולה על מנת להבטיח אוורור מתאים של החיידקים.
  8. הכן מניות גליצרול על ידי ערבוב גליצרול 100% סטרילי עם תרבות נוזלת חיידקי הלילה ב יחס של 1: 1. הפץ את תערובת חיידקים / גליצרול לתוך צלוחיות קריוגני 2 מ"ל (500 μl / בקבוקון) בקבוקוני העברת למקפיא -80 מעלות צלזיוס לאחסון.
    הערה: שיטות מניות חרוזות יכולות לשמש גם במקום של מניות גליצרול לאחסון חיידקים. לפי שיטה זו, microbeads הנקבובי הם מחוסנים עם תרבות טהורה של חיידקים ל 'מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס. ניתן להשתמש בכל חרוז לחסן תרבות טריה לפי צורך. ראה רשימת חומרים לקבלת מידע נוסף.

2. קביעת עקומת צמיחה של ל חיידקים ב יום תרבות הערה: הליך זה מתאר כיצד ליצור את עקומת הצמיחה חיידקי L. המשמש להעריך את יחידות המושבה להרכיב (CFU) ללימודי זיהום. כל הצעדים שיש פוטנציאל ליצור אירוסולים צריכה להתבצע בתוך BSC מוסמך.

  1. קח 100 μl של תרבות לילה שנוצר בשלב 1.7 למדיה BHI 10 מ"ל בתוך שפופרת 50 מ"ל פרקו ו לגדול ב 37 מעלות צלזיוס חממה רועד (225 סל"ד, מוטה ב -45 מעלות זווית). השתמש צינור שאינו מחוסן כביקורת.
  2. קח 0.5 מיליליטר דגימות של התרבות במרווחים לשעה (1, 2, 3, 4, 5, 6 שעות, וכו '.). לדלל כל aliquot 1: 1 (V / V) עם מדיה BHI ב קובט פלסטיק. פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) ב 600 ננומטר (OD 600) באמצעות ספקטרומטר. המשך culturing חיידקים עד OD 600 = 1.
  3. במקביל, לקחת דגימה 100 μl של תרבות לדלל עם 900 מדיה μl BHI בתוך 1.5 מ"ל micr סטריליצינור ocentrifuge (זהו דילול 10 -1). צנטריפוגה החיידקים 6,000 XG במשך 5 דקות, לשאוב supernatant.
  4. פעמיים לשטוף חיידקים על ידי resuspending גלולה ב 1 מ"ל של התקשורת BHI, centrifuging במשך 5 דקות ב 6000 XG, ולאחר מכן aspirating supernatant. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל התקשורת BHI. כן סדרת דילול של פי 10 של מדגם זה בתקשורת BHI (10 -2 עד 10 -9). מורחים 100 μl של כל diluent על צלחות אגר BHI נפרד. דגירה צלחות לילה בשעה 37 ° C באינקובטור.
  5. למחרת, לאסוף צלחות שיש בין 30 - 300 מושבות. מחק את השאר. ספירת מושבות על הצלחות אלה. טבלה 1 מראה דוגמא של ספירה שהושגה aliquot שנלקחה כאשר OD 600 = 0.84. בדוגמה זו, אחד מלוחות (כלומר, 10 -6 דילול) היה ספירת המושבה בין 30 - 300 ו שימש לצורך חישוב CFU / ml.
    הערה: צלחות עם יותרמ -300 מושבות אינן משמשות, מאז צפיפות יכולה לעכב התפתחות חיידקים וגם עושות את זה קשה להבחין ולפקידת מושבות בודדות. צלחות עם ספירה <30 גם לא רגילות בגלל טעויות קטנות בטכניקת דילול או הנוכחות של מזהמים יכולות להיות השפעה גדולה על הדיוק של ספירה בקצה התחתון של הטווח.
  6. מחלק את מספר מושבות על פי ההיקף המצופה ולאחר מכן להכפיל במקדם הדילול כדי לקבל את ערך CFU / ml עבור דילול מסוים. בדוגמא בטבלה 1, הספירה בדילול 10 -6 היה 70. פרד ערך זה על ידי 0.1 מיליליטר כדי לקבל את ערך CFU / ml עבור התרבות המדוללת. ואז להכפיל ערך זה על ידי גורם לדילול (10 6) כדי לקבל את הערך CFU / ml של התרבות חי (7.0 x 10 8).
  7. מגרש את OD 600 (ציר y) לעומת הזמן ב h (ציר x) לזהות בשלב לוגריתמי של צמיחה 26.
    הערה: זו צמיחה הכמתמ"כדואר מספק אומדן של מיליליטר CFU / של התרבות היום שבו גדל קריאת OD מסוימת. בחר קריאת OD 600 כי הוא בשלב הלוגריתמים של צמיחה שיכול לשמש OD יעד 600 לגידול תרביות יום. נתונים אלה כעת ניתן להשתמש כדי להעריך את CFU בתרבות להכנת הבידוד (נוהל 3).

