Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Eksperimentell infeksjon med Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54554
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan å inokulere C57BL / 6J-mus med EGD stamme av Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) og for å måle interferon-γ (IFN-γ) responser av naturlige dreperceller (NK) celler, naturlig drepe-T (NKT-celler), og adaptive T-lymfocytter post-infeksjon. Denne protokollen beskriver også hvordan å gjennomføre overlevelse hos mus etter infeksjon med en modifisert LD 50 dose av organismen.

Abstract

L. monocytogenes er en gram-positiv bakterie som er en årsak til matbårne sykdommer hos mennesker. Eksperimentell infeksjon av mus med dette patogenet har vært svært lærerikt på seg rollen som medfødte og ervervede immunceller og spesifikke cytokiner i verts immunitet mot intracellulære patogener. Produksjon av IFN-γ ved medfødte celler under subletal infeksjon med L. monocytogenes er viktig for aktivering av makrofager og tidlig kontroll av organismen 1-3. I tillegg er IFN-γ produksjon av adaptive hukommelseslymfocytter viktig for priming aktivering av medfødt celler ved reinfeksjon 4. L. monocytogenes infeksjonsmodell og dermed fungerer som et flott verktøy for å undersøke om nye behandlingsformer som er designet for å øke IFN-γ produksjon har en innvirkning på IFN-γ responser in vivo og har produktive biologiske effekter som øker bakteriell clearance eller forbedre mus overlevelse frainfeksjon. Beskrevet her er en enkel protokoll for hvordan man skal utføre intraperitoneale infeksjoner i C57BL / 6J-mus med EGD stamme av L. monocytogenes og for å måle IFN-γ produksjon ved hjelp av NK-celler, NKT-celler og lymfocytter adaptive ved strømningscytometri. I tillegg er fremgangsmåter beskrevet i: (1) dyrke og forberede bakterier for inokulering, (2) å måle bakteriemengde i milten og leveren, og (3) måle dyr overlevelse til endepunktene. Representative data er også gitt for å illustrere hvordan denne infeksjonsmodellen kan brukes for å teste effekten av spesifikke midler på IFN-y-responser på L. monocytogenes og overlevelse av mus fra denne infeksjon.

Introduction

IFN-γ er et cytokin som er viktig for formidling av immunitet mot intracellulære patogener og for å kontrollere tumorvekst 5. Betydningen av dette cytokin i bakteriell resistens er tydelig i den observasjon at mennesker med mutasjoner i IFN-γ signalveien er svært utsatt for infeksjon med mykobakterier og salmonellae 6. Tilsvarende mus mangler enten IFN-γ eller IFN-γ-reseptor utstillingen defekter i motstand mot mykobakterier 7-9 og andre intracellulære patogener inkludert L. monocytogenes 10,11, Leishmania store 12, Salmonella typhimurium 13, og enkelte virus 11. I tillegg til å bekjempe patogener, spiller IFN-γ en avgjørende rolle i host-forsvar mot svulster 14. Selv om høyere produksjon av IFN-γ er fordelaktig i sammenheng med infeksjon eller cancer, har langvarig produksjon av dette cytokinet vært knyttet to utvikling av systemisk autoimmunitet 15-17 og akselerasjon av type I diabetes i ikke-overvektige diabetiske mus modell 18.

De viktigste kilder til IFN-γ omfatter NK-celler, NKT-celler, γδ T-celler, T-hjelper 1 (Th1) -celler og cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) 5,19,20. IFN-γ forbedrer både medfødt og adaptiv immunitet ved: (1) opp-regulering av hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I og II ekspresjon, (2) å øke ekspresjon av kostimulerende molekyler på antigenpresenterende celler, (3) å øke makrofag fagocytose og produksjon av proinflammatoriske cytokiner og mikrobicide faktorer (for eksempel nitrogenoksid og reaktive oksygenforbindelser), (4) å fremme differensiering av naive CD4 + T-celler til Th1 effektorceller, (5) fremme antistoffklasse bytte til immunglobulin ( ig) 2a og IgG3 (i mus), (6) fremkalle produksjon av kjemokiner til å rekruttere immunceller til områder i infection, og (7) å øke NK-celle og CTL-responser 5,19. Gitt den avgjørende betydning av IFN-γ i vertens respons på patogener og tumorer, har rekombinant IFN-γ blitt testet som en behandling for forskjellige infeksjoner og maligniteter (oversikt i 19). Men på grunn systemisk administrasjon av IFN-γ eller Th1 fremme cytokinet interleukin-12 (IL-12) er forbundet med bivirkninger og doserelatert toksisitet 19,21, er det interesse for å utvikle alternative strategier for å øke IFN-γ produksjon av immunceller. Utvikling av nye biologiske og små molekyler krever in vivo screening verktøy for å teste om slike midler øker IFN-γ produksjon i løpet av en immunrespons og om dette oversettes til meningsfulle biologiske effekter som økninger i dyr overlevelse.

Eksperimentell infeksjon av mus med gram-positive bakterien L. monocytogenes har vært en medvirkende modell fortyde rollen IFN-γ i host-immunitet mot intracellulære patogener 1,22. Infeksjon av mus med patogenet intravenøst ​​eller intraperitonealt (ip) fører til rask spredning av bakterier til milt og lever, hvor de blir internalisert av resident makrofager og hepatocytter med topp bakterielle belastninger i milten som oppstår mellom tre og fire dager post- infeksjon 1,3,22. Produksjon av IFN-γ ved hjelp av NK-celler er viktig for makrofagaktivering og tidlig motstand mot patogenet 3; imidlertid ved høye smittsomme doser, kan produksjon av IFN-γ også være skadelig for patogen clearance 23. NKT-celler er også en kilde til IFN-γ i milten og leveren i løpet av tidlig kontroll av patogener 2,24, og denne produksjonen er blitt vist å forsterke IFN-γ produksjon av andre celletyper, inkludert NK-celler 2. På den annen side senere virkende adaptive T-lymfocytter, CD8 + T-celler på partisielt, er viktig for formidling clearance av organismen og gir beskyttelse mot ny infeksjon 1,4,22.

Denne infeksjonen modellen har vært attraktivt for forskere for en rekke årsaker (anmeldt i 1). Først infeksjon med patogenet er meget reproduserbar og induserer en kraftig Th1 og cellulær immunrespons. For det andre, i løpet av subletal infeksjon, bakteriemengde konsentreres i leveren og milten, hvor det lett kan måles. For det tredje kan patogenet trygt håndteres under biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) forhold. For det fjerde organismen og immunrespons at det genererer har blitt omfattende karakterisert. Til slutt, et utvalg av mutante og genetisk modifiserte stammer har blitt utviklet som er tilgjengelige for bruk.

Beskrevet her er en grunnleggende protokollen for inokulering av C57BL / 6J mus med EGD stamme av L. monocytogenes 25 og for måling av IFN - γ responses av NK, NKT, og adaptive lymfocytter post-infeksjon. Det beskrives også hvordan man kan måle bakteriemengde i milten og leveren etter subletal smitte og å utføre rednings studier etter infeksjon med en modifisert LD 50 dose av organismen. Endelig er representative data vist hvordan denne protokollen kan bli benyttet for å undersøke effekten av nye behandlinger på IFN-y-responser og mus overlevelse av L. monocytogenes-infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sikkerhetsmerknad

Denne protokollen beskriver infeksjon av mus med levende L. monocytogenes. Patogenet håndteres trygt i henhold BSL2 forhold av opplært personell som ikke er svekket immunforsvar. Immunsupprimerte mennesker for gravide, eldre og personer som er HIV-smittet eller har kroniske tilstander som krever behandling med immunsuppressiv behandling. Personell skal ta på seg beskyttende lab frakk eller kjole, hansker, maske og vernebriller ved håndtering av infiserte prøvene. Arbeidet beskrevet her ble utført under BSL2 forhold under et sertifikat (# 32876) som ble utstedt av University Health Network (uhn) biosikkerhet kontor. Slakt fra infiserte mus eller ubrukte vev var dobbelt samlet og kastes i biohazard avfall. Bur fra infiserte mus ble også dekontamineres ved autoklavering.

etikk Statement

Musene ble opprettholdt og infisert i en Quarantine rom innenfor uhn dyrefasiliteter og var ivaretatt i samsvar med de retningslinjer som er fastsatt av den kanadiske Council on Animal Care. Alle prosedyrer på mus ble utført under bruk dyr protokollen # 3214 som ble godkjent av uhn dyr omsorg komiteen. På grunn av etiske hensyn, ble døden ikke brukt som et endepunkt for overlevelse studier. Den modifiserte LD 50 dose rapportert her for L. monocytogenes infeksjon ble bestemt til å være den dose ved hvilken 50% av musene nådde spesifikke endepunkter, som besto av et 20% tap i kroppsvekt eller utført på minst to av de følgende kliniske tegn: slapphet, ruffled pels, krum holdning, anstrengt pust, kjedelig eller innsunkne øyne. Mus ble avlivet da de nådde endepunkter via eksponering for karbondioksid (CO 2) i henhold til uhn anlegget retningslinjer.

1. Utarbeidelse av glyserol aksjer for langvarig oppbevaring

MERK: Denne prosedyren beskriver hvordan glyserol aksjer iEGD stamme av L. monocytogenes er forberedt fra en opprinnelig glyserol lager. Trinn som har potensial til å generere aerosoler bør utføres innenfor en sertifisert biosikkerhet kabinett (BSC).

  1. Forbered hjerne hjerte infusjon (BHI) agar-plater for bakterievekst. For dette tillegget 3,8% (w / v) BHI kraft og 1,5% (w / v) agar til dobbelt destillert H 2 O (DDH 2 O). Autoclave væske. Når agar avkjøles til 50 ° C, avgi væske inn i bakteriepetriskåler (25 ml / skål) og la platene tørre (udekket) i nevnte BSC i 1 time.
    MERK: Overføring BHI-agar i et 50 ° C vannbad etter autoklavering for å unngå størkning før helling platene. Oppbevar BHI plater ved 4 ° C opp ned (med media side på toppen) til den er klar til bruk.
  2. Forbered flytende BHI medier. For dette, bland 3,8% (w / v) BHI-buljong i DDH 2 O. autoklav.
  3. Fjern frossen glyserol lager av L. monocytogenes EGD belastning fra -80 ° C fryser og tine til romtemperatur.
  4. Dypp en steril pipette tips i tint glyserol lager og umiddelbart strek spissen frem og tilbake over en del av en BHI plate. Dette er den primære strek.
  5. Snu platen ved 90 ° C og med en ny pipette, drar gjennom den første strek og spre det til neste ¼ av platen (dette er den sekundære strek). Gjenta en gang til for å gjøre den høyere strek.
  6. Snu platen opp ned og inkuberes ved 37 ° C over natten. Enkelt ensartede kolonier bør innhentes i det siste settet med striper og synlig mellom 16 og 24 timer.
  7. Dispensere 10 ml sterilt BHI kraft inn i et sterilt 50 ml rør ventilert. Plukk en koloni av L. monocytogenes fra platen ved hjelp av en steril pipette tips og vaksinere suppen. Inkuber kultur i en 37 ° C orbital risteinkubator over natten, eller inntil OD 600 = 1,0 med innstillinger på 225 rotasjoner per minutt (rpm).
    MERK: Glass eller engangs plastic Erlenmeyerkolber kan også bli anvendt for å dyrke bakterier. Uavhengig av typen av beholder som brukes, være sikker på at det er sterilt, ventilert og at volumet av kulturen ikke overstiger 20% av det totale volum av beholderen for å sikre hensiktsmessig lufting av bakteriene.
  8. Forbered glyserol aksjer ved å blande sterile 100% glyserol med overnatting bakterie flytende kultur på en 1: 1-forhold. Fordel det bakterielle / glycerol-blandingen i 2 ml kryogeniske hetteglass (500 ul / ampulle) og overføre ampuller til -80 ° C fryseren for lagring.
    MERK: Perler lager metoder kan også brukes i stedet for glyserol aksjer for å lagre bakterier. Ved denne metoden, er porøse mikrokuler inokulert med en ren kultur av L. monocytogenes og lagres ved -80 ° C. Hver perle kan brukes til å inokulere en frisk kultur etter behov. Se materialer liste for ytterligere informasjon.

2. Fastsettelse av vekstkurve av L. monocytogenes i dag Culture MERK: Denne prosedyren beskriver hvordan å generere vekstkurven for L. monocytogenes som brukes til å beregne de kolonidannende enheter (CFU) for infeksjonsstudier. Alle trinn som har potensial til å generere aerosoler bør utføres innenfor en sertifisert BSC.

  1. Ta 100 ul natten kultur som genereres i trinn 1,7 til 10 ml BHI media i et ventilert 50 ml rør og vokse ved 37 ° C i en rysteinkubator (225 opm, skråstilt i 45 ° vinkel). Bruke en ikke-inokulerte rør som en kontroll.
  2. Ta 0,5 ml prøver av kulturen ved timesintervaller (1, 2, 3, 4, 5, 6 timer, osv.). Fortynn hver aliquot 1: 1 (v / v) med BHI media i en plast kyvette. Pipetter opp og ned for å blande. Måle den optiske tetthet (OD) ved 600 nm (OD 600) ved hjelp av et spektrometer. Fortsett å dyrke bakterier til OD 600 = 1.
  3. På samme tid, ta en 100 pl prøve av kulturen og fortynn med 900 ul BHI media i et sterilt 1,5 ml Microcentrifuge rør (dette er den 10 -1 fortynning). Sentrifuger bakterier ved 6000 xg i 5 min, og aspirer supernatanten.
  4. Vask bakterier to ganger ved resuspendering av pelleten i 1 ml BHI media, sentrifugering i 5 min ved 6000 x g, og deretter aspirering av supernatanten. Resuspender pelleten i 1 ml BHI-medium. Forbered en 10 gangers fortynning serie av denne prøven i BHI media (10 -2 til 10 -9). Spre 100 ul av hver fortynningsmiddel på separate BHI agarplater. Inkuber skålene over natten ved 37 ° C i en inkubator.
  5. Den neste dagen, plukke plater som har mellom 30-300 kolonier. Kast resten. Telle koloniene på disse platene. Tabell 1 viser et eksempel på en teller som oppnås i en prøve som ble tatt da OD 600 = 0,84. I dette eksempel er en av platene (dvs. 10 -6 fortynning) hadde kimtall inn mellom 30 - 300 og ble anvendt for CFU / ml beregning.
    MERK: Plater med størreenn 300 kolonier blir ikke brukt, ettersom overbefolkning kan hindre bakterievekst, og gjør det også vanskelig å skjelne og nummerere individuelle kolonier. Plater med tall <30, er heller ikke brukes fordi små feil i fortynning teknikk eller tilstedeværelse av forurensninger kan ha en stor innvirkning på presisjonen av tellinger ved den nedre enden av området.
  6. Dele antall kolonier av volumet belagt og deretter multiplisere med fortynningsfaktoren for å oppnå den CFU / ml verdi for en bestemt fortynning. I eksemplet i tabell 1, telleverdien ved 10 -6 fortynning var 70. Skille denne verdien med 0,1 ml for å få den CFU / ml verdi for den fortynnede kulturen. Deretter multiplisere denne verdien med fortynningsfaktoren (10 6) for å oppnå CFU / ml verdi av ufortynnet kultur (7,0 x 10 8).
  7. Plott OD 600 (y-aksen) som funksjon av tiden i timer (x-aksen) for å identifisere den logaritmiske vekstfase 26.
    MERK: Denne veksten buee gir et estimat for CFU / ml av dagen når kulturen dyrket til en viss OD avlesning. Velge en OD 600 lesning som er i logaritmisk vekstfase som kan brukes som et mål OD 600 for dyrking dag kulturer. Disse dataene nå kan brukes til å estimere CFU i en kultur for fremstilling av inokulum (Prosedyre 3).

3. Klargjøring av Inoculum for eksperimentell infeksjon med L. monocytogenes

MERK: Denne prosedyren beskriver fremstillingen av den smittsomme podestoff fra en dag kultur som ble startet fra en overnatting kultur (utarbeidet i Procedure 2). Alle disse trinnene utføres i den BSC hvis ikke annet er angitt.

  1. Beregn antall CFU kreves for infeksjon basert på antallet av mus og eksperimentell design av studien. Tilsett en passende volum av BHI media til en steril Erlenmeyerkolbe ventilert eller dyrkningsrør.
    MERK: CFU bakterier prepared vil være avhengig av den type eksperiment utført. For å studere NK og NKT-celle responser på infeksjon, er hver mus inokulert med 10 5 CFU bakterier (Prosedyre 6). Ved å studere adaptive T-celle responser på infeksjon eller måling av bakteriemengde, er hver mus inokulert med 2 x 10 4 CFU bakterier (Fremgangsmåte 8). Hvis studere overlevelse til endepunkter, er hver mus inokulert med LD 50 dose av organismen (som er 10 5 CFU for menn og 1,5 x 10 5 CFU for kvinner, se Prosedyre 9).
  2. Inokulere rør inneholdende BHI-media med 100 ul over natten kultur. Inkuber kultur i en 37 ° C orbital risteinkubator (225 opm) inntil målet OD 600 er nådd. Overfør kultur innholdet til et sterilt sentrifugerør.
  3. Sentrifuger bakterier i en pellet i 5 minutter ved 6000 xg ved hjelp av en sentrifuge. Aspirer supernatanten ved hjelp av en vakuum festet til en felle kolbe inneholdende blekemiddel.
  4. Vask pellet to ganger med 1 x fosfatbufret saltvann (PBS), sentrifugering (5 min ved 6000 x g) i mellom.
  5. Aspirer andre vask og fortynne bakterier ved den passende konsentrasjon i 1 x PBS for å levere den CFU av interesse for hver mus i et 200 ul volum.
    MERK: Det er best å bruke en kommersiell kilde til sterile 1x PBS for vasking bakterier og for utarbeidelse av pode, siden lab glass kan introdusere immunologiske forurensninger som lipopolysakkarid.

4. Eksperimentell infeksjon av mus med L. monocytogenes

MERK: Denne prosedyren beskriver hvordan du infisere mus med pode utarbeidet prosedyre 3 og hvordan du bekrefter CFU levert i podestoff. Håndtering av mus og injeksjoner er utført i en BSC.

  1. Bestill et tilstrekkelig antall mannlig eller kvinnelig C57BL / 6J mus for eksperimentet. Også bestille mus til å fungere som friske kontroller.
  2. Tillat mus tilakklimatisere seg for en uke før bakteriell inokulasjon.
    MERK: Dette er fordi stress forbundet med transport av dyrene kan utløse en forbigående økning i spenning hormonproduksjon og lymfopeni 27,28.
  3. På dagen for vaksinasjon, få en baseline kroppsvekt for hver mus og ta det opp i laboratoriet bærbare.
  4. I BSC, blande bakteriesuspensjonen opp og ned ved hjelp av en steril pipette for å sikre at bakterien er jevnt fordelt, og deretter ta opp 200 ul av inokulumet i en 1 ml sikkerhet konstruert sprøyte utstyrt med en 25 G nål.
  5. Sprøyt en mus ip med 200 ul forberedt podestoff (for eksempel 10 5 CFU for NK celle infeksjon, Prosedyre 6). For denne prosedyren, Scruff mus med mindre dominerende hånd ved å gripe den løse huden rundt muse skuldre. Etter at musen er godt behersket, injisere mus i nedre kvadrant av magen, like lateralt for midline for å unngå blæren.
  6. Kast nålen og sprøyten i en biohazard kanylebøtte.
  7. Gjenta trinn 04.03 til 04.06 før alle musene injiseres. Gjennomføre tilsvarende trinn med 1x PBS injisert mus (ikke-infiserte kontroller).
    MERK: Siden CFU er et estimat basert på vekstkurven, er det også god praksis å kontrollere den faktiske CFU i inokulum. For dette, forberede 3 - 4 forskjellige fortynninger av forberedt podestoff (med 10 gangers fortynning serie) som du forventer vil resultere i tellbar kolonier. Spre 100 ul av hver fortynningsmiddel på en BHI-agarplate og inkubert over natten ved 37 ° C. Telle koloniene og beregne den faktiske CFU / ml som beskrevet i Fremgangsmåte 2.

5. Klarvarme drept L. monocytogenes for immun Studies

MERK: Alle trinn som har potensial til å generere aerosoler utført innen BSC.

  1. Grow dag kultur til OD 600 verdier enre nådd som er innenfor den logaritmiske fase. Tilsett kultur i 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  2. Inkuber rørene i et 70 ° C i et vannbad i 1 time for å drepe bakterier.
  3. Vask bakterier to ganger med 1x PBS som i trinn 3.3 og 3.4. Resuspender i sterile fullstendige RPMI-medium inneholdende føtalt kalveserum (FCS) (se Supplemental Fil 1 for oppskrift) ved en konsentrasjon på 4 x 10 6 / ml. Delmengde drepte bakterier inn i 2 ml sterile kryogene hetteglass og oppbevar ved -80 ° C.
  4. Bekrefte død av bakterier ved å spre 100 pl varme-drepte bakterier forberedelse på BHI-agarplater og inkubering over natten ved 37 ° C.
    MERK: Disse varmedrepte bakterier bør være klar for å stimulere lymfocytter i kultur i Prosedyre 8. Hvis det er noen kolonier som vokser på BHI agar plate, gjenta varme-drapet prosedyre.

6. Måling av IFN-y Responses NK og NKT celler under Infeksjon

MERK: Denne prosedyren beskriver hvordan du måle IFN-y svar av NK og NKT celler i mus ved 24 timer etter infeksjon med 10 5 CFU av L. monocytogenes. Denne dosen blir brukt fordi den induserer robuste IFN-y-responser hos NK og NKT-celler i milten 24. Gjennomføre alle trinnene i BSC. For å opprettholde celle levedyktighet, holde cellene på is når det er mulig og bruke iskald buffere.

  1. Inokuler mus som beskrevet i Fremgangsmåte 4 med 10 5 CFU av L. monocytogenes. På samme tid, injiserer ikke-infiserte kontrollmusene ip med et like stort volum av 1 x PBS.
  2. Avlive mus ved 24 timer etter vaksinasjon av CO 2 innånding henhold til institusjonelle retningslinjer.
  3. Ligg hver mus på sin høyre side og våt ned huden med 70% etanol ved hjelp av en klemme flaske.
  4. Ved hjelp av aseptiske eller sterile tenger og tøffe snitt saks, langsgående snitt i huden like under bunnen av brystkassen.
  5. spray nedden eksponerte muskellaget med 70% etanol. Milten skal være synlig under muskellaget (åpen pil hode i figur 1).
  6. Ved bruk av aseptiske eller sterile pinsetter og fine sakser, langsgående snitt i muskellaget for å avsløre milten. Forsiktig ta tak i milt med pinsett og bruke gode saks til å klippe milten vekk fra omkringliggende bindevev.
  7. Plasser milten i en 15 ml konisk rør som inneholder sterilt 1x PBS.
  8. Halv fylle sterile petriskåler med sterilt 1x PBS. Dissosiere milten gjennom et 70 mikrometer nylon celle sil inn i petriskålen ved hjelp av den flate enden av en steril 3 ml sprøyte.
  9. Overfør splenocytt suspensjonen inn i en ren sterilt 15 ml konisk rør ved hjelp av en steril 10 ml serologisk pipette.
  10. Sentrifuger prøver ved 335 xg i 10 min ved 4 ° C.
  11. Aspirer supernatanten til en felle kolbe inneholdende blekemiddel. Løsne cellepelleten ved å dra fingeren røret med en finger eller ved å dra den nederste røretfrem og tilbake langs en korrugert overflate (f.eks luftstrøm ventilen i BSC).
  12. Lyse røde blodceller ved å legge 1,5 ml av ammonium-klorid-Kalium (ACK) lysis buffer (se Supplemental Fil 1 for oppskrift) til hver milt. Etter nøyaktig 1 minutt og 15 sekunder, fylle røret med 1 x PBS for å stoppe cellelyse.
  13. Sentrifuger cellene som beskrevet i trinn 6,10. Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 10 ml av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) Buffer (1x steril PBS inneholdende 2% FCS).
  14. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. For dette ta to alikvoter av cellesuspensjonen for telling. Tilsett 15 ul av hver cellesuspensjon til et like stort volum av Trypan blått (0,04%, laget ved fortynning av 0,4% trypanblått-oppløsning i DDH 2 O). Belastning 15 ul av hver celle / Trypan blå suspensjon inn i kammeret i hemocytometer (dvs. en i det øvre kammer, en i den nederste kammer).
  15. Ved hjelp av et mikroskop, telle alle ikke-blå celler ifem store rutene i sentralnettet i hvert kammer (figur 2). Ta denne tellingen og dele det med 10 for å få antall celler i 10 6 / ml. I eksempelet i figur 2, er den telle 215 celler i 5 kvadrater; derfor, er cellekonsentrasjonen 21,5 x 10 6 / ml. Gjennomsnittlig cellekonsentrasjoner innhentet fra de to prøvene.
  16. Seed 1 x 10 6 celler per brønn / flekk i en 96-brønns rundbunnet plate for flowcytometri farging. Sørg for å også frø celler for unstained og fluorescens minus én (FMO) kontrollene. Se anbefalte flowcytometri farging panel i tabell 2.
    MERK: For de neste trinnene, er det anbefalt å holde cellene på is eller ved 4 ° C, og for å beskytte cellene mot lys med folie når fluorokromer er til stede. En flerkanals pipette kan brukes for å utlevere væsker inn i 96-brønners plater fargings for å fremskynde behandling. Vær forsiktig med å forstyrre cellen pellet nåraspirering av supernatanten fra den sentrifugerte platen. Farging kan også gjøres i FACS-rør hvis sentrifugen ikke er utstyrt med plateadaptere. Alle sentrifuger skritt fra dette punktet på er gjort på 456 xg i 5 min ved 4 ° C.
  17. Sentrifuger plate og deretter vaske cellene to ganger med FACS-buffer. En vask blir utført ved å tilsette 200 ul FACS-buffer til hver brønn, sentrifugering av platen, og deretter aspirering av supernatanten.
  18. Utføre blokkeringstrinn ved å tilsette 50 ul / brønn av FACS-buffer inneholdende anti-mus CD16 / CD32 (renset Fc blokk) (0,5 ug). Inkuber cellene ved 4 ° C i 15 min. Vask cellene en gang i 1 x PBS som beskrevet ovenfor.
  19. Tilsett 100 ul levedyktighet fargestoff (festbar levedyktighet fargestoff fortynnet 1: 1000 i 1 x PBS) til cellene. Flekk-celler ved 4 ° C i mørke (i kjøleskap) i 30 min. Vask cellene to ganger i FACS-buffer som beskrevet ovenfor.
  20. Etter en andre vask, tilsett 100 ul av celleoverflate antistoffer eller tetramerer til respektive brønner i henhold to farging panel som er beskrevet i tabell 2. Flekk-celler ved 4 ° C i mørke (i kjøleskap) i 30 min. På denne tiden, også legge antistoffer for beising enkle positive og FMO kontroller.
    MERK: Når det gjelder enkelt positive kontroller, er det anbefalt å enten bruke splenocytes som er farget med ulike fluorokromkonjugerte versjoner av CD4 antistoff eller kommersielle kompensasjon perler som er farget med antistoffer som brukes i panelet. Før du utfører denne fargeprosedyre, bør alle FACS antistoffer titreres i test studier for å bestemme optimale konsentrasjoner for farging.
  21. Vask cellene to ganger i FACS-buffer som beskrevet ovenfor, og deretter løse celler ved resuspendering av dem i 50 pl av 4% paraformaldehyd (16% paraformaldehyd lager fortynnet i DDH 2 O) og inkubering i 10 minutter ved romtemperatur. FORSIKTIG: paraformaldehyde er giftig og bør bare håndteres i avtrekksskap.
  22. Vask cellene to ganger in FACS-buffer, sentrifugering i mellom. Resuspender cellene i FACS-buffer. Fortsett til neste trinn eller lagercellene i kjøleskapet beskyttes mot lys i opptil tre dager.
  23. Sentrifuger cellene, fjern supernatanten, og vask celler to ganger med 150 ul 1x Permeabilization / vaskebuffer (Perm / vaskebuffer), sentrifugering i mellom. Perm / vaskebuffer fremstilles fra et 10x lager ved å fortynne 1: 9 (v / v) i DDH 2 O.
  24. Etter den andre vask, resuspender cellene i 150 pl av Perm / vaskebuffer og inkuber i 15 min ved 4 ° C i mørket.
  25. Sentrifuger cellene igjen og deretter aspirer supernatanten. Resuspender celler i 50 ul av 1 x Perm / vaskebuffer inneholdende anti-IFN-γ og inkuberes i 1 time ved 4 ° C i mørke.
  26. Vask cellene to ganger med 1 x Perm / vaskebuffer, sentrifugering i mellom. Resuspender celler i 250 ul FACS-buffer og deretter overføre celler til FACS rør.
  27. Fortsett til flowcytometri oppkjøp ved hjelp av en flyt cytometer som har en passende laser konfigurasjon og filtersett for å diskriminere fluorokromer benyttes i farge panel som er beskrevet i tabell 2 29. Samle minst 200.000 hendelser per prøve og 10.000 arrangementer for kompensasjon kontroller.
  28. Påfør kompensasjon matrise og analysere data ved hjelp av flowcytometrisk analyse programvare 30.

7. Måling av bakteriemengde i milt og lever på tidspunktet for Peak Infeksjon

MERK: Alle trinnene utføres innenfor en BSC med mindre annet er angitt.

  1. Vaksinere mus IP med 2 x 10 4 CFU av organismen ved hjelp av prosedyrer beskrevet i Prosedyre 4.
  2. På dag 3 etter infeksjonen, fremstille sterile 1,5 ml mikrosentrifugerør, hver inneholdende 500 mL iskald steril 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS og 0,2 til 0,3 g 1,5 til 2 mm syre-vasket sterile glasskuler. Veie hvert rør.
    MERK: Glassperler er syrevasket av incubating i 10% eddiksyre i et begerglass på en magnetrører i 1 time. Disse perler blir deretter grundig vasket med DDH 2 O for å fjerne syre, er lufttørket, og deretter autoklavert før bruk.
  3. Avlive mus ved CO 2 eksponering.
  4. For disseksjon av organer, lå dyret på ryggen på en dissekere bord og pin lemmer musen til å styre ved hjelp av 25 g nåler. Desinfiser huden ved å fukte med 70% etanol.
  5. Bruk sterile tøffe kutt saks, lage en midtlinjen snitt i huden fra lysken til midten brystet og deretter fra midten lysken mot hvert kne og fra midten av brystet mot hverandre albuen. Blunt dissekere og reflektere tilbake huden, låsing det åpnes med 25 g nåler.
  6. Desinfisere muskelen laget ved å fukte det med 70% etanol og deretter ved hjelp av sterile fin saks lage et midtlinjesnitt i det peritoneale veggen. Grab xiphoid prosessen med pinsett. Deretter bruker de samme gode saks, gjøre kutt i peritoneal veggen fra xiphoid process lateralt på hver side, etter brystkassen, like nedenfor mellomgulvet å avsløre leveren.
  7. Klipp ut en ~ 100 mg del av leveren (bruk samme lapp for alle mus) med steril saks og legg den i en pre-veide 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  8. Bruk pinsett for å forsiktig skyve til side organene på venstre side av bukhulen for å visual milten. Forsiktig ta tak i milten med en pinsett og frigjøre den fra bukhulen ved å skjære bort det omkringliggende bindevev.
  9. Plasser milt i pre-veide 1,5 ml mikro rør som inneholder perler. Transport av vev til laboratoriet i en lekkasjesikker beholder inneholdende is. Re-veie rør inneholdende organer for å bestemme vev vektene i mg.
  10. Homogenisere vevet ved å riste rørene ved hjelp av en kulemølle homogenisator i 3 minutter ved frekvens på 30 Hz.
    MERK: foretrekkes Den kulemølle metode for homogenisering som det er mottagelig for psynge et stort antall prøver og skaper mindre rot og potensiell eksponering for patogenet. Men automatiske homogenizers eller autoklaveres 2 ml manuell glassfiberduk homogenizers kan brukes som et alternativ.
  11. Fremstille en 10-gangers fortynningsserie av homogenatene i 0,1% Triton-X-100 i 1 x PBS, som strekker seg fra (i området fra ufortynnet til 10 -7).
  12. Spre 100 ul av hver fortynnet homogenat på en BHI-agarplate (i duplikat) ved hjelp av en steril sprederen. Overføre platene til en 37 ° C inkubator og inkubert over natten.
  13. Hold platene som inneholder mellom 30 og 300 kolonier / plate, kast resten. Tell kolonier på hver plate, og bestemme det midlere antall kolonier etter doble oppslag.
  14. Beregn CFU / mg ifølge den følgende ligning:
    CFU / mg = CFU / ml i homogenatet, multiplisert med de ml homogenat fremstilt, dividert med mg vekt av vevet homogenisert.
    MERK: For eksempel, hvis et gjennomsnitt på 30 colonies ble tellet etter plating 100 mL av 10 -2 fortynnet homogenat fremstilt fra et 120 mg del av leveren ble homogenisert i 0,5 ml, er beregningene vil være som følger:
    CFU / ml = 30 kolonier x 100 (fortynningsfaktoren) / 0,1 ml (volum spredt) = 30 000 CFU / ml.
    CFU / mg = 30,000 CFU / ml x 0,5 ml homogenat / 120 mg vev = 125 CFU / mg.

8. Effekter av L. monocytogenes på IFN-y Responses av CD4 + og CD8 + celler

MERK: Denne prosedyren beskriver hvordan man kan måle IFN-γ produksjon av milt CD4 + og CD8 + T-effektorceller høstet ved toppen av den adaptive immunrespons (~ 7 d etter infeksjon) ved hjelp av to metoder: (1) flyt cytometri for å måle IFN-y ved CD4 + og CD8 + -celler ved intracellulær cytokin flekker, og (2) ELISA for å måle totale IFN-γ nivåene produsert av splenocytter (omfatter alle T-celler). prosedyrerutføres innenfor BSC.

  1. Infisere mus ved å injisere ip med 2 x 10 4 CFU av organismen ved å bruke prosedyrer beskrevet i fremgangsmåte 4.
  2. På dag 7 etter infeksjon, avlive mus ved CO 2 innånding henhold til institusjonelle retningslinjer.
  3. Dissekere milten (som beskrevet ovenfor) og plasser i en 15 ml konisk rør som inneholder sterilt 1x PBS. Transportere rørene til laboratoriet i en lekkasjesikker beholder inneholdende is.
  4. Behandle milten til en enkelt cellesuspensjon, lyse røde blodceller, som beskrevet i kapittel 6, og deretter resuspender celler i fullstendig RPMI-medium som inneholder 10% FCS. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
  5. Sett opp kulturene for måling av IFN-y-responser. For dette doserings-celler (4 x 10 6 i 1 ml / brønn) i 24-brønners plater sammen med og like nummer (4 x 10 til 6 eller 1 ml / brønn) av tinte varme-drepte L. monocytogenes (fremstilt i Fremgangsmåte 5) . Overfør cellene til en 37° C inkubator.
  6. Etter 20 timers inkubasjon legge 0,66 mL / ml protein transport inhibitor til brønner og fortsette inkubasjoner.
  7. Fire timer senere, overføre platen til BSC og samle 500 ul kultursupernatant og fryse (ved -80 ° C) for senere måling av IFN-y-nivåer ved hjelp av et kommersielt enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) sett 31. Og samle cellene inn i et sterilt 15 ml rør. Vask brønner med 1x PBS og basseng denne vaske sammen med oppsamlede celler.
  8. Gjennomføre celleoverflatefarging og intracellulær farging for IFN-γ på CD4 + og CD8 + -celler som beskrevet i Fremgangsmåte 6, bortsett fra å bruke farging panel som er beskrevet i tabell 3. Fortsett til flowcytometer oppkjøp (samle 200.000 hendelser / sample) og analysere data 29 ved hjelp av flowcytometri analyse programvare 30.

9. Måling Mouse Survival å endepunkter etter L. monocytogenes Infecsjon

MERK: Denne prosedyren beskriver effekten av en agent på mus overlevelse til endepunkter post-infeksjon med modifiserte LD 50 dose av organismen. Alle disse fremgangsmåtene er utført i nevnte BSC i dyret anlegget.

  1. Injisere mus IP med den modifiserte LD 50 dose av L. monocytogenes som beskrevet i Fremgangsmåte 4. Dette ble bestemt til 10 5 CFU (for menn) eller 1,5 x 10 5 CFU (for kvinner) 31.
  2. Følg mus to ganger daglig for kliniske tegn og registrere disse tegn og dyr kroppsvekt i en lab notatbok. Avlive mus hvis de viser en 20% tap av kroppsvekt eller to kliniske tegn på listeriose (slapphet, ruffled pels, krum holdning, anstrengt pust, kjedelig eller innsunkne øyne).
  3. Etter 14 dager, avlive overlevende mus via CO 2 innånding.
  4. Fremstille Kaplan-Meier plot av data ved å plotte den prosentvise overlevelse av hver gruppe mot tid 32.
    (figur 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3 viser noen typiske flowcytometri farging av IFN-γ i milt-NK og NKT-celler ved 24 timer etter infeksjon med 10 5 CFU av organismen. Denne figuren illustrerer også portstyringsstrategien for farging panel som er beskrevet i tabell 2. Figur 4 viser noen representative data som ble oppnådd i ett eksperiment hvor hannmus ble behandlet med den PPARa antagonist IS001 eller bærerkontroll, infisert med 10 5 CFU L. monocytogenes, og deretter analysert med hensyn til IFN-γ i NK og NKT-celler etter 24 timers . Denne figuren viser at behandling med IS001 forsterket IFN-y-responser hos NKT-celler, men ikke NK-celler etter infeksjon med patogen. Figur 5 viser representative farging for IFN-γ i milten CD4 + og CD8 + -T-celler etter 7 dager etter infeksjon etter re-stimulering ex vivo med varme-drepte pathogen. Denne figur viser også portstyringsstrategien for farging panel som er beskrevet i tabell 3. Figur 6 viser representative data som ble oppnådd i ett eksperiment hvor hannmus ble behandlet daglig med PPARa antagonist IS001 eller bærerkontroll, infisert med en subletal dose av L. monocytogenes, og analysert ved 7 dager etter infeksjon. Dette eksperimentet viser at behandling med IS001 forbedret IFN-y svar av både CD4 + og CD8 + lymfocytter. Figur 7 viser representative data fra en studie som undersøkte effekten av PPARa antagonist IS001 på mus overlevelse til endepunktene etter infeksjon med den modifiserte LD50 dose av organismen. Plottet er den prosentvise overlevelse av mus mot tiden etter infeksjon. Denne figuren viser at behandling med IS001 øket overlevelsen av hannmus til endepunktene. Til sammen vil disse data illustrerer hvordan denne modellen kan brukes til å undersøkeeffekten av nye legemidler eller behandlinger på IFN-γ responser in vivo og å utforske hvordan disse immun endringene påvirke dyr overlevelse fra infeksjon.

Figur 1
Figur 1. dissekere Milter fra infiserte mus. Denne serien av bilder viser hvordan å dissekere milten fra en død mus. (a) Ligg musen på sin høyre side og spray ned huden med 70% etanol. (b) Ved bruk av aseptiske eller sterile pinsetter og tøffe snitt saks, langsgående snitt i huden like under bunnen av brystkassen. (c) Spray ned det eksponerte muskellaget med 70% etanol. Milten skal være synlig under muskelen laget (åpen pil hodet). (d) Ved bruk av aseptiske eller sterile pinsetter og fine sakser, langsgående snitt i muskellaget for å avsløre milten. (e) ta forsiktig milt med pinsett og uSE gode saks til å klippe milten vekk fra omkringliggende bindevev. (f) Plasser milten i en 15 ml konisk rør som inneholder sterilt 1x PBS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Telle Splenocytter ved hjelp av en hemocytometer. (a) viser det sentrale gitteret på hemocytometer. (b) viser et forstørret riss av det sentrale gitter som inneholder 25 store kvadrater (som hver inneholder 16 mindre firkanter). De fem store rutene som brukes for telling er uthevet i grått (4 hjørne firkanter pluss sentrum torget i sentralnettet). (c) viser et forstørret riss av en av de store grå ruter. For å bestemme cellevolum i 10 6 / ml, første tellingalle levende celler i de fem store grå firkanter. I det viste eksemplet er dette teller 215. Når telle, sørg for å bare telle alle de klare (ikke-blå) celler, inkludert de som berører de doble linjene på høyre og nederst i rutenettet. Ikke telle cellene berøre doble linjer på venstre og toppen av rutenettet. Ta det totale fem firkantet tall og dele det ved 10 for å oppnå det antall celler i 10 6 / ml. I eksemplet, 215 dividert med 10 er 21,5 x 10 6 celler / ml. Merk at disse beregningene bare fungere hvis du teller fem av de store rutene som uthevet og fortynne celler 1: 1 i trypanblått. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. gating Strategi for påvisning av IFNγ Produksjonen i NK og NKT-celler. Først gate på lymfocytter på FSC-A av SSC-A plot. Deretter gate på de hendelser som er på diagonalen på FSC-H / FSC-A plot. Disse er de sing. Deretter gate på live (AmCyan -) og CD8 - celler. Deretter plotte tetramer flekker mot TCRβ. De NKT-cellene er innenfor den doble positive befolkningen og NK-celler er innenfor den doble negative befolkningen. Gate på de doble positive celler, og tomten NKp46 versus FSC. Gate på NKp46 negative befolkningen, som er de NKT-celler (denne porten kan settes ved å finne det punktet av divisjonen i de to populasjonene fra NK-cellen tomten). Den NK-celler er de tetramer - TCRβ - NKp46 + populasjonen. Innenfor NK og NKT-celler portene, blir de IFN-y + celler i PE kanalen identifisert etter innstilling av en port basert på FMO kontroll. Vennligst klikkher for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Representative data innhentet for frekvensene av IFN-γ + NK og NKT celler på 24 timer etter infeksjon. I dette eksperimentet, hann C57BL / 6J-mus (n = 3-4 / gruppe) ble infisert ip med 10 5 CFU for L. monocytogenes eller ble igjen un-infisert. Mus ble også administrert medikamentet IS001 eller bærer (0,5% karboksymetylcellulose) på samme tid av inokulering og 12 timer senere. Tjuefire timer etter inokulering, ble musene avlivet, og milten ble fjernet og ble behandlet hver for seg og farget for strømningscytometri. Vist er gjennomsnitt ± SEM frekvens av IFN-γ + celler i NK (a) eller NKT-celler porter (b) i ikke-infiserte eller infiserte mus etter behandling med et kjøretøy eller medikamentet IS001. *Indikereren forskjell (P <0,05) fra bærerkontrollen ved to-halet t-test. Data er re-skrives ut fra 31 med tillatelse fra Journal of Immunology (volum 195, pp. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. The American Association of Immunologer, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. gating strategi for påvisning av IFN-γ Produksjonen i CD4 og CD8-celler. Først gate på lymfocytter på FSC-A av SSC-A plott. Deretter gate på de hendelser som er på diagonalen på FSC-H / FSC-A plot. Disse er de sing. Innenfor denne gate, gate på live (AmCyan -) CD45 + celler. Deretter gate på enten CD8 + eller CD4 + populasjoner. Innenfor hver gate, IFN-γ +cellene i PE kanalen blir identifisert ved å sammenligne fargingen for FMO kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Representative data oppnådd for frekvensene av IFN-γ + CD4 + og CD8 + T-celler ved 7 dager efter infeksjon med L. monocytogenes (EGD-stamme). I dette eksperimentet, ble hann C57BL / 6J-mus infisert ip med 2 x 10 4 CFU L. monocytogenes (n = 7 / gruppe) eller ble igjen uinfiserte (n = 3 / gruppe). Mus ble også administrert medikamentet IS001 eller bærer (0,5% karboksymetylcellulose) to ganger daglig start på dagen for inokulering. Syv dager senere ble musene avlivet, og milten ble fjernet og ble behandlet individuelt forcellekultur. Splenocytt mononukleære celler ble stimulert i 24 timer med varmedrepte L. monocytogenes med protein transport hemmer lagt til finalen fire timer av kultur. Cellene ble så farget for strømningscytometri. Vist er gjennomsnitt ± SEM frekvens av IFN-γ + celler i CD4 + (a) eller CD8 + celle-porter (b) i uinfiserte eller infiserte mus etter behandling med en bærer (0,5% karboksymetylcellulose) eller medikamentet IS001. * Angir en forskjell (P <0,05) fra den bærerkontrollen motstykke som bestemt ved to-halet t-test. Data er re-skrives ut fra 31 med tillatelse fra Journal of Immunology (volum 195, pp. 5189-5202, 2015) .Copyright 2015. The American Association of Immunologer, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 7. Representant data innhentet i løpet av et eksperiment som sammenlignet effekten av et PPARa Antagonist 1S001 på mus overlevelse til endepunkter etter smitte av Mann C57BL / 6J Mus med L. monocytogenes (EGD belastning). I dette eksperimentet, hann C57BL / 6J-mus (N = 10 mus / gruppe) ble infisert ip med den modifiserte LD50 dose av organismen (10 5 CFU) av L. monocytogenes. Mus ble også administrert medikamentet IS001 eller bærer (0,5% karboksymetylcellulose) to ganger daglig start på dagen for inokulering. Musene ble fulgt daglig for kliniske tegn og ble avlivet hvis humane endepunkter var oppfylt. Vist er den prosentvise overlevelse av mus for å endepunkter over tid * angir en forskjell i overlevelse mellom gruppene som bestemt ved log-rank-test (P <0,05). Data er re-skrives ut fra 31 med tillatelse fra tidsskriftet of Immunology (volum 195, pp. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. The American Association of Immunologer, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1: Viser noen representative beregninger for å bestemme CFU i en delmengde av Day Culture. I dette eksemplet ble en porsjon av kulturen tatt dag og ble fortynnet 1: 1 med BHI-medium. OD 600 av denne fortynnede prøve ble bestemt til å være 0,84. I tillegg ble en 100 pl prøve tatt for bestemmelse CFU. Denne prøve ble fortynnet med 900 ul av BHI medier (10 -1) og ble vasket og resuspendert i 1 ml BHI. En 10-gangers fortynning serie av denne prøven ble utarbeidet (10 -2 til 10 -9) og fortynnede prøver ble sådd ut på BHI agar platene (bare verdier for 10 -4 til 10 -9 er vist). Neste dag kolonier ble tellet. Bare de platene som hadde koloni tall mellom 30-300 ble ansett for beregningen (dvs. 10 -6 plate, markert med gult). Antallet kolonier på denne plate (70) ble deretter dividert med 0,1 (volum i ml sådd ut) for å få den CFU / ml av den fortynnede prøven. Denne verdien ble deretter multiplisert med fortynningsfaktoren (10 6) for å oppnå CFU / ml lesning av ufortynnet kulturen. TMTC = for mange til å telle.

Tabell 2
Tabell 2: Farging Panel for påvisning av IFN-γ i NK og NKT celler. Legg merke til at enten kompensasjon perler farget med strømnings antistoffene anvendt i panelet eller splenocytter farget med forskjellige fluorokromkonjugerte versjoner av CD4-antistoff klon GK1.1 kan anvendes som enkle positive kontroller.

Tabell 3
Tabell 3: Farging Panel for påvisning av IFN-γ i CD4 + og CD8 + celler. Legg merke til at enten kompensasjon perler farget med strømnings antistoffene anvendt i panelet eller splenocytter farget med forskjellige fluorokromkonjugerte versjoner av CD4-antistoff klon GK1.1 kan anvendes som enkle positive kontroller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en protokoll på hvordan man skal gjennomføre en grunnleggende eksperimentell infeksjon med EGD stamme av L. monocytogenes 25 i mannlige eller kvinnelige C57BL / 6J mus. Denne protokollen ble satt opp for å studere effekten av en roman lite molekyl IS001 på IFN-γ produksjon av medfødte og ervervede lymfocytter in vivo 31. Ved å overvåke bakterie klaring og overlevelse etter infeksjon, ble innsikt oppnådd i hvordan disse forandringer i IFN-γ påvirket vertens evne til å kontrollere infeksjonen.

Kritiske betraktninger i protokollen

Et viktig hensyn i utformingen av denne typen studier er at hvert forsøk være tilstrekkelig drevet og hensiktsmessig kontrollert. På grunn av biologisk variasjon i immunresponsen mot infeksjon (se figurene 4 og 6), er det anbefalt at N = 4. - 5. mus pr gruppe som skal brukes for de innledende immun studiene. Hvis enfter disse studiene er det en trend i dataene, men ingen signifikant forskjell åpenbar mellom gruppene, kan en kraft beregning gjøres for å bestemme det minste antall dyr som kreves i senere studier for å oppnå statistisk signifikans. Når det gjelder kontroller, er det viktig å ta med ikke-infiserte kontroller for bestemmelse av basislinje IFN-y responser for immun studier og kjøretøy-kontroller for å bidra til å skille effekten av behandlingen av stress forbundet med administrering av behandlingen. Et annet viktig hensyn er tidspunktet for behandlingen. Siden det medfødte respons til L. monocytogenes er meget hurtig, er det anbefalt at den første behandlingen administreres på dagen før, eller samtidig som, inokulering for å sikre at terapeutiske nivåer av reagenset oppnås før initiering av den medfødte immunrespons.

Enda en annen viktig faktor er den dose av organismen som skal brukes for infection. En subletal dose anbefales for måling av bakteriemengde, ettersom det øker sjansen for at patogenet vil bli konsentrert i milten og leveren, slik at det mer nøyaktig telling av bakteriene. En sublethal dose anbefales også for opplisting IFN-y svar av adaptive lymfocytter for å sikre at dyr ikke bukke under for listeriose før tidspunktet for peak T-celle ekspansjon. I motsetning til dette er det anbefalt at en høyere infeksiøs dose anvendes for måling av tidlig NK og NKT-cellerespons på 24 timer for å maksimere den IFN-γ produksjon av disse cellene.

Den klassiske LD 50 er dosen av patogen som resulterer i 50% dødelighet hos mus. Siden døden var ikke en akseptabel endepunkt ved vår institusjon og siden mange symptomer på listeriose kan forutsi om et dyr er sannsynlig å bukke under for en infeksjon, brukte vi en definert liste over kliniske tegn i stedet for døden som et endepunkt i våre studier. USIng denne metoden, ble det bestemt at den modifiserte LD 50 var 10 5 CFU for åtte uker gamle mannlige og 1,5 x 10 5 CFU for 8 uker gammel kvinnelig C57BL / 6J mus 31. Disse LD 50 doser ble bestemt ved måling av prosent overlevelse av mus for å endepunkter i trinnvise doseeskalerings studier (N = 5 studier totalt) som hver inneholdt N = 8 mus per gruppe (for eksempel mus ble infisert først med 10 000 CFU , deretter en andre batch med 20 000 CFU, etc.). LD 50 Beregningen ble bestemt fra en regresjon plotting av log (CFU) (x-akse) versus den probit av prosent overlevelse verdier (y-aksen) (webside: userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit /ProbitAnalysis.pdf).

Legg merke til at den modifiserte LD 50 dose bestemmes i vårt laboratorium kan være forskjellig fra den i en annen lab selv når infisere mus med den samme stamme av L. monocytogenes. En del av denne variasjonen kan være knyttet til den subjektive natur of overvåke kliniske tegn på listeriose i forhold til de mer absolutte antall dødsfall. Ytterligere variasjon kan skyldes forskjeller i miljøfaktorer som mus diett eller bakterieflora eller forskjeller i utarbeidelsen av podestoff mellom laboratorier. Dermed anbefales det at før du tar fatt på noen overlevelsesstudier, være en pilotstudie utført hvor hunnmus (N = 8 mus / gruppe) er infisert med 1,5 x 10 5 CFU av samme stamme av L. monocytogenes som brukes i denne studere og symptomer overvåkes for å avgjøre om denne dosen faktisk resulterer i 50% overlevelse til endepunkter. Hvis overlevelse er lavere eller høyere enn 50% på dette CFU, kan trinnvis doseøkning eller dose nedtrapping studier gjennomføres for raskt å begrense i på LD 50 dose.

En annen viktig faktor er den belastning eller substrain av mus som brukes for infeksjonsstudier. Denne protokollen beskriver infeksjon av den vanlig brukte innavlet musestamme C57BL / 6J. Dette stammen er godt egnet for måling av IFN-y-reaksjoner, siden denne musen anses å være en Th1-utsatt for belastning 33, og som et resultat, er forholdsvis motstandsdyktig mot L. monocytogenes infeksjon (sammenlignet med Th2-utsatt musestammer så som BALB / c) 34,35. Tilpasning av denne protokollen til andre musestammer krever kunnskap om den smittende dose av organismen for den bestemte belastning. Det anbefales også å bruke mus på samme alder, kjønn og leverandøren som skissert i denne protokollen for å redusere mengden av feilsøking involvert i å sette opp modellen. For eksempel, C57BL / 6 mus bestilles fra én leverandør (f.eks C57BL / 6J) kan fremvise genetiske forskjeller enn C67BL / 6 mus bestilt fra en annen leverandør (f.eks C57BL / 6NTac) 36. I tillegg tarmfloraen er forskjellig mellom C57BL / 6 substrains oppnådd fra forskjellige leverandører, som kan påvirke balansen av Th1 og Th17 responser i mus 37.

ove_title "> Potensielle Endringer i Teknikk

Musene oftest inokuleres ip eller intravenøst, i motsetning til den naturlige vei for infeksjoner i mennesker, som er gjennom mage-tarmkanalen. Orale infeksjoner er mindre vanlig fordi standard stammer av L. monocytogenes ineffektivt infisere tarmepitelet av mus 38. Dette er fordi det er en enkelt aminosyreforandring i sekvensen til mus E-cadherin fra human E-cadherin som resulterer i tap av gjenkjenning av E-cadherin av listerial invasjon protein, internalin A (Inia) 39. For å overvinne denne barrieren, forskere bruker mus som er transgene for human E-cadherin protein eller bruke listeria som er konstruert for å uttrykke en mutert sekvens av Inia (Inia mut) som binder seg til muse E-cadherin med samme affinitet som WT EGD for menneskelig E-cadherin 40. Således, en potensiell modifikasjon av denne teknikken er å infisere mus via den orale rute. Leseren henvises til en annen Jove publikasjon som beskriver muntlige inokulasjon metoder 38. Legg merke til at forandre modusen for infeksjon vil påvirke den smittende dose, så vel som kinetikken ved formidling av organismen.

Denne protokollen beskriver ved hjelp av varme-drepte listeria å utløse IFN-γ produksjon av CD4 + og CD8 + T-celler. Varme drept L. monocytogenes ble valgt som en stimulans i våre studier, fordi dette antigenet er billig og fordi vår lab var primært interessert i CD4 + T-celle responser til patogenet. En begrensning er at varme-drepte bakterier ikke effektivt prim CD8 + T-celle-responser, enten in vitro 41 eller in vivo 42,43 infeksjon. Således kan CD8 + T-celle-IFN-γ produksjon som vi observerte av splenocytter høstes på toppen av infeksjon (dvs. figur 6) sannsynligvis er i respons til den gjenværendelevende bakterier til stede i splenocytt kulturer eller ble utløst som følge av cytokin-indusert cytokin frigjøre 41. Som et alternativ til varmedrepte listeria, kan man også fremkalle IFN-y-responser ex vivo ved å utsette T-celler til peptider som koder epitoper på listerial proteiner. Faktisk immunodominant MHC klasse II-begrenset epitoper for listeriolysin O og p60 hydrolase og har blitt beskrevet for C57BL / 6 og BALB / C-mus og immunodominante MHC klasse I-epitoper er blitt beskrevet for BALB / c-44. Enda en annen løsning er å infisere mus med stammer av L. monocytogenes som har blitt konstruert til å uttrykke modell antigener, slik som ovalbumin eller virale antigener for å utnytte eksisterende MHC klasse I- og klasse II MHC-tetramer reagenser for å spesifisere antigenspesifikk T-celler i infiserte mus 45,46.

Andre Begrensninger i protokollen

En annen begrensning av denne modellen er at den oNLY tiltak IFN-γ produksjonen av immunceller i milten. I tillegg til bruk av tetramerer å nummerere antigen-spesifikke T-celler (av ovalbumin-uttrykkende varianter av L. monocytogenes), strømningscytometri flekker paneler som er beskrevet her kan lett modifiseres til å måle produksjonen av andre cytokiner så som TNF og IL-2 eller effektor molekyler som deltar i CD8 T-celle eller NK-mediert dreping av organismen som perforin eller granzyme B. i tillegg kan denne protokollen også være tilpasset for å undersøke IFN-γ produsert av immunceller i leveren.

fremtidige Applications

Når denne protokollen er mestret, kan det fungere som en enkel in vivo modell for å screene effekten av ulike agenter eller gener på Th1 og cellulær immunitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion Broth, Modified BD 299070 any brand should be appropriate
Agar BD 214010 any brand should be appropriate
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 any brand should be appropriate
1x PBS Sigma D8537 any brand should be appropriate
TissueLyser II Qiagen 85300 any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl) any brand should be appropriate
KHCO3 any brand should be appropriate
Na2EDTA any brand should be appropriate
RPMI 1640 Gibco 22400089 any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum  Gibco 12483 Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine Gibco 25030 any brand should be appropriate
Non-essential amino acids Gibco 11140 any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD 554724 Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaldehye Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS
10x Perm/Wash buffer BD 554723 Dilute 1x in ddH2O
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506 eBioscience 65-0866 Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) eBioscience 15-0041 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) eBioscience 11-0081 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC NIH Tetramer Core Facility N/A Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) eBioscience 25-5961 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) eBioscience 47-3351 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) eBioscience 25-0451 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) eBioscience 12-7311 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads eBioscience 01-1111 Use one drop per stain
Mouse IFN gamma ELISA kit eBioscience 88-7314 Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 ml vented tubes for culture Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes any brand should be appropriate
bacterial petri dishes any brand should be appropriate
2 ml cyrovials any brand should be appropriate
UV spectrometer any brand should be appropriate
safety engineered needles any brand should be appropriate
C57BL/6J Jackson laboratories Stock#000664 Order for arrival at 7 weeks
Bleach For decontamination
70% Ethanol For decontamination
Glass beads any brand should be appropriate
Centrifuge rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge any brand should be appropriate
Sterile Glycerol any brand should be appropriate
Pipette Tips any brand should be appropriate
Pipette any brand should be appropriate
Surgical instruments any brand should be appropriate
70 micron strainers any brand should be appropriate
3 ml syringe any brand should be appropriate
Pipette gun any brand should be appropriate
Filtration Units any brand should be appropriate
Trypan Blue Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate
Hemocytometer any brand should be appropriate
Round bottomed plates any brand should be appropriate
FACs tubes Fisher Scientific 14-959-5
BD LSR II BD Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software Treestar Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0 - 300 µl) Eppendorf Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System Pro-lab Diagnostics Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
  2. Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
  3. Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
  4. Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
  5. Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
  6. Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
  7. Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  8. Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
  9. Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
  10. Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
  11. Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
  12. Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
  13. Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
  14. Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
  15. Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
  16. Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
  17. Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
  18. Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
  19. Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
  20. Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
  21. Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
  22. Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
  23. Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
  24. Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
  25. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  26. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
  27. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
  28. Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
  29. BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf (2007).
  30. Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. http://www.flowjo.com/tutorials (2016).
  31. Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
  32. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
  33. Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
  34. Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
  35. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  36. Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
  37. Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
  38. Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
  39. Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
  40. Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
  41. Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
  42. Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
  43. Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
  44. Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
  45. Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
  46. Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).

Tags

Infeksjon , Bakterier infeksjonsmodell mus strømningscytometri interferon-γ svar
Eksperimentell infeksjon med<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Som en modell for å studere Host interferon-y Responses
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, … More

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, M. A., Mallevaey, T., Dunn, S. E. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (117), e54554, doi:10.3791/54554 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter