פרוטוקול זה מתאר כיצד לחסן עכברי C57BL/6J בזן EGD של ליסטריה מונוציטוגנס (L. monocytogenes) ולמדוד תגובות אינטרפרון-γ (IFN-γ) על ידי תאי הרג טבעי (NK), תאי T הורגים טבעיים (NKT) ולימפוציטים מסוג T אדפטיביים לאחר הדבקה. פרוטוקול זה מתאר גם כיצד לבצע מחקרי הישרדות בעכברים לאחר הדבקה במינון LD50 שונה של הפתוגן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהום הניסיון עם
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
ל חיידקים הוא חיידק גראם חיובי כי הוא הגורם למחלה שמקורן במזון בבני אדם. זיהום ניסיוני של עכברים עם הפתוגן זה כבר אינפורמטיבי מאוד על עצם את התפקיד של תאי מערכת חיסון מולדים ובעלי כושר הסתגלות וציטוקינים ספציפי חסינות מארח נגד פתוגנים תאיים. הייצור-γ IFN ידי תאי מולד במהלך הדבקת sublethal עם חיידקי L. חשוב להפעלת מקרופאגים ובקר מוקדמים של הפתוגן 1-3. בנוסף, ייצור IFN-γ על ידי לימפוציטים זיכרון אדפטיבית חשוב תחול ההפעלה של תאי מולד על הדבקה חוזר 4. ל חיידקי מודל זיהום ובכך משמש כלי נהדר עבור חוקרת האם טיפולים חדשים אשר נועדו להגביר את ייצור IFN-γ להשפיע על תגובות IFN-γ in vivo ויש להם תופעות ביולוגיות פרודוקטיבי כגון הגדלת אישור חיידקים או שיפור הישרדות עכבר מהַדבָּקָה. המתואר כאן הוא פרוטוקול בסיסי איך לנהל זיהומים intraperitoneal של C57BL / 6J עם זן EGD של חיידקי L. וכדי למדוד ייצור IFN-γ על ידי תאי NK, תאי NKT, ו לימפוציטים אדפטיבית ידי cytometry הזרימה. בנוסף, הליכים מתוארים ל: (1) לגדול ולהכין את החיידקים עבור חיסון, (2) למדוד עומס חיידקים בטחול ובכבד, ו (3) הישרדות בעלי חי מידה לנקודות קצה. נציג נתונים ניתנים גם כדי להמחיש כיצד מודל זיהום זה יכול לשמש כדי לבחון את ההשפעה של סוכנים ספציפיים על התגובות IFN-γ כדי חיידקי L. והישרדות של עכברים מזיהום זה.
מבוא
IFN-γ הוא ציטוקין כי הוא חיוני בתיווך חסינות מפני פתוגנים תאיים לבקרת צמיחת גידול 5. חשיבותה של ציטוקינים זה עמיד החיידקים באה לידי ביטוי העובדה שבני האדם עם מוטציות מסלול איתות IFN-γ הן רגישות מאוד לזיהום עם mycobacteria ו salmonellae 6. בדומה לכך, עכברים שחסרים לו או IFN-γ או פגמי IFN-γ קולטן התערוכה העמיד mycobacteria 7-9 ופתוגנים תאיים אחרים לרבות ל חיידקי 10,11, שושנת יריחו מרכזי 12, סלמונלה typhimurium 13, וכן וירוסים מסוימים 11. בנוסף פתוגנים ללחום, IFN-γ ממלא תפקיד מכריע מארח הגנה מפני גידולים 14. למרות ייצ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הצהרת בטיחות
פרוטוקול זה מתאר זיהום של עכברים עם חיידקים ל חיים. מחולל מטופל בבטחה בתנאי BSL2 ידי צוות מיומן אשר אינם בעלי דיכוי חיסוני. אנשים בעלי דיכוי חיסוני כולל נשים בהריון, קשישים ואנשים הנמצאים החיים עם HIV או מחלות כרוניות הדורשות טיפול בתרופות לדיכוי מערכת החיסון. אדם צריך ללבוש חלוק מעבדת מגן או חלוק, כפפות, מסכה, ומשקפי מגן בעת טיפול דגימות נגועות. העבודה המתוארת במסמך זה בוצעה בתנאי BSL2 תחת תעודה (# 32,876) שהוצאה על ידי רשת בריאות האוניברסיטה (פתאום?) בטיחות ביולוגית משרד. פגרים מעכברים נגועים או כל רקמות בשימוש היו בשקיות כפולים ו מסולק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 3 מציג דוגמאות טיפוסיות לצביעה בציטומטריה של זרימה של IFN-γ בתאי NK ו-NKT ספלניים 24 שעות לאחר הדבקה ב-105 CFU של הפתוגן. איור זה ממחיש גם את אסטרטגיית ה-gating עבור פאנל הצביעה המתואר ב-טבלה 2. איור 4 מציג נתונים מייצגים שהתקבלו בניסוי אחד שבו עכברים זכרים טופלו ב-IS001, אנטגוניסט של PPARα, או בביקורת vehicle, הודבקו ב-105 CFU של L. monocytogenes, ולאחר מכן נותחו לבדיקת IFN-γ בתאי NK ו-NKT לאחר 24 שעות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מתארים פרוטוקול כיצד לבצע זיהום ניסיוני בסיסי בזן EGD של L. monocytogenes25 בעכברי C57BL/6J זכרים או נקבות. פרוטוקול זה הוקם במטרה לחקור את ההשפעה של מולקולה קטנה חדשה IS001 על ייצור IFN-γ על ידי לימפוציטים מולדים ואדפטיביים in vivo31. על ידי ניטור פינוי חיידקים והישרדות לאחר הדבקה, הושגו תובנות לגבי האופן שבו שינויים אלה ב-IFN-γ השפיעו על יכולתו של המארח לשלוט בזיהום.