3. הכנת הבידוד עבור זיהום הניסיון עם חיידקי L.

הערה: הליך זה מתאר את הכנת הבידוד זיהומיות מתרבה יום כי החל מתרבות לילה (מוכן נוהל 2). כל הצעדים האלה מתבצעים BSC אלא אם צוין אחרת.

  1. לחשב את מספר CFU הנדרש זיהום מבוסס על מספר העכברים ותכנון ניסויים של המחקר. להוסיף נפח מתאים של תקשורת BHI לצינור בקבוק או תרבות Erlenmeyer פרק סטרילי.
    הערה: CFU של חיידקים prepared יהיה תלוי בסוג הניסוי מבוצע. ללימוד NK ותגובות התא NKT במהלך ההדבקה, כל עכבר הוא מחוסן עם 10 5 CFU של חיידקים (נוהל 6). אם לומד תגובות תא T אדפטיבית לזיהום או מדידת עומס חיידקים, כל עכבר הוא מחוסן עם 2 x 10 4 CFU של חיידקים (נוהל 8). אם לומד הישרדות לנקודות קצה, כל עכבר הוא מחוסן עם מינון LD 50 של הפתוגן (המהווה 10 5 CFU לזכרים ו -1.5 x 10 5 CFU לנקבות, ראה נוהל 9).
  2. לחסן את השפופרת המכילה תקשורת BHI עם 100 μl של תרבות הלילה. דגירת תרבות חממה רועדת מסלולית 37 מעלות צלזיוס (225 סל"ד) עד היעד OD 600 הוא הגיע. העבר תוכן תרבות לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי.
  3. חיידקי צנטריפוגה לתוך גלולה במשך 5 דקות ב 6000 XG באמצעות צנטריפוגות. לשאוב את supernatant באמצעות ואקום מצורף בבקבוק מלכודת המכיל אקונומיקה.
  4. לשטוף גלולה פעמיים עם בופר פוספט 1x (PBS), צנטריפוגה (5 דקות ב 6000 XG) שביניהם.
  5. לשאוב לשטוף את השני לדלל חיידקים בריכוז המתאים PBS 1x כדי לספק את CFU לעניין כל עכבר בנפח 200 μl.
    הערה: עדיף להשתמש במקור מסחרי של PBS 1x סטרילי לחיידקים לשטיפה להכנת הבידוד, מאז מעבדת זכוכית יכולה להכניס לגופם מזהמים אימונולוגיים כגון lipopolysaccharide.

4. זיהום ניסיוני של עכברים עם חיידקי L.

הערה: הליך זה מתאר כיצד להדביק עכברים עם הבידוד הערוך נוהל 3 וכיצד לאמת את CFU נמסר הבידוד. טיפול של עכברי זריקות מבוצע BSC.

