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Immunology and Infection

Experimentelle Infektion mit Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54554
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt , wie C57BL / 6J - Mäuse mit dem Stamm EGD von Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) und zur Messung der Interferon-γ (IFN-γ) Antworten , die durch natürliche Killer (NK) Zellen, natürliche Killer - T (NKT) -Zellen zu inokulieren, und adaptive T-Lymphozyten nach der Infektion. Dieses Protokoll beschreibt auch , wie Überlebensstudien bei Mäusen mit einer modifizierten LD 50 Dosis des Erregers nach der Infektion zu führen.

Abstract

L. monocytogenes ist ein gram-positive Bakterien , die eine Ursache der durch Lebensmittel übertragenen Krankheiten beim Menschen ist. Experimentelle Infektion von Mäusen mit diesem Erreger hat sich auf die Rolle der angeborenen und adaptiven Immunzellen und spezifische Zytokine in Wirtsimmunität gegen intrazelluläre Erreger sehr informativ gewesen. Produktion von IFN-γ durch angeborene Zellen während der Infektion mit subletalen L. monocytogenes ist wichtig für Makrophagen und frühe Kontrolle des Krankheitserregers 1-3 aktiviert. Zusätzlich kann durch adaptive Speicher Lymphozyten IFN-γ - Produktion ist wichtig zur Grundierung , die Aktivierung von angeborenen Zellen nach Reinfektion 4. Die L. monocytogenes - Infektionsmodell dient somit als großes Werkzeug für die Untersuchung , ob neue Therapien , die IFN-γ Produktion haben einen Einfluss auf die IFN-γ - Antworten in vivo und haben produktive biologische Effekte wie die Erhöhung der bakteriellen Clearance oder die Verbesserung der das Überleben der Mäuse zu erhöhen sind so konzipiert, vonInfektion. Beschrieben ist hier ein Basisprotokoll für den Umgang mit der EGD Stamm von L. monocytogenes intraperitoneale Infektionen von C57BL / 6J - Mäusen zu führen und IFN-γ - Produktion durch NK - Zellen, NKT - Zellen und adaptive Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie zu messen. Außerdem werden Verfahren beschrieben: (1) wachsen, und die Bakterien zur Inokulation herzustellen, (2) Messung der Keimbelastung in der Milz und in der Leber, und (3) das Überleben der Tiere zu messen Endpunkten. Repräsentative Daten sind vorgesehen , um auch veranschaulichen , wie dieses Infektionsmodell verwendet werden kann , um die Wirkung von spezifischen Mitteln auf IFN-γ Reaktionen auf L. monocytogenes und das Überleben der Mäuse aus dieser Infektion zu testen.

Introduction

IFN-γ ist ein Zytokin , das für die Vermittlung von Immunität gegen intrazelluläre Pathogene und zur Steuerung des Tumorwachstums 5 entscheidend. Die Bedeutung dieses Zytokin in bakteriellen Resistenz ist in der Beobachtung offensichtlich , die mit Mutationen in der IFN-γ - Signalweg sind sehr anfällig für eine Infektion mit Mykobakterien und Salmonellen 6 Menschen. In ähnlicher Weise defizienten Mäusen entweder IFN-γ oder die IFN-γ - Rezeptor zeigen Defekte im Widerstand gegen Mykobakterien 7-9 und andere intrazelluläre Pathogene einschließlich L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, S. typhimurium 13 und bestimmte Viren 11. Neben der Bekämpfung von Krankheitserregern, IFN-γ spielt eine entscheidende Rolle bei der Wirtsverteidigung gegen Tumoren 14. Obwohl höhere Produktion von IFN-γ im Rahmen einer Infektion oder Krebs nützlich ist, verlängerte Produktion dieses Zytokins wurde t verknüpfto der Entwicklung von systemischer Autoimmunität 15-17 und der Beschleunigung von Diabetes Typ I in dem nicht-fettleibigen diabetischen Maus - Modell 18.

Die Hauptquellen von IFN-γ sind : NK - Zellen, NKT - Zellen, γδ - T - Zellen, T - Helfer 1 (Th1) -Zellen, und zytotoxischen T - Lymphozyten (CTL) 5,19,20. IFN-γ erhöht sowohl angeborenen und erworbenen Immunität durch: (1) Hochregulieren Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I und II-Expression, (2) die Expression von co-stimulatorischen Molekülen auf Antigen-präsentierenden Zellen zu erhöhen, (3) Verbesserung der Makrophagen Phagozytose und die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen und mikrobizide Faktoren (beispielsweise Stickstoffmonoxid und reaktive Sauerstoffspezies), (4) die Förderung der Differenzierung von naiven CD4 + T - Zellen in Th1 - Effektorzellen, (5) Förderung der Antikörperklasse Umschaltung auf Immunglobulin ( Ig) 2a und IgG3 (in der Maus), (6) Induzierung der Produktion von Chemokinen Immunzellen-Stellen von i zu rekrutierennfection und (7) Verbesserung der NK - Zellen und CTL - Antworten 5,19. Aufgrund der entscheidenden Bedeutung der IFN-γ in der Wirtsantwort auf Pathogene und Tumore, rekombinantes IFN-γ wurde als Behandlung für verschiedene Infektionen und Malignitäten (in 19 überprüft) getestet. Da jedoch die systemische Verabreichung von IFN-γ oder Th1 Zytokin Förderung Interleukin-12 (IL-12) mit Nebenwirkungen verbunden ist und dosisabhängige Toxizität 19,21 besteht ein Interesse alternative Strategien bei der Entwicklung von IFN-γ - Produktion zu erhöhen , indem Immunzellen. Entwicklung neuer Biologika und kleinen Molekülen erfordert in vivo Screening - Tools zu testen , ob solche Mittel während einer Immunantwort IFN-γ Produktion zu erhöhen , und ob dies in einer sinnvollen biologischen Wirkungen wie Erhöhung der das Überleben der Tiere.

Experimentelle Infektion von Mäusen mit dem grampositiven Bakterium L. monocytogenes ist ein Instrumental - Modell seitEntschlüsselung der Rolle von IFN-γ in Wirtsimmunität gegen intrazelluläre Erreger 1,22. Infektion von Mäusen mit dem Pathogen intravenös oder intraperitoneal (ip) führt zur schnellen Verbreitung der Bakterien an der Milz und der Leber, wo sie von Makrophagen und Hepatozyten mit peak bakterielle Belastungen in der Milz internalisiert zwischen 3 und 4 Tage auftretenden post- Infektion 1,3,22. Produktion von IFN-γ durch NK - Zellen ist wichtig für die Makrophagenaktivierung und frühen Widerstand gegen den Erreger 3; jedoch bei hohen Infektionsdosen, die Produktion von IFN-γ kann auch auf Erreger - Clearance 23 schädlich sein. NKT - Zellen sind auch eine Quelle von IFN-γ in der Milz und Leber während der frühen Kontrolle von Pathogenen 2,24 und diese Produktion wurde 2 gezeigt , IFN-γ - Produktion durch andere Zelltypen , einschließlich NK - Zellen verstärken. Auf der anderen Seite, die später wirkenden adaptive T - Lymphozyten, CD8 + T - Zellen in partidere sind wichtig für das Spiel des Erregers zu vermitteln und den Schutz gegen eine erneute Infektion 1,4,22 bereitstellt.

Diese Infektionsmodell wurde für eine Reihe von Gründen für Forscher attraktiv war ( beschrieben in 1). Erstens, eine Infektion mit dem Pathogen ist in hohem Maße reproduzierbar und induziert eine starke Th1 und zellulären Immunantwort. Zweitens, während subletalen Infektion wird bakterielle Belastung in der Leber und der Milz konzentriert, wo es kann leicht gemessen werden. Drittens kann der Erreger sicher unter Biosafety Level 2 (BSL2) Bedingungen behandelt werden. Viertens der Organismus und die Immunantwort, dass es weitgehend charakterisiert worden erzeugt. Schließlich wurde eine Vielzahl von Mutanten und genetisch veränderte Stämme entwickelt, die für die Verwendung zur Verfügung stehen.

Beschrieben ist hier ein Basisprotokoll für die Impfung von C57BL / 6J - Mäuse mit dem EGD Stamm von L. monocytogenes und 25 für IFN Messung - γ reAntworten von NK, NKT und adaptive Lymphozyten nach der Infektion. Beschrieben ist , wie bakterielle Belastung in der Milz und Leber nach subletalen Infektion zu messen , und die Überlebensstudien nach der Infektion durchgeführt werden mit einer modifizierten LD 50 -Dosis des Pathogens. Schließlich werden repräsentative Daten gezeigt, wie kann dieses Protokoll verwendet werden , um die Wirkung neuer Therapien auf IFN-γ - Antworten und das Überleben der Mäuse zum Screening von L. monocytogenes Infektion.

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Protocol

Sicherheitserklärung

Dieses Protokoll beschreibt Infektion von Mäusen mit lebenden L. monocytogenes. Der Erreger wird durch geschultes Personal sicher unter BSL2 Bedingungen behandelt, die nicht immunsupprimierten. Menschen mit geschwächtem Immunsystem sind schwangere Frauen, ältere Menschen und Personen, die HIV-infiziert sind oder chronischen Erkrankungen, die Behandlung mit einer immunsuppressiven Therapie erfordern. Das Personal sollte eine Schutzlaborkittel oder Kittel, Handschuhe, Maske und Augenschutz don während infizierte Handhabung von Proben. Die hierin beschriebene Arbeit wurde unter BSL2 Bedingungen, unter einem Zertifikat ausgeführt (# 32876), die von der University Health Network (UHN) Biosicherheitsbehörde ausgestellt worden. Karkassen von infizierten Mäusen oder nicht in Anspruch genommenen Gewebe wurden doppelt verpackt und in Biohazard Abfall entsorgt. Käfige aus infizierten Mäuse wurden auch durch Autoklavieren dekontaminiert.

Ethikerklärung

Die Mäuse wurden in einem Quara gehalten und infiziertenntine Raum innerhalb UHN Tiereinrichtungen und wurden in Übereinstimmung mit den von der kanadischen Rat festgelegten Leitlinien für die Tierpflege betreut. Alle Verfahren an Mäusen wurden unter Verwendung von Tieren Protokoll # 3214 durchgeführt, die von der UHN Tierpflegeausschuss genehmigt wurde. Aus ethischen Überlegungen wurde der Tod nicht als Endpunkt für das Überleben Studien verwendet. Die modifizierte LD 50 -Dosis hier für L. monocytogenes - Infektion berichtet wurde bestimmt die Dosis sein , bei der 50% der Mäuse spezifischen Endpunkte erreicht, die in das Körpergewicht einer 20% igen Verlust besteht oder zumindest zwei der folgenden klinischen Symptome zeigt: Lethargie, gekräuselte Fell, gekrümmte Haltung, erschwerte Atmung, dumpf oder eingesunkene Augen. Die Mäuse wurden euthanasiert , wenn sie Endpunkte durch Einwirkung von Kohlendioxid erreicht (CO 2) nach UHN Anlage Richtlinien.

1. Herstellung von Glycerol Stocks für Langzeitlagerung

Hinweis: Dieses Verfahren beschreibt , wie Glycerin Aktien derEGD Stamm von L. monocytogenes sind von einem ursprünglichen Glycerolstammlösung hergestellt. Die Schritte, die das Potenzial zur Erzeugung von Aerosolen haben sollte innerhalb von einem zertifizierten Biosicherheitswerkbank (BSC) durchgeführt werden.

  1. Bereiten Hirn-Herz-Infusion (BHI) -Agar-Platten für das Bakterienwachstum. Hierzu 3,8% hinzufügen (w / v) BHI broth und 1,5% (w / v) Agar destilliert , um Doppel - H 2 O (ddH 2 O). Autoklav Flüssigkeit. Sobald der Agar auf 50 ° C abkühlt, Flüssigkeit in bakterielle Petrischalen (25 ml / Schale) verzichten und für 1 h in der BSC Platten trocken (offene) lassen.
    HINWEIS: Transfer BHI - Agar in ein 50 ° C Wasserbad nach Autoklavierung Verfestigung vor dem Gießen Platten zu vermeiden. Shop BHI-Platten bei 4 ° C den Kopf (mit Medienseite oben) bis zur Verwendung.
  2. Bereiten Flüssigkeit BHI-Medien. Dazu mischen 3,8% (w / v) BHI broth in ddH 2 O. Autoclave.
  3. Entfernen Sie gefrorene Glycerolstammlösung der L. monocytogenes EGD - Stamm aus dem -80 ° C einfrierenr und Auftauen auf Raumtemperatur.
  4. Tauchen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze in der aufgetauten Glycerin auf Lager und sofort Streifen die Spitze hin und her über einen Abschnitt einer BHI-Platte. Dies ist der Hauptstrecke.
  5. Drehen Sie die Platte um 90 ° C und mit einer frischen Pipettenspitze, ziehen durch die erste Streifen und verteilt es auf die nächste ¼ der Platte (dies ist die Sekundär Streifen). Wiederholen Sie noch einmal auf die tertiäre Streifen machen.
  6. Drehen Sie den Kopf Platte und Inkubation bei 37 ° C über Nacht. Einzelne einheitliche Kolonien sollten in den letzten Satz von Streifen und sichtbar zwischen 16 und 24 Stunden erhalten werden.
  7. Dispense 10 ml steriler BHI-Brühe in ein steriles 50 ml Röhrchen entlüftet. Wählen Sie eine Kolonie von L. monocytogenes von der Platte mit einer sterilen Pipettenspitze und impfen die Brühe. Inkubieren Sie die Kultur in einem 37 ° C - Orbital Schüttelinkubator über Nacht oder bis OD 600 = 1,0 mit Einstellungen bei 225 Umdrehungen pro Minute (rpm).
    HINWEIS: Glas oder Einweg - plaTox-Erlenmeyerkolben können auch zur Kultur Bakterien verwendet werden. Unabhängig von der Art von Behälter verwendet wird, sicherstellen, dass es steril ist, entlüftet, und dass das Volumen der Kultur nicht mehr als 20% des Gesamtvolumens des Behälters geeignete Belüftung der Bakterien zu gewährleisten.
  8. Bereiten Glycerin Bestände durch sterile 100% Glycerin mit über Nacht Bakterienflüssigkultur Mischen in einem Verhältnis 1: 1. Verteilen das bakterielle / Glycerin Mischung in 2 ml Kryoröhrchen (500 & mgr; l / Röhrchen) und Transfer Phiolen bis -80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung.
    HINWEIS: Bead Lager Methoden können auch anstelle von Glycerin Aktien verwendet werden , um Bakterien zu speichern. Durch dieses Verfahren werden poröse Mikrokugeln mit einer Reinkultur von L. monocytogenes inokuliert und bei -80 ° C gelagert. Jede Perle kann verwendet werden, um eine frische Kultur zur Beimpfung nach Bedarf. Siehe Materialliste für weitere Informationen.

2. Bestimmung der Wachstumskurve von L. monocytogenes in Tag Kultur HINWEIS: Bei diesem Verfahren wird beschrieben , wie die Wachstumskurve für L. monocytogenes zu erzeugen , die verwendet wird , um die Kolonie bildenden Einheiten (KBE) für Infektionsstudien zu schätzen. Alle Schritte, die das Potenzial haben, Aerosole erzeugen sollte innerhalb von einem zertifizierten BSC durchgeführt werden.

  1. Nehmen Sie 100 & mgr; l der Übernachtkultur erzeugt in Schritt von 1,7 bis 10 ml BHI Medium in einem 50 ml-Röhrchen entlüftet und wachsen in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C (225 rpm, bei 45 ° Winkel geneigt). Verwenden Sie eine nicht-geimpften Röhrchen als Kontrolle.
  2. Nehmen Sie 0.5 ml Proben der Kultur in stündlichen Intervallen (1, 2, 3, 4, 5, 6 h, etc.). Verdünnte jedes Aliquot 1: 1 (v / v) mit BHI Medium in einer Kunststoffküvette. Pipette nach oben und unten zu mischen. Messen der optischen Dichte (OD) bei 600 nm (OD 600) unter Verwendung eines Spektrometers. Weiter Bakterien bis OD 600 = 1 kultiviert werden .
  3. Zur gleichen Zeit, nehmen Sie eine 100 ul-Probe der Kultur und verdünnt mit 900 & mgr; l BHI Medium in einem sterilen 1,5 ml microcentrifuge Rohr (das ist die 10 -1 Verdünnung). Zentrifugieren Sie die Bakterien bei 6000 × g für 5 min und den Überstand aspirieren.
  4. Waschen Bakterien zweimal durch das Pellet in 1 ml BHI-Medium resuspendiert, für 5 min bei 6000 xg zentrifugiert und dann der Überstand abgesaugt. Das Pellet in 1 ml BHI-Medien. Bereiten Sie eine 10-fache Verdünnungsreihe dieser Probe in BHI - Medien (10 -2 bis 10 -9). Striches 100 ul jeder Verdünnungsmittel auf separate BHI-Agar-Platten. Inkubieren Platten über Nacht bei 37 ° C in einem Inkubator.
  5. Am nächsten Tag holen Platten, die zwischen 30 haben - 300 Kolonien. Entsorgen Sie den Rest. Zählen Sie die Kolonien auf diesen Platten. Tabelle 1 zeigt ein Beispiel von Zählungen in einem Aliquot erhalten , die bei OD 600 = 0,84 genommen wurde. In diesem Beispiel wird eine der Platten (dh 10 -6 Verdünnung) hatte Koloniezahlen zwischen 30 bis 300 und wurde für die CFU / ml Berechnung verwendet.
    HINWEIS: Die Platten mit einer größerenals 300 Kolonien nicht verwendet werden, da macht Überfüllung Bakterienwachstum verhindern kann, und auch schwierig, zu erkennen und einzelne Kolonien Aufzählen es. Platten mit Zahlen <30 sind ebenfalls nicht verwendet, weil kleine Fehler in Verdünnungstechnik oder das Vorhandensein von Verunreinigungen einen großen Einfluss auf die Genauigkeit der Zählungen am unteren Ende des Bereichs aufweisen.
  6. Unterteilen, die Anzahl der Kolonien, die durch das Volumen plattiert und dann mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren, um die CFU / ml-Wert für eine bestimmte Verdünnung zu erhalten. In dem Beispiel in Tabelle 1, bei der Zählung der 10 -6 Verdünnung war 70. Diesen Wert um 0,1 ml der CFU / ml - Wert für die verdünnte Kultur zu erhalten. Dann multiplizieren Sie mit dem Verdünnungsfaktor diesen Wert (10 6) , um die KBE / ml Wert der unverdünnten Kultur zu erhalten (7,0 x 10 8).
  7. Plotten die OD 600 (y-Achse) gegen die Zeit in Stunden (x-Achse) 26 der logarithmischen Phase des Wachstums zu identifizieren.
    Hinweis: Dieses Wachstum curve stellt eine Schätzung der CFU / ml des Tages Kultur, wenn zu einem bestimmten OD-Wert gezüchtet. Wählen Sie eine OD 600 das Lesen , die in der logarithmischen Wachstumsphase ist , die als Ziel OD 600 für den Anbau von Tag Kulturen verwendet werden können. Diese Daten können nun verwendet werden, um die CFU in einer Kultur zu schätzen, für die Herstellung des Inokulums (Verfahren 3).

3. Vorbereitung des Inokulums für experimentelle Infektion mit L. monocytogenes

HINWEIS: Bei diesem Verfahren wird die Herstellung des infektiösen Inokulum von einem Tag Kultur , die von einer Übernachtkultur (hergestellt in Verfahren 2) gestartet wurde. Alle diese Schritte werden in der BSC durchgeführt, wenn nicht anders angegeben.

  1. Berechnung der Anzahl der CFU für Infektion benötigt basierend auf der Anzahl von Mäusen und experimentelles Design der Studie. Fügen Sie ein geeignetes Volumen von BHI Medien in einen sterilen belüftet Erlenmeyerkolben oder Kulturröhrchen.
    HINWEIS: Die CFU von Bakterien prepared hängt von der Art des Experiments abhängig sein durchgeführt. Für das Studium NK und NKT - Zell - Reaktionen während der Infektion, wird jede Maus mit 10 5 CFU von Bakterien (Verfahren 6) beimpft. Wenn das Studium adaptive T - Zell - Reaktionen auf eine Infektion oder Messung bakterielle Belastung wird jede Maus mit 2 x 10 4 CFU von Bakterien (Verfahren 8) inokuliert. Wenn das Überleben Endpunkte zu studieren, wird jede Maus mit der LD 50 Dosis des Erregers (die 10 5 CFU ist für Männer und 1,5 x 10 5 CFU für Frauen, siehe Prozedur 9) beimpft.
  2. Impfen das Röhrchen mit BHI-Medien mit 100 ul über Nacht Kultur. Die Kultur in einem 37 ° C orbital Schüttelinkubator inkubieren (225 rpm) bis Ziel OD 600 erreicht ist . Übertragen Kultur Inhalt in ein steriles Zentrifugenröhrchen.
  3. Zentrifuge Bakterien in einem Pellet für 5 min bei 6000 xg unter Verwendung einer Zentrifuge. Saugen Sie den Überstand eines Vakuums in eine Falle Kolben, der Bleiche befestigt werden.
  4. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), (5 min bei 6000 xg) zwischen Zentrifugieren.
  5. Aspirieren dem zweiten Waschen und verdünnte Bakterien bei der entsprechenden Konzentration in 1x PBS die CFU von Interesse für jede Maus in einem 200 ul-Volumen zu liefern.
    HINWEIS: Es ist am besten , eine kommerzielle Quelle für sterile 1x PBS zum Waschen Bakterien zu verwenden und für die Herstellung des Inokulums, da Laborglaswaren immunologische Verunreinigungen wie Lipopolysacchariden einführen kann.

4. Experimentelle Infektion von Mäusen mit L. monocytogenes

Hinweis: Dieses Verfahren beschreibt , wie Mäuse in Verfahren hergestellt , mit dem Impfstoff zu infizieren 3 und wie die CFU in dem Inokulum geliefert zu überprüfen. Handhabung von Mäusen und Injektionen werden in einer BSC durchgeführt.

  1. Um eine ausreichende Anzahl von männlichen oder weiblichen C57BL / 6J-Mäuse für Ihr Experiment. Bestellen Sie auch Mäuse als nicht infizierte Kontrollen zu dienen.
  2. Lassen Mäusefür 1 Woche vor bakterieller Inokulation akklimatisieren.
    Hinweis: Dies ist , weil der Stress im Zusammenhang mit Transport der Tiere eine vorübergehende Erhöhung der Stresshormonproduktion und Lymphopenie 27,28 auslösen können.
  3. Am Tag der Inokulation ein Ausgangskörpergewicht für jede Maus erhalten und im Labor-Notebook aufzeichnen.
  4. In der BSC, mischen, um die Bakteriensuspension nach oben und unten mit einer sterilen Pipette, um sicherzustellen, dass die Bakterien gleichmäßig verteilt werden und dann 200 & mgr; l des Inokulums in ein 1 ml Sicherheit entwickelt Spritze mit einer 25 G-Nadel ausgestattet aufzunehmen.
  5. Injizieren Sie eine Maus ip mit 200 ul vorbereitet Inokulum (zB 10 5 CFU für NK - Zell - Infektion, Verfahren 6). Für dieses Verfahren Scruff Mäuse mit der weniger dominanten Hand durch die lose Haut greifen um die Schultern des Maus. Nachdem er sich vergewissert, dass die Maus gut zurückhaltend ist, injizieren die Maus im unteren Quadranten des Abdomens, nur lateral der midline die Blase zu vermeiden.
  6. Entsorgen Sie die Nadel und Spritze in einem Biohazard Behälter für spitze Gegenstände.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,6, bis alle Mäuse injiziert werden. Führen Sie ähnliche Schritte mit 1x PBS injizierten Mäusen (nicht infizierte Kontrollen).
    HINWEIS: Da die CFU eine Schätzung auf der Wachstumskurve basiert, ist es auch ratsam , die eigentliche CFU in dem Inokulum zu überprüfen. Dazu bereiten 3-4 verschiedenen Verdünnungen des hergestellten Inokulum (10-fach-Verdünnungsreihe verwendet wird), die Sie in zählbare Kolonien führt zu erwarten. Striches 100 ul jeder Verdünnungsmittel auf eine BHI-Agar-Platte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C. Zählen Sie die Kolonien und berechnen die tatsächliche KBE / ml, wie in Verfahren 2 beschrieben.

5. Vorbereitung Hitze getötete L. monocytogenes für Immunforschung

Hinweis: Alle Schritte , die das Potenzial haben , zu erzeugen Aerosole innerhalb des BSC durchgeführt werden.

  1. Wachsen Tag Kultur , bis die OD 600 Werte einwieder erreicht wird, die in der logarithmischen Phase sind. Dispense Kultur in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Die Röhrchen in ein 70 ° C in einem Wasserbad für 1 h Bakterien abzutöten.
  3. Waschen Bakterien zweimal mit 1x PBS wie in den Schritten 3.3 und 3.4. Resuspendieren in sterilem kompletten RPMI Medium fötales Kälberserum (FCS) enthält , (Supplemental Datei 1 für Rezept sehen) in einer Konzentration von 4 x 10 & sup6 ; / ml. Aliquotieren abgetötete Bakterien in 2 ml sterile Kryoröhrchen und bei -80 ° C.
  4. Bestätigen Sie den Tod der Bakterien durch die Verbreitung 100 ul durch Hitze abgetötete Bakterien Vorbereitung auf BHI-Agar-Platten und über Nacht bei 37 ° C inkubiert werden.
    Hinweis: Diese Hitze abgetötete Bakterien sollten zur Stimulierung der Lymphozyten in Kultur in Verfahren 8. bereit sein , wenn es irgendwelche Kolonien sind auf der BHI Agar - Platte, wiederholen Hitze-Tötung Verfahren.

6. Messung der IFN-γ Antworten von NK und NKT-Zellen während der Infektion

Hinweis: Dieses Verfahren beschreibt , wie die IFN-γ - Antworten von NK und NKT - Zellen in Mäusen , die mit 10 5 CFU der L. monocytogenes nach der Infektion bei 24 Stunden zu messen. Diese Dosis wird verwendet, da es robust IFN-γ - Antworten von NK und NKT - Zellen in der Milz 24 induziert. Führen Sie alle Schritte des BSC. Um die Lebensfähigkeit der Zellen erhalten, halten Zellen auf Eis, wann immer möglich und eiskalter Puffer verwenden.

  1. Impfen Mäuse wie in Verfahren 4 mit 10 5 CFU der L. monocytogenes beschrieben. Zur gleichen Zeit, zu injizieren nicht infizierten Kontrollmäusen mit einem gleichen Volumen von PBS 1x ip.
  2. Euthanize Mäuse bei 24 Stunden nach der Inokulation durch CO 2 Inhalation gemäß gültiger Richtlinien.
  3. Legen Sie jede Maus auf der rechten Seite und benetzen Sie die Haut mit 70% Ethanol eine Squeeze-Flasche mit.
  4. Mit aseptischen oder sterilen Pinzette und zäh-schneiden Schere, einzuschneiden die Haut direkt unter der Unterseite des Brustkorbs.
  5. Abspritzendie freiliegende Muskelschicht mit 70% Ethanol. Die Milz sollte unterhalb der Muskelschicht (offenen Pfeil in Abbildung 1) zu sehen sein.
  6. Mit aseptischen oder sterilen Pinzette und einer feinen Schere, einzuschneiden die Muskelschicht der Milz zu offenbaren. packen Sie vorsichtig die Milz mit der Zange und verwenden feinen Schere die Milz entfernt von umgebenden Bindegewebe zu schneiden.
  7. Legen Sie die Milz in einem 15 ml konischen Röhrchen mit steriler 1x PBS.
  8. Halb füllen sterile Petrischalen mit sterilen 1x PBS. Distanzieren die Milz durch einen 70 & mgr; m Nylon Zelle Sieb in die Petrischale mit dem flachen Ende einer sterilen 3 ml Spritze.
  9. Übertragen Sie die Splenozyten-Suspension in einem sauberen sterilen 15 ml konischen Röhrchen mit einer sterilen 10 ml serologische Pipette.
  10. Zentrifuge Proben bei 335 × g für 10 min bei 4 ° C.
  11. Saugen Sie den Überstand in einen Kolben Falle mit Bleichlauge. Lösen des Zellpellets durch das Rohr mit einem Finger Ausklopfen oder durch das untere Rohr ziehenhin und her entlang einer gewellten Oberfläche (zB Lüftungsluftstroms in der BSC).
  12. Lyse roter Blutkörperchen von 1,5 ml Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer hinzugefügt werden (siehe Zusatz Datei 1 für Rezept) zu jeder Milz. Nach genau 1 Minute und 15 Sekunden, um das Rohr mit 1x PBS füllen die Zell-Lyse zu stoppen.
  13. Zentrifugen Zellen wie in Schritt 6.10 beschrieben. Aspirieren den Überstand und Zellpellet in 10 ml fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Buffer (sterile 1x PBS 2% FCS enthält).
  14. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Dazu nehmen zwei Aliquots der Zellsuspension zum Zählen. Werden 15 ul jeder Zellsuspension in einem gleichen Volumen von Trypan Blau (0,04%, hergestellt von 0,4% Trypanblau-Lösung in ddH 2 O verdünnt). Last 15 ul jeder Zelle / Trypanblau Suspension in die Kammer des Hämozytometer (dh eine in der oberen Kammer, eine in der unteren Kammer).
  15. Mit Hilfe eines Mikroskops, zählen alle nicht-blauen Zellen infünf große Quadrate des zentralen Gitters in jeder Kammer (Abbildung 2). Nehmen Sie diese Zählung und teilen sie durch 10 die Anzahl der Zellen in 10 6 / ml zu erhalten. In dem Beispiel in Abbildung 2 wird der Zählwert 215 - Zellen in den 5 Quadrate; Daher ist die Zellkonzentration von 21,5 x 10 & sup6 ; / ml. Der Mittelwert der Zellkonzentrationen von den beiden Proben erhalten.
  16. Seed 1 x 10 6 Zellen pro Well / Fleck in einer 96-Well - Rundbodenplatte für die Durchflusszytometrie Färbung. Achten Sie darauf, auch Zellen für die ungefärbten und Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollen Saatgut. Siehe empfohlene Durchflusszytometrie Färbung Tafel in Tabelle 2.
    HINWEIS: Für die folgenden Schritte, empfiehlt es sich Zellen auf Eis oder bei 4 ° C zu halten und Zellen aus Licht mit einer Folie zu schützen , wenn Fluorochrome vorhanden sind. Eine Mehrkanalpipette kann verwendet werden, Flüssigkeiten in 96-Well-Färbeplatten verzichtet die Verarbeitung zu beschleunigen. Achten Sie darauf, nicht das Zellpellet zu stören, wennAbsaugen der Überstand der zentrifugierten Platte. Färbung kann auch in FACS-Röhrchen durchgeführt werden, wenn die Zentrifuge nicht mit Plattenadapter angebracht ist. Alle Zentrifuge Schritte von diesem Zeitpunkt an werden bei 456 g für 5 min bei 4 ° C durchgeführt.
  17. Zentrifugieren Sie die Platte und dann waschen Sie die Zellen zweimal mit FACS-Puffer. Eine Waschlösung wird durch Zugabe von 200 & mgr; l FACS-Puffer in jede Vertiefung, Zentrifugieren der Platte gemacht, und dann Absaugen der Überstand.
  18. Führen Sie Blockierungsschritt 50 & mgr; l durch Zugabe / Vertiefung FACS-Puffer mit anti-Maus-CD16 / CD32 (gereinigtes Fc-Block) (0,5 ug). Inkubiere Zellen bei 4 ° C für 15 min. Wasche einmal Zellen in 1x PBS, wie oben beschrieben.
  19. 100 l Lebensfähigkeit Farbstoff (fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff verdünnt 1: 1000 in 1x PBS) zu den Zellen. Stain-Zellen bei 4 ° C im Dunkeln (im Kühlschrank) für 30 min. Wasche die Zellen zweimal in FACS-Puffer wie oben beschrieben.
  20. Nach einem zweiten Wasch, 100 & mgr; l der Zelloberflächen-Antikörper oder Tetramere in die jeweiligen Vertiefungen nach to die Färbung Tafel in Tabelle 2 beschrieben. Stain-Zellen bei 4 ° C im Dunkeln (im Kühlschrank) für 30 min. Zu dieser Zeit fügen auch Antikörper zur Färbung von einzelnen positiven und FMO Kontrollen.
    HINWEIS: In Bezug auf einzelne positive Kontrollen wird es entweder auf den Einsatz Splenozyten empfohlen , die mit verschiedenen Fluorochrom Versionen des CD4 - Antikörper oder kommerziellen Ausgleich Perlen gefärbt sind , die mit den in der Platte verwendeten Antikörpern gefärbt werden. Vor diesen Färbeverfahren Durchführung alle FACS-Antikörper sollten in Teststudien titriert werden, um eine optimale Konzentrationen für die Färbung bestimmen.
  21. Zweimal waschen Zellen in Puffer FACS wie oben beschrieben und dann Zellen beheben , indem sie in 50 ul 4% Paraformaldehyd (16% Paraformaldehyd Lager verdünnt in ddH 2 O) und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur resuspendieren. ACHTUNG: Der Paraformaldehyd ist giftig und sollte nur im Abzug gehandhabt werden.
  22. Waschen Sie die Zellen zweimal in FACS-Puffer, Zentrifugieren dazwischen. Die Zellen in FACS-Puffer. Weiter zum nächsten Schritt oder Speicherzellen in den Kühlschrank vor Licht geschützt für bis zu drei Tage.
  23. Centrifuge Zellen, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 ul 1x Permeabilisierungs / Waschpuffer (Perm / Wash-Puffer), Zentrifugieren dazwischen. Die Perm / Wash Buffer wird von einem 10 - fach Lager , hergestellt durch Verdünnen von 1: 9 (v / v) in ddH 2 O.
  24. Nach dem zweiten Waschen, Resuspendieren der Zellen in 150 ul Perm / Wash Buffer und bei 4 ° C im Dunkeln für 15 min inkubiert.
  25. Centrifuge Zellen wieder und dann den Überstand aspirieren. Resuspendiere Zellen in 50 ul 1x Perm / Waschpuffer anti-IFN-γ enthält, und in der Dunkelheit bei 4 ° C für 1 Stunde inkubiert.
  26. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x Perm / Waschpuffer, Zentrifugieren dazwischen. Die Zellen in 250 ul Puffer FACS und dann übertragen Zellen FACS-Röhrchen.
  27. Gehen Zytometrie Erwerb fließen ein Fluss cytomet miter , dass eine geeignete Laserkonfiguration und Filtersatz Fluorochrome in der Färbungstafel in Tabelle 2 29 beschrieben verwendet , zu unterscheiden. Sammeln Sie mindestens 200.000 Ereignissen pro Probe und 10.000 Ereignisse für Kompensationssteuerungen.
  28. Bewerben Kompensationsmatrix und Analyse von Daten Durchflusszytometrie - Analyse - Software unter Verwendung von 30.

7. Messung von bakterielle Belastung in der Milz und Leber zum Zeitpunkt der Peak-Infektion

HINWEIS: Alle Schritte innerhalb eines BSC durchgeführt werden , sofern nicht anders angegeben.

  1. Beimpfen von Mäusen , die mit 2 x 10 & sup4 ; CFU des Pathogens IP 4 in beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Verfahren.
  2. Am Tag 3 nach der Infektion vorbereiten sterile 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die jeweils 500 ul eiskaltem sterilen 0,1% Triton X-100 in 1x PBS und 0,2 bis 0,3 g 1,5-2 mm säuregewaschen sterile Glasperlen. Wiegen Sie jedes Röhrchen.
    HINWEIS: Glasperlen werden Säure durch incu gewaschenin 10% Essigsäure Beize in einem Becherglas auf einem Magnetrührer 1 Stunde. Diese Kügelchen werden dann mit ddH 2 O zu entfernen Säure ausgiebig gewaschen, luftgetrocknet und dann vor der Verwendung im Autoklaven behandelt.
  3. Euthanize Mäuse durch CO 2 Exposition.
  4. Für Präparation von Organen, lag das Tier auf dem Rücken auf einem Sezieren Brett und Stift, um die Schenkel der Maus auf dem Brett mit 25 G Nadeln. Desinfizieren Sie die Haut, indem sie mit 70% Ethanol zu benetzen.
  5. Mit einer sterilen harten Schnitt Schere, machen einen Mittelschnitt in der Haut von der Leiste bis in die Mitte der Brust und dann von der Mitte der Leiste auf jedem Knie und aus der Mitte der Brust zu jedem Ellbogen. Blunt sezieren und die Haut reflektieren, es öffnen Pinning 25 G Nadeln.
  6. Desinfizieren Muskelschicht, indem sie es mit 70% Ethanol benetzt und dann steril einer feinen Schere in der Bauchwand einen Mittelschnitt machen mit. Besorgen Sie sich die Xiphoidbasis mit einer Pinzette. Dann die gleichen feinen Schere verwenden, stellen Schnitte in der Bauchwand von der xiphoid process seitlich auf jeder Seite nach dem Brustkorb, direkt unterhalb der Membran, die Leber zu offenbaren.
  7. Schneiden Sie ein ~ 100 mg Stück der Leber (mit dem gleichen Lappen für alle Mäuse) mit einer sterilen Schere und legen Sie sie in einem vorgewogen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  8. Verwenden einer Pinzette vorsichtig die Organe auf der linken Seite der Bauchhöhle zur Seite schieben, um die Milz zu visualisieren. packen Sie vorsichtig die Milz mit einer Pinzette und lassen Sie ihn aus der Bauchhöhle durch das umgebende Bindegewebe Wegschneiden.
  9. Legen Sie die Milz in der vorher gewogenes 1,5 ml Mikroröhrchen mit Perlen. Transport Gewebe Labor in einem auslaufsicheren Behälter mit Eis. Erneut wiegen die Rohre, die Organe mit den Gewebegewichte in mg zu bestimmen.
  10. Homogenisieren des Gewebes durch die Rohre Schütteln einer Perlmühle Homogenisator für 3 min bei einer Frequenz von 30 Hertz verwendet wird.
    HINWEIS: Die Perlmühle Verfahren wird zur Homogenisierung bevorzugt , da sie für die Vorarb zugänglich istsingen, eine große Anzahl von Proben und erzeugt weniger Chaos und der möglichen Exposition gegenüber dem Erreger. Jedoch automatische Homogenisatoren oder autoklaviert 2 ml manuelle Glasgewebe Homogenisatoren als Alternative verwendet werden könnten.
  11. Bereiten Sie eine 10-fache Verdünnungsreihe der Homogenate in 0,1% Triton-X-100 in 1x PBS, die von ( im Bereich von unverdünntem bis 10 -7).
  12. Striches 100 & mgr; l jeder verdünnten Homogenats auf eine BHI-Agar-Platte (in zweifacher Ausfertigung) eine sterile Spreizer. Übertragungsplatten zu einem 37 ° C Inkubator und Inkubation über Nacht.
  13. Halten Sie die Platten, die zwischen 30 und 300 Kolonien / Platte enthalten, entsorgen Sie den Rest. Zählen Kolonien auf jeder Platte, und die mittlere Anzahl der Kolonien nach doppelten Aufstrichen.
  14. Berechnen Sie die KBE / mg gemäß der folgenden Gleichung:
    CFU / mg = CFU / ml in dem Homogenat, hergestellt durch die ml Homogenat multipliziert durch das Gewicht mg des homogenisierten Gewebes geteilt.
    HINWEIS: Wenn beispielsweise ein Mittelwert von 30 colOnies wurden nach der Plattierung 100 & mgr; l von 10 -2 verdünnten Homogenats aus einer 120 mg Stück Leber hergestellt gezählt , die wie folgt in 0,5 ml, würden die Berechnungen homogenisiert:
    KBE / ml = 30 Kolonien x 100 (Verdünnungsfaktor) / 0,1 ml (Volumen Spread) = 30.000 KBE / ml.
    CFU / mg = 30.000 CFU / ml x 0,5 ml Homogenat / 120 mg Gewebe = 125 CFU / mg.

8. Wirkungen von L. monocytogenes auf IFN-γ Responses von CD4 + und CD8 + Zellen

Hinweis: Dieses Verfahren beschreibt , wie IFN-γ - Produktion durch Milz- CD4 + und CD8 + T - Effektorzellen zum Zeitpunkt der Spitze der adaptiven Immunantwort (~ 7 d nach der Infektion) mit zwei Methoden geerntet zu messen: (1) fließen Zytometrie IFN-gamma von CD4 + und CD8 + Zellen durch intrazelluläre Zytokin - Färbung zu messen, und (2) ELISA Gesamt IFN-γ Ebenen von Splenozyten (enthält alle T - Zellen) produziert zu messen. Verfahrenwerden innerhalb der BSC durchgeführt.

  1. Infect Mäusen durch ip mit 2 x 10 4 CFU des Erregers Injektion beschrieben unter Verwendung von Verfahren in Verfahren 4.
  2. Am 7. Tag nach der Infektion, einschläfern Mäuse durch CO 2 Inhalation gemäß gültiger Richtlinien.
  3. Präparieren Sie die Milz (wie oben beschrieben) und in einem 15 ml konischen Röhrchen mit steriler 1x PBS. Transport der Rohre an das Labor in einem dicht Behälter mit Eis.
  4. Verarbeiten Sie die Milzen in einer einzigen Zellsuspension, lysieren roten Blutkörperchen, wie in Kapitel 6, beschrieben und dann resuspendieren Zellen in komplettem RPMI-Medium, das 10% FCS. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
  5. Richten Sie Kulturen für die Messung von IFN-γ-Antworten. Für diese Abgabezellen (4 x 10 6 in 1 ml / Vertiefung) in 24-Well - Platten mit und gleiche Anzahl (4 x 10 6 oder 1 ml / well) des aufgetauten Hitze abgetöteten L. monocytogenes (hergestellt in Schritt 5) . Transfer-Zellen zu einem 37° C Inkubator.
  6. Nach 20 h Inkubation wurden 0,66 ul / ml Proteintransport-Hemmstoff, um Brunnen und weiter Inkubationen hinzuzufügen.
  7. Vier Stunden später, Transferplatte BSC und sammeln 500 ul Kulturüberstand und gefrier (bei -80 ° C) für die spätere Messung von IFN-γ Ebenen Kommerzielle enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) -Kit 31 verwendet wird . Dann sammeln Zellen in ein steriles 15 ml Röhrchen. Waschen Sie Brunnen mit 1x PBS und bündeln diese Wäsche zusammen mit gesammelten Zellen.
  8. Zuführen Zelloberflächenfärbung und intrazelluläre Färbung für IFN-γ auf CD4 + und CD8 + Zellen , wie in Verfahren 6 beschrieben , außer dass die Anfärbung Tafel in Tabelle 3 beschrieben , verwenden. Gehen cytometer Erwerb fließen (Sammeln von 200.000 Ereignisse / Probe) und analysieren 29 Daten 30 Durchflusszytometrie - Analyse - Software verwendet wird .

9. Mess das Überleben der Mäuse auf Endpoints nach L. monocytogenes Infection

Hinweis: Dieses Verfahren beschreibt die Wirkung eines Mittels auf das Überleben der Mäuse an Endpunkte nach der Infektion mit dem modifizierten LD 50 Dosis des Erregers. All diese Verfahren sind in der BSC in der Tiereinrichtung durchgeführt.

  1. Inject Mäuse ip mit dem modifizierten LD 50 -Dosis von L. monocytogenes wie in Verfahren 4 beschrieben Dies wurde bestimmt 10 5 CFU zu sein (für Männer) bzw. 1,5 x 10 5 CFU (für Frauen) 31.
  2. Folgen Sie zweimal täglich Mäuse auf klinische Zeichen und zeichnen diese Zeichen und Tierkörpergewicht in einem Labor-Notebook. Euthanize Mäuse, wenn sie einen Verlust von 20% des Körpergewichts oder zwei klinischen Anzeichen von Listeriose (Lethargie, gekräuselte Fell, gekrümmte Haltung, erschwerte Atmung, dumpf oder eingesunkene Augen) zeigen.
  3. Nach 14 Tagen einschläfern Mäuse über CO 2 Inhalation zu überleben.
  4. Bereiten Sie Kaplan-Meier - Plots der Daten durch das prozentuale Überleben jeder Gruppe gegen die Zeit aufgetragen 32.
    (Abbildung 7).

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Representative Results

Abbildung 3 zeigt eine typische Durchflusszytometrie Färbung von IFN-γ in Milz- NK und NKT - Zellen bei 24 Stunden nach der Infektion mit 10 5 CFU des Erregers. Diese Figur zeigt auch die Gating - Strategie für die Färbung Tafel in Tabelle 2 beschrieben. Figur 4 zeigt einige repräsentative Daten , die in einem Experiment erhalten wurden , in denen männliche Mäuse mit dem PPAR & agr; Antagonist IS001 oder Vehikelkontrolle behandelt wurden, infiziert mit 10 5 CFU L. monocytogenes und dann für IFN-γ in NK und NKT - Zellen nach 24 h analysiert . Diese Figur zeigt, dass die Behandlung mit IS001 verstärkte IFN-γ-Antworten von NKT-Zellen, aber nicht NK-Zellen nach Infektion mit dem Erreger. Figur 5 zeigt repräsentative Färbung für IFN-γ in der Milz CD4 + und CD8 + T - Zellen nach 7 Tagen nach der Infektion nach einer erneuten Stimulation ex vivo mit durch Hitze abgetöteten pathogen. Diese Figur zeigt auch die Gating - Strategie für die Anfärbung Tafel in Tabelle 3 beschrieben. 6 zeigt repräsentative Daten , die in einem Experiment erhalten wurden , in denen männliche Mäuse täglich behandelt wurden mit dem PPAR & agr; Antagonist IS001 oder Fahrzeugsteuerung, mit einer subletalen Dosis von L. monocytogenes infiziert und analysiert bei 7 Tage nach der Infektion. Dieses Experiment zeigt , dass die Behandlung mit IS001 verbesserten IFN-γ - Antworten sowohl von CD4 + und CD8 + Lymphozyten. Abbildung 7 zeigt repräsentative Daten aus einer Studie, die die Wirkung des PPAR & agr; Antagonist IS001 auf das Überleben der Mäuse zu Endpunkte nach der Infektion mit dem modifizierten LD 50 -Dosis des Pathogens untersucht. Aufgetragen ist die prozentuale Überleben von Mäusen gegen die Zeit nach der Infektion. Diese Abbildung zeigt, dass die Behandlung mit IS001 das Überleben der männlichen Mäuse Endpunkte erhöht. Zusammen stellen diese Daten veranschaulichen, wie dieses Modell angewendet werden kann, zu untersuchen,die Auswirkungen neuer Medikamente oder Behandlungen auf IFN-γ - Antworten in vivo und zu untersuchen , wie diese Immun Veränderungen das Überleben der Tiere vor einer Infektion auswirken.

Abbildung 1
Abbildung 1. Die Milzen von infizierten Mäusen Sezieren. Diese Reihe von Fotos zeigt, wie die Milz von einer toten Maus zu sezieren. (a) Legen Sie die Maus auf der rechten Seite und sprühen Sie die Haut mit 70% Ethanol. (b) Verwendung von aseptischen oder sterilen Pinzette und zäh-schneiden Schere, einzuschneiden die Haut direkt unter der Unterseite des Brustkorbs. (c) Sprühen Sie die freiliegenden Muskelschicht mit 70% Ethanol nach unten. Die Milz sollte unterhalb der Muskelschicht (offenen Pfeil) sichtbar sein. (d) Verwendung von aseptischen oder sterilen Pinzette und einer feinen Schere, einzuschneiden die Muskelschicht der Milz zu offenbaren. (e) greifen Sie vorsichtig die Milz mit der Zange und use einer feinen Schere die Milz entfernt zu schneiden das Bindegewebe aus umgibt. (f) Legen Sie die Milz in einem 15 ml konischen Röhrchen mit steriler 1x PBS. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Zählen Splenocyten eine Zählkammer. (a) zeigt das zentrale Netz des Hämozytometer. (b) zeigt eine vergrößerte Ansicht des zentralen Gitter , das 25 große Quadrate enthält (die jeweils 16 kleinere Quadrate enthalten). Die fünf großen Plätzen zum Zählen verwendet werden grau (4 Eckquadrate plus der Mitte Platz im zentralen Netz) hervorgehoben. (c) zeigt eine vergrößerte Ansicht eines der großen grauen Quadrate. Zur Bestimmung der Zellvolumen in 10 6 / ml, erste Zählungalle lebenden Zellen innerhalb der fünf großen grauen Quadrate. In dem gezeigten Beispiel ist diese Zählung 215. Bei der Zählung, stellen Sie sicher, dass alle den klaren (nicht blau) Zellen nur zählen, einschließlich derjenigen, die die Doppellinien auf der rechten und unteren Rand des Gitters zu berühren. Sie nicht die Zellen zählen die doppelten Linien auf der linken und oberen Rand des Gitters zu berühren. Nehmen Sie die insgesamt fünf Quadratzahl und teilen sie durch 10 die Anzahl der Zellen in 10 6 / ml zu erhalten. Im Beispiel durch 10 geteilt 215 ist 21,5 x 10 6 Zellen / ml. Beachten Sie, dass nur diese Berechnungen arbeiten, wenn Sie 5 der großen Plätzen zählen als hervorgehoben und verdünnen Sie Ihre Zellen 1: 1 in Trypanblau. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Gating - Strategie zum Nachweis von IFN-γ Produktion in NK und NKT-Zellen. Erste Tor auf Lymphozyten auf FSC-A von SSC-A-Plot. Dann Tor auf jene Ereignisse, die auf dem FSC-H / FSC-A Plot auf der Diagonalen sind. Dies sind die Singuletts. Dann Tor auf Live (AmCyan -) und CD8 - Zellen. Dann zeichnen Sie die Tetramerfärbung gegen TCR & bgr;. Die NKT-Zellen sind innerhalb der doppelt positiven Bevölkerung und die NK-Zellen sind innerhalb der doppelten negativen Bevölkerung. Tor auf der doppelt positiven Zellen und Plot NKp46 gegen FSC. Tor auf der NKp46 negativen Bevölkerung, die die NKT-Zellen sind (dieses Tor kann von der Suche nach dem Punkt der Teilung in den beiden Populationen aus der NK-Zell-Plot eingestellt werden). Die NK - Zellen sind die Tetramer - TCR & bgr; - NKp46 + Bevölkerung. Innerhalb von NK und NKT - Zell - Tore, die IFN-γ + Zellen in der PE - Kanal werden nach dem Setzen eines Tor auf der FMO Steuerung basiert identifiziert. bitte klickenhier, um eine größere Version dieser Figur sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Repräsentative Daten , die für die Frequenzen von IFN-γ + NK und NKT - Zellen bei 24 Stunden nach der Infektion. In diesem Experiment wurden männliche C57BL / 6J - Mäusen (N = 3 - 4 / Gruppe) wurden infizierte ip mit 10 5 CFU von L. monocytogenes oder wurden un-infizierten verlassen. Mäuse wurden auch die Droge IS001 oder Vehikel (0,5% Carboxymethylcellulose) gleichzeitig Zeitpunkt der Inokulation und 12 Stunden später verabreicht. Vierundzwanzig Stunden nach der Beimpfung wurden die Mäuse getötet und die Milzen wurden entfernt und wurden einzeln und gefärbt für die Durchflusszytometrie verarbeitet. Gezeigt sind die Mittelwerte ± SEM Häufigkeit von IFN-γ + -Zellen in der NK sind (a) oder NKT - Zelle - Gattern (b) in nicht - infizierten oder infizierten Mäusen nach der Behandlung mit einem Fahrzeug oder dem Medikament IS001. *Zeigensa Unterschied (p <0,05) von Fahrzeugkontrolle durch zweiseitigen T-Test. Die Daten werden neu gedruckt von 31 mit freundlicher Genehmigung aus dem Journal of Immunology (Band 195, S.. 5189-5202, 2015). Copyright 2015 der American Association of Immunologen, Inc. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Gating - Strategie zum Nachweis von IFN-γ Produktion in CD4 und CD8 - Zellen. Erste Tor auf Lymphozyten auf FSC-A von SSC-A Plots. Dann Tor auf jene Ereignisse, die auf dem FSC-H / FSC-A Plot auf der Diagonalen sind. Dies sind die Singuletts. Innerhalb dieses Tor, Tor auf Live (AmCyan -) CD45 + Zellen. Dann Tor auf entweder CD8 + oder CD4 + Populationen. Innerhalb jedes Tor, das IFN-γ +Zellen in dem PE-Kanal werden durch Vergleich der Färbung der FMO Steuerung identifiziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Repräsentative Daten , die für die Frequenzen von IFN-γ + CD4 + und CD8 + T - Zellen bei 7 Tage nach Infektion mit L. monocytogenes (EGD - Stamm). In diesem Experiment wurden männliche C57BL / 6J - Mäuse infiziert ip mit 2 x 10 & sup4 ; CFU L. monocytogenes (n = 7 / Gruppe) wurden nicht - infizierte oder links (N = 3 / Gruppe). Mäuse wurden auch die Droge IS001 oder Vehikel (0,5% Carboxymethylcellulose) zweimal täglich ab dem Tag der Impfung verabreicht. Sieben Tage später wurden die Mäuse getötet und die Milzen wurden entfernt und wurden einzeln verarbeitet, umZellkultur. Splenozyten mononukleären Zellen wurden für 24 h mit durch Hitze abgetöteten L. monocytogenes mit den Proteintransport stimuliert Inhibitor für die endgültige 4 Stunden der Kultur zugegeben. Die Zellen wurden dann für die Durchflusszytometrie gefärbt. Gezeigt sind die Mittelwerte ± SEM Häufigkeit von IFN-γ + -Zellen in den CD4 + (a) oder CD8 + Zelle Gatter sind (b) in nicht - infizierten oder infizierten Mäusen nach der Behandlung mit einem Vehikel (0,5% Carboxymethylcellulose) oder das Medikament IS001. * Zeigt einen Unterschied (P <0,05) von dem Fahrzeugsteuergegenstück, wie durch zweiseitigen T-Test bestimmt. Die Daten werden neu gedruckt von 31 mit freundlicher Genehmigung aus dem Journal of Immunology (Band 195, S.. 5189-5202, 2015) .Copyright 2015 der American Association of Immunologen, Inc. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Abbildung 7. Repräsentative Daten während eines Experiments erreicht , dass die Wirkung eines PPARalpha - Antagonist 1S001 auf das Überleben der Mäuse zu Endpoints nach der Infektion der männlichen C57BL / 6J - Mäuse , die mit L. monocytogenes (EGD - Stamm) verglichen. In diesem Experiment wurden männliche C57BL / 6J - Mäuse (N = 10 Mäuse / Gruppe) wurden ip infizierte mit dem modifizierten LD 50 -Dosis des Erregers (10 5 CFU) von L. monocytogenes. Mäuse wurden auch die Droge IS001 oder Vehikel (0,5% Carboxymethylcellulose) zweimal täglich ab dem Tag der Impfung verabreicht. Die Mäuse wurden anschließend täglich auf klinische Anzeichen und wurden eingeschläfert, wenn humane Endpunkte erreicht wurden. Dargestellt ist die prozentuale Überleben von Mäusen zu Endpunkten über die Zeit anzeigt, * einen Unterschied in der Überlebenszeit zwischen den Gruppen bestimmt, wie von Log-Rank-Test (P <0,05). Die Daten werden neu gedruckt von 31 mit freundlicher Genehmigung der Zeitschrift of Immunologie (Volumen 195, S.. 5189-5202, 2015). Copyright 2015 der American Association of Immunologen, Inc. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1
Tabelle 1: Zeigt einige repräsentative Berechnungen zur Bestimmung der CFU in einem aliquoten Teil des Tages Kultur. In diesem Beispiel wurde ein Aliquot der Kultur entnommen und Tag wurde 1: 1 mit BHI-Medien. Die OD 600 dieser verdünnten Probe wurde bestimmt 0,84 sein. Außerdem wurde ein 100 ul Aliquot für CFU Bestimmung entnommen. Diese Probe wurde mit 900 & mgr; l BHI - Medien (10 -1) verdünnt und in 1 ml BHI gewaschen und resuspendiert. Eine 10-fache Verdünnungsreihe dieser Probe wurde hergestellt (10 -2 bis 10 -9) und verdünnten Proben wurden auf BHI aga plattiertr Platten (nur Werte für 10 -4 bis 10 -9 gezeigt sind). Am nächsten Tag wurden Kolonien gezählt. Nur jene Platten , die Koloniezahlen zwischen 30-300 hatten , wurden für die Berechnung nicht berücksichtigt (dh 10 -6 Platte, gelb markiert). Die Anzahl der Kolonien, die auf dieser Platte (70) wurde dann von 0,1 (Volumen in ml plattiert) geteilt, um die CFU / ml der verdünnten Probe zu erhalten. Dieser Wert wurde dann mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert (10 6) , um die CFU / ml Lesen der unverdünnte Kultur zu erhalten. TMTC = zu viele zu zählen.

Tabelle 2
Tabelle 2: Die Färbung Feld zum Nachweis von IFN - γ in NK und NKT - Zellen. Beachten Sie, dass entweder Kompensations Perlen gefärbt mit den Strömungs verwendeten Antikörper in der Platte oder Splenozyten gefärbt mit verschiedenen Fluorochrom Versionen von CD4-Antikörper Klon GK1.1 können als einzelne positive Kontrollen verwendet werden.

Tabelle 3
Tabelle 3: Anfärben - Panel zum Nachweis von IFN - γ in CD4 + und CD8 + Zellen. Beachten Sie, dass entweder Kompensations Perlen gefärbt mit den Strömungs verwendeten Antikörper in der Platte oder Splenozyten gefärbt mit verschiedenen Fluorochrom Versionen von CD4-Antikörper Klon GK1.1 können als einzelne positive Kontrollen verwendet werden.

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Discussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll, wie eine grundlegende experimentelle Infektion durchzuführen mit der EGD Stamm von L. monocytogenes 25 bei männlichen oder weiblichen C57BL / 6J - Mäuse. Dieses Protokoll wurde für die Zwecke der Untersuchung der Wirkung eines neuartigen niedermolekularen IS001 auf IFN-γ Produktion von angeborenen und adaptiven Lymphozyten in vivo 31 eingerichtet. Bakterien-Clearance und das Überleben nach der Infektion Durch die Überwachung wurden Erkenntnisse gewonnen, wie sich diese Veränderungen in der IFN-γ die Host-Fähigkeit beeinflusst, die Infektion zu kontrollieren.

Kritische Überlegungen im Protokoll

Eine wichtige Überlegung bei der Konstruktion dieser Art von Studie ist, dass jedes Experiment angemessen angetrieben sein und in geeigneter Weise gesteuert. Durch biologische Veränderung der Immunantwort auf eine Infektion (siehe 4 und 6), wird empfohlen , dass N = 4 - 5 Mäuse pro Gruppe für die ersten Immununtersuchungen verwendet werden sollte. Wenn einfter diese Studien gibt es einen Trend in den Daten, aber keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen ersichtlich, könnte eine Leistungsberechnung durchgeführt werden, um die geringste Anzahl von Tieren in nachfolgenden Studien erforderlich, um zu bestimmen statistische Signifikanz zu erreichen. In Bezug auf Kontrollen, ist es wichtig, nicht infizierten Kontrollen zur Bestimmung der Baseline-IFN-γ-Antworten für Immun Studien und Fahrzeug umfassen steuert die Wirkung der Behandlung von Stress bei Verabreichung der Behandlung verbunden sind, um zu unterscheiden. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist der Zeitpunkt der Behandlung. Da der angeboren Antwort auf L. monocytogenes sehr schnell ist, wird empfohlen , dass die erste Behandlung am Tag verabreicht werden , vor oder zur gleichen Zeit wie der Inokulation , damit therapeutische Mengen des Reagens sicherzustellen dem Stand erreicht werden Initiierung der angeborenen Immunantwort.

Noch ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Dosis des Erregers für infectio verwendet werdenn. Eine subletalen Dosis wird für die Messung der Bakterienbelastung zu empfehlen, da es die Chance erhöht, dass der Erreger wird in der Milz und Leber konzentriert werden, so dass für die genauere Zählung der Bakterien. Einer subletalen Dosis ist auch für Aufzählen IFN-γ-Antworten von Lymphozyten adaptive empfohlen, um sicherzustellen, dass die Tiere unterliegen nicht vor dem Zeitpunkt der maximalen T-Zell-Expansion Listeriose. Im Gegensatz dazu wird es empfohlen, daß eine höhere Infektionsdosis zur Messung der frühen NK und NKT-Zell-Antwort bei 24 Stunden, um die IFN-γ Produktion durch diese Zellen zu maximieren, verwendet werden.

Die klassische LD 50 ist die Dosis des Erregers , die in 50% Letalität von Mäusen führt. Da der Tod an unserer Hochschule keine akzeptable Endpunkt war und da viele Symptome der Listeriose kann vorhersagen, ob ein Tier wahrscheinlich zu einer Infektion zu erliegen ist, haben wir eine definierte Liste von klinischen Zeichen anstelle von Tod als Endpunkt in unseren Studien. Using dieses Verfahren wurde festgestellt , dass das modifizierte LD 50 10 5 CFU für 8 Wochen alten männlichen und 1,5 x 10 5 CFU für 8 Wochen alte weibliche 31 C57BL / 6J - Mäusen war. Diese LD 50 Dosen durch Messung der prozentualen Überlebenszeit von Mäusen zu Endpunkten in stufenweisen Dosiseskalationsstudien ermittelt wurden (N = 5 Studien insgesamt) , die jeweils enthaltenen N = 8 Mäuse pro Gruppe (zB Mäuse wurden infiziert zunächst mit 10.000 CFU , dann eine zweite Charge mit 20.000 CFU, etc.). Userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit: die LD 50 Berechnung wurde aus einer Regressions Auftragung des log (CFU) (x-Achse) gegen die Probit der prozentualen Überlebens - Werte (y-Achse) (Internet bestimmt /ProbitAnalysis.pdf).

Beachten Sie, dass die modifizierte LD 50 -Dosis bestimmt in unserem Labor aus , dass auch in einem anderen Labor unterschiedlich sein können , wenn Mäuse mit dem gleichen Stamm von L. monocytogenes infiziert. Ein Teil dieser Variabilität können sich auf die subjektive Natur of Überwachung klinischer Symptome der Listeriose im Vergleich zu den mehr absolute Endpunkt des Todes. Zusätzliche Variabilität kann aus Unterschieden in Umweltfaktoren, wie Ernährung der Maus oder der Mikrobioten oder Unterschiede in der Herstellung von Inokulum zwischen labs führen. Daher wird empfohlen, bevor sie auf irgendwelchen Überlebensstudien zu einsteigen, eine Pilotstudie durchgeführt werden , in denen weibliche Mäuse (N = 8 Mäuse / Gruppe) mit 1,5 × 10 5 CFU des gleichen Stammes von L. monocytogenes in diesem verwendete infiziert sind studieren und Symptome überwacht, um festzustellen, ob diese Dosis tatsächlich in 50% Überleben Endpunkte führt. Wenn das Überleben in dieser CFU niedriger oder höher als 50% ist, schrittweise Dosissteigerung oder Dosis Deeskalation Studien konnten schnell durchgeführt werden , auf der LD 50 -Dosis zu verengen in.

Ein weiterer wichtiger Aspekt ist der Stamm oder Unterstamm von Mäusen für Infektionsstudien verwendet. Dieses Protokoll beschreibt Infektion der allgemein verwendeten Inzuchtmausstamm C57BL / 6J. Dies Stamm ist gut geeignet für die Messung des IFN-γ - Antworten , da diese Maus eine Th1 neigende Stamm 33 zu sein , und als Ergebnis betrachtet wird, ist relativ widerstandsfähig gegen L. monocytogenes - Infektion ( im Vergleich zu Th2 neigende Mausstämme wie BALB / c) 34,35. dieses Protokoll auf andere Mausstämme Anpassung wird die Kenntnis der infektiösen Dosis des Erregers für die besonderen Belastungen erfordern. Es wird auch die Menge der Fehlersuche in diesem Protokoll zu verwenden, um Mäuse im gleichen Alter, Geschlecht und Anbieter wie skizziert empfohlen bei der Einrichtung des Modells beteiligt zu reduzieren. So bestellte C57BL / 6 - Mäuse von einem Anbieter (zB C57BL / 6J) genetische Unterschiede als C67BL / 6 - Mäuse zeigen kann von einem anderen Anbieter bestellt (zB C57BL / 6NTac) 36. Darüber hinaus unterscheidet sich die Darmflora zwischen C57BL / 6 Subkulturen von verschiedenen Anbietern erhalten, die das Gleichgewicht der Th1 und Th17 - Antworten in der Maus 37 beeinflussen können.

ove_title "> Mögliche Änderungen an Technik

Mäuse werden am häufigsten ip inokuliert oder intravenös über den natürlichen Weg der Infektion beim Menschen gegenüber, die durch den Gastrointestinaltrakt ist. Orale Infektionen sind weniger häufig , weil Standard - Stämme von L. monocytogenes ineffizienten das Darmepithel der Mäuse 38 infizieren. Dies ist , weil es eine einzige Aminosäureaustausch in der Sequenz der Maus E-Cadherin aus humanen E-Cadherin ist, die durch die Invasion listeriellen Protein in Verlust der Erkennung von E-cadherin - Ergebnisse Internalinfamilie A (INIA) 39. Um diese Barriere zu überwinden, nutzen die Forscher Mäuse , die für die menschliche Protein E-Cadherin transgen sind oder Listeria verwenden , die entwickelt wurden , um eine mutierte Sequenz von Inia (Inia mut) zum Ausdruck bringen , dass E-Cadherin mit der gleichen Affinität wie WT EGD Maus bindet für humanen E-Cadherin - 40. Somit ist eine mögliche Modifikation dieser Technik Mäusen auf oralem Wege infizieren. Der Leser wird auf eine andere JoVE Veröffentlichung bezeichnet , die orale Impfung Methoden 38 beschreibt. Beachten Sie, dass die Art der Infektion verändert die infektiöse Dosis sowie die Kinetik der Verbreitung des Erregers beeinflussen.

Dieses Protokoll beschreibt Hitze abgetöteten Listeria Verwendung zur IFN-γ - Produktion durch CD4 + und CD8 + T - Zellen hervorzurufen. Durch Hitze getötete L. monocytogenes wurde als Anregung in unseren Studien gewählt, weil dieses Antigen billig ist und weil unser Labor war in erster Linie interessiert an CD4 + T - Zell - Reaktionen gegen den Erreger. Eine Einschränkung besteht darin , dass durch Hitze abgetötete Bakterien nicht effizient prime CD8 + T - Zell - Antworten entweder in vitro oder in vivo 41 42,43 Infektion. Somit kann die CD8 + T - Zell - IFN-γ Produktion , die wir von Splenocyten beobachtet auf dem Höhepunkt der Infektion geerntet (dh 6) wahrscheinlich als Reaktion auf die Restlebenden Bakterien , die in den Splenozyten Kulturen oder wurde als Folge der Zytokin-induzierte Zytokinfreisetzung 41 ausgelöst. Als Alternative abgetöteten Wärme Listeria, könnte man auch IFN-γ - Antworten ex vivo auslösen durch T - Zellen auf Peptide Belichten Epitope auf listeriellen Proteine kodieren. Tatsächlich immunodominant MHC Klasse II-restringierten Epitopen für Listeriolysin O und dem p60 - Hydrolase und haben für C57BL / 6 und BALB / C - Mäuse und immunodominant MHC Klasse I - Epitope wurden beschrieben für BALB / c 44 beschrieben. Noch ein weiterer Ansatz ist , Mäuse mit Stämmen von L. monocytogenes zu infizieren , die konstruiert wurden , Modell - Antigene wie Ovalbumin oder virale Antigene , um die Vorteile der bestehenden MHC Klasse I- und MHC Klasse II-Tetramer - Reagenzien zu exprimieren antigenspezifischen aufzuzählen T - Zellen in infizierten Mäusen 45,46.

Weitere Einschränkungen des Protokolls

Eine weitere Einschränkung dieses Modells ist, dass es only Maßnahmen IFN-γ-Produktion durch Immunzellen in der Milz. Neben der Verwendung von Tetrameren Antigen - spezifischen T - Zellen (von Ovalbumin-exprimierenden Varianten von L. monocytogenes), Durchflusszytometrie Anfärbung Platten beschrieben Hier kann leicht modifiziert zur Messung der Produktion von anderen Cytokinen, wie TNF oder IL-2 oder aufzuzählen Effektor-Moleküle, die in CD8 T-Zellen oder NK-vermittelte Abtötung des Erregers wie Perforin Granzym oder B. Zusätzlich teilnehmen könnte dieses Protokoll auch durch Immunzellen in der Leber zu untersuchen, IFN-γ angepasst werden.

Zukünftige Anwendungen

Sobald dieses Protokoll beherrscht wird, kann es als ein einfaches In - vivo - Modell dienen die Effekte verschiedener Wirkstoffe oder Gene auf Th1 und zelluläre Immunität zu screenen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion Broth, Modified BD 299070 any brand should be appropriate
Agar BD 214010 any brand should be appropriate
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 any brand should be appropriate
1x PBS Sigma D8537 any brand should be appropriate
TissueLyser II Qiagen 85300 any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl) any brand should be appropriate
KHCO3 any brand should be appropriate
Na2EDTA any brand should be appropriate
RPMI 1640 Gibco 22400089 any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum  Gibco 12483 Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine Gibco 25030 any brand should be appropriate
Non-essential amino acids Gibco 11140 any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD 554724 Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaldehye Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS
10x Perm/Wash buffer BD 554723 Dilute 1x in ddH2O
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506 eBioscience 65-0866 Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) eBioscience 15-0041 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) eBioscience 11-0081 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC NIH Tetramer Core Facility N/A Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) eBioscience 25-5961 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) eBioscience 47-3351 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) eBioscience 25-0451 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) eBioscience 12-7311 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads eBioscience 01-1111 Use one drop per stain
Mouse IFN gamma ELISA kit eBioscience 88-7314 Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 ml vented tubes for culture Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes any brand should be appropriate
bacterial petri dishes any brand should be appropriate
2 ml cyrovials any brand should be appropriate
UV spectrometer any brand should be appropriate
safety engineered needles any brand should be appropriate
C57BL/6J Jackson laboratories Stock#000664 Order for arrival at 7 weeks
Bleach For decontamination
70% Ethanol For decontamination
Glass beads any brand should be appropriate
Centrifuge rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge any brand should be appropriate
Sterile Glycerol any brand should be appropriate
Pipette Tips any brand should be appropriate
Pipette any brand should be appropriate
Surgical instruments any brand should be appropriate
70 micron strainers any brand should be appropriate
3 ml syringe any brand should be appropriate
Pipette gun any brand should be appropriate
Filtration Units any brand should be appropriate
Trypan Blue Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate
Hemocytometer any brand should be appropriate
Round bottomed plates any brand should be appropriate
FACs tubes Fisher Scientific 14-959-5
BD LSR II BD Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software Treestar Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0 - 300 µl) Eppendorf Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System Pro-lab Diagnostics Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria

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References

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Die Infektion Ausgabe 117, Bakterien Infektionsmodell Mäuse Durchflusszytometrie Interferon-γ-Antwort
Experimentelle Infektion mit<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten
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Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, … More

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, M. A., Mallevaey, T., Dunn, S. E. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (117), e54554, doi:10.3791/54554 (2016).

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