שיקולים קריטיים בפרוטוקול
שיקול חשוב בתכנון מחקר מסו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
פיתוח פרוטוקול זה נתמך על ידי מענק תפעולי מ-CIHR (MOP97807) ל-SED.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מרק עירוי לב למוח, שונה | BD | 299070 | כל מותג צריך להיות מתאים |
| Agar | BD | 214010 | כל מותג צריך להיות מתאים |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | כל מותג צריך להיות מתאים |
| 1x PBS | Sigma | D8537 | כל מותג צריך להיות מתאים |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | כל מותג צריך להיות מתאים |
| אמוניום כלוריד (NH3Cl) | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| KHCO3 | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| Na2EDTA | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | כל מותג צריך להיות מתאים |
| סרום בקר עוברי | Gibco | 12483 | לפני השימוש, יש להשבית את החום ב-56 מעלות; C למשך 30 דקות |
| L-גלוטמין | Gibco | 25030 | כל מותג צריך להיות מתאים |
| חומצות אמינו לא חיוניות | Gibco | 11140 | כל מותג צריך להיות מתאים |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Gibco | 15140 | כל מותג צריך להיות מתאים |
| מעכב הובלת חלבון GolgiStop (המכיל מוננסין) | BD | 554724 | שימוש 4 μ l בתרבית תאים של 6 מ"ל |
| 16% Paraformaldehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | לדלל ל-4% PFA ב-ddH2O או 1x PBS |
| 10x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | לדלל 1x בבלוק FC ddH2O |
| Fc, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | לדלל 1:50 |
| צבע כדאיות לתיקון eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | לדלל 1:1,000 (השתמשנו גם בצבעי כדאיות מבדיקות מולקולריות) |
| נגד עכבר CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | היצרן ממליץ על גודל בדיקה מסוים; עם זאת יש לטטר זאת לפני השימוש. |
| נגד עכבר CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | היצרן ממליץ על גודל בדיקה מסוים; אולם יש לטטר אותו לפני השימוש. |
| PBS57/mCD1d טטרמר-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | התקבל במתנה מהמתקן |
| נגד עכבר TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | היצרן ממליץ על גודל בדיקה מסוים; עם זאת יש לטטר אותו לפני השימוש. |
| נגד עכבר NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | היצרן ממליץ על גודל בדיקה מסוים; עם זאת יש לטטר אותו לפני השימוש. |
| נגד עכבר CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | היצרן ממליץ על גודל בדיקה מסוים; עם זאת, יש לטטר אותו לפני השימוש. |
| נגד עכבר IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | היצרן ממליץ על גודל בדיקה מסוים; עם זאת, יש לטטר אותו לפני השימוש. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | השתמש בטיפה אחת לכל כתם |
| עכבר IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | משמש למדידת גמא האינטרפרון בתרבית supernatant |
| 50 מ"ל צינורות מאווררים לתרבית | משמש לתרבית החיידקים, כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| פטרי חיידקיות | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| 2 מ"ל Cyrovials | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| ספקטרומטר | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| מחטים | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| C57BL/6J | מעבדות ג'קסון | מלאי #000664 | הזמנה עבור הגעה לאחר 7 שבועות |
| אקונומיקה | לטיהור | ||
| 70% אתנול | לטיהור | ||
| חרוזי | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| צנטריפוגה | , דליים, כיסויי דלי. | ||
| מיקרוצנטריפוגה | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| גליצרול | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| טיפים | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| פיפטה | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| מכשירים | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| 70 מיקרון מסננות | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| מזרק | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| אקדח | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| יחידות | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| טריפן כחול | דילול 1 עד 9 ב-ddH2O, כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| המוציטומטר | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| צלחות עם תחתית עגולה | כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| צינורות FAC | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| BD LSR II | BD | כל ציטומטר זרימה יכול לשמש לרכישה שיש לה תצורת לייזר מתאימה וסט מסננים כדי להבחין בין הפלואורוקורמים | |
| Flowjo תוכנה | Treestar | משמש לניתוח נתונים. סוגים אחרים של תוכנות ניתוח נתונים יתאימו גם | |
| פיפטור רב ערוצי (0 - 300 ומיקרו; l) | Eppendorf | משמש לשטיפת תאים והוספת נוגדנים במהלך צביעת ציטומטריית זרימה | |
| חומצה אצטית | המשמשת לשטיפת חרוזי זכוכית, כל מותג צריך להיות מתאים | ||
| מערכת שימור חיידקים Microbank | Pro-lab Diagnostics | משמש כחלופה למלאי גליצרול לאחסון ארוך טווח של חיידקים |
מקורות
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
- Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