  1. להזמין מספר מספיק של C57BL זכר או נקבה / 6J עבור הניסוי שלך. גם להזמין עכברים לשמש שולטים נגוע.
  2. אפשר עכבריםלהתאקלם במשך שבוע 1 לפני חיסון חיידקים.
    הערה: הסיבה לכך היא הלחץ הקשור להובלת בעלי החיים יכול לעורר עלייה זמנית בייצור הורמון הלחץ במספר הלימפוציטים 27,28.
  3. ביום של חיסון, להשיג משקל גוף בסיס עבור כל עכבר ולהקליט אותו במחברת המעבדה.
  4. ב BSC, לערבב את השעית החיידקים למעלה ולמטה בעזרת פיפטה סטרילית, כדי להבטיח כי החיידקים מופצים באופן שווה ולאחר מכן לקחת את 200 μl של הבידוד לתוך מזרק מהונדס 1 מיליליטר בטיחות מצויד במחט 25 G.
  5. הזרק IP עכבר עם 200 μl של בידוד מוכן (למשל, 10 5 CFU עבור זיהום תא NK, נוהל 6). עבור הליך זה, בעורפו עכברים עם היד הדומיננטית פחות על ידי גרירה של עור רפוי סביב כתפיו של העכבר. לאחר שווידאת כי העכבר הוא-מרוסנת היטב, להזריק את העכבר ברבע התחתון של הבטן, לרוחב רק אל מ 'idline להימנע השלפוחית.
  6. השלך את מחט המזרק במיכל החדים Biohazard.
  7. חזור על שלבים 4.3 - 4.6 עד שכל העכברים מוזרקים. לנהל צעדים דומים עם PBS 1x מוזרק עכברים (לא נגוע שולטים).
    הערה: מאז CFU הוא אומדן המבוסס על עקומת הצמיחה, הוא גם תרגול טוב כדי לבדוק את CFU בפועל הבידוד. לשם כך, להכין 3 - 4 דילולים שונים של הבידוד המוכן (באמצעות סדרת הדילול של פי 10) שאתה מצפה תגרום מושבות ספיר. מורחים 100 μl של כל diluent לצלחת אגר BHI דגירה לילה בשעה 37 ° C. ספירת מושבות ולחשב את מ"ל / CFU בפועל כמתואר נוהל 2.

5. חיידקי L. חום נהרג הכנה לחקר חיסון

הערה: כל השלבים כי יש פוטנציאל ליצור אירוסולים מבוצעים בתוך BSC.

  1. לגדול בתרבות יום עד ערכי OD 600מחדש הגיע כי הם במסגרת שלב הלוגריתמים. לוותר תרבות לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge.
  2. דגירת צינורות ב 70 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך שעה 1 כדי להרוג חיידקים.
  3. פעמיים לשטוף חיידקים עם 1x PBS כמו שלבים 3.3 ו -3.4. גלולה בתקשורת סטרילי RPMI להשלים המכילה עובר עגל בסרום (FCS) (ראה קובץ משלימה 1 למתכון) בריכוז של 4 x 10 6 / ml. Aliquot נהרג חיידקים לתוך 2 מ"ל בקבוקונים קריוגני סטריליים ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
  4. אשר את מותו של חיידקים על ידי הפצת 100 μl של הכנת חיידקים-הרג חום על גבי צלחות אגר BHI דוגרים לילה בשעה 37 ° C.
    הערה: אלה חיידקים-הרג חום צריכים להיות מוכנים מגרה לימפוציטים בתרבות בנוהל 8. אם יש מושבות גדלו על הצלחת אגר BHI, חזור על רצף פעולות הרג-חום.

6. מדידת תגובות IFN-γ על ידי תאי NK ו NKT במהלך זיהום

הערה: הליך זה מתאר כיצד למדוד את תגובות IFN-γ ידי NK ו NKT תאים בעכברים ב 24 שעות לאחר הדבקה עם 10 5 CFU של החיידקים ל. מינון זה משמש כי זה גורם לתגובות IFN-γ חזקים ידי תאי NK ו NKT בטחול 24. לנהל את כל הפעולות של BSC. כדי לעזור לשמור על כדאיות התא, לשמור על התאים על הקרח בכל הזדמנות אפשרית ולהשתמש מאגרים קר כקרח.

  1. לחסן עכברים כמתוארים נוהל 4 עם 10 5 CFU של החיידקים ל. במקביל, להזריק עכברי שליטה הלא נגועים IP עם נפח שווה של 1x PBS.
  2. להרדים עכברים ב 24 שעות לאחר חיסון משאיפת CO 2 על פי הנחיות מוסדיות.
  3. שכבי כל עכבר על צידו הימני והרטיב את העור עם אתנול 70% באמצעות מבקבוק לחיץ.
  4. בעזרת מלקחיים מזוהמים או סטרילי ומספריים קשים לחתוך, לחתוך את העור ממש מתחת לתחתית של כלוב הצלעות.
  5. תרסיס למטהשכבת השריר החשופה עם אתנול 70%. הטחול צריך להיות גלוי מתחת לשכבת השריר (ראש חץ פתוח באיור 1).
  6. בעזרת מלקחיים מזוהמים או סטרילי מספריים בסדר, לחתוך את שכבת השריר כדי לחשוף את הטחול. בעדינות לתפוס את הטחול עם מלקחיים להשתמש במספריים בסדר לחתוך את הטחול הרחק שמסביב רקמת חיבור.
  7. מניחים את הטחול בתוך שפופרת חרוטי 15 מ"ל המכיל PBS 1x סטרילי.
  8. חצי למלא בצלחות פטרי סטרילית עם PBS 1x סטרילי. לנתק את הטחול דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר לתוך צלחת פטרי בעזרת קצה שטוח של מזרק 3 מ"ל סטרילי.
  9. מעבירים את ההשעיה splenocyte לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל נקי סטרילי באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל סטרילי.
  10. צנטריפוגה דגימות ב 335 XG במשך 10 דקות ב 4 °.
  11. לשאוב supernatant לתוך בקבוק מלכודת המכיל אקונומיקה. שחרר את התא גלולה ידי מצליף את הצינורית עם אצבע או באמצעות גרירת הצינור התחתוןהלוך ושוב לאורך משטח גלי (למשל, זרימת אוויר פורקן של BSC).
  12. Lyse אדום דם תאים על ידי הוספת 1.5 מיליליטר של אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) חיץ תמוגה (ראו קובץ המשלימה 1 למתכון) לכל טחול. אחרי בדיוק 1 דקות ו -15 שניות, למלא את הצינור עם PBS 1x לעצור את תמוגה התא.
  13. צנטריפוגה תאים כפי שתוארו בשלב 6.10. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של תא הקרינה מיון מופעל (FACS) חוצץ (PBS 1x סטרילי המכיל 2% FCS).
  14. ספירת התאים באמצעות hemocytometer. לשם כך, לקחת שני aliquots של השעית תא לספירה. הוסף 15 μl של כל השעית תא נפח שווה של Trypan כחול (0.04%, שנעשה על ידי דילול פתרון כחול 0.4% trypan ב O DDH 2). טען 15 μl של כל תא / השעיה כחולה Trypan ההחדרה של hemocytometer (כלומר, אחד בבית הבליעה העליונה, אחד בבית הבליעה למטה).
  15. באמצעות מיקרוסקופ, לספור את כל התאים שאינם כחוליםחמישה ריבועים גדולים של הרשת המרכזית בתא אחד (איור 2). קח בספירה זו ולחלק אותו ב -10 כדי לקבל את המספר של תאים 10 6 / ml. בדוגמא באיור 2, הספירה היא 215 תאים 5 הריבועים; לכן, ריכוז התא הוא 21.5 x 10 6 / ml. ממוצע ריכוזי התא המתקבל שני המדגמים.
  16. זרע 1 x 10 6 תאים לכל טוב / כתם בצלחת 96-היטב מסביב לתחתית עבור cytometry זרימה מכתים. ודא גם זרע תאים עבור פקדי אחד בלא כתם הקרינה מינוס (FMO). ראה מומלץ זרימת cytometry לוח מכתים בטבלה 2.
    הערה: לקבלת השלבים הבאים, מומלץ לשמור על תאים על קרח או על 4 מעלות צלזיוס, כדי להגן על תאים מפני אור עם רדיד כאשר fluorochromes נוכח. טפטף רב יכול לשמש כדי לוותר נוזלים לתוך צלחות מכתימות 96-גם להאיץ את עיבוד. היזהר שלא להפריע תא גלול כאשרaspirating את supernatant מהצלחת centrifuged. מכתים יכול להיעשות גם צינורות FACS אם צנטריפוגה היא שלא הותקן בהם מתאמי צלחת. כל הצעדים צנטריפוגות מ על נקודה זו נעשים 456 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C..
  17. צנטריפוגה צלחת ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ FACS. אחת לשטוף נעשה על ידי הוספת 200 μl של חיץ FACS זה טוב, צנטריפוגה את הצלחת, ולאחר מכן aspirating supernatant.
  18. בצע פעולת חסימה ידי הוספת 50 μl / היטב חיץ FACS המכיל אנטי עכבר CD16 / CD32 (בלוק Fc מטוהר) (0.5 מיקרוגרם). דגירת תאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. שטפו תאים פעם 1x PBS כמתואר לעיל.
  19. הוספת 100 צבע כדאיות μl (צבען כדאיות fixable בדילול 1: 1,000 ב PBS 1x) לתאים. כתם תאים ב 4 ° C בחושך (במקרר) למשך 30 דקות. שטפו תאים פעמיים במאגר FACS כמתואר לעיל.
  20. לאחר לשטוף את השני, להוסיף 100 μl של נוגדנים פני תא או tetramers לבארות בהתאמה על פי to בלוח מכתים המתואר בטבלה 2. כתם תאים ב 4 ° C בחושך (במקרר) למשך 30 דקות. בשלב זה, גם להוסיף נוגדנים מכתימים יחידות בקרות חיוביות FMO.
    הערה: נושאי בקרה יחידה חיובית, מומלצת גם splenocytes לשימוש מגואלות גרסות fluorochrome השונים של נוגדן CD4 או חרוזי פיצויים מסחריים מגואלות הנוגדנים המשמשים בלוח. לפני עריכת הליך מכתים זה, כל נוגדני FACS צריכים להיות טיטרציה במחקרי בדיקה כדי לקבוע ריכוזים אופטימליים מכתים.
  21. שטפו תאים פעמיים במאגר FACS כמתואר לעיל ולאחר מכן לתקן תאים על ידי resuspending אותם 50 μl של paraformaldehyde 4% (המניה paraformaldehyde 16% מדולל DDH 2 O) ו דוגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. זהירות: paraformaldehyde רעיל צריכים להיות מטופלים רק במנדף.
  22. שטוף תאים פעמים in חיץ FACS, צנטריפוגה שביניהם. Resuspend תאי חיץ FACS. המשך תאי צעד או לחנות הבאות במקרר המוגן מפני אור עד שלושה ימים.
  23. תאים צנטריפוגה, להסיר את supernatant, ולשטוף תאים פעמיים עם 150 μl של הצפת 1x Permeabilization / Wash (חיץ פרם / Wash), צנטריפוגה שביניהם. פרם / לשטוף ההצפה מוכנה ממלאי 10x על ידי דילול 1: 9 (v / v) ב DDH 2 O.
  24. לאחר לשטוף את השני, resuspend התאים 150 μl פרם / לשטוף הצפת דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C בחושך.
  25. צנטריפוגה תאים שוב ואז לשאוב supernatant. תאי Resuspend ב 50 μl של חיץ 1x פרם / Wash המכילים אנטי IFN-γ ו דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C בחושך.
  26. שטפו תאים פעמיים עם חיץ 1x פרם / Wash, צנטריפוגה שביניהם. Resuspend התאים 250 μl של חיץ FACS ולאחר מכן להעביר תאים צינורות FACS.
  27. המשך לזרום cytometry הרכישה באמצעות זרימת cytometאה כי יש מסנן ותצורה לייזר מתאים סט להפלות fluorochromes המשמש בלוח מכתים המתואר בטבלה 2 29. אסוף לפחות 200,000 אירועים לדגימה ו -10,000 אירועים שולטים פיצוי.
  28. החל מטריקס פיצוי ולנתח נתונים באמצעות ניתוח תזרים cytometric תוכנה 30.

מדידת 7. של עומס חיידקים בתוך הטחול והכבד על הזמן של זיהום Peak

הערה: כל השלבים מבוצעים בתוך BSC אלא אם צוין אחרת.

  1. לחסן עכברים IP עם 2 x 10 4 CFU של הפתוגן באמצעות הליכים המתוארים בהליך 4.
  2. ביום 3 שלאחר זיהום, להכין צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge סטרילית, כל 500 μl של קר כקרח סטרילי 0.1% Triton X-100 ב 1x PBS ו -0.2 המכיל - 0.3 גרם של 1.5 - 2 מ"מ-חומצה שטף חרוזי זכוכית סטרילית. לשקול כל צינור.
    הערה: חרוזי זכוכית נשטפים חומצה ידי incubating בחומצה אצטית 10% בכוס על בוחש מגנטי עבור שעה 1. חרוזים אלה ולאחר מכן לשטוף בהרחבה עם DDH 2 O להסיר חומצה, הם אוויר יבש, ולאחר מכן autoclaved לפני השימוש.
  3. להרדים עכברים על ידי חשיפת CO 2.
  4. לנתיחה של איברים, להניח את התנין על גבו על לוח לנתח ולהצמיד הגפיים של העכבר ללוח באמצעות 25 מחטים G. לחטא את העור על ידי הרטבת עם 70% אתנול.
  5. בעזרת מספריים לחתוך קשוחים סטרילי, לעשות חתך קו אמצע בעור מהמפשעה לחזה באמצע ואז מהמפשעה באמצע כלפי כל ברך מהחזה באמצע אחד כלפי מרפק. לנתח בלאנט ומשקפים בחזרה את העור, מצמיד אותו לפתוח באמצעות 25 מחטים G.
  6. לחטא שכבת השריר באמצעות הרטבתה עם 70% אתנול ולאחר מכן באמצעות מספריים בסדר סטרילי לעשות חתך קו האמצע של קיר הבטן. תפוס את תהליך xiphoid עם מלקחיים. לאחר מכן, תוך שימוש באותה מספריים בסדר, לבצע חתכים בדופן הבטן מן proce xiphoidss רוחבית בכל צד, בעקבות כלוב הצלעות, ממש מתחת לסרעפת כדי לחשוף את הכבד.
  7. לגזור חתיכת מ"ג ~ 100 של הכבד (להשתמש באותה האונה עבור כל העכברים) באמצעות מספריים סטרילי ולמקם אותו בצינור microcentrifuge טרום שקל 1.5 מ"ל.
  8. שימוש במלקחיים כדי לדחוק את האיברים בעדינות בצד שמאל של חלל הצפק כדי להמחיש את הטחול. בעדינות לתפוס את הטחול עם זוג מלקחיים ולשחרר אותו מחלל הצפק על ידי חיתוך משם את רקמת החיבור שמסביב.
  9. מניחים את הטחול בצינור 1.5 מ"ל טרום שקל microcentrifuge המכילה חרוזים. תחבורת רקמות למעבדה בתוך קרח המכיל מיכל דליפת הוכחה. Re-לשקול את הצינורות המכילים את האיברים כדי לקבוע את משקולות רקמות מ"ג.
  10. Homogenize הרקמות על ידי טלטול הצינורות באמצעות homogenizer טחנת חרוז במשך 3 דקות בתדירות של 30 הרץ.
    הערה: השיטה טחנת חרוז עדיפה עבור המגון כפי שהוא מקובל טרומיים לעיבודלשיר מספר רב של דגימות ויוצר פחות בלגן חשיפה אפשרית הפתוגן. עם זאת, homogenizers אוטומטית או autoclaved 2 מ"ל homogenizers רקמות זכוכית ידנית יכול לשמש כחלופה.
  11. כן סדרת דילול של פי 10 של homogenates ב 0.1% Triton-X-100 ב PBS 1x, החל (החל חי עד 10 -7).
  12. מורחים 100 μl של כל homogenate מדולל לצלחת אגר BHI (בשני עותקים) באמצעות מפזר סטרילי. צלחות מעבירים 37 ° C חממת דגירת הלילה.
  13. שמור על הצלחות המכילות בין 30 ל -300 מושבות / צלחת, וזורק את השאר. רוזן מושב על כל צלחת ולקבוע את המספר הממוצע של מושבות עבור ממרחים כפולים.
  14. חשב את מ"ג CFU / פי המשוואה הבאה:
    CFU / מ"ג = CFU / ml ב homogenate, מוכפל מ"ל של homogenate מוכן, מחולקת במשקל מ"ג של הרקמה הומוגני.
    הערה: לדוגמה, אם ממוצע של 30 colonies נספרו לאחר ציפוי 100 μl של 10 -2 בדילול homogenate מוכן מחתיכת 120 מ"ג של הכבד כי היה הומוגני ב 0.5 מ"ל, החישובים יהיה כדלקמן:
    CFU / ml = 30 מושבות x 100 (גורם לדילול) / 0.1 מ"ל (התפשטות נפח) = 30,000 CFU / ml.
    CFU / מ"ג = 30,000 CFU / ml x 0.5 מ"ל homogenate / 120 מ"ג רקמה = 125 CFU / מ"ג.

8. השפעות של חיידקי L. על תגובות γ IFN ידי CD4 + ו- CD8 + תאים

הערה: הליך זה מתאר כיצד למדוד ייצור IFN-γ על ידי טחול CD4 + ו- CD8 + T תאי מפעיל שנקטף בזמן השיא של התגובה החיסונית אדפטיבית (~ 7 ד לאחר הדבקה) באמצעות שתי שיטות: (1) תזרים cytometry למדוד IFN-γ ידי CD4 + ו- CD8 + תאים על ידי מכתים ציטוקינים תאיים, ו (2) ELISA כדי למדוד את רמות IFN-γ הכולל המיוצר על ידי splenocytes (כולל את כל תאי T). נהליםמבוצעים בתוך BSC.

  1. להדביק עכברים על ידי הזרקת IP עם 2 x 10 4 CFU של הפתוגן באמצעות הליכים המתוארים בהליך 4.
  2. ביום 7 לאחר הפגיעה, להרדים עכברים משאיפת CO 2 על פי הנחיות מוסדיים.
  3. לנתח את הטחול (כמתואר לעיל) ומניחים צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל PBS 1x סטרילי. הובלת צינורות למעבדה בתוך קרח המכיל מיכל הוכחה דליפה.
  4. לעבד את הטחול לתוך השעית תא בודדת, lyse כדורי דם אדום כמפורט בסעיף 6, ולאחר מכן resuspend תאי מדיה מלאה RPMI המכילה 10% FCS. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
  5. הגדרת תרבויות למדידת תגובות IFN-γ. עבור תאים לוותר זה (4 x 10 6 ב 1 מ"ל / טוב) לתוך צלחות 24 גם יחד עם מספר שווה (4 x 10 6 או 1 מ"ל / טוב) של חיידקי L. חום נהרג מופשר (מוכן נוהל 5) . העברת תאי 37° C חממה.
  6. לאחר 20 שעות של דגירה, להוסיף 0.66 מ"ל / μl של מעכב תחבורה חלבון לבארות להמשיך incubations.
  7. ארבע שעות מאוחר יותר, העברת צלחת BSC ולאסוף 500 μl של תרבות supernatant ולהקפיא (ב -80 ° C) עבור המדידה העוקבת של רמות IFN-γ באמצעות assay immunosorbent enzyme-linked מסחרי (ELISA) ערכת 31. ואז לאסוף תאים לתוך צינור 15 מ"ל סטרילי. לשטוף בארות עם 1x PBS וברכה זה לשטוף יחד עם תאים שנאספו.
  8. לנהל מכתים פני קרום התא מכתים תאיים עבור-γ IFN על CD4 + ו- CD8 + תאים כמתואר נוהל 6 למעט להשתמש בלוח מכתים המתואר בטבלה 3. המשך לזרום cytometer הרכישה (איסוף 200,000 אירועים / המדגם) ולנתח נתונים 29 באמצעות זרימת cytometry תוכנה לניתוח 30.

9. מדידת עכבר הישרדות לנקודות קצה לאחר ל חיידקי Infection

הערה: הליך זה מתאר את ההשפעה של סוכן על הישרדות עכבר לנקודות קצה לאחר הדבקה עם המינון השונה LD 50 של הפתוגן. כל התהליכים האלה מתנהלים BSC במתקן חיה.

  1. להזריק עכברי IP עם המינון השונה LD 50 של חיידקים ל כמתואר נוהל 4. זה היה נחוש בדעתו להיות 10 5 CFU (עבור גברים) או 1.5 x 10 5 CFU (עבור נשים) 31.
  2. עקוב עכברים פעמיים ביום למשך סימנים קליניים ולהקליט הסימנים האלה ומשקולות גוף החיה במחברת המעבדה. להרדים עכברים אם הם מראים פסד 20% ממשקל גוף או שתיים סימנים קליניים של ליסטריה (עייפות, פרווה פרועה, יציבה כפופה, נשימה מאומצת, עיניים כבויות או שקועות).
  3. לאחר 14 ימים, להרדים לשרוד עכברים באמצעות שאיפת CO 2.
  4. כן מגרש קפלן-מאייר של הנתונים על ידי התוויית הישרדות האחוזים של כל קבוצה נגד זמן 32.
    (איור 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion Broth, Modified BD 299070 any brand should be appropriate
Agar BD 214010 any brand should be appropriate
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 any brand should be appropriate
1x PBS Sigma D8537 any brand should be appropriate
TissueLyser II Qiagen 85300 any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl) any brand should be appropriate
KHCO3 any brand should be appropriate
Na2EDTA any brand should be appropriate
RPMI 1640 Gibco 22400089 any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum  Gibco 12483 Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine Gibco 25030 any brand should be appropriate
Non-essential amino acids Gibco 11140 any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD 554724 Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaldehye Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS
10x Perm/Wash buffer BD 554723 Dilute 1x in ddH2O
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506 eBioscience 65-0866 Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) eBioscience 15-0041 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) eBioscience 11-0081 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC NIH Tetramer Core Facility N/A Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) eBioscience 25-5961 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) eBioscience 47-3351 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) eBioscience 25-0451 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) eBioscience 12-7311 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads eBioscience 01-1111 Use one drop per stain
Mouse IFN gamma ELISA kit eBioscience 88-7314 Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 ml vented tubes for culture Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes any brand should be appropriate
bacterial petri dishes any brand should be appropriate
2 ml cyrovials any brand should be appropriate
UV spectrometer any brand should be appropriate
safety engineered needles any brand should be appropriate
C57BL/6J Jackson laboratories Stock#000664 Order for arrival at 7 weeks
Bleach For decontamination
70% Ethanol For decontamination
Glass beads any brand should be appropriate
Centrifuge rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge any brand should be appropriate
Sterile Glycerol any brand should be appropriate
Pipette Tips any brand should be appropriate
Pipette any brand should be appropriate
Surgical instruments any brand should be appropriate
70 micron strainers any brand should be appropriate
3 ml syringe any brand should be appropriate
Pipette gun any brand should be appropriate
Filtration Units any brand should be appropriate
Trypan Blue Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate
Hemocytometer any brand should be appropriate
Round bottomed plates any brand should be appropriate
FACs tubes Fisher Scientific 14-959-5
BD LSR II BD Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software Treestar Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0 - 300 µl) Eppendorf Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System Pro-lab Diagnostics Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
  2. Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
  3. Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
  4. Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
  5. Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
  6. Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
  7. Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  8. Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
  9. Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
  10. Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
  11. Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
  12. Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
  13. Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
  14. Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
  15. Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
  16. Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
  17. Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
  18. Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
  19. Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
  20. Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
  21. Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
  22. Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
  23. Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
  24. Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
  25. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  26. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
  27. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
  28. Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
  29. BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf (2007).
  30. Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. http://www.flowjo.com/tutorials (2016).
  31. Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
  32. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
  33. Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
  34. Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
  35. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  36. Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
  37. Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
  38. Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
  39. Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
  40. Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
  41. Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
  42. Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
  43. Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
  44. Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
  45. Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
  46. Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).
זיהום הניסיון עם<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; כמודל תגובות לימוד מארח אינטרפרון-γ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, … More

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, M. A., Mallevaey, T., Dunn, S. E. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (117), e54554, doi:10.3791/54554 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter