Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Deneysel Enfeksiyon Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54554
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, Listeria monocytogenes EGD suşu ile (L. monocytogenes) C57BL / 6J fareleri aşılamak için ve doğal öldürücü (NK) hücreleri, doğal katil T (NKT) hücreler tarafından interferon-y (IFN-γ) tepkilerini ölçmek açıklamaktadır ve adaptif T sonrası enfeksiyon lenfosit. Bu protokol ayrıca patojen modifiye LD 50 dozu ile enfeksiyondan sonra farelerde hayatta kalma çalışmaları yürütmek açıklamaktadır.

Abstract

L. monocytogenes, insanlarda gıda kaynaklı bir hastalık nedeni olan gram pozitif bir bakteridir. Bu patojenin farelerin deneysel enfeksiyon hücre içi patojenlere karşı konak bağışıklık doğal ve kazanılmış bağışıklık hücreleri ve belirli sitokinler rolü son derece bilgilendirici olmuştur. L. monositogenleri öldürücü enfeksiyon sırasında doğal hücreler tarafından IFN-y üretimi, makrofajları ve patojen 1-3 erken harekete geçirilmesi için çok önemlidir. Buna ek olarak, uyarlanır bellek lenfositler tarafından IFN-γ üretimi yeniden enfeksiyona 4 üzerine doğal hücrelerinin aktivasyonunu kullanıma hazırlanması için çok önemlidir. L. böylece enfeksiyon modeli monocytogenes IFN-γ üretimini artırmak için tasarlanmış yeni tedaviler in vivo IFN-γ yanıtları üzerinde bir etkiye sahip ve bu tür bakteriyel açıklık artan ya da fare sağ kalımı iyileştirmek gibi üretken biyolojik etkilere sahip olup olmadığını araştırmak için harika bir araç olarak hizmet vermektedir itibarenenfeksiyon. L. monocytogenes EGD suşu ile C57BL / 6J fareler intraperitoneal enfeksiyonları yapmak için ve akış sitometrisi ile NK hücreleri, NKT hücreleri ve adaptif lenfosit IFN-γ üretimini ölçmek için nasıl temel protokol, aşağıda tarif edilmiştir. (1) büyür ve aşılama için bakteri hazırlanması (2) uç noktalara dalak ve karaciğer, ve (3) ölçüsü, hayvan yaşam bakteri yükünü ölçmek: Buna ek olarak, prosedür tarif edilmektedir. Örnek verileri, bu enfeksiyon modeli L. monocytogenes ve bu enfeksiyonun farelerin hayatta kalması için, IFN-γ yanıtları belirli maddelerin etkisini test etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için verilmiştir.

Introduction

IFN-γ, hücre içi patojenlere karşı bağışıklık aracılık edecek ve tümör büyümesini 5 kontrol edilmesi için önemli olan bir sitokindir. Bakteriyel direnç, bu sitokinin önemi IFN-γ sinyalleme yolağında mutasyonlar mikobakteriler ve Salmonella 6 ile enfeksiyona karşı oldukça hassas olan sahip insanlar gözlem belirgindir. Aynı şekilde, fare IFN-y ya da L 10,11 monocytogenes dahil olmak üzere, mikobakteriler 7-9 ve diğer hücre içi patojenlere dirençte, IFN-γ reseptör sergi kusurlar ya Layişmanya majör 12, Salmonella typhimurium 13, ve bazı virüsler 11 eksikliği olan. Mücadele patojenlere ek olarak, IFN-γ tümörlere 14 karşı konak savunma önemli bir rol oynar. IFN-y ve yüksek üretim enfeksiyon ya da kanser bağlamında faydalı olmasına rağmen, bu sitokinin uzun süreli üretim t bağlantılıdırObez olmayan diyabetik fare modelinde 18 sistemik otoimmün 15-17 geliştirilmesi ve Çeşidi hızlandırılmasına O I diyabet.

IFN-y önemli kaynaklar, NK hücreleri, NKT hücreleri, γδ T hücrelerini, T yardımcı-1 (Th1) hücreler ve sitotoksik T lenfositler (CTL), 5,19,20 içerir. IFN-γ ile doğal ve kazanılmış bağışıklığı hem de geliştirir: (1) yukarı-regüle (3) arttırıcı makrofaj, (2) antijen sunan hücrelerde ko-stimülatör moleküllerinin ekspresyonunu arttırarak, majör histo-uyumluluk kompleksi (MHC) sınıf I ve II ifadesini fagositoz ve pro-inflamatuar sitokinlerin üretimi ve mikrop öldürücü etkenler (örneğin, nitrik oksit ve reaktif oksijen türleri), (4) (5) (immünoglobülin antikor sınıfı anahtarlama teşvik Th1 efektör hücrelere naif CD4 + T hücrelerinin farklılaşmasını teşvik Ig) 2a ve farede IgG3 (), (6) kemokinlerin üretimini indükleyen I sitelerine immün hücreleri işenfection, ve (7), NK hücreleri ve CTL karşılıklarını 5,19 artar. Patojenler ve tümörlere yanıtta IFN-y hayati önemi göz önüne alındığında, rekombinant IFN-γ (19 gözden) çeşitli enfeksiyonlara ve habis için bir tedavi olarak test edilmiştir. IFN-y ya da Th1 teşvik sitokin interlökin-12 (IL-12) ve sistemik uygulama yan etkileri ile ilişkili olan ve dozla ilişkili toksisite 19,21 olduğu için, ancak, IFN-γ üretimi artırmak için alternatif stratejiler geliştirilmesinde ilgi vardır immün hücreleri. Yeni biyolojik ve küçük moleküllerin geliştirilmesi, bu tür maddeler, bir immün tepkisi sırasında IFN-γ üretimini artırmak olmadığını test etmek için in vivo tarama araçları gerektirir olup, bu, hayvan hayatta kalma arttıkça anlamlı bir biyolojik etki anlamına gelir.

Gram-pozitif bakteri L. monocytogenes ile farelerin deneysel enfeksiyon için bir enstrümantal model olmuşturhücre içi patojenlere 1,22 karşı konak-bağışıklık IFN-y rolünü deşifre. patojen intravenöz veya intraperitoneal (ip) ile farelerin enfeksiyonu günlerce sonrası 3 ila 4 oluşan dalak zirve bakteriyel yükleri ile ikamet makrofajlar ve hepatositler tarafından içselleştirilmiş hale dalak ve karaciğer, bakterilerin hızla yayılmasına yol açar enfeksiyon 1,3,22. NK hücreleri ile IFN-y üretimi, makrofaj aktivasyonu ve patojen 3 karşı erken direnç için de önemlidir, Bununla birlikte, yüksek enfeksiyon dozlardaki, IFN-y üretimi, aynı zamanda patojen açıklık 23 için zararlı olabilir. NKT hücreleri, aynı zamanda patojen 2,24 erken kontrolü sırasında dalak ve karaciğerdeki IFN-y kaynağı ve bu üretim, NK hücreleri 2 dahil olmak üzere başka hücre tipleri tarafından IFN-γ üretimini yükseltmek için gösterilmiştir. Parti Diğer yandan, uyum sağlayıcı T lenfositler, daha sonra etkili, CD8 + T hücrelerivasküler, patojen temizlenmesini aracılık yeniden enfeksiyon 1,4,22 karşı koruma sağlamak için önemlidir.

Bu enfeksiyon modeli (1 gözden) bir takım nedenlerden araştırmacılar için cazip olmuştur. İlk olarak, patojen enfeksiyonu yüksek tekrarlanabilir ve Th1 ve güçlü hücresel bağışıklık tepkisi oluşturur. İkinci olarak, öldürücü enfeksiyon sırasında, bakteri yükü kolayca ölçülebilir karaciğer ve dalakta konsantre edilir. Üçüncü olarak, patojen güvenle Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL2) koşullar altında ele alınabilir. Dördüncüsü, organizma ve bağışıklık tepkisi bu kapsamlı karakterize edilmiştir üretir olduğunu. Son olarak, mutant ve genetik olarak modifiye edilmiş suşların çeşitli kullanım için uygun olduğu geliştirilmiştir.

L. EGD suşu ile C57BL / 6J fareler aşılama için temel protokol, burada 25 monositogenlerinden olarak tanımlayan ve IFN ölçüm - γ yenidenNK, NKT ve adaptif lenfositler sonrası enfeksiyon tarafından leflimleri. Ayrıca açıklanan öldürücü enfeksiyon sonrası bakteri dalak yükü ve karaciğer ölçmek ve patojenin değiştirilmiş LD 50 dozu ile enfeksiyondan sonra hayatta kalma çalışmaları yürütmek için nasıl. Son olarak, Örnek veriler, bu protokol, L. monocytogenesin IFN-γ yanıtları ve fare hayatta kalma ile ilgili yeni tedavilerin etkisini taranması için kullanılabilir nasıl gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Güvenlik Bildirimi

Bu protokol, canlı L. monositogenleri farelerin enfeksiyonu açıklanmaktadır. patojen bağışıklığı olmayan eğitimli personel tarafından BSL2 şartlarında güvenle ele alınır. Bağışıklığı baskılanmış kişiler HIV ile enfekte olan veya immünsupresif tedavi ile tedavi gerektiren kronik koşulları hamile kadınlar, yaşlılar ve bireyler bulunmaktadır. Enfekte örnekleri işlerken Personel koruyucu laboratuvar önlüğü veya cüppe, eldiven, maske ve göz koruyucu don gerekir. Burada tarif edilen çalışma Üniversitesi Sağlık Ağı tarafından (UHN) Biyogüvenlik ofis yayınlanan bir sertifika (# 32876) altında BSL2 koşulları altında gerçekleştirilmiştir. enfekte olmuş fareler ya da herhangi bir kullanılmayan dokularından karkaslar çift torbalı ve biyolojik tehlike atık bertaraf edildi. Enfekte farelerin kafesleri de otoklav ile dekontamine edildi.

Etik Beyanı

Fareler muhafaza ve Quara enfekte edildintine UHN hayvan tesisleri içinde oda ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi tarafından belirlenen kurallara uygun olarak bakım için. fareler üzerinde tüm işlemler UHN hayvan bakım komitesi tarafından onaylandı hayvan kullanımı protokol # 3214 altında gerçekleştirilmiştir. Etik kaygılar nedeniyle, ölüm hayatta kalma çalışmaları için bir son nokta olarak kullanılmamıştır. L. burada bildirilen değiştirilmiş LD 50 dozunun enfeksiyonu, farelerin% 50'si,% 20, vücut ağırlığında kayıp ya da aşağıdaki klinik işaretlerin en az iki gösteren oluşan belirli bir son noktalar, ulaştığı doz olarak belirlenmiştir monocytogenes: uyuşukluk, karıştırdı kürk, kambur duruş, nefes darlığı, donuk veya batık gözler. Onlar UHN tesis kurallarına göre karbondioksite maruz yoluyla uç noktaları (CO 2) ulaştığında farelere ötenazi uygulandı.

Uzun vadeli depolama için Gliserin Stoklar 1. Hazırlık

NOT: Bu prosedür nasıl gliserol stokları açıklarL. monocytogenes EGD suşu orijinal gliserol stokundan hazırlanır. aerosoller üretmek potansiyeline sahip Adımlar sertifikalı biyogüvenlik kabini (BSC) içinde yapılmalıdır.

  1. bakteri üremesi için beyin kalp infüzyon (BHI) ağar tabak hazırlayın. Bu% 3.8 ilave için BHI et suyu ve% 1.5 (w / v) agar damıtılmış ikiye katlamak için (a / h) H2O (GKD 2 O). Otoklav sıvı. ağar, 50 ° C'ye soğuduktan sonra, bakteriyel petri çanaklarına sıvısının dağıtılması (25 ml / kutu) ve 1 saat BSC kuru levhalar (ortaya) sağlar.
    NOT: otoklav sonrası 50 ° C su banyosunda içine aktarın BHI agar önce plakaları dökme için katılaşma önlemek için. ters (üstte medya yüzü) kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın BHI plakaları.
  2. Sıvı BHI ortamı hazırlayın. Bunun için, GKD 2 O otoklavda BHI et suyu (ağ / hac)% 3.8 karıştırın.
  3. L. monocytogenes EGD suşu dondurulmuş gliserol stok kaldırmak -80 C ° dondurmaR ve oda sıcaklığına kadar eritilir.
  4. Bir BHI plakası bir bölümü boyunca ileri geri steril bir pipet çözülmüş gliserol stok ucu ve hemen çizgi ucu batırın. Bu birincil çizgi olduğunu.
  5. (Bu ikincil çizgi ise) 90 ° C plaka çevirin ve taze bir pipet kullanarak, ilk çizgi boyunca sürükleyin ve plaka sonraki ¼ kadar yayıldı. üçüncül çizgi yapmak için bir kez daha tekrarlayın.
  6. ters plaka getirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Tek tek tip koloniler çizgiler son setinde elde 16 ve 24 saat arasında görülebilir olmalıdır.
  7. steril havalandırılmış 50 ml tüp içine steril BHI et suyu 10 ml koyun. Steril bir pipet kullanarak plaka L. monocytogenes bir koloni seçin ve suyu aşılamak. Bir gecede ya da OD 600 = min (rpm) 225 devirlerde ayarları ile 1.0 kadar 37 ° C yörünge sallayarak inkübatör kültür inkübe.
    NOT: Cam veya tek plaSTIC Erlenmeyer kabı da bir bakteri için kullanılabilir. Bağımsız olarak kullanılan kabın türüne, havalandırılmış steril olduğunu ve kültür hacmi bakterilerin, uygun havalandırma sağlamak için, kabın toplam hacminin% 20 geçmemesi emin olun.
  8. 1: 1 oranında, bir gece boyunca, bakteriyel sıvı kültür steril% 100 gliserol karıştırılarak, gliserol stokları hazırlayın. depolama için -80 ° C dondurucu 2 mi kriyojenik şişeler (500 ul / tüp) ve transfer şişelere bakteriyel / gliserol karışımı dağıtın.
    NOT: boncuk stoğu yöntemleri de bakteri depolamak için gliserol stokları yerine kullanılabilir. Bu yöntem ile, gözenekli mikro-L. monocytogenes saf kültürü ile aşılanır ve -80 ° C'de saklanır. Her bir kordon gerektiğinde yeni bir kültürü inoküle etmede kullanılabilir. Daha fazla bilgi için malzemeler listesine bakın.

L. Büyüme Eğrisi 2. Belirlenmesi Günü Kültür monocytogenes NOT: Bu prosedür enfeksiyon çalışmaları için koloni oluşturan birim (CFU) tahmin etmek için kullanılan L. monocytogenes için büyüme eğrisi oluşturmak açıklamaktadır. aerosoller üretmek potansiyeline sahip tüm adımlar sertifikalı BSC içinde yapılmalıdır.

  1. Havalandırmalı bir 50 ml tüp içinde 10 ml BHI ortamı Adım 1.7'de elde gecelik kültüründen 100 ul alın ve (45 ° açı ile eğik 225 rpm) bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de büyür. Bir kontrol olarak, bir sigara İnoküle tüp kullanın.
  2. Saatlik aralıklarla kültür 0.5 ml numune alın (vs 1, 2, 3, 4, 5, 6 saat.). Bir plastik küvet içine BHI ortamı ile 1 (hac / hac): Her bir alikot 1 seyreltin. yukarı pipet ve aşağı karıştırın. Bir spektrometresi kullanılarak 600 nm (OD 600) de optik yoğunluk (OD) ölçün. OD 600 = 1 kadar bakteri kültürleme devam edin.
  3. Aynı zamanda, kültür, 100 ul numune almak ve steril bir 1.5 mi MICR 900 ul BHI ortamı seyreltinocentrifuge tüp (bu 10 -1 seyreltme) olduğunu. 5 dakika boyunca 6.000 xg'de bakterileri santrifüj ve süpernatant aspire.
  4. , BHI ortamı, 1 ml pelet yeniden 6000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje tabi tutarak, ardından süpernatan aspire iki bakteri yıkayın. 1 ml BHI medya pelletini. BHI ortamı (10 -2 -9 10) bu numunenin, bir 10 katlı bir seyreltme serisi hazırlanır. Ayrı BHI agar plakları üzerine her seyreltici 100 ul yayıldı. Bir inkübatör içerisinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  5. 300 koloniler - Ertesi gün, 30 ila sahip plakaları almak. gerisini atın. Bu plakalar üzerindeki koloniler sayın. Tablo 1 OD 600 = 0.84 alınan bir alikot elde sayımların bir örneğini göstermektedir. Bu örnekte, plakaların bir (örneğin, 10 -6 seyreltme) 30 arasında koloni sayımları - 300 CFU / ml'lik hesaplanması için kullanılmıştır.
    NOT: Daha plakalar300'den koloniler aşırı kalabalık bakteri üremesini engelleyebilir beri kullanılan ve aynı zamanda zor ayırt ve bireysel koloniler numaralandırmak için yapar değildir. seyreltme tekniği veya kirletici mevcudiyetinde küçük hatalar aralığının alt ucunda sayımların hassas üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir, çünkü sayısı <30 plakaları da kullanılmamaktadır.
  6. kaplama hacimce koloni sayısını bölün ve sonra belirli bir seyreltme için CFU / ml değeri elde etmek için seyreltme faktörü ile çarpın. Tablo 1 'de örnekte, 10 -6 seyreltide sayısı 70 Böl seyreltilmiş kültür için CFU / mL değerini elde etmek için 0.1 mL, bu değer. Sonra sulandırılmamış kültür (7.0 x 10 8) CFU / ml değeri elde etmek için seyreltme faktörü (10 6) bu değeri çarpın.
  7. Büyüme 26 logaritmik fazı teşhis etmek için H zaman karşılık OD 600 (y-ekseni) (x ekseni) çizilir.
    NOT: Bu büyüme CurvBelirli bir OD okuma büyüdü, e günlük kültür CFU / ml bir tahmin sağlar. Günlük kültürlerin yetiştirilmesi için bir hedef OD 600 olarak kullanılabilen büyüme logaritmik fazı olan bir OD 600 okuma seçin. Şimdi aşı hazırlanması için bir kültür CFU tahmin etmek için de kullanılabilir Bu veriler (Prosedür 3).

L. monocytogenes ile Deneysel Enfeksiyonu için İnokulum 3. hazırlanması

NOT: Bu işlem, bir gecelik kültürden başlatıldı günde kültüründen Bulaşıcı inokulum hazırlanmasını anlatır (Prosedür 2'de hazırlanan). Aksi belirtilmedikçe, bu adımların hepsi BSC yapılmaktadır.

  1. farelerin ve çalışma deneysel tasarım sayısına göre enfeksiyonu için gerekli CFU sayısını hesaplayın. steril havalandırmalı bir Erlenmeyer şişesi veya kültür tüpüne BHI ortamı, uygun bir hacim.
    NOT: Bakteri p CFUrepared gerçekleştirilen deney tipine bağlı olacaktır. Enfeksiyon sırasında NK ve NKT hücresi yanıtlarını eğitim için, her bir fare bakteri 10 5 CFU (Prosedür 6) ile aşılanır. Bakteriyel yük enfeksiyondan için uyarlayıcı T hücresi tepkilerini okuyan veya ölçüm için, her bir fare bakteri 2 x 10 4 CFU (Prosedür 8) ile aşılanır. Uç noktalara hayatta kalma eğitimi, her bir fare (erkeklerde 10 5 CFU ve kadınlar için 1.5 x 10 5 CFU, Prosedür 9 see) patojenin LD 50 dozu ile aşılanmıştır.
  2. gecelik kültüründen 100 ul ile aşılanmış BHI ortamı içeren tüp inoküle. Hedef OD 600 kadar 37 ° C orbital çalkalama inkübatöründe (225 rpm) inkübe kültür ulaşılır. steril bir santrifüj tüpüne kültür aktarın.
  3. Bir santrifüj kullanılarak 6000 x g'de 5 dakika boyunca bir pelet halinde Santrifüj bakteri. çamaşır suyu içeren bir tuzak şişeye bağlı bir vakum kullanarak süpernatant aspire.
  4. Yıkama arasında (6.000 x g'de 5 dakika) santrifüj, 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez pelet.
  5. İkinci yıkama aspire ve 200 ul hacim içinde, her farenin ilgi CFU sunmak için 1x PBS içinde uygun konsantrasyonda bakteri seyreltin.
    NOT: laboratuvar cam lipopolisakkaritler gibi immünolojik kirletici tanıtmak beri, yıkama bakteri ve inokulum hazırlanması için steril 1x PBS ticari kaynağı kullanmak en iyisidir.

L. monocytogenes ile Fare 4. Deneysel İnfeksiyon

Not: Bu yordam Prosedür 3 ve nasıl inokulum teslim CFU doğrulamak için hazırlanan inokulum ile fareleri enfekte açıklamaktadır. farelerin ve enjeksiyonlar taşınması bir BSC yapılmaktadır.

  1. denemeniz için erkek veya dişi C57BL / 6J farelerin yeterli sayıda sipariş edin. Ayrıca fareler olarak bulaşmamış kontrolleri hizmet emrediyorum.
  2. fareler izinbakteriyel aşılama öncesinde 1 hafta iklime alıştırmak.
    NOT: Hayvanların taşınması ile ilgili stres stres hormonu üretimi ve lenfopeni 27,28 geçici bir artış tetikleyebilir olmasıdır.
  3. Aşılama gününde, her bir fare için bir temel vücut ağırlığı elde edilir ve defterin olarak kaydedin.
  4. BSC, yukarı ve bakteriler eşit olarak dağıtılır sağlamak ve daha sonra bir 25 G iğne ile donatılmış 1 ml güvenlik mühendisliği enjektöre inokulum 200 ul almak için steril bir pipet kullanarak aşağı bakteri süspansiyonu karıştırın.
  5. Hazırlanan inokulum 200 ul fare ip enjekte (örneğin, NK hücre enfeksiyonu için 10 5 CFU, Prosedür 6). Bu işlem için, farenin omuzlarına gevşek deriyi kapma daha az dominant elin ile fareler Scruff. Fare iyi ölçülü olmasını sağlamak sonra, m sadece yanal, karın alt kadranda fare enjekteidline mesane önlemek için.
  6. Bir biyolojik tehlike kesici kapta iğne ve şırınga imha edin.
  7. Tüm fareler enjekte kadar 4.6 - Tekrar 4.3 adımları. 1x PBS ile benzer adımları Davranış fareler (non-enfekte kontrol) enjekte edilir.
    NOT: CFU büyüme eğrisi dayanan bir tahmindir olduğundan, inokulum gerçek CFU kontrol etmek iyi bir uygulamadır. Eğer sayılabilir koloniler neden bekliyoruz (10 katlı bir seyreltme serisi kullanılarak) hazırlanmış aşı 4 farklı seyreltme - Bunun için, 3 hazırlayın. Bir BHI agar plakası üzerine her çözücünün 100 ul yayıldı ve bir gece boyunca 37 ° C enkübe edilir. kolonileri sayın ve işlem 2'de tarif edildiği şekilde, gerçek CFU / ml hesaplanır.

Bağışıklık Çalışmaları 5. hazırlanması Isı ile öldürülmüş L. monocytogenes

NOT: aerosoller BSC içinde gerçekleştirilir üretmek potansiyeline sahip tüm adımlar.

  1. OD 600 değerleri a kadar günlük kültür büyütünlogaritmik faz içinde olduğunu ulaştı yeniden. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine kültür koyun.
  2. bakterileri öldürmek için 1 saat için bir su banyosu içinde 70 ° C olarak inkübe edin.
  3. Adımlar 3.3 ve 3.4 gibi 1x PBS ile iki kez bakteri yıkayın. Cenin buzağı serumu (FCS) ihtiva eden steril bir tam RPMI ortamında yeniden süspanse 4 x 10 6 / ml'lik bir konsantrasyonda (tarifi için ek dosya 1 e bakınız). Kısım -80 ° C'de 2 ml steril kriyojenik flakon ve mağaza içine bakteri öldürdü.
  4. BHI agar plakları üzerine ısı ile öldürülmüş bakterilerin hazırlanması 100 ul yayılması ve 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilerek bakteri ölümünün teyit edin.
    NOT: BHI agar plaka üzerinde büyüyen herhangi koloniler varsa bu ısı ile öldürülmüş bakteriler Prosedür 8'de kültüründe lenfositleri uyararak için hazır olmalıdır, ısı öldürme işlemi tekrarlayın.

Enfeksiyon sırasında NK ve NKT hücrelerinin IFN-γ Cevaplarının 6. Ölçüm

Not: Bu yordam L. monocytogenes 10 5 CFU ile enfeksiyondan sonra 24 saat sonra farelerde NK ve NKT hücreleri tarafından IFN-γ tepkilerini ölçmek açıklamaktadır. Dalak 24 NK ve NKT hücreleri tarafından sağlam bir IFN-γ tepkileri indükler, bu doz kullanılır. BSC tüm adımları yürütün. Hücre canlılığını korumak mümkün olduğunca buz üzerinde hücreleri tutmak ve buz tamponlar kullanmanıza yardımcı olmak için.

  1. L. monocytogenes 10 5 CFU ile prosedür 4'te tarif edildiği gibi fare inoküle. Aynı zamanda, enfekte olmayan kontrol fareleri 1x PBS eşit hacimde ip enjekte edilir.
  2. Kurumsal kurallarına göre CO 2 inhalasyon 24 saat sonrası aşılamadan fareler Euthanize.
  3. onun sağ tarafında her fare yalan ve bir sıkmak şişe kullanılarak% 70 etanol ile cilt aşağı ıslak.
  4. aseptik veya steril forseps ve sert kesimli makas kullanarak, sadece göğüs kafesinin alt altında cilt insizyon.
  5. aşağı sprey% 70 etanol ile ortaya kas tabakası. Dalak kas tabakası (Şekil 1'de açık ok başı) altında görünür olmalıdır.
  6. aseptik veya steril forseps ve ince makas kullanarak, dalak ortaya çıkarmak için kas tabakası insizyon. Yavaşça forseps ile dalak kapmak ve bağ dokusu çevredeki uzak dalak kesmek için ince makas kullanın.
  7. Steril 1x PBS içeren 15 ml konik bir tüp içinde dalak yerleştirin.
  8. Steril 1x PBS ile steril petri kaplarına Yarım doldurun. steril 3 ml şırınga düz ucunu kullanarak petri içine 70 mikron naylon hücre süzgecinden dalak ayırmak.
  9. steril 10 ml serolojik pipet kullanarak temiz, steril 15 ml konik tüp içine splenosit süspansiyon aktarın.
  10. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 335 x g'de santrifüj örnekleri.
  11. çamaşır suyu içeren bir tuzak balona süpernatant aspire. bir parmak ile tüp hafifçe vurarak veya alt tüp sürükleyerek hücre pelet gevşetinileri geri bir oluklu yüzeyi boyunca (örneğin, hava akış BSC havalandırma).
  12. Amonyum Klorür-Potasyum (ACK) lizis tamponu 1.5 ml ekleyerek Lyse kırmızı kan hücreleri, her dalak (tarifi için yazmak File 1'e bakınız). Tam 1 dakika ve 15 saniye sonra, hücre parçalama durdurmak için 1x PBS ile tüp doldurun.
  13. Santrifüj hücreleri olarak adım 6.10'da nitelendirdi. Süpernatant aspire ve (FACS) tampon (steril 1 x PBS,% 2 FCS ihtiva eden) ayırma floresan aktive hücre, 10 ml hücre pelletini.
  14. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Bunun için, sayım için hücre süspansiyonu iki alikotları alır. (GKD 2 O% 0.4 tripan mavi bir çözelti seyreltilmesi% 0.04), tripan mavisi, eşit hacimde her hücre süspansiyonu 15 ul ekle. Yük hemasitometre bölmesine her hücre / Trypan mavi süspansiyon 15 ul (yani, üst bölmede bir alt bölme bir).
  15. Bir mikroskop kullanarak, tüm olmayan mavi hücreleri saymakHer odasında merkezi ızgara beş büyük kareler (Şekil 2). Bu sayı alın ve 10 6 / ml hücre sayısını elde etmek için 10 bölün. Şekil 2'de örnek olarak, sayısı 5 kareler 215 hücre olduğu; Bu nedenle, hücre konsantrasyonu 21.5 x 10 6 / ml'dir. İki örnekten elde edilen hücre konsantrasyonları ortalama.
  16. Boyama akış sitometrisi için 96 gözlü yuvarlak tabanlı plakanın üzerindeki çukurların / leke başına tohum 1 x 10 6 hücre. Ayrıca lekesiz ve floresan eksi bir (FMO) kontrolleri için hücreleri tohum emin olun. Tablo 2'de boyama panelinin sitometri tavsiye akışını bakın.
    Not: Aşağıdaki adımları için, buz üzerinde ya da 4 ° C 'de hücreler tutmak ve fluorochromes mevcut olduğunda folyo ile ışıktan hücreleri korumak için tavsiye edilir. Çok kanallı bir pipet işlenmesini hızlandırmak için 96 oyuklu boyama plakalara sıvıların dağıtılması için kullanılabilir. zaman hücre pelet rahatsız özen gösterinsantrifüj plakadan süpernatant aspire. santrifüj plaka adaptörleri ile donatılmış değilse Boyama ayrıca FACS tüpler yapılabilir. Bu noktada tüm santrifüj adımlar 4 ° C'de 5 dakika boyunca 456 xg'de yapılır.
  17. plaka santrifüj ve ardından FACS tamponu ile iki kez yıkama hücreleri. Bir yıkama, her bir FACS tampon 200 ul ekleyerek plaka santrifüj ve ardından süpernatan aspire yapılır.
  18. 50 ul / oyuk anti-fare CD16 / CD32 (saflaştırılmıştır Fc Block) (0.5 ug) ihtiva eden FACS tampon eklenerek bloke aşamasını gerçekleştirir. 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe hücreleri. yukarıda tarif edildiği gibi 1 x PBS içinde bir kez hücreler yıkanır.
  19. hücrelere: 100 ul canlılığı boya (1x PBS içinde 1.000 sabitlenebilir canlılığı boya 1 seyreltilmiş) ekleyin. 30 dakika boyunca (buzdolabında) karanlıkta 4 ° C'de Leke hücreleri. Yukarıda tarif edildiği gibi, FACS tamponu içerisinde hücreler iki kez yıkayın.
  20. İkinci yıkamadan sonra, ilgili kuyuları göre t 100 hücre yüzey antikorların ul veya tetramers eklemekO lekeleme paneli Tablo 2'de tarif edilen. 30 dakika boyunca (buzdolabında) karanlıkta 4 ° C'de Leke hücreleri. Şu anda, aynı zamanda tek pozitif ve FMO kontrol boyanması için antikor ekleyin.
    NOT: Tek bir pozitif kontrol ile ilgili olarak, bu panelde kullanılan antikorlar ile lekelendi CD4 antikoru veya ticari dengeleme boncuk çeşitli florokrom alternatifler ile boyanır ya da kullanımı dalak önerilir. Bundan önce boyama işlemi yürütülmesi için, her FACS antikorlar boyama için uygun konsantrasyonlarını belirlemek için test çalışmalarının titre edilmelidir.
  21. Yukarıda tarif edildiği gibi, FACS tamponu içerisinde hücreler iki kez yıkanır ve daha sonra% 4 paraformaldehid (GKD 2 O içinde seyreltilmiş% 16 paraformaldehit stok) 50 ul bunları yeniden süspanse edildi ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edilerek hücrelerin tespit. DİKKAT: paraformaldehit toksik ve sadece davlumbaz ele alınmalıdır.
  22. iki kez hücre yıkayınn FACS tamponu arasında santrifüj. FACS tampon hücrelerin tekrar. en fazla üç gün boyunca ışıktan koruyarak buzdolabında sonraki adım ya da depolayan hücreler devam edin.
  23. Santrifüj hücreleri, aralarında santrifüj Süpernatantı ve 1X Permeabilization / Yıkama Tamponu (Perm / yıkama tamponu) 150 ul hücreler iki kez yıkayın. 9 (h / h) ile kombine 2 O.: Perm / Wash Buffer 1 seyreltilmesi ile 10x stoklar hazırlanır
  24. İkinci yıkamadan sonra, Perm / Wash Buffer 150 ul hücreleri tekrar süspansiyon ve karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
  25. Santrifüj hücreleri tekrar ve daha sonra süpernatant aspire. Anti-IFN-y ihtiva eden ve karanlıkta 4 ° C'de 1 saat boyunca inkübe 1x Perm / Wash tamponu 50 ul içinde süspanse hücreleri.
  26. arasında santrifüj, 1x Perm / Wash tamponu ile hücreler iki kez yıkanır. FACS tampon 250 ul hücrelerin tekrar ve daha sonra FACS tüpler hücreleri aktarmak.
  27. bir akış cytomet kullanarak satın alma akım sitometri geçiner bu Tablo 2'de 29 anlatıldığı boyama panelinde kullanılan fluorochromes ayrımcılık için uygun bir lazer yapılandırma ve filtre kümesi vardır. numune başına en az 200.000 olayları ve tazminat kontrolleri için 10.000 olayları toplayın.
  28. Tazminat matris uygulayın ve akım sitometri analizi yazılımı 30 kullanarak verileri analiz edin.

Tepe Enfeksiyon Seferde Dalak ve Karaciğer Bakteriyel Yük 7. ölçümü

NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları BSC dahilinde gerçekleştirilmektedir.

  1. Farenin prosedür 4'te tarif edilen prosedürler kullanılarak patojen 2 x 10 4 CFU IP inoküle.
  2. 3. gün sonrası enfeksiyon üzerine, bir 1.5 mL steril mikrosantrifüj tüpü hazırlayın her biri 1 x PBS içinde buz soğukluğunda steril% 0.1 Triton X-100, 500 ul 0,2-2 mm asitle yıkanmış steril cam boncuk - 1.5 0.3 g. Her tüp tartılır.
    NOT: Cam boncuk asit incu tarafından yıkanır1 saat boyunca manyetik bir karıştırıcı ile bir çanak içinde% 10 asetik asit içinde sama. Bu boncuklar daha sonra yoğun, hava ile kurutulmuş olan asiti çıkarmak için GKD H2O ile yıkandı ve daha sonra kullanımdan önce sterilize edildi.
  3. CO 2 maruz kalma fareler Euthanize.
  4. organların diseksiyon için, bir diseksiyon gemide sırtında hayvan yatıyordu ve 25 G iğneler kullanılarak kuruluna fare uzuvlarını pin. % 70 etanol ile ıslatma cildi dezenfekte.
  5. Steril sert kesim makas kullanarak, her diz doğru ve her dirsek doğru orta göğüs orta kasık sonra orta göğüs kasık deri bir orta hat kesi yapmak ve. Teşrih künt, 25 G iğneler kullanılarak açmak iğneleme, cildi geri yansıtır ve.
  6. Steril ince makas periton duvarında bir orta hat kesi yapmak kullanarak daha sonra% 70 etanol ile ıslatma ve kas tabakası dezenfekte edin. forseps ile kılıç şeklinde sürecini tut. Ardından, aynı ince makas kullanarak, kılıç şeklinde proce periton duvar kesimler yapmakdiyaframın hemen altında, göğüs kafesine aşağıdaki yanal her iki tarafta ss, karaciğer ortaya çıkarmak için.
  7. Steril makas kullanılarak karaciğer ~ 100 mg parça (her fare için, aynı lob kullanın) kesin ve önceden tartılmış bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine koyun.
  8. nazikçe dalak görselleştirmek için periton boşluğuna sol tarafındaki organları bir kenara itmek için forseps kullanabilir. Yavaşça forseps bir çift ile dalak kapmak ve çevresindeki bağ dokusu uzak kesim tarafından periton boşluğundan bırakın.
  9. boncuklar içeren önceden tartılmış bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde dalak yerleştirin. Ulaştırma sızdırmaz bir kap içeren buz laboratuvara dokular. mg doku ağırlıklarını belirlemek için organları içeren tüpler yeniden tartın.
  10. 30 hertz frekans 3 dakika boyunca bir boncuk değirmeni homojenleştirici kullanılarak tüp çalkalanarak dokular homojenize edilir.
    NOT: boncuk değirmeni yöntemi homojenizasyon için tercih edilir o işlenme müsait olduğuörneklerin çok sayıda şarkı ve daha az karışıklık ve patojene potansiyel riski oluşturur. Ancak, otomatik veya manuel homojenizatörler cam doku homojenizatörler bir alternatif olarak kullanılabilir 2 ml otoklava.
  11. (Seyreltilmemiş 10 -7 arasında) arasında değişen, 1 x PBS içinde% 0.1 Triton-X-100'de homojenatlarında 10 katlı bir seyreltme serisi hazırlanır.
  12. steril dağıtıcısı kullanarak (iki nüsha) bir BHI agar plaka üzerine her seyreltilmiş Homojenat 100 ul yayıldı. 37 ° C inkübatör transfer plakaları ve gece boyunca inkübe edilir.
  13. geri kalanını atmak, 30 ve 300 koloni / plaka arasında ihtiva plakaları tutun. Her plaka üzerinde koloniler sayın ve yinelenen formalar için kolonilerin ortalama sayısını belirlemek.
  14. şu denkleme göre CFU / mg hesaplayın:
    Homojenize doku mg ağırlığına bölünür hazırlanan homojenat ml çarpılır Homojenat CFU / mg = CFU / ml.
    Not: 30 col Örneğin, ortalamaonies gibi olacaktır hesaplamalar aşağıdaki 0.5 ml homojenleştirilmiştir karaciğer 120 mg birim hazırlanan 10 -2 seyreltildi homojenat 100 ul kaplama sonrası sayılmıştır:
    CFU / ml = 30 koloni x 100 (seyreltme faktörü) / 0.1 ml (hacim yayılmış) = 30.000 CFU / ml.
    CFU / mg = 30,000 CFU / ml x 0.5 ml Homojenat / 120 mg doku = 125 CFU / mg.

8. CD4 + ve CD8 IFN-γ Yanıtları üzerinde L. monocytogenes Etkileri + Hücreler

Not: (1) akış: Bu işlem iki yöntem kullanılarak adaptif bağışıklık yanıtı (~ 7 gün sonrası enfeksiyon) zirve zaman hasat dalak CD4 + ve CD8 + efektör T hücreleri tarafından IFN-γ üretimini ölçmek açıklamaktadır sitometrisi hücre içi sitokin boyama ile CD4 + ve CD8 + hücreleri ile IFN-y ölçümü için, ve (2) ELISA splenositler (tüm T hücrelerini içerir) tarafından üretilen toplam IFN-γ düzeylerini ölçmek için. prosedürlerBSC dahilinde gerçekleştirilmektedir.

  1. Prosedür 4'e de tanımlanan prosedürler kullanılarak patojen 2 x 10 4 CFU ip enjekte fareler Infect.
  2. Gün 7 sonrası enfeksiyon, kurumsal kurallarına göre CO 2 inhalasyon fareler euthanize.
  3. Steril 1x PBS içeren 15 ml'lik konik bir tüp içinde dalak (yukarıda tarif edildiği gibi) ve yer teşrih. sızdırmaz bir kap içeren buz laboratuvara tüpleri taşıyın.
  4. , Tek bir hücre süspansiyonu içine dalak proses aşaması 6'da tarif edildiği gibi, kırmızı kan hücrelerinin lize ve daha sonra% 10 FCS içeren tam RPMI ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
  5. IFN-γ yanıtlarının ölçümü için ayarlayın kültürleri. Bu dağıtma hücreleri için (1 4 x 10 6 ml / oyuk) ile birlikte 24 oyuklu plakalar ve eşit sayıda (4 x 10 6 ya da 1 ml / oyuk) çözülmüş ısı ile öldürülmüş L. monositogenleri (Prosedür 5'te hazırlanan) . 37 hücreleri aktarınC inkübatör °.
  6. inkübasyondan 20 saat sonra, gözlere, protein taşınma inhibitörünün 0.66 ul / ml ilave edilir ve inkubasyon devam edin.
  7. Dört saat sonra, ticari bir enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) kiti kullanılarak 31, IFN-γ seviyelerinin daha ölçümü için transfer BSC plaka ve (-80 ° C) kültür yüzey ve dondurularak 500 ul toplar. Daha sonra steril bir 15 ml tüp içine hücreleri toplamak. 1x PBS ile kuyu yıkayın ve toplanan hücreler ile birlikte bu yıkama havuz.
  8. Tablo 3'te tarif edilen boyama panelini kullanarak hariç, Yöntem 6'da tarif edildiği gibi, CD4 + ve CD8 + hücreleri üzerinde IFN-y için hücre yüzeyi lekelenmesi ve hücre içi boyama yapılması. Edinimi sitometresi (200.000 olayları / numune toplama) akış ve analiz yazılımı 30 flow sitometri kullanarak veri 29 analiz geçin.

9. L. monocytogenes Infec sonra endpointi Fare Survival Ölçmeyon

Not: Bu yordam patojenin modifiye LD 50 dozu ile uç noktalara fare sağkalım üzerine bir ajanın etkisi sonrası enfeksiyon açıklanır. Bütün bu işlemler hayvan barınağında BSC yapılmaktadır.

  1. Prosedür 4'de tarif edildiği gibi farenin L. monocytogenes değiştirilmiş LD 50 dozu ile ip Enjekte Bu (kadınlarda), 10 5 CFU ya da (bir kadın için) 1.5 x 10 5 CFU 31 olduğu tespit edildi.
  2. günde iki kez klinik bulguları fareler izleyin ve bir laboratuar dizüstü bu belirti ve hayvan vücut ağırlıklarını kaydeder. onlar% 20 vücut ağırlığı veya listeriosis iki klinik bulgular kaybı (uyuşukluk, karıştırdı kürk, kambur duruş, yorucu nefes, donuk veya batık gözler) gösterirseniz fareler Euthanize.
  3. 14 gün sonra, CO2 inhalasyonu ile farelerin hayatta euthanize.
  4. Zaman 32 karşı her grubun yüzde hayatta çizerek veri Kaplan-Meier araziler hazırlayın.
    (Şekil 7) ile gerçekleşir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 3 patojenin 10 5 CFU ile 24 saat sonrası enfeksiyon dalak NK ve NKT hücrelerinin IFN-y boyanması sitometri bazı tipik akışı sunar. Bu şekil, aynı zamanda, Tablo 2'de tarif edilen boyama paneli geçit stratejisini göstermektedir. Şekil 4, 10 5 CFU L. monositogenleri enfekte erkek fare PPARa antagonisti IS001 ya da vasıta ile tedavi edilen tek bir deneyde elde edilen bazı temsili verileri göstermektedir, ve daha sonra 24 saat sonra NK ve NKT hücreleri IFN-y için incelenmiştir . Bu rakam IS001 ile tedavi patojenle enfeksiyondan sonra IFN-γ NKT hücreleri tarafından yanıtları, ancak NK hücrelerini artırdığını göstermektedir. Şekil 5, ısı ile öldürülmüş PA ile yeniden uyarma ex vivo sonra 7 gün sonrası enfeksiyon dalak CD4 + ve CD8 + T hücrelerinde IFN-y için örnek boyamasını göstermektedirthogen. Bu şekil, aynı zamanda, Tablo 3'te tarif edilen boyama paneli geçit stratejisini gösterir. Şekil 6, Enfeksiyondan 7 gün sonra, erkek fare PPARa antagonisti IS001 ya da vasıta ile günlük olarak tedavi edilmiş bir deneyde elde edilen L. monositogenleri bir öldürücü olmayan bir dozu ile enfekte edildi ve analiz edildi Örnek verileri gösterir. Bu deney, IS001 ile tedavi, CD4 + ve CD8 + lenfositleri, hem IFN-γ tepkileri gelişmiş olduğunu göstermektedir. Şekil 7 patojenin modifiye LD 50 dozu ile enfeksiyondan sonra uç noktalara fare sağkalım üzerine PPARa antagonisti IS001 etkisi araştırılmıştır bir çalışmada temsilcisi verileri gösterir. Çizilen zaman sonrası enfeksiyona karşı farelerin yüzde hayatta kalma olduğunu. Bu rakam IS001 ile tedavi uç noktalarının bir erkek farelerin hayatta kalma arttığını göstermektedir. Bu veriler birlikte, bu model araştırmak için nasıl uygulanabileceğini göstermektedirBu immün değişiklikler enfeksiyondan hayvan hayatta kalma nasıl etkilediğini IFN-γ yanıtları in vivo ve yeni ilaçlar veya tedavilerin etkileri keşfetmek için.

Şekil 1
Enfekte farelerden dalakları Diseksiyon Şekil 1.. Bu fotoğraf serisi ölü fare dalak incelemek için nasıl gösterir. (a) sağ tarafta fare Lie ve% 70 etanol ile cilt aşağı sprey. (b) aseptik veya steril forseps ve sert kesimli makas kullanarak, sadece göğüs kafesinin alt altında cilt insizyon. (c)% 70 etanol ile maruz kas tabakası aşağı püskürtün. dalak kas tabakası (açık ok başı) altında görünür olmalıdır. aseptik veya steril forseps ve ince makas kullanarak (d), dalak ortaya çıkarmak için kas tabakası insizyon. (e) yavaşça forseps ve u dalak kapmakse ince makas bağ dokusunu çevreleyen uzak dalak kesmek için. (f) steril 1x PBS içeren 15 ml konik bir tüp içinde dalak yerleştirin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil hemasitometre kullanarak 2. Sayma Splenositler. (a) hemasitometre merkezi ızgara gösterir. (b) (her biri 16 küçük kareler içeren) 25 büyük kareler içeren merkezi bir ızgara büyütülmüş bir görünümünü göstermektedir. sayımı için kullanılan beş büyük kareler gri (4 köşe kareler artı merkezi ızgara merkez meydanında) vurgulanır. (c) büyük gri kareler birinin büyütülmüş bir görünümünü göstermektedir. 10 6 / ml, ilk sayısında hücre hacmi belirlemek içinbeş büyük gri kareler içindeki tüm canlı hücreler. Gösterilen örnekte, bu sayı 215. sayma, yalnızca ızgarasının sağındaki ve altındaki çift çizgiler dokunmadan olanlar dahil net (non-mavi) tüm hücreleri, saymak emin olmaktır. ızgara ve solunda üstünde çift çizgiler dokunmadan hücreleri saymayın. Toplam beş kare sayısını alın ve 10 6 / ml hücre sayısını elde etmek için 10 bölün. Örnek olarak, 10 bölü 215 21.5 x 10 6 hücre / ml 'dir. tripan mavisi 1: Bu hesaplamalar sadece vurgulanan gibi büyük kareler 5 sayım eğer çalışmak ve hücreler 1 sulandırmak unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
IFN-Tespiti için Şekil 3. Ayırıcı StratejisiNK ve NKT hücreleri y üretimi. SSC-A arsa ile FSC-A lenfositlerin ilk kapısı. Sonra FSC-H / FSC-A arsa üzerinde diyagonal üzerinde olan bu olaylar üzerine kapısı. Bunlar mayoları vardır. Sonra canlı (AmCyan -) üzerine kapı ve CD8 - hücreler. Sonra TCRβ karşı tetramer boyama arsa. NKT hücreleri çift pozitif nüfus içinde ve NK hücreleri çift negatif nüfus içindedir. çift ​​pozitif hücreler üzerinde Kapısı ve FSC karşı komplo NKp46. NKT hücreleri NKp46 negatif nüfus üzerinde Kapısı (bu kapı NK hücresi arsa iki nüfus bölünme noktası bularak ayarlanabilir). TCRβ - - NKp46 + popülasyonu NK hücreleri tetramer vardır. NK ve NKT hücre kapıları içinde, PE kanalında IFN-γ + hücreler FMO denetimine dayalı bir kapı ayarladıktan sonra tespit edilir. lütfen tıklayınBurada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Şekil 4,
Şekil 4. Temsilcisi Veri 24 saat sonrası enfeksiyon IFN-y + NK ve NKT Hücrelerinin Frekanslar için elde edildi. Bu deneyde, erkek C57BL / 6J fareleri (n = 3-4 / grup), 10 5 CFU L. monositogenleri enfekte IP olduğunu ya da un ile enfekte kalmıştı. Fareler ayrıca aşılama ve daha sonra 12 saat arasında, aynı zamanda, ilaç IS001 veya taşıyıcı (% 0.5 karboksimetil selüloz) uygulanmıştır. Yirmi dört saat aşılamadan sonra, fareler öldürüldü ve dalakları çıkarıldı ve ayrı ayrı işlenmiş ve akış sitometrisi için boyandı. IFN-y + NK hücreleri SEM frekans ortalama ± gösterilir: (a) ya da NKT hücresi kapıları, (b) bir araç ya da ilaç IS001 ile muamele edildikten sonra enfekte edilmemiş ve enfekte edilmiş farelerin. * belirtiniziki kuyruklu t-testi ile araç kontrolünden sa fark (P <0.05). Veri İmmünoloji Dergisi (hacim 195, s. 5189-5202, 2015) izniyle 31 re-yazdırılır. Telif Hakkı 2015 immünolojistler Amerikan Derneği, Inc. , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5. CD4 ve CD8 hücrelerinde IFN-γ Üretiminin Belirlenmesi için Yolluk Stratejisi. SSC-A araziler tarafından FSC-A lenfositlerin ilk kapısı. Sonra FSC-H / FSC-A arsa üzerinde diyagonal üzerinde olan bu olaylar üzerine kapısı. Bunlar mayoları vardır. Bu kapının içinde, canlı (AmCyan -) üzerinde kapı CD45 + hücreler. Sonra CD8 + veya CD4 + ya popülasyonlar üzerinde geçit. Her kapı içinde, IFN-γ +PE kanal hücreleri FMO kontrol boyama karşılaştırarak belirlenmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6. Örnek veri L. monositogenleri 7 gün Enfeksiyondan (EGD suşu) de IFN-y + CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin frekanslar için, elde edildi. Bu deneyde, erkek C57BL / 6J fareler, 2 x 10 4 CFU L. monocytogenes (n = 7 / grup) IP olarak enfekte edilmiştir ve enfekte edilmemiş (n = 3 / grup), kalmıştı. Fareler ayrıca aşılama gününde ilaç IS001 veya taşıyıcı (% 0.5 karboksimetil selüloz), günde iki kez başlangıç ​​tatbik edilmiştir. Yedi gün sonra fareler öldürüldü ve dalakları çıkarıldı ve ayrı ayrı için işlendihücre kültürü. Splenosit mononükleer hücreler kültür son 4 saat ilave önleyici protein taşıma ısı ile öldürülmüş L. monositogenleri 24 saat boyunca uyarıldı. Hücreler daha sonra akım sitometrisi için boyandı. IFN-y, bir taşıyıcı (% 0.5 karboksimetil selüloz) ile muamele edildikten sonra CD4 + (a) veya enfekte olmamış ya da enfekte olmuş farelerde CD8 + hücresi kapıları (b) + hücrelerinin ya da ilaç IS001 SEM frekans ortalama ± gösterilmiştir. * Iki kuyruklu t testi ile tespit edildiği üzere, araç kontrol muadili bir fark (P <0.05) göstermektedir. Veri İmmünoloji Dergisi (hacim 195, s. 5189-5202, 2015) .Copyright 2015 immünolojistler Amerikan Derneği izni ile 31 den yeniden basılmış, Inc. , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


Şekil 7. Temsilcisi Veri L. monocytogenes ile Erkek C57BL / 6J Fareler (EGD suşu) ve Enfeksiyon sonra endpointi Fare Survival bir PPARa rakip 1S001 Etkisini karşılaştırıldığında bir deneyde sırasında elde edildi. Bu deneyde, erkek C57BL / 6J farelerine (N = 10 fare / grup), L. monocytogenes patojenin değiştirilmiş LD 50 dozunun (10 5 CFU) ile enfekte IP edildi. Fareler ayrıca aşılama gününde ilaç IS001 veya taşıyıcı (% 0.5 karboksimetil selüloz), günde iki kez başlangıç ​​tatbik edilmiştir. Fareler klinik belirtiler için günlük olarak takip edilmiş ve insancıl uç noktaları karşılandı eğer ötenazi edildi. Log-Rank testi (P ​​<0.05) ile saptandığı haliyle zaman * içinde son noktalar farelerin hayatta kalma yüzdesi gruplar arasında hayatta kalma bir fark gösterir gösterilmektedir. Veri Dergi o izni ile 31 re-yazdırılırf İmmünoloji (hacim 195, s. 5189-5202, 2015). Telif Hakkı 2015 immünolojistler Amerikan Derneği, Inc. , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

tablo 1
Tablo 1: Gündüz kültüründen bir tam bölen CFU belirlenmesi için bazı Örnek hesaplamaları gösterir. Bu örnekte, günlük kültür ul'lik bir alikuot alınmış ve tamponu 1: BHI ortamı ile 1. Bu seyreltilmiş numunenin OD'si 600 0.84 olduğu tespit edildi. Buna ek olarak, 100 ul alikosu CFU belirlenmesi için alınmıştır. Bu örnek, BHI ortamı 900 ul (10 -1) ile seyreltildi ve yıkandı ve 1 ml BHI içinde yeniden süspanse edilmiştir. Bu örnek bir 10-kat seyreltme serisi (10 -2 -9 10) elde edilmiştir ve seyreltilmiş numune, BHI aga ekildir plakaları (10 -4 -9 10 için yalnızca değerleri gösterilir). Ertesi gün koloniler sayılmıştır. 30-300 arasında koloni sayıları vardı sadece o plakalar (yani, 10 -6 levha, sarı vurgulanan) hesaplaması için kabul edildi. Bu plaka (70) üzerindeki kolonilerin sayısı daha sonra seyreltilmiş örnek CFU / ml elde etmek için 0.1 (kaplama mi hacim) ile bölünmüştür. Bu değer daha sonra, seyreltilmemiş kültür CFU / mL değerini elde etmek için seyreltme faktörü (10 6) ile çarpıldı. TMTC saymak için çok =.

Tablo 2
Tablo 2: NK ve NKT Hücrelerde Algılama IFN-gamma için boyama Paneli. panel ya da CD4 antikoru klonu GK1.1 çeşitli florokrom alternatifler ile boyanmış splenositler kullanılan akış antikor ile boyandı dengeleme boncuk ya tek pozitif kontrol olarak kullanılabilir unutmayın.

Tablo 3
Tablo 3: CD4 + ve CD8 + hücrelerinde algılama IFN-y için boyama panel. panel ya da CD4 antikoru klonu GK1.1 çeşitli florokrom alternatifler ile boyanmış splenositler kullanılan akış antikor ile boyandı ya da dengeleme boncuklar tek pozitif kontrol olarak kullanılabilir unutmayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada L. EGD suşu kadın veya erkek C57BL / 6J farelerde 25 monocytogenes ile temel deneysel enfeksiyon yürütmek için nasıl bir protokol açıklar. Bu protokol, in vivo 31 doğal ve kazanılmış lenfositler tarafından IFN-γ üretimi üzerinde yeni küçük moleküllü IS001 etkisini incelemek amacıyla kuruldu. bakteriyel temizleme ve hayatta kalma sonrası enfeksiyon izleyerek, anlayışlar IFN-y bu değişikliklerin enfeksiyon kontrol etme konağın yeteneğini nasıl etkilediğini içine elde edilmiştir.

Protokolde kritik Hususlar

Bu tür bir araştırmada tasarımında önemli bir husus, her deney, yeterli güç ve uygun kontrol edilebilir olmasıdır. Enfeksiyon nedeniyle bağışıklık tepkisi biyolojik varyasyona (bakınız Şekil 4 ve 6) göre, n = 4 önerilir - grup başına 5 fare başlangıçta olan bağışıklık çalışmalar için kullanılmalıdır. Eğer birfter verilerde bir eğilim, ancak gruplar arasında belirgin anlamlı bir fark yoktur bu çalışmaların bir güç hesaplaması istatistiksel olarak anlamlı elde etmek için daha sonraki çalışmalarda gerekli hayvanların en az sayısını belirlemek için yapılabilir. kontroller ile ilgili olarak, bağışıklık çalışmalar ve araç tedavisi uygulanmasıyla ilişkili stres tedavisinin etkisini ayırt yardımcı kontrol için temel IFN-γ yanıtlarının belirlenmesi için bulaşmamış kontrolleri dahil etmek önemlidir. Bir diğer önemli husus tedavi zamanlaması olduğunu. L. monocytogenes Doğal yanıt çok hızlı olduğu için, birinci işlem ya da reaktif olduğu için, terapötik seviyeleri sağlamak için aşılama, aynı zamanda önce elde edilecek önceden günde tatbik edilmesi önerilir doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin başlatılması.

Yine diğer bir önemli mesele, patojen doz infectio için kullanılacak olann. Bu patojen bakterilerin daha doğru sayım sağlayan, dalak ve karaciğer içinde konsantre edildi olasılığını arttırır yana öldürücü dozu bakteri yükünün ölçülmesi tavsiye edilir. Bir öldürücü doz, hayvan en yüksek T hücre genişlemesinin süresi öncesinde listeriya teslim olmayan sağlamak için uyarlanabilir lenfosit IFN-γ yanıtları numaralandırma için tavsiye edilir. Bunun aksine, daha yüksek bir enfeksiyon dozu, bu hücreler tarafından IFN-γ üretimini maksimize etmek için 24 saat sonra erken bir NK ve NKT hücresi tepkisinin ölçümü için kullanılması önerilmektedir.

Klasik LD50 farelerin% 50 öldürücülüğü sonuçlanan patojenin dozdur. listeriosis birçok belirtiler bir hayvan bir enfeksiyon yenik olasılığı olup olmadığını tahmin edebilirsiniz çünkü ölüm bizim kurumda kabul edilebilir bir son nokta değildi ve bu yana, bizim çalışmalarda bir son nokta olarak tanımlanan bir klinik bulguların listesini yerine ölümü kullanılır. usiBu yöntem ng, modifiye LD 50 8 haftalık erkek 10 5 CFU ve 8 haftalık dişi C57BL / 6J fareler 31 için 1.5 x 10 5 CFU olduğu tespit edilmiştir. Bu LD 50 doz, her grup için N = 8 fare ihtiva ettiğini (N = toplam 5 çalışma) adım adım doz arttırma çalışmalarında son noktalar farelerin yüzde hayatta kalma ölçülerek belirlenmiştir (örneğin, fareler 10,000 CFU ilk enfekte edildi daha sonra 20.000 CFU, vs.) ile ikinci parti. Userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit~~pobj: LD 50 Hesaplama hayatta kalma yüzdesi değerleri (y-ekseni) (web probit karşı log bir regresyon arsa (CFU) (x-ekseni) belirlendi /ProbitAnalysis.pdf).

L. monocytogenes aynı suşu ile enfekte fareler bile laboratuarımızda tespit modifiye LD 50 dozu başka laboratuvarda farklı olabilir unutmayın. Bu değişkenlik Bölüm öznel doğası o ilgili olabilirf ölüm daha mutlak bitiş noktasına kıyasla listeriosis klinik belirtilerini izlemek. Ek değişkenlik, fare diyet veya Mikrobiyota veya laboratuarlar arası inokulum hazırlanması farklılıklar gibi çevresel faktörlere farklılıklardan kaynaklanabilir. Nedenle, dişi fareler (n = 8 fare / grup), L. monocytogenes aynı gerginlik 1.5 x 10 5 CFU bulaşmış burada kullanılan önceden herhangi bir Hayatta kalma çalışmalarında başlamadan için bir pilot çalışma yapıldı önerilir çalışma ve bu doz gerçekten uç noktalara% 50 hayatta kalma sonuçları ise izlenen semptomlar belirlemek için. Hayatta bu CFU daha düşük ya da% 50 daha yüksek ise, adım adım doz artırımına ya da doz de-eskalasyon çalışmaları hızla LD 50 dozu daraltmak için yapılabildi.

Bir diğer önemli husus enfeksiyon çalışmaları için kullanılan farelerin zorlanma ya da alt türünün olduğunu. Bu protokol yaygın olarak kullanılan kendilenmiş fare suşu C57BL / 6J enfeksiyonunu açıklar. Bu soyu Bu fare suşu 33 Th1 eğilimli olduğu düşünülmektedir çünkü, IFN-γ yanıtların ölçümü için çok uygun bir sonuç olarak, L. oldukça dayanıklı BALB / gibi Th2 eğilimli fare suşlarının göre enfeksiyon (monocytogenes olduğu c) 34,35. Diğer fare suşları için bu protokolü uyarlanması belirli suşu için patojenin bulaşıcı dozu hakkında bilgi gerektirir. Aynı zamanda model kurma katılan sorunsuz çekim miktarını azaltmak için bu protokolde belirtildiği gibi aynı yaş, cinsiyet fareler ve satıcı kullanılması tavsiye edilir. Örneğin, C57BL / 6 fareleri (ör C57BL / 6NTac), başka bir satıcıdan 36 sipariş C67BL / 6 farelerden daha genetik farklılıkları sergileyebilir bir satıcı (ör C57BL / 6J) sipariş. Buna ek olarak, bağırsak Mikrobiyota C57BL arasındaki fare 37 Th1 ve Th17 yanıtlarının dengesini etkileyebilir farklı satıcılardan elde edilen / 6 substrains farklıdır.

Tekniğe ove_title "> Potansiyel Değişiklikler

mide bağırsak sistemi boyunca olan insanlarda enfeksiyona doğal yoldan, karşıt olarak fareler en sık damar içinden ip aşılanır veya edilir. L. monocytogenes standart suşları verimsiz farelerin 38 intestinal epitel enfekte çünkü Ağız enfeksiyonları daha az görülür. Lısterıal invazyon proteini ile E-kadherin tanınması kaybı ile sonuçlanan, insan E-kadherin fare E-kadherin dizisinde, tek bir amino asit değişimi A (Inia) 39 ınternalın var olmasıdır. Bu engeli aşmak için, araştırmacılar insan E-kadherin proteini için transgenik olan ve WT EGD aynı afinite fare E-kadherin bağlanan Inia (Inia MUT) mutasyona uğramış bir sekansı ifade etmek üzere tasarlanmış olan Listeria kullanımı fareler kullanmak insan E-kadherin 40. Böylece, bu tekniğin bir değişiklik, ağız yoluyla fareleri enfekte olan. Okuyucu Oral aşılama yöntemleri 38 açıklanır başka vallahi yayına denir. enfeksiyon modunu değiştirerek bulaşıcı dozu yanı sıra patojenin yayılması kinetik etkileyeceğini unutmayın.

Bu protokol, CD4 + ve CD8 + T hücreleri tarafından IFN-γ üretimini ortaya çıkarmak için ısı ile öldürülmüş Listeria ile açıklanmaktadır. Isı ile öldürülmüş L. monocytogenes bu antijen ucuz olduğu için, bizim çalışmalarda bir uyarıcı olarak seçilmiş ve bizim laboratuar patojene CD4 + T hücre yanıtları öncelikle ilgi çünkü. Bir sınırlama ısı ile öldürülmüş bakterilerin etkin bir şekilde, in vitro 41 ya da in vivo 42,43 enfeksiyon ya birinci CD8 + T hücresi tepkilerini kalmamasıdır. Böylece, enfeksiyonun tepe hasat splenositler tarafından gözlenen CD8 + T hücre IFN-γ üretimi (yani, Şekil 6) büyük olasılıkla kalıntı tepki olaraksplenosit kültürleri içinde mevcut veya sitokin-kaynaklı sitokin sonucu açığa çıkarıldı canlı bakteri 41 bırakın. Alternatif listeria öldürülmüş ısı gelince, bir de listerial proteinler üzerinde epitopları kodlayan peptitler T hücrelerini teşhir ederek IFN-γ yanıtları ex vivo ortaya olabilir. Gerçekten de, immünodominant MHC Sınıf listeriolisin O ve p60 hidrolaz için epitoplar II kısıtlı ve BALB / C 44 için tarif edilmiştir C57BL / 6 ve Balb / C fareler ve immünodominant MHC sınıf I epitoplar için tarif edilmiştir. Diğer bir yaklaşım, antijene özgü numaralandırmak için MHC Sınıf I- ve MHC Sınıf II-tetramer reaktifler, mevcut yararlanmak üzere bu ovalbümin veya viral antijenleri gibi model antijenleri ifade etmek üzere tasarlanmış olan L. monocytogenes suşları ile fareleri enfekte olan enfekte edilen farelerin 45,46 T hücreleri.

Protokolün diğer Sınırlamalar

Bu modelin bir diğer kısıtlılığı öyle o olduğunudalakta bağışıklık hücreleri tarafından nly önlemler IFN-γ üretimi. Burada tarif edilen boyama panel akış sitometrisi (ovalbümin sentezleyen L. monocytogenes varyantlarının) antijene spesifik T hücreleri saymak tetramerleri kullanımına ek olarak kolayca TNF ya da IL-2 ya da başka sitokinlerin üretimini ölçmek için modifiye edilebilir CD8 T hücresi veya bu tür ek olarak perforin ya granzim B olarak patojen NK-aracılı öldürme katılmak efektör molekülleri, bu protokol, aynı zamanda, karaciğer bağışıklık hücreleri tarafından üretilen IFN-y incelemek için uyarlanabilir.

gelecek Uygulamaları

Bu protokol, hakim sonra, Th1 ve hücresel bağışıklık üzerindeki çeşitli maddelerin ya da gen etkisini taranması için bir in vivo model basit olarak hizmet edebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion Broth, Modified BD 299070 any brand should be appropriate
Agar BD 214010 any brand should be appropriate
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 any brand should be appropriate
1x PBS Sigma D8537 any brand should be appropriate
TissueLyser II Qiagen 85300 any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl) any brand should be appropriate
KHCO3 any brand should be appropriate
Na2EDTA any brand should be appropriate
RPMI 1640 Gibco 22400089 any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum  Gibco 12483 Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine Gibco 25030 any brand should be appropriate
Non-essential amino acids Gibco 11140 any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD 554724 Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaldehye Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS
10x Perm/Wash buffer BD 554723 Dilute 1x in ddH2O
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506 eBioscience 65-0866 Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) eBioscience 15-0041 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) eBioscience 11-0081 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC NIH Tetramer Core Facility N/A Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) eBioscience 25-5961 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) eBioscience 47-3351 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) eBioscience 25-0451 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) eBioscience 12-7311 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads eBioscience 01-1111 Use one drop per stain
Mouse IFN gamma ELISA kit eBioscience 88-7314 Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 ml vented tubes for culture Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes any brand should be appropriate
bacterial petri dishes any brand should be appropriate
2 ml cyrovials any brand should be appropriate
UV spectrometer any brand should be appropriate
safety engineered needles any brand should be appropriate
C57BL/6J Jackson laboratories Stock#000664 Order for arrival at 7 weeks
Bleach For decontamination
70% Ethanol For decontamination
Glass beads any brand should be appropriate
Centrifuge rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge any brand should be appropriate
Sterile Glycerol any brand should be appropriate
Pipette Tips any brand should be appropriate
Pipette any brand should be appropriate
Surgical instruments any brand should be appropriate
70 micron strainers any brand should be appropriate
3 ml syringe any brand should be appropriate
Pipette gun any brand should be appropriate
Filtration Units any brand should be appropriate
Trypan Blue Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate
Hemocytometer any brand should be appropriate
Round bottomed plates any brand should be appropriate
FACs tubes Fisher Scientific 14-959-5
BD LSR II BD Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software Treestar Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0 - 300 µl) Eppendorf Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System Pro-lab Diagnostics Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
  2. Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
  3. Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
  4. Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
  5. Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
  6. Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
  7. Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  8. Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
  9. Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
  10. Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
  11. Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
  12. Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
  13. Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
  14. Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
  15. Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
  16. Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
  17. Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
  18. Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
  19. Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
  20. Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
  21. Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
  22. Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
  23. Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
  24. Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
  25. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  26. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
  27. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
  28. Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
  29. BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf (2007).
  30. Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. http://www.flowjo.com/tutorials (2016).
  31. Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
  32. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
  33. Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
  34. Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
  35. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  36. Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
  37. Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
  38. Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
  39. Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
  40. Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
  41. Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
  42. Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
  43. Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
  44. Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
  45. Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
  46. Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).

Tags

Enfeksiyon Sayı 117, Bakteri enfeksiyon modeli fareler sitometri interferon-γ yanıtı akış
Deneysel Enfeksiyon<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Ana İnterferon-γ Yanıtları incelenmesi için Bir Model Olarak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, … More

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, M. A., Mallevaey, T., Dunn, S. E. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (117), e54554, doi:10.3791/54554 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter