Experimentelle Infektion mit Listeria monocytogenes Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten

Summary

Dieses Protokoll beschreibt , wie C57BL / 6J - Mäuse mit dem Stamm EGD von Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) und zur Messung der Interferon-γ (IFN-γ) Antworten , die durch natürliche Killer (NK) Zellen, natürliche Killer - T (NKT) -Zellen zu inokulieren, und adaptive T-Lymphozyten nach der Infektion. Dieses Protokoll beschreibt auch , wie Überlebensstudien bei Mäusen mit einer modifizierten LD ₅₀ Dosis des Erregers nach der Infektion zu führen.

Abstract

L. monocytogenes ist ein gram-positive Bakterien , die eine Ursache der durch Lebensmittel übertragenen Krankheiten beim Menschen ist. Experimentelle Infektion von Mäusen mit diesem Erreger hat sich auf die Rolle der angeborenen und adaptiven Immunzellen und spezifische Zytokine in Wirtsimmunität gegen intrazelluläre Erreger sehr informativ gewesen. Produktion von IFN-γ durch angeborene Zellen während der Infektion mit subletalen L. monocytogenes ist wichtig für Makrophagen und frühe Kontrolle des Krankheitserregers ^1-3 aktiviert. Zusätzlich kann durch adaptive Speicher Lymphozyten IFN-γ - Produktion ist wichtig zur Grundierung , die Aktivierung von angeborenen Zellen nach Reinfektion ^4. Die L. monocytogenes - Infektionsmodell dient somit als großes Werkzeug für die Untersuchung , ob neue Therapien , die IFN-γ Produktion haben einen Einfluss auf die IFN-γ - Antworten in vivo und haben produktive biologische Effekte wie die Erhöhung der bakteriellen Clearance oder die Verbesserung der das Überleben der Mäuse zu erhöhen sind so konzipiert, vonInfektion. Beschrieben ist hier ein Basisprotokoll für den Umgang mit der EGD Stamm von L. monocytogenes intraperitoneale Infektionen von C57BL / 6J - Mäusen zu führen und IFN-γ - Produktion durch NK - Zellen, NKT - Zellen und adaptive Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie zu messen. Außerdem werden Verfahren beschrieben: (1) wachsen, und die Bakterien zur Inokulation herzustellen, (2) Messung der Keimbelastung in der Milz und in der Leber, und (3) das Überleben der Tiere zu messen Endpunkten. Repräsentative Daten sind vorgesehen , um auch veranschaulichen , wie dieses Infektionsmodell verwendet werden kann , um die Wirkung von spezifischen Mitteln auf IFN-γ Reaktionen auf L. monocytogenes und das Überleben der Mäuse aus dieser Infektion zu testen.

Introduction

IFN-γ ist ein Zytokin , das für die Vermittlung von Immunität gegen intrazelluläre Pathogene und zur Steuerung des Tumorwachstums ⁵ entscheidend. Die Bedeutung dieses Zytokin in bakteriellen Resistenz ist in der Beobachtung offensichtlich , die mit Mutationen in der IFN-γ - Signalweg sind sehr anfällig für eine Infektion mit Mykobakterien und Salmonellen ⁶ Menschen. In ähnlicher Weise defizienten Mäusen entweder IFN-γ oder die IFN-γ - Rezeptor zeigen Defekte im Widerstand gegen Mykobakterien ^7-9 und andere intrazelluläre Pathogene einschließlich L. monocytogenes ^10,11, Leishmania major ^12, S....

Protocol

Sicherheitserklärung

Dieses Protokoll beschreibt Infektion von Mäusen mit lebenden L. monocytogenes. Der Erreger wird durch geschultes Personal sicher unter BSL2 Bedingungen behandelt, die nicht immunsupprimierten. Menschen mit geschwächtem Immunsystem sind schwangere Frauen, ältere Menschen und Personen, die HIV-infiziert sind oder chronischen Erkrankungen, die Behandlung mit einer immunsuppressiven Therapie erfordern. Das Personal sollte eine Schutzlaborkittel oder Kittel, Handschuhe, Maske und Augenschutz don während infizierte Handhabung von Proben. Die hierin beschriebene Arbeit wurde unter BSL2 Bedingungen, unter einem Zertif....

Results

Abbildung 3 zeigt eine typische Durchflusszytometrie Färbung von IFN-γ in Milz- NK und NKT - Zellen bei 24 Stunden nach der Infektion mit 10 ⁵ CFU des Erregers. Diese Figur zeigt auch die Gating - Strategie für die Färbung Tafel in Tabelle 2 beschrieben. Figur 4 zeigt einige repräsentative Daten , die in einem Experiment erhalten wurden , in denen männliche Mäuse mit dem PPAR & agr; Antagonist IS001 oder Vehikelkontrolle b.......

Discussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll, wie eine grundlegende experimentelle Infektion durchzuführen mit der EGD Stamm von L. monocytogenes ²⁵ bei männlichen oder weiblichen C57BL / 6J - Mäuse. Dieses Protokoll wurde für die Zwecke der Untersuchung der Wirkung eines neuartigen niedermolekularen IS001 auf IFN-γ Produktion von angeborenen und adaptiven Lymphozyten in vivo ³¹ eingerichtet. Bakterien-Clearance und das Überleben nach der Infektion Durch die Überwachung wurden Erkenntnisse .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gehirn Herz Infusionsbrühe, modifiziert	BD	299070	jede Marke sollte passend sein
Agar	BD	214010	jede Marke sollte passend sein
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	jede Marke sollte passend sein
1x PBS	Sigma	D8537	jede Marke sollte passend sein
TissueLyser II	Qiagen	85300	Jede Marke sollte geeignet sein
Ammoniumchlorid (NH3Cl)			Jede Marke sollte geeignet sein
KHCO3			jede Marke sollte angemessen sein
Na2EDTA			Jede Marke sollte angemessen sein
RPMI 1640	Gibco	22400089	jede Marke sollte angemessen sein
Fötales Rinderserum	Gibco	12483	Vor Gebrauch bei 56° Hitze inaktivieren; C für 30 min
L-Glutamin	Gibco	25030	jede Marke sollte geeignet sein
Nicht-essentielle Aminosäuren	Gibco	11140	jede Marke sollte geeignet sein
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140	jede Marke sollte geeignet sein
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (enthält Monensin)BD		554724	verwenden 4 μ l in 6 ml Zellkultur
16 % Paraformaldehye	Elektronenmikroskopie Sciences	15710	Verdünnung auf 4 % PFA in ddH2O oder 1x PBS
10x Perm/Wash Puffer	BD	554723	Verdünnung 1x in ddH2O Fc-Block
, Anti-Maus CD16/CD32 Aufgereinigt	eBioscience	14-0161	Verdünnung 1:50
Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 506	eBioscience	65-0866	1:1.000 verdünnen (wir haben auch Viabilitätsfarbstoffe von Molecular Probes verwendet)
anti-Maus CD4-PE-Cy5 (GK1.5)	eBioscience	15-0041	Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.
Anti-Maus CD8-FITC (53-6.7)	eBioscience	11-0081	Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.
PBS57/mCD1d tetramer-APC	NIH Tetramer Core Facility	N/A	Bezogen als Geschenk von der Einrichtung
anti-Maus TCRβ-PE-Cy7 (H56-597)	eBioscience	25-5961	Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.
Anti-Maus NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)	eBioscience	47-3351	Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.
Anti-Maus CD45 PE-Cyanin7 (30-F11)	eBioscience	25-0451	Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.
Anti-Maus IFN gamma-PE (XMG1.2)	eBioscience	12-7311	Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.
OneComp	eBeads eBioscience	01-1111	Verwenden Sie einen Tropfen pro Färbung
Maus IFN Gamma ELISA-Kit	eBioscience	88-7314	Wird zur Messung des Interferon-Gammas im Kulturüberstand
50 ml belüftete Röhrchen für die Kultur			Wird für die Kultivierung der Bakterien verwendet, jede Marke sollte geeignet sein
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen			Jede Marke sollte geeignet sein
bakterielle Petrischalen			Jede Marke sollte geeignet sein
2 ml Cyroviale			Jede Marke sollte geeignet sein
UV-Spektrometer			Jede Marke sollte geeignet sein
Sicherheitsnadeln			Marke sollte geeignet sein
C57BL / 6J	Jackson Laboratorien	Lager # 000664	Bestellen für Ankunft in 7 Wochen
Bleiche			Für die Dekontamination
70% Ethanol			Für die Dekontamination
Glasperlen			jeder Marke sollte geeignet sein
Zentrifugenrotor			, Eimer, Eimerabdeckungen.
Mikrozentrifuge			jeder Marke sollte geeignet sein
Steriles Glycerin	jede Marke sollte geeignet sein
			Jede Marke sollte geeignet sein
Pipette			Jede Marke sollte geeignet sein
Chirurgische Instrumente			Jede Marke sollte geeignet sein
70 Mikron Siebe			Jede Marke sollte geeignet sein
3 ml Spritze			Jede Marke sollte geeignet sein
Pipettenpistole			Jede Marke sollte geeignet sein
Filtrationseinheiten			Jede Marke sollte geeignet sein
Trypanblau			Verdünnt 1 bis 9 in ddH2O, jede Marke sollte geeignet sein
Hämozytometer			jeder Marke sollte geeignet sein
		rundem Boden	Jede Marke sollte geeignet sein
FACs Röhrchen	Fisher Scientific	14-959-5
BD LSR II	BD		Jedes Durchflusszytometer kann für die Erfassung verwendet werden, das über eine geeignete Laserkonfiguration und einen Filtersatz verfügt, um die Fluorochorme zu diskriminieren
Flowjo Software	Treestar		Wird für die Datenanalyse verwendet. Andere Arten von Datenanalysesoftware sind ebenfalls geeignet
Mehrkanalpipetten (0 - 300 & Mikro; l)	Eppendorf		Wird zum Waschen von Zellen und zum Hinzufügen von Antikörpern während der Durchflusszytometrie-Färbung verwendet
Essigsäure			Wird zum Waschen von Glasperlen verwendet, jede Marke sollte geeignet sein
Mikrobank Bakterielles Konservierungssystem	Pro-lab Diagnostik		Wird als Alternative zu Glycerinvorräten für die Langzeitlagerung von Bakterien verwendet