Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Experimentele infectie met Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54554
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft het enten van C57BL / 6J muizen met de EGD stam van Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) en interferon-γ (IFN-γ) responsen door natuurlijke killer (NK) cellen, natuurlijke killercellen (NKT) cellen te meten, en adaptieve T-lymfocyten na de infectie. Dit protocol beschrijft ook hoe om te overleven onderzoek bij muizen na infectie met een aangepaste LD 50 dosis van de ziekteverwekker.

Abstract

L. monocytogenes is een gram-positieve bacterie die een oorzaak van voedsel overgedragen ziekte bij mensen. Experimentele infectie van muizen met deze ziekteverwekker zeer informatief over de rol van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem cellen en specifieke cytokinen in gastheer immuniteit tegen intracellulaire pathogenen zijn. Productie van IFN-γ door aangeboren cellen tijdens subletale infectie met L. monocytogenes is belangrijk voor het activeren van macrofagen en snelle bestrijding van het pathogeen 1-3. Bovendien, IFN-γ productie door adaptieve geheugen lymfocyten is belangrijk voor het vullen van de activering van het aangeboren cellen na 4 herinfectie. L. monocytogenes infectie model vormt dus een groot hulpmiddel voor het onderzoeken of er nieuwe therapieën die zijn ontworpen om IFN-γ verhogen van invloed zijn op IFN-γ responsen in vivo en zijn productieve biologische effecten zoals het verhogen van bacteriële verwijdering en overleving verbeteren muis vaninfectie. Hier beschreven is een eenvoudig protocol voor hoe intraperitoneale infectie van C57BL / 6J muizen met de EGD stam van L. monocytogenes te voeren en IFN-γ productie door NK-cellen, NKT-cellen en adaptieve lymfocyten door flowcytometrie gemeten. Bovendien worden procedures beschreven: (1) groeien en voorbereiden van de bacteriën voor inoculatie (2) meten bacteriële verontreiniging in de milt en lever, en (3) overleving maatregel dier eindpunten. Representatieve gegevens worden ook verschaft om te illustreren hoe deze infectie model kan worden gebruikt om het effect van specifieke middelen die IFN-γ reacties op L. monocytogenes en overleving van muizen uit deze infectie te testen.

Introduction

IFN-γ is een cytokine die cruciaal is voor het mediëren van immuniteit tegen intracellulaire pathogenen en voor het regelen tumorgroei 5. Het belang van deze cytokine in bacteriële resistentie blijkt uit de observatie dat de mens met mutaties in de IFN-γ signaalweg zijn zeer gevoelig voor infectie met mycobacteriën en Salmonella 6. Evenzo muizen die zowel IFN-γ of IFN-γ receptor vertonen defecten in weerstand tegen mycobacteriën 7-9 en andere intracellulaire pathogenen waaronder L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, Salmonella typhimurium 13 en 11 bepaalde virussen. Naast bestrijding pathogenen, IFN-γ speelt een cruciale rol in gastheer-afweer tegen tumoren 14. Hoewel hogere productie van IFN-γ gunstig in verband met infectie of kanker is langdurige productie van dit cytokine verbonden to de ontwikkeling van systemische auto-immuniteit 15-17 en de versnelling van diabetes type I in de niet-obese diabetische muismodel 18.

De belangrijkste bronnen van IFN-γ omvatten NK-cellen, NKT-cellen, γδ T-cellen, T helper 1 (Th1) cellen en cytotoxische T-lymfocyten (CTL) 5,19,20. IFN-γ verhoogt zowel aangeboren als adaptieve immuniteit door: (1) opreguleren major histocompatibility complex (MHC) klasse I en II expressie, (2) het verhogen van de expressie van co-stimulatoire moleculen op antigeen presenterende cellen, (3) verbetering macrofaag fagocytose en de productie van pro-inflammatoire cytokines en microbiële factoren (bijvoorbeeld stikstofoxide en reactieve zuurstofsoorten), (4) het bevorderen van de differentiatie van naïeve CD4 + T-cellen in Th1 effectorcellen, (5) het bevorderen antilichaamklasse omschakeling immunoglobuline ( ig) 2a en IgG3 (in muizen), (6) het induceren van de productie van chemokinen immuuncellen rekruteren naar sites infection, en (7) verbetering van NK-cellen en CTL-reacties 5,19. Gezien het grote belang van IFN-γ in de gastheer respons op pathogenen en tumoren is recombinant IFN-γ getest voor de behandeling van verschillende infecties en maligniteiten (besproken in 19). Vanwege systemische toediening van IFN-γ of Th1 bevorderen cytokine interleukine-12 (IL-12) is geassocieerd met bijwerkingen en dosis-gerelateerde toxiciteit 19,21 is er belangstelling voor de ontwikkeling van alternatieve strategieën voor IFN-γ-productie door verhogen immuuncellen. Ontwikkeling van nieuwe biologische middelen en kleine moleculen nodig vivo screening hulpmiddelen om te testen of dergelijke middelen verhogen IFN-γ productie tijdens een immuunrespons en of dit neer zinvolle biologische effecten, zoals toename in overleving van dieren.

Experimentele infectie van muizen met de gram-positieve bacterie L. monocytogenes is een instrumentale model geweestontcijferen van de rol van IFN-γ in gastheer-immuniteit tegen intracellulaire pathogenen 1,22. Infectie van muizen met het pathogeen intraveneus of intraperitoneaal (ip) leidt tot de snelle verspreiding van de bacteriën aan de milt en lever, waar ze raken geïnternaliseerd door macrofagen en hepatocyten met piek bacteriële belasting in de milt die tussen 3 en 4 dagen na de infectie 1,3,22. Productie van IFN-γ NK-cellen is belangrijk voor macrofaagactivering en vroege resistentie tegen het pathogeen 3; echter bij hoge infectieuze doses productie van IFN-γ kan ook schadelijk pathogeen speling 23 zijn. NKT cellen zijn ook een bron van IFN-γ in de milt en lever tijdens de vroege beheersing van pathogenen 2,24 en deze productie is aangetoond dat amplificeren IFN-γ productie door andere celtypen, waaronder NK-cellen 2. Anderzijds, later werkende adaptieve T-lymfocyten, CD8 + T-cellen in partiname op, zijn belangrijk voor het bemiddelen van de goedkeuring van de ziekteverwekker en bescherming tegen herinfectie 1,4,22.

Deze infectie model voor onderzoekers om een aantal redenen (besproken in 1) is. Eerste infectie met het pathogeen is zeer reproduceerbaar en induceert een sterke Th1 en cellulaire immuunrespons. Anderzijds in subletale infecties, bacteriële verontreiniging wordt geconcentreerd in de lever en milt die gemakkelijk kan worden gemeten. Ten derde kan de ziekteverwekker veilig worden behandeld onder Biosafety Level 2 (BSL2) omstandigheden. Ten vierde, het organisme en de immuunrespons die wordt gegenereerd zijn uitgebreid gekarakteriseerd. Tenslotte zijn verschillende mutant en genetisch gemodificeerde stammen ontwikkeld die beschikbaar zijn voor gebruik.

Hier beschreven is een eenvoudig protocol voor inoculatie van C57BL / 6J muizen met de EGD stam van L. monocytogenes en 25 voor het meten van IFN - γ reresponsies door NK, NKT en adaptieve lymfocyten na infectie. Ook beschreven is hoe bacteriële verontreiniging in de milt en lever meten nadat subletale infectie en overleving studies na infectie uit te voeren met een gewijzigde LD 50 dosis van de ziekteverwekker. Tenslotte zijn representatieve gegevens weergegeven hoe dit protocol kan worden gebruikt om het effect van nieuwe behandelingen IFN-γ reacties en muis overleving screenen van L. monocytogenes infectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

veiligheid Verklaring

Dit protocol beschrijft infectie van muizen met levende L. monocytogenes. De ziekteverwekker wordt veilig behandeld onder BSL2 omstandigheden door getraind personeel die niet immuungecompromitteerd. Immunogecompromitteerde mensen onder zwangere vrouwen, ouderen en mensen die HIV-geïnfecteerde of chronische aandoeningen die behandeling met immunosuppressieve therapie nodig hebben. Het personeel moet een beschermende lab jas of jurk, handschoenen, masker en oogbescherming te trekken tijdens het hanteren van besmette monsters. De hierin beschreven werk werd uitgevoerd onder BSL2 voorwaarden waaronder een certificaat (# 32876) die werd uitgegeven door de University Health Network (UHN) Biosafety kantoor. Karkassen van geïnfecteerde muizen of ongebruikte weefsels waren dubbel verpakt en afgevoerd in biologisch gevaarlijk afval. Kooien van geïnfecteerde muizen werden ook ontsmet door autoclaveren.

ethiek Verklaring

De muizen werden onderhouden en besmet in een quarantine kamer binnen UHN dier faciliteiten en waren in overeenstemming met de door de Canadese Raad over Animal Care richtsnoeren verzorgd. Alle procedures op muizen werden uitgevoerd in het kader van het gebruik van dieren protocol # 3214 die door de UHN dier zorg commissie werd goedgekeurd uitgevoerd. Als gevolg van ethische overwegingen, werd de dood niet als een eindpunt om te overleven studies. De gemodificeerde LD 50 dosis hier beschreven voor L. monocytogenes infectie werd bepaald aan de dosis waarbij 50% van de muizen bereikte specifieke eindpunten, die bestond uit een 20% verlies aan lichaamsgewicht of waarin ten minste twee van de volgende klinische symptomen zijn: lethargie, gegolfde vacht, gebogen houding, ademhalingsmoeilijkheden, saai of ingevallen ogen. Muizen werden gedood als ze eindpunten via blootstelling aan kooldioxide (CO 2) volgens UHN faciliteit richtlijnen bereikt.

1. Bereiding van glycerol voorraden voor langdurige opslag

OPMERKING: Deze procedure wordt beschreven hoe glycerol voorraden van deEGD stam van L. monocytogenes zijn bereid uit een originele glycerol voorraad. Stappen die de potentie om aerosolen te genereren moet worden uitgevoerd binnen een gecertificeerd bioveiligheid kast (BSC).

  1. Bereid je hersenen het hart infusie (BHI) agar platen voor de groei van bacteriën. Hierbij voeg 3,8% (w / v) BHI bouillon en 1,5% (w / v) agar dubbel gedestilleerd H2 O (DDH 2 O). Autoclaaf vloeistof. Zodra de agar afkoelt tot 50 ° C, doseren vloeistof in bacteriële petrischalen (25 ml / schaal) en laat drogen platen (blanke) in de BSC voor 1 uur.
    OPMERKING: Transfer BHI agar in een 50 ° C waterbad na autoclaveren te stollen voor het gieten platen voorkomen. Store BHI platen bij 4 ° C op zijn kop (met media-kant op de top), totdat klaar voor gebruik.
  2. Bereid vloeibaar BHI media. Hiervoor meng 3,8% (w / v) BHI bouillon DDH 2 O. autoclaaf.
  3. Verwijder bevroren glycerol voorraad van de L. monocytogenes EGD stam uit het -80 ° C vriesr en ontdooien bij kamertemperatuur.
  4. Dompel een steriele pipet tip in de ontdooide glycerol voorraad en onmiddellijk streak de punt heen en weer over een gedeelte van een BHI plaat. Dit is de eerste streep.
  5. Draai de plaat 90 ° C en het gebruik van een frisse pipetpunt, sleept u door de eerste streak en verspreiden naar de volgende ¼ van de plaat (dit is de secundaire streak). Herhaal dit nog een keer naar de tertiaire streak te maken.
  6. Draaiplaat ondersteboven en incubeer bij 37 ° C overnacht. Één uniform kolonies moet worden verkregen in de laatste set van strepen en zichtbaar tussen de 16 en 24 uur.
  7. Doseer 10 ml steriel BHI bouillon in een steriele geventileerd 50 ml buis. Kies één kolonie van L. monocytogenes van de plaat met behulp van een steriele pipet tip en het enten van de bouillon. Incubeer de cultuur in een 37 ° C orbitale schudden incubator 's nachts of totdat OD 600 = 1.0 met instellingen bij 225 omwentelingen per minuut (rpm).
    LET OP: Het glas of wegwerp plastic Erlenmeyer kolven kan ook worden gebruikt om kweken bacteriën. Ongeacht het soort container gebruikt, ervoor zorgen dat het steriel, afgeblazen en dat het volume van de cultuur ten hoogste 20% van het totale volume van de houder passende beluchting van de bacteriën te verzekeren.
  8. Bereiden glycerol voorraden door het mengen van een steriele 100% glycerol met overnachting bacteriële vloeibare kweek in een verhouding 1: 1. Verdeel de bacteriële / glycerol mengsel in 2 ml cryogene flesjes (500 ul / flacon) en de overdracht van flesjes tot -80 ° C vriezer voor opslag.
    OPMERKING: Bead stock werkwijzen kunnen ook worden gebruikt in plaats van glycerol voorraden bacteriën slaan. Door deze werkwijze worden poreuze microkralen geënt met een zuivere kweek van L. monocytogenes en worden bij -80 ° C bewaard. Elke kraal kan worden gebruikt om een ​​nieuwe kweek te inoculeren indien nodig. Zie materialen lijst voor meer informatie.

2. Vaststelling van de groeicurve van L. monocytogenes in Dag van Cultuur OPMERKING: deze procedure wordt beschreven hoe u de groeicurve voor L. monocytogenes die wordt gebruikt om de kolonievormende eenheden (CFU) te schatten voor infectie studies te genereren. Alle stappen die het potentieel hebben om aerosolen te genereren moet worden uitgevoerd binnen een gecertificeerd BSC.

  1. Neem 100 pl kweek gedurende de nacht geproduceerd in stap 1,7-10 ml BHI media in een geventileerde 50 ml buis en groeien bij 37 ° C in een schudincubator (225 rpm, gekanteld onder 45 ° hoek). Gebruik een niet-geënte buis ter controle.
  2. Neem 0,5 ml monsters van de kweek om het uur (1, 2, 3, 4, 5, 6 uur, enz.). Verdun elk aliquot 1: (v / v) met 1 BHI media in een plastic cuvet. Pipet op en neer om te mengen. Meet de optische dichtheid (OD) bij 600 nm (OD 600) met een spectrometer. Ga door het kweken van bacteriën tot OD 600 = 1.
  3. Tegelijkertijd, raadpleeg 100 pi monster van de kweek en verdun met 900 ul BHI media in een steriele 1,5 ml microcentrifuge buis (dit is de 10 -1 verdunning). Centrifugeer de kiemen bij 6000 g gedurende 5 min, en zuig de supernatant.
  4. Was tweemaal bacteriën door resuspenderen van de pellet in 1 ml BHI media, centrifugeren gedurende 5 min bij 6000 xg, en de bovenstaande vloeistof opzuigen. Resuspendeer de pellet in 1 ml BHI media. Bereid een 10-voudige verdunningsreeks van dit monster in BHI media (10 -2 tot 10 -9). Spread 100 gl van elk oplosmiddel afzonderlijk op BHI-agarplaten. Incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 ° C in een incubator.
  5. De volgende dag, pick-platen die tussen de 30 hebben - 300 kolonies. Gooi de rest weg. De kolonies op deze platen. Tabel 1 toont een voorbeeld van tellingen verkregen in een hoeveelheid die is gemaakt bij OD 600 = 0,84. In dit voorbeeld, één van de platen (dwz 10 -6 verdunning) had kiemgetal tussen 30-300 en werd gebruikt voor de CFU / ml berekening.
    LET OP: Platen met een groteredan 300 kolonies worden niet gebruikt, omdat overbevolking bacteriegroei kunnen belemmeren en maakt het ook moeilijk te onderscheiden en te sommen individuele kolonies. Platen met tellingen <30 ook niet gebruikt omdat kleine fouten in verdunningstechniek of de aanwezigheid van verontreinigingen een grote invloed op de nauwkeurigheid van tellingen aan de onderkant van het bereik kan hebben.
  6. Verdeel het aantal kolonies door het volume bedekt en vervolgens vermenigvuldigen met de verdunningsfactor de CFU / ml waarde voor een bepaalde verdunning te verkrijgen. In het voorbeeld in Tabel 1, de telling van de 10 -6 verdunning was 70. Verdeel deze waarde met 0,1 ml aan de CFU / ml waarde voor de verdunde cultuur. Vermenigvuldigt dan deze waarde met de verdunningsfactor (10 6) naar de CFU / ml waarde van de onverdunde kweek (7,0 x 10 8) te verkrijgen.
  7. Zet de OD 600 (y-as) versus de tijd in h (x-as) tot de logaritmische groeifase 26 identificeren.
    LET OP: Deze groei curve geeft een schatting van de CFU / ml kweek van de dag wanneer ze groeien tot een bepaalde OD. Kies een OD 600 lezing die in de logaritmische groeifase die kan worden gebruikt als een doelwit OD 600 voor het kweken van dag kweken. Deze gegevens kunnen nu worden gebruikt om de CFU schatten in een kweek voor de bereiding van inoculum (Procedure 3).

3. Voorbereiding van de Inoculum voor experimentele besmetting met L. monocytogenes

OPMERKING: Deze procedure beschrijft de bereiding van de besmettelijke entstof van een dagje cultuur die werd gestart vanuit een nachtelijke kweek (bereid in Procedure 2). Al deze stappen worden uitgevoerd in de BSC, tenzij anders aangegeven.

  1. Bereken het aantal CFU nodig voor infectie op basis van het aantal muizen en de experimentele opzet van de studie. Voeg een geschikt volume van BHI media om een ​​steriele geventileerde Erlenmeyerkolf of cultuur buis.
    LET OP: De CFU bacteriën pgerepareerd is afhankelijk van het soort experiment uitvoerbaar is. Voor het bestuderen NK en NKT cel responsen tijdens infectie wordt elke muis geïnoculeerd met 10 CFU bacteriën 5 (Procedure 6). Als bestuderen adaptieve T celresponsen infectie of meten van bacteriën, is elke muis geïnoculeerd met 2 x 10 4 CFU bacteriën (Procedure 8). Bij het bestuderen van de overleving van eindpunten, wordt elke muis geënt met de LD 50 dosis van het pathogeen (dat is 10 5 CFU voor mannen en 1,5 x 10 5 CFU voor vrouwen, zie Procedure 9).
  2. Inoculeer de buis met BHI media met 100 ul van 's nachts cultuur. Incubeer de cultuur in een 37 ° C orbitale schudden incubator (225 rpm) tot doel OD600 is bereikt. Transfer inhoud cultuur in een steriele centrifugebuis.
  3. Centrifuge bacteriën tot een pellet gedurende 5 minuten bij 6000 xg met een centrifuge. Zuig het supernatant met een stofzuiger bevestigd aan een val kolf met bleekwater.
  4. Was de pellet twee keer met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), centrifugeren (5 min bij 6000 xg) ertussen.
  5. Zuig het tweede wassing en verdun bacteriën met de juiste concentratie van 1 x PBS om de CFU leveren van belang elke muis in een 200 ui volume.
    LET OP: Het beste is om een commerciële bron van steriele 1x PBS te gebruiken voor het wassen van bacteriën en voor de bereiding van de entstof, omdat lab glaswerk immunologische verontreinigingen zoals lipopolysaccharide kunnen introduceren.

4. experimentele besmetting van muizen met L. monocytogenes

OPMERKING: Deze procedure wordt beschreven hoe om muizen te infecteren met het bereid is in procedure 3 en hoe de CFU geleverd in het inoculum te controleren. Behandeling van muizen en injecties worden uitgevoerd in een BSC.

  1. Bestel een voldoende aantal mannelijke of vrouwelijke C57BL / 6J muizen voor uw experiment. Ook bestellen muizen om als niet-geïnfecteerde controles dienen.
  2. Toestaan ​​muizenacclimatiseren 1 week voor bacteriële inoculatie.
    Opmerking: Dit is omdat de stress in verband met transport van de dieren een voorbijgaande toename stresshormoon productie lymfopenie 27,28 kan leiden.
  3. Op de dag van inoculatie verkrijgen van een basislijn lichaamsgewicht voor elke muis en opnemen in de Labjournaal.
  4. In de BSC, meng de bacteriële suspensie op en neer met een steriele pipet zodat de bacteriën gelijkmatig zijn verdeeld en neem vervolgens 200 ul van het inoculum in een 1 ml veiligheid ontworpen injectiespuit voorzien van een 25 G naald.
  5. Injecteer muis ip met 200 gl van bereide inoculum (bijvoorbeeld 10 5 CFU NK cel infectie Procedure 6). Voor deze procedure Scruff muizen met de minder dominante hand door grijpen de losse huid rond de schouders van de muis. Nadat verzekerd is dat de muis staat ingehouden, spuit de muis in het onderste kwadrant van de buik, net lateraal van de midline naar de blaas te voorkomen.
  6. Gooi de naald en spuit in een biologisch gevaarlijk naaldencontainer.
  7. Herhaal stap 4,3-4,6 totdat alle muizen geïnjecteerd. Voeren soortgelijke stappen met 1x PBS geïnjecteerde muizen (niet-geïnfecteerde controles).
    LET OP: Aangezien de CFU is een schatting op basis van de groeicurve, het is ook een goede gewoonte om de eigenlijke CFU in het inoculum te controleren. Hiervoor bereiden 3-4 verschillende verdunningen van het bereide inoculum (met 10-voudige verdunningsreeks) die u verwacht leidt tot telbare kolonies. Spread 100 gl van elk verdunningsmiddel op een BHI agar plaat en incubeer overnacht bij 37 ° C. De kolonies en berekening van de werkelijke CFU / ml zoals beschreven in procedure 2.

5. Voorbereiden-Heat gedood L. monocytogenes voor Immune Studies

OPMERKING: Alle stappen die het potentieel voor het genereren van aerosolen worden uitgevoerd binnen de BSC hebben.

  1. Grow dag cultuur tot OD 600 waarden eenopnieuw bereikt die binnen de logaritmische fase. Doseer cultuur in 1,5 ml microcentrifugebuizen.
  2. Incubeer buizen in een 70 ° C in een waterbad gedurende 1 uur om bacteriën te doden.
  3. Was bacteriën tweemaal met 1x PBS zoals in stap 3,3 en 3,4. Resuspendeer in steriele RPMI compleet medium met foetaal kalfsserum (FCS) (zie Aanvullende bestand naar recept 1) bij een concentratie van 4 x 10 6 / ml. Aliquot gedode bacteriën in 2 ml steriele cryogene flesjes en bewaar bij -80 ° C.
  4. Bevestigen de dood van de bacteriën door het verspreiden van 100 pl hitte gedode bacteriën voorbereiding op BHI-agarplaten en overnacht incuberen bij 37 ° C.
    LET OP: Deze hitte gedode bacteriën moet klaar zijn voor het stimuleren van lymfocyten in cultuur in Procedure 8. zijn Als er sprake is van kolonies groeien op de BHI agar plaat, herhaalde hitte doden procedure.

6. Meting van IFN-γ Antwoorden NK en NKT cellen tijdens infectie

LET OP: deze procedure wordt beschreven hoe u de IFN-γ reacties van NK en NKT-cellen bij muizen te meten bij 24 uur na infectie met 10 5 CFU van de L. monocytogenes. Deze dosis wordt gebruikt omdat het leidt tot robuuste IFN-γ responsen NK en NKT-cellen in de milt 24. Voeren alle stappen in de BSC. Te helpen handhaven levensvatbaarheid van de cellen, blijven cellen op ijs indien mogelijk en gebruik ijskoude buffers.

  1. Inoculeer muizen zoals beschreven in Procedure 4 met 10 5 CFU van de L. monocytogenes. Tegelijkertijd injecteren niet-geïnfecteerde controlemuizen ip met een gelijk volume van 1 x PBS.
  2. Euthanaseren muizen 24 uur na inenting door CO 2 inhalatie volgens de institutionele richtlijnen.
  3. Liggen elke muis op zijn rechterkant en nat beneden de huid met 70% ethanol met behulp van een knijpfles.
  4. Met behulp van aseptische of steriel pincet en taai-cut schaar, incise de huid net onder de onderkant van de ribbenkast.
  5. Spray omlaagde blootgestelde spierlaag met 70% ethanol. De milt moet zichtbaar onder de spierlaag (open pijlpunt in figuur 1) zijn.
  6. Met behulp van aseptische of steriel pincet en fijne schaar, incise de spierlaag om de milt te onthullen. Voorzichtig pak de milt met de tang en het gebruik van fijne schaar om de milt weg te snijden uit de omliggende bindweefsel.
  7. Plaats de milt in een 15 ml conische buis met steriel 1x PBS.
  8. Half-fill steriele petrischaaltjes met steriel 1x PBS. Distantiëren de milt door een 70 um nylon cel zeef in de petrischaal met behulp van de platte kant van een steriele 3 ml spuit.
  9. Breng de splenocyten suspensie in een schone steriele 15 ml conische buis met een steriele 10 ml serologische pipet.
  10. Centrifugeer monsters bij 335 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  11. Zuig het supernatant in een val kolf met bleekwater. Draai de cel pellet door de knop van de buis met een vinger of door de onderste buis te slepenheen en weer over een gegolfd oppervlak (bv luchtstroom opening in de BSC).
  12. Lyse rode bloedcellen door het toevoegen van 1,5 ml ammonium-chloride-Kalium (ACK) lysisbuffer (zie Aanvullende File 1 voor recept) aan elke milt. Na exact 1 minuut en 15 seconden, vul de buis met 1x PBS om de cellyse stoppen.
  13. Centrifugeer cellen zoals beschreven in stap 6.10. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer (1x steriele PBS dat 2% FCS).
  14. Tel de cellen met een hemocytometer. Hiervoor neem twee porties van celsuspensie voor het tellen. Voeg 15 pi van elke celsuspensie aan een gelijk volume van trypan blauw (0,04%, gemaakt door verdunning 0,4% trypan blauwe oplossing in DDH 2 O). Belasting 15 pi van elke cel / trypan blauw schorsing in de kamer van de hemocytometer (dat wil zeggen, een in de bovenste kamer, een in de onderste kamer).
  15. Met behulp van een microscoop, tel alle niet-blauwe cellen invijf grote vierkanten van het centrale netwerk in elke kamer (figuur 2). Neem deze telling en delen door 10 om het aantal cellen in 10 6 / ml. In het voorbeeld in figuur 2, de telling 215 cellen in 5 vierkantjes; Daarom is de celconcentratie 21,5 x 10 6 / ml. Middel de celconcentraties verkregen uit de twee monsters.
  16. Seed 1 x 10 6 cellen per putje / vlek in een 96 putjes ronde bodemplaat voor flowcytometrie kleuring. Zorg ervoor dat de cellen ook zaad voor ongekleurd en fluorescentie min één (FMO) controles. Zie aanbevolen flowcytometrie kleuring paneel in tabel 2.
    LET OP: Voor de volgende stappen, is het raadzaam om cellen op ijs of bij 4 ° C te houden en om cellen te beschermen tegen licht met folie als fluorochromen aanwezig zijn. Een multichannel pipet kan worden gebruikt om vloeistoffen in 96-well platen kleuring afzien versnellen verwerking. Zorg ervoor dat u de cel pellet wanneer verstorenopzuigen het supernatant van het gecentrifugeerde plaat. Kleuring kan ook in FACS buisjes als de centrifuge niet voorzien is van plaat adapters. Alle centrifuge een steenworp afstand van dit punt worden gedaan op 456 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  17. Centrifuge de plaat en daarna wassen cellen tweemaal met FACS buffer. Wassen wordt uitgevoerd door toevoeging van 200 pi FACS-buffer aan elk putje, de plaat centrifugeren, afzuigen en het supernatant.
  18. Voer blokkeringsstap door toevoeging van 50 gl / putje van FACS buffer die anti-muis CD16 / CD32 (gezuiverd Fc blok) (0,5 ug). Incubeer de cellen bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Was de cellen eenmaal in 1x PBS zoals hierboven beschreven.
  19. Voeg 100 ul levensvatbaarheid kleurstof (opgelapt levensvatbaarheid kleurstof verdund 1: 1000 in 1x PBS) aan cellen. Vlek cellen bij 4 ° C in het donker (in de koelkast) gedurende 30 min. Was de cellen tweemaal in FACS-buffer zoals hierboven beschreven.
  20. Na een tweede wasbeurt, voeg 100 ul van celoppervlak antilichamen of tetrameren respectievelijk aan de putjes volgens to de kleuring paneel in Tabel 2. Vlek cellen bij 4 ° C in het donker (in de koelkast) gedurende 30 min. Op dit moment, ook antilichamen toe te voegen voor het kleuren van één positieve en FMO controles.
    OPMERKING: Met betrekking enkele positieve controles, is het raadzaam hetzij gebruik splenocyten die zijn gekleurd met fluorochroom verschillende versies van het CD4-antilichaam of commerciële compensatie kralen die zijn gekleurd met de antilichamen die in het paneel. Voordat zij deze kleuring procedure moeten alle FACS antilichamen worden getitreerd proef studies optimale concentraties kleuring bepalen.
  21. Was de cellen tweemaal in FACS-buffer zoals hierboven beschreven en bevestig cellen door ze te resuspenderen in 50 ui 4% paraformaldehyde (16% paraformaldehyde stock verdund in DDH 2 O) en incubatie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. LET OP: Het paraformaldehyde is giftig en mag alleen in de zuurkast worden behandeld.
  22. Was de cellen tweemaal in FACS buffer, centrifugeren tussenin. Resuspendeer cellen in FACS-buffer. Ga door naar de volgende stap of op te slaan cellen in de koelkast beschermd tegen licht voor maximaal drie dagen.
  23. Centrifuge cellen, verwijder het supernatant en was de cellen tweemaal met 150 ul van 1x Permeabilisatie / Wash Buffer (Perm / Wash buffer), centrifugeren tussenin. De Perm / Wash Buffer wordt bereid uit een 10x voorraad door verdunning 1: 9 (v / v) in DDH 2 O.
  24. Na de tweede wasbeurt, resuspendeer de cellen in 150 ui Perm / Wash Buffer en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C in het donker.
  25. Centrifuge cellen weer en dan zuig het supernatant. Resuspendeer cellen in 50 pl 1x Perm / Wash buffer die anti-IFN-γ en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C in het donker.
  26. Was de cellen tweemaal met 1x Perm / Wash buffer, centrifugeren tussenin. Resuspendeer cellen in 250 gl FACS buffer en breng cellen FACS buizen.
  27. Ga verder met flowcytometrie acquisitie met behulp van een stroom cytometeh, dat beschikt over een passend laser configuratie en filter ingesteld op fluorochromen gebruikt in de kleuring paneel in tabel 2 29 beschreven discrimineren. Verzamel minstens 200.000 gebeurtenissen per monster en 10.000 evenementen voor compensatie controles.
  28. Solliciteer compensatie matrix en gegevens met behulp van flowcytometrische analyse software 30 te analyseren.

7. Meting van Bacteriële Load in de milt en lever op het moment van Peak Infection

Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd bij een BSC, tenzij anders vermeld.

  1. Wordt geënt in muizen ip met 2 x 10 4 CFU van de ziekteverwekker met behulp van procedures in procedure 4 beschreven.
  2. Op dag 3 na infectie bereid steriele 1,5 ml microcentrifuge buisjes, die elk 500 pi ijskoude steriele 0,1% Triton X-100 in 1 x PBS en 0,2-0,3 g 1,5-2 mm met zuur gewassen steriele glazen kralen. Weeg elke buis.
    LET OP: parels Glass zijn zuur gewassen door Incubating in 10% azijnzuur in een beker op een magnetische roerder gedurende 1 uur. Deze korrels worden daarna uitgebreid gewassen met DDH 2 O om zuur te verwijderen, zijn lucht gedroogd en vervolgens geautoclaveerd voor gebruik.
  3. Euthanaseren muizen door CO 2 blootstelling.
  4. Voor de dissectie van organen, lag het dier op zijn rug op een dissectie board en speld de ledematen van de muis aan de raad met behulp van 25 G naalden. Ontsmet de huid door bevochtigen met 70% ethanol.
  5. Steriele taai knippen schaar, maak een middellijn incisie in de huid van de lies tot midden borst en vervolgens vanaf het midden naar elkaar lies knie en vanaf het midden van de borst naar elkaar elleboog. Blunt ontleden en weerspiegelen de rug van de huid, pinning het te openen met behulp van 25 G naalden.
  6. Desinfecteren spierlaag door bevochtiging met 70% ethanol en steriele fijne schaar maken een middellijn incisie in de peritoneale wand. Pak de zwaardvormig proces met een tang. Vervolgens worden met dezelfde fijne schaar, bezuinigen in de peritoneale wand van de proce zwaardvormigss lateraal aan elke kant na de ribbenkast, net onder het diafragma naar de lever te onthullen.
  7. Snijd een ~ 100 mg stukje van de lever (gebruik dezelfde kwab voor alle muizen) met behulp van steriele schaar en plaats deze in een vooraf gewogen 1,5 ml microcentrifugebuis.
  8. Gebruik een tang om voorzichtig verdringen de organen aan de linkerkant van de buikholte van de milt te visualiseren. Voorzichtig pak de milt met een pincet en laat deze uit de peritoneale holte door het wegsnijden van het omringende bindweefsel.
  9. Plaats de milt in de vooraf gewogen 1,5 ml microcentrifugebuis met kralen. Transport weefsels naar het laboratorium in een lekvrije container met ijs. Weeg de buisjes met de organen om het weefsel gewichten bepalen mg.
  10. Homogeniseer de weefsels door schudden van de buizen met behulp van een parelmolen homogenisator gedurende 3 min bij frequentie van 30 Hertz.
    OPMERKING: De parelmolen werkwijze heeft de voorkeur voor homogenisering aangezien het vatbaar voor pzingen een groot aantal monsters en zorgt voor minder rommel en mogelijke blootstelling aan de ziekteverwekker. Echter, automatische homogenisatoren of geautoclaveerd 2 ml handmatige glasvlies Homogenisatie kan worden gebruikt als alternatief.
  11. Bereid een 10-voudige verdunningsreeks van de homogenaten in 0,1% Triton-X-100 in 1 x PBS, van (van onverdund tot 10 -7).
  12. Spread 100 pi van elke verdunde homogenaat op een BHI-agarplaat (in duplo) met een steriele spreader. Overdrachtsplaten een 37 ° C incubator en incubeer overnacht.
  13. Houd de platen die tussen 30 en 300 kolonies / plaat, gooi de rest weg. Telling kolonies op elk bord en bepaal de gemiddelde aantal kolonies op dubbele spreads.
  14. Bereken de CFU / mg volgens de volgende vergelijking:
    CFU / mg = CFU / ml in het homogenaat, vermenigvuldigd met de ml homogenaat bereid, gedeeld door het gewicht in mg van het weefsel gehomogeniseerd.
    OPMERKING: Indien bijvoorbeeld een gemiddelde van 30 colOnies werden geteld na uitplaten 100 pl 10 -2 verdunde homogenaat bereid uit 120 mg stuk lever die werd gehomogeniseerd in 0,5 ml, berekeningen zou als volgt:
    CFU / ml = 30 kolonies x 100 (verdunningsfactor) / 0,1 ml (volume spread) = 30.000 CFU / ml.
    CFU / mg = 30.000 CFU / ml x 0,5 ml homogenaat / 120 mg weefsel = 125 CFU / mg.

8. Effecten van L. monocytogenes die IFN-γ Antwoorden van CD4 + en CD8 + cellen

Opmerking: Deze procedure om IFN-γ productie van milt CD4 + en CD8 + T-effectorcellen geoogst op het tijdstip van de piek van de adaptieve immuunrespons (~ 7 d na infectie) op twee manieren gemeten: (1) stroming cytometrie gemeten IFN-y van CD4 + en CD8 + cellen door intracellulaire cytokine kleuring, en (2) ELISA aan totale IFN-γ niveaus door splenocyten (inclusief alle T-cellen) te meten. Proceduresprocessen in de BSC.

  1. Infect muizen door het injecteren ip met 2 x 10 4 CFU van het pathogeen middels procedures Procedure 4 beschreven.
  2. Op dag 7 na de infectie, euthanaseren muizen door CO 2 inhalatie volgens de institutionele richtlijnen.
  3. Ontleden de milt (zoals hierboven beschreven) en in een 15 ml conische buis met steriel 1x PBS. Transporteren de buizen naar het laboratorium in een lekvrije container met ijs.
  4. Verwerk de milten in een enkele celsuspensie lyseren van rode bloedcellen zoals beschreven in hoofdstuk 6, en resuspendeer cellen in volledige RPMI media met 10% FCS. Aantal cellen met een hemocytometer.
  5. Opgericht kweken voor het meten van IFN-γ reacties. Voor deze afgifte-cellen (4 x 10 6 in 1 ml / putje) in 24-well platen met en gelijk aantal (4 x 10 6 of 1 ml / putje) of ontdooid hitte gedode L. monocytogenes (bereid in Werkwijze 5) . Overdracht cellen om een ​​37° C incubator.
  6. Na 20 uur incubatie, voeg 0,66 ul / ml eiwit remmer van de putjes en incubaties blijven.
  7. Vier uur later overdrachtsplaat BSC en het verzamelen van 500 pi kweeksupernatant en bevriezen (bij -80 ° C) voor de latere meting van IFN-γ niveaus met behulp van een commercieel enzym-gebonden immunosorbent assay (ELISA) kit 31. Dan verzamelen cellen in een steriele 15 ml buis. Was de putjes met 1x PBS en het zwembad dit wassen samen met verzamelde cellen.
  8. Voeren celoppervlak kleuring en intracellulaire kleuring voor IFN-γ op CD4 + en CD8 + cellen zoals beschreven in procedure 6 behalve gebruik kleuring paneel in tabel 3 beschreven. Ga verder met stromingscytometer acquisitie (het verzamelen van 200.000 events / sample) en analyseren van gegevens 29 met behulp van flowcytometrie analyse software 30.

9. Het meten van de muis Survival om eindpunten na L. monocytogenes Infectie

Opmerking: In deze procedure wordt het effect van een middel op muis overleving eindpunten na infectie met de gemodificeerde LD 50 dosis van het pathogeen. Al deze procedures zijn uitgevoerd in de BSC in het dier faciliteit.

  1. Inject muizen ip de gewijzigde LD 50 dosis van L. monocytogenes zoals beschreven in procedure 4. Dit werd bepaald als zijnde 10 5 CFU (voor mannen) of 1,5 x 10 5 CFU (voor vrouwen) 31.
  2. Volg muizen tweemaal daags klinische tekenen en deze tekens en dierlijk lichaamsgewicht bij een Labjournaal opnemen. Euthanaseren muizen als zij een verlies van 20% van het lichaamsgewicht of twee klinische symptomen van listeriose (lethargie, gegolfde vacht, gebogen houding, ademhalingsmoeilijkheden, saai of ingevallen ogen) te tonen.
  3. Na 14 dagen, euthanaseren overlevende muizen via CO 2 inademing.
  4. Bereid Kaplan-Meier grafieken van de gegevens door het uitzetten van het percentage overleving van elke groep 32 tegen de tijd.
    (figuur 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 3 toont enkele typische flowcytometrie kleuring van IFN-γ in milt NK en NKT cellen op 24 uur na infectie met 10 5 CFU van het pathogeen. Deze figuur illustreert ook de gating strategie voor de kleuring paneel in Tabel 2 beschreven. Figuur 4 toont enkele representatieve gegevens die in een experiment waarbij mannelijke muizen werden behandeld met de PPARa antagonist IS001 of dragercontrole verkregen, geïnfecteerd met 10 5 CFU L. monocytogenes en vervolgens geanalyseerd voor IFN-γ in NK en NKT-cellen na 24 uur . Deze figuur laat zien dat behandeling met IS001 versterkt IFN-γ reacties van NKT-cellen, maar niet NK cellen na infectie met het pathogeen. Figuur 5 toont representatieve kleuring voor IFN-γ in milt CD4 + en CD8 + T-cellen op dag 7 na infectie na re-stimulatie ex vivo met hitte gedode pathogen. Deze figuur toont ook de gating strategie voor de kleuring paneel in tabel 3 beschreven. Figuur 6 toont representatieve gegevens die in een experiment waarbij mannelijke muizen werden dagelijks behandeld met de PPARa antagonist IS001 of dragercontrole verkregen, geïnfecteerd met een subletale dosis van L. monocytogenes en geanalyseerd 7 dagen na de infectie. Dit experiment toont aan dat behandeling met IS001 verhoogde IFN-γ reacties van CD4 + en CD8 + lymfocyten. Figuur 7 toont representatieve gegevens van een onderzoek dat het effect van PPARa antagonist IS001 op muis overleving onderzocht eindpunten na infectie met de gemodificeerde LD 50 dosis van het pathogeen. Uitgezet is het percentage overleving van muizen tegen de tijd na infectie. Deze figuur toont dat behandeling met IS001 verhoogde de overleving van mannelijke muizen eindpunten. Tezamen tonen deze gegevens hoe dat model kan worden toegepast om te onderzoekeneffecten van nieuwe geneesmiddelen of behandelingen IFN-γ responsen in vivo te onderzoeken hoe zulke immune veranderingen beïnvloeden dieroverleving infectie.

Figuur 1
Figuur 1. Opheldering van de milt van geïnfecteerde muizen. Deze serie foto's laat zien hoe de milt ontleden van een dode muis. (a) liggen de muis op zijn rechterkant en spuit beneden de huid met 70% ethanol. (b) Met behulp van aseptische of steriel pincet en taai-cut schaar, incise de huid net onder de onderkant van de ribbenkast. (c) Spray beneden de blootgestelde spierlaag met 70% ethanol. De milt moet zichtbaar onder de spierlaag (open pijlpunt) zijn. (d) Met behulp van aseptische of steriel pincet en fijne schaar, incise de spierlaag om de milt te onthullen. (e) voorzichtig pak de milt met de tang en Use fijne schaar om de milt weg te snijden uit de omliggende het bindweefsel. (f) Plaats de milt in een 15 ml conische buis met steriel 1x PBS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Tellen Splenocyten behulp van een hemocytometer. (a) toont de centrale rooster van de hemocytometer. (b) toont een vergroot aanzicht van het centrale raster dat 25 grote vierkanten bevat (die bevatten elk 16 kleine vierkanten). De vijf grote pleinen gebruikt voor de telling zijn gemarkeerd in grijs (4 hoek pleinen plus het centrum plein in het centrale rooster). (c) toont een vergroot aanzicht van een van de grote grijze vierkanten. Om het volume cel in 10 6 / ml, de eerste telling bepalenalle levensvatbare cellen binnen de vijf grote grijze vierkanten. In het getoonde voorbeeld, deze telling is 215. Bij het tellen, zorg ervoor om alleen al de heldere (niet-blauw) cellen, met inbegrip van die van de dubbele lijnen aan de rechterkant en onderkant van het raster raken tellen. Reken niet de cellen het aanraken van de dubbele lijnen aan de linkerzijde en de bovenkant van het rooster. Neem het totaal vijf vierkante tellen en delen door 10 om het aantal cellen in 10 6 / ml. In het voorbeeld 215 gedeeld door 10 is 21,5 x 10 6 cellen / ml. Merk op dat deze berekeningen alleen werken als je rekenen 5 van de grote pleinen als gemarkeerd en verdun je cellen 1: 1 in trypan blauw. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Gating strategie voor detectie van IFNγ productie in NK en NKT-cellen. Eerste poort op lymfocyten op FSC-A door SSC-A plot. Dan poort aan die gebeurtenissen die op de diagonaal over het FSC-H / FSC-A plot. Dit zijn de singlets. Dan gate op levende (AmCyan -) en CD8 - cellen. plot dan de tetrameer kleuring tegen TcR. De NKT cellen zijn binnen de dubbele positieve bevolking en de NK-cellen binnen de dubbele negatieve bevolking. Poort op de dubbele positieve cellen, en plot NKp46 versus FSC. Poort aan de NKp46 negatieve bevolking, die de NKT-cellen (deze poort kan door het vinden van het punt van verdeeldheid in de twee populaties van de NK-cellen plot worden ingesteld). De NK-cellen zijn tetrameer - TcR - NKp46 + populatie. Binnen NK en NKT celpoorten worden de IFN-γ + cellen in het PE kanaal geïdentificeerd nadat een poort gebaseerd op de FMO controle. klik ophier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Representatieve gegevens verkregen voor frequenties van IFN-γ + NK en NKT cellen op 24 uur na infectie. In dit experiment werden mannelijke C57BL / 6J muizen (N = 3-4 / groep) werden geïnfecteerd met ip 10 5 CFU van L. monocytogenes of werden un geïnfecteerd gelaten. Muizen werden toegediend het geneesmiddel IS001 of drager (0,5% carboxymethylcellulose) tegelijkertijd inoculatie en 12 uur later. Vierentwintig uur na inoculatie werden de muizen gedood en werd de milt verwijderd en werden afzonderlijk verwerkt en gekleurd voor stroomcytometrie. Getoond zijn het gemiddelde ± SEM frequentie van IFN-γ + cellen in de NK (a) of NKT celpoorten (b) bij niet-geïnfecteerde of geïnfecteerde muizen na behandeling met een voertuig of het geneesmiddel IS001. * Geefsa verschil (P <0,05) van de controle voertuig tweezijdige t-toets. De gegevens worden opnieuw afgedrukt vanaf 31 met toestemming van het Journal of Immunology (volume 195, blz. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging van immunologen, Inc. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Gating strategie voor detectie van IFN-γ productie in CD4 en CD8-cellen. Eerste poort op lymfocyten op FSC-A door SSC-A percelen. Dan poort aan die gebeurtenissen die op de diagonaal over het FSC-H / FSC-A plot. Dit zijn de singlets. Binnen deze poort, poort op levende (AmCyan -) CD45 + cellen. Vervolgens poort aan beide CD8 + of CD4 + populaties. Binnen elke poort, de IFN-γ +cellen in het PE kanaal geïdentificeerd door vergelijking van de kleuring met de FMO controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6. Representatieve gegevens verkregen voor frequenties van IFN-γ + CD4 + en CD8 + T-cellen bij 7 dagen na infectie met L. monocytogenes (EGD stam). In dit experiment werden mannelijke C57BL / 6J muizen geïnfecteerd ip met 2 x 10 4 CFU L. monocytogenes (N = 7 / groep) of bleven niet-geïnfecteerde (N = 3 / groep). De muizen werden ook toegediend het geneesmiddel IS001 of voertuig (0,5% carboxymethylcellulose) tweemaal per dag te beginnen op de dag van de inenting. Zeven dagen later werden de muizen gedood en werd de milt verwijderd en werden afzonderlijk verwerktecel cultuur. Splenocyten mononucleaire cellen werden gestimuleerd gedurende 24 uur met warmte gedode L. monocytogenes met eiwit transport remmer toegevoegd voor de laatste 4 uur van de cultuur. De cellen werden daarna gekleurd voor stroomcytometrie. Getoond zijn het gemiddelde ± SEM frequentie van IFN-γ + cellen in de CD4 + (a) of CD8 + celpoorten (b) bij niet-geïnfecteerde of geïnfecteerde muizen na behandeling met vehikel (0,5% carboxymethylcellulose) of het geneesmiddel IS001. * Geeft een verschil (P <0,05) vanaf de dragercontrole tegenhanger wat bepaald met tweezijdige t-test. De gegevens worden opnieuw afgedrukt vanaf 31 met toestemming van het Journal of Immunology (volume 195, blz. 5189-5202, 2015) .Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging van immunologen, Inc. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.


Figuur 7. Vertegenwoordiger van gegevens die zijn verkregen tijdens een experiment dat het effect van een PPARa Antagonist 1S001 op Mouse Survival om eindpunten Vergeleken na Infectie van mannelijke C57BL / 6J muizen met L. monocytogenes (EGD stam). In dit experiment werden mannelijke C57BL / 6J muizen (N = 10 muizen / groep) werden geïnfecteerd ip de gewijzigde LD 50 dosis van de pathogeen (10 5 CFU) van L. monocytogenes. De muizen werden ook toegediend het geneesmiddel IS001 of voertuig (0,5% carboxymethylcellulose) tweemaal per dag te beginnen op de dag van de inenting. De muizen werden dagelijks gevolgd op klinische tekenen en werden gedood als humane eindpunten waren vervuld. Getoond wordt het percentage overleving van muizen eindpunten tijd * geeft een verschil in overleving tussen groepen zoals bepaald met log-rank test (P <0,05). De gegevens worden opnieuw afgedrukt vanaf 31 met toestemming van het Journal of Immunologie (volume 195, blz. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging van immunologen, Inc. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

tafel 1
Tabel 1: toont enige vertegenwoordiger berekeningen voor het bepalen van CFU in een portie van de Dag van Cultuur. In dit voorbeeld werd een hoeveelheid dag kweek genomen en verdund 1: 1 met BHI media. De OD 600 van dit verdunde monster werd bepaald op 0,84. Daarnaast werd een 100 ul aliquot genomen CFU bepalen. Dit monster werd verdund met 900 ui BHI medium (10 -1) en werd gewassen en opnieuw gesuspendeerd in 1 ml BHI. Een 10-voudige verdunningsreeks van dit monster werd bereid (10 -2 tot 10 -9) en verdunde monsters werden uitgeplaat op BHI agar platen (enkel waarden voor 10 -4 tot 10 -9 getoond). De volgende dag kolonies werden geteld. Alleen die platen die kolonie getallen tussen 30-300 hadden werden beschouwd voor de berekening (dat wil zeggen, 10 -6 plaat, geel gemarkeerd). Het aantal kolonies op de plaat (70) werd vervolgens gedeeld door 0,1 (volume in ml uitgeplaat) naar de CFU / ml van het verdunde monster te krijgen. Deze waarde werd vervolgens vermenigvuldigd met de verdunningsfactor (10 6) naar de CFU / ml lezing van de onverdunde kweek te verkrijgen. TMTC = Te veel om te tellen.

tabel 2
Tabel 2: Staining Panel voor detectie van IFN-γ in NK en NKT cellen. Merk op dat beide compensatie korrels gekleurd met de stroom antilichamen die in het paneel of splenocyten gekleurd met fluorochroom verschillende versies van CD4 antilichaam kloon GK1.1 kan als afzonderlijke positieve controles.

tabel 3
Tabel 3: Kleuring Panel voor detectie van IFN-γ in CD4 + en CD8 + cellen. Merk op dat beide compensatie korrels gekleurd met de stroom antilichamen die in het paneel of splenocyten gekleurd met fluorochroom verschillende versies van CD4 antilichaam kloon GK1.1 kan als afzonderlijke positieve controles.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier beschrijven we een protocol van hoe een eenvoudige experimentele besmetting uit te voeren met de EGD stam van L. monocytogenes 25 in mannelijke of vrouwelijke C57BL / 6J muizen. Dit protocol werd opgezet met het oog op het bestuderen van het effect van een unieke chemische IS001 IFN-γ productie door aangeboren en adaptieve lymfocyten in vivo 31. Door het monitoren bacteriële verwijdering en overleving na infectie werden inzichten in hoe deze veranderingen in IFN-γ beïnvloed vermogen van de gastheer om de besmetting te bestrijden.

Kritische overwegingen in het Protocol

Een belangrijke overweging bij het ontwerp van dit soort onderzoek is dat elk experiment adequaat aangedreven en adequaat gecontroleerd. Door biologische variatie in de immuunrespons op infectie (zie figuren 4 en 6), wordt aanbevolen dat N = 4-5 muizen per groep worden gebruikt voor de initiële immune studies. Als eenN a deze onderzoeken is een trend in de gegevens, maar geen significant verschil zichtbaar tussen groepen, kon een vermogenberekening worden gedaan om het minst aantal benodigde dieren in latere studies statistisch significant teweeg heeft gebracht. Betreffende controles is het belangrijk om niet-geïnfecteerde controles omvatten uitgangswaarde IFN-γ immune responsen voor studies en besturingsorganen om onderscheiden van het effect van de behandeling van stress in verband met het toedienen van de behandeling. Een andere belangrijke overweging is de timing van de behandeling. Aangezien de aangeboren reactie op L. monocytogenes is zeer snel, wordt aanbevolen de eerste behandeling worden toegediend op de dag voorafgaand aan, of op hetzelfde tijdstip wordt inoculatie teneinde te waarborgen dat therapeutische niveaus van het reagens voor de bereikte inleiding van de aangeboren immuunrespons.

Nog een andere belangrijke overweging is de dosis van het pathogeen te gebruiken voor infection. Een dosis subletale aanbevolen voor het meten van bacteriële verontreiniging, aangezien de kans dat het pathogeen wordt geconcentreerd in de milt en de lever, waardoor het nauwkeuriger opsomming van de bacteriën toeneemt. Een sublethale dosis wordt ook aanbevolen voor het opsommen van IFN-γ adaptieve responsen van lymfocyten om te verzekeren dat dieren niet eerder bezwijken voor listeriosis de piekbelasting T celexpansie. Daarentegen wordt aanbevolen dat een hogere infectieuze dosis worden gebruikt voor het meten van de vroege NK en NKT celreactie op 24 uur om de IFN-γ maximaliseren door deze cellen.

De klassieke LD 50 is de dosis pathogeen dat leidt tot 50% sterfte van muizen. Omdat dood geen acceptabel eindpunt onze instelling en sinds vele symptomen van listeriose kan voorspellen of een dier waarschijnlijk bezwijken aan een infectie, gebruikten we een bepaalde lijst van klinische symptomen in plaats van de dood als eindpunt in onze studies. Using deze werkwijze werd bepaald dat het gemodificeerde LD 50 was 10 5 CFU 8 weken oude mannelijke en 1,5 x 10 5 CFU 8 weken oude vrouwelijke C57BL / 6J-muizen 31. De LD 50 doses werden bepaald door het meten van het percentage overleving van muizen eindpunten stapsgewijze dosisverhoging studies (N = 5 onderzoeken in totaal) elk bevatte N = 8 muizen per groep (bijvoorbeeld muizen werden eerst geïnfecteerd met 10.000 CFU , dan is een tweede partij met 20.000 CFU, etc.). De LD 50 berekening werd bepaald uit een regressie grafiek van de log (CFU) (x-as) versus de probit van het percentage overleving waarden (y-as) (website: userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit /ProbitAnalysis.pdf).

Merk op dat de gemodificeerde LD 50 dosis bepaald in ons lab kan verschillen van die in een laboratorium zelfs wanneer infecteren muizen van dezelfde stam van L. monocytogenes. Een deel van deze variatie kan betrekking hebben op de persoonlijke aard of bewaken van de klinische verschijnselen van listeriosis vergelijking met de meer absolute eindpunt van overlijden. Extra variabiliteit kan voortkomen uit verschillen in omgevingsfactoren zoals muis dieet of de microbiota of verschillen in de bereiding van entmateriaal tussen laboratoria. Derhalve wordt aanbevolen dat dan het opstarten van elke overlevingsstudies een pilotstudie uitgevoerd wanneer vrouwelijke muizen (N = 8 muizen / groep) geïnfecteerd met 1,5 x 10 5 CFU van dezelfde stam van L. monocytogenes zoals in deze bestuderen en symptomen gecontroleerd om te bepalen of deze dosis inderdaad resulteert in 50% overleving eindpunten. Als overleven is lager of hoger dan 50% in deze CFU, kon stapsgewijze dosisverhoging of de dosis de-escalatie studies worden uitgevoerd om snel verfijnen in op de dosis LD 50.

Een andere belangrijke overweging is vervormingenwordt substam muizen die geïnfecteerd studies. Dit protocol beschrijft infectie van de veelgebruikte inteelt muizenstam C57BL / 6J. Deze stam is goed geschikt voor het meten van IFN-γ responsen aangezien muis als een Th1-gevoelig zijn stam 33 en daardoor relatief bestand tegen L. monocytogenes infectie (vergeleken met Th2-gevoelige muizenstammen zoals BALB / c) 34,35. Aanpassing van dit protocol om andere muis stammen zullen kennis van de besmettelijke dosis van het pathogeen voor de specifieke stam vereisen. Het wordt ook aanbevolen om muizen van dezelfde leeftijd, geslacht en leveranciers te gebruiken, zoals beschreven in dit protocol om de hoeveelheid trouble-shooting die betrokken zijn bij het opzetten van het model te verminderen. Bijvoorbeeld C57BL / 6 muizen besteld bij een leverancier (bijvoorbeeld C57BL / 6J) kan genetische verschillen dan C67BL / 6 muizen besteld bij een andere leverancier (bijvoorbeeld C57BL / 6NTac) 36 vertonen. Bovendien, de darmflora verschilt C57BL / 6 substammen verkregen van verschillende leveranciers, waarbij de balans van Th1 en Th17 reacties kunnen beïnvloeden bij de muis 37.

ove_title "> Mogelijke Wijzigingen in techniek

Muizen worden meestal geënt ip of intraveneus in tegenstelling tot de natuurlijke route van infectie bij de mens, die door het maagdarmkanaal. Orale infecties komen minder vaak voor omdat de standaard stammen van L. monocytogenes inefficiënt infecteren het darmepitheel van muizen 38. Dit komt omdat er een aminozuurverandering in de sequentie van muis E-cadherine uit humane E-cadherine, dat resulteert in een verminderde opname van E-cadherine door Listeria invasie eiwit internalin A (INIA) 39. Om deze barrière te overwinnen, onderzoekers gebruik van muizen die transgeen voor menselijk E-cadherine eiwit zijn of gebruik maken van listeria die zijn ontworpen om een gemuteerde sequentie van Inia (Inia mut), die de muis E-cadherine bindt met dezelfde affiniteit als WT EGD te uiten humane E-cadherine 40. Daarom is een potentieel modificatie van deze techniek is om muizen te infecteren via orale toediening. De lezer wordt doorverwezen naar een andere Jupiter publicatie die orale enting methoden 38 beschrijft. Merk op dat het veranderen van de wijze van infectie de infectieuze dosis en de kinetiek van verspreiding van de pathogeen beïnvloeden.

Dit protocol beschrijft middels hitte gedode listeria ontlokken IFN-γ-productie door CD4 + en CD8 + T-cellen. Hitte gedode L. monocytogenes werd gekozen als een stimulus in onze studies, omdat dit antigeen is goedkoop en omdat ons lab was vooral geïnteresseerd in CD4 + T-celreacties op het pathogeen. Een beperking is dat door warmte gedode bacteriën niet efficiënt primaire CD8 + T cel responsen in vitro of in vivo 41 42,43 infectie. Zo is de CD8 + T-cel IFN-γ productie die we geobserveerd door splenocyten geoogst op het hoogtepunt van de infectie (dwz figuur 6) waarschijnlijk in reactie op de residuelelevende bacteriën in de kweken van splenocyten of werd opgewekt als gevolg van cytokine-geïnduceerde cytokineafgifte 41. Als alternatief voor warmte gedode listeria, kan men ook opwekken IFN-γ responsen ex vivo door het blootstellen van T-cellen op peptiden coderen voor epitopen op eiwitten Listeria. Inderdaad, immunodominante MHC klasse II-beperkte epitopen listeriolysin O en p60 hydrolase en beschreven voor C57BL / 6 en BALB / C muizen en immunodominante MHC klasse I epitopen zijn beschreven voor BALB / c 44. Nog een andere benadering is om muizen te infecteren met L. monocytogenes stammen die zijn ontworpen om model antigenen, zoals ovalbumine of virale antigenen tot expressie teneinde te profiteren van bestaande MHC klasse I- en klasse II-MHC tetrameer reagentia antigeenspecifieke sommen T-cellen in geïnfecteerde muizen 45,46.

Andere beperkingen van het Protocol

Een andere beperking van dit model is dat het only maatregelen IFN-γ-productie door immuuncellen in de milt. Naast het gebruik van tetrameren antigeen specifieke T-cellen sommen (ovalbumine tot expressie varianten van L. monocytogenes), flowcytometrie kleuring panelen beschreven gemakkelijk kunnen worden aangepast aan de productie van andere cytokines zoals TNF of IL-2 of maatregel effector moleculen die deelnemen aan CD8 T-cellen of NK-gemedieerde doden van het pathogeen zoals perforine en granzyme B. Bovendien kan dit protocol worden aangepast aan IFN-γ geproduceerd door immuuncellen in de lever te onderzoeken.

toekomstige toepassingen

Zodra dit protocol wordt geleid, kan het dienen als een eenvoudige in vivo model om de effecten van verschillende middelen of genen op Th1 en cellulaire immuniteit screenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion Broth, Modified BD 299070 any brand should be appropriate
Agar BD 214010 any brand should be appropriate
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 any brand should be appropriate
1x PBS Sigma D8537 any brand should be appropriate
TissueLyser II Qiagen 85300 any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl) any brand should be appropriate
KHCO3 any brand should be appropriate
Na2EDTA any brand should be appropriate
RPMI 1640 Gibco 22400089 any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum  Gibco 12483 Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine Gibco 25030 any brand should be appropriate
Non-essential amino acids Gibco 11140 any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD 554724 Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaldehye Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS
10x Perm/Wash buffer BD 554723 Dilute 1x in ddH2O
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506 eBioscience 65-0866 Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) eBioscience 15-0041 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) eBioscience 11-0081 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC NIH Tetramer Core Facility N/A Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) eBioscience 25-5961 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) eBioscience 47-3351 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) eBioscience 25-0451 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) eBioscience 12-7311 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads eBioscience 01-1111 Use one drop per stain
Mouse IFN gamma ELISA kit eBioscience 88-7314 Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 ml vented tubes for culture Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes any brand should be appropriate
bacterial petri dishes any brand should be appropriate
2 ml cyrovials any brand should be appropriate
UV spectrometer any brand should be appropriate
safety engineered needles any brand should be appropriate
C57BL/6J Jackson laboratories Stock#000664 Order for arrival at 7 weeks
Bleach For decontamination
70% Ethanol For decontamination
Glass beads any brand should be appropriate
Centrifuge rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge any brand should be appropriate
Sterile Glycerol any brand should be appropriate
Pipette Tips any brand should be appropriate
Pipette any brand should be appropriate
Surgical instruments any brand should be appropriate
70 micron strainers any brand should be appropriate
3 ml syringe any brand should be appropriate
Pipette gun any brand should be appropriate
Filtration Units any brand should be appropriate
Trypan Blue Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate
Hemocytometer any brand should be appropriate
Round bottomed plates any brand should be appropriate
FACs tubes Fisher Scientific 14-959-5
BD LSR II BD Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software Treestar Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0 - 300 µl) Eppendorf Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System Pro-lab Diagnostics Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
  2. Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
  3. Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
  4. Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
  5. Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
  6. Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
  7. Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  8. Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
  9. Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
  10. Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
  11. Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
  12. Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
  13. Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
  14. Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
  15. Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
  16. Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
  17. Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
  18. Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
  19. Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
  20. Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
  21. Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
  22. Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
  23. Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
  24. Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
  25. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  26. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
  27. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
  28. Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
  29. BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf (2007).
  30. Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. http://www.flowjo.com/tutorials (2016).
  31. Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
  32. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
  33. Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
  34. Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
  35. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  36. Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
  37. Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
  38. Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
  39. Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
  40. Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
  41. Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
  42. Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
  43. Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
  44. Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
  45. Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
  46. Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).

Tags

Infectie , Bacteriën infectiemodel muizen flowcytometrie interferon-γ respons
Experimentele infectie met<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als een model voor de studie Host Interferon-γ Responses
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, … More

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, M. A., Mallevaey, T., Dunn, S. E. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (117), e54554, doi:10.3791/54554 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter