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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Infecção experimental com Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54554
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo descreve como para inocular ratinhos C57BL / 6J com a estirpe de Listeria monocytogenes EGD (L. monocytogenes) e para medir o interferão-γ (IFN-γ) respostas de células assassinas naturais (NK), as células T assassinas naturais (NKT), e adaptativa linfócitos T após a infecção. Este protocolo descreve como também a realização de estudos de sobrevivência de ratinhos após a infecção com uma dose de LD 50 modificada do agente patogénico.

Abstract

L. monocytogenes é uma bactéria Gram-positiva que é uma causa da doença de origem alimentar em humanos. A infecção experimental de ratinhos com este patogénio tem sido altamente informativos sobre o papel das células do sistema imune inata e adaptativa e citocinas específicas na imunidade do hospedeiro contra agentes patogénicos intracelulares. Produção de IFN-γ por células inatas durante a infecção com L. monocytogenes subletal é importante para a activação de macrófagos e de controlo no início do patógeno 1-3. Além disso, a produção de IFN-γ por linfócitos memória adaptativa é importante para aprontar a activação de células inatas sobre reinfecção 4. A L. monocytogenes modelo de infecção, portanto, serve como uma grande ferramenta para investigar se novas terapias que são projetados para aumentar a produção de IFN-γ ter um impacto sobre respostas de IFN-γ in vivo e têm efeitos biológicos produtivos, tais como aumento da depuração bacteriana ou melhorar a sobrevivência do mouse a partir deinfecção. Aqui descrito é um protocolo de base para a forma de realizar infecções intraperitoneais de murganhos C57BL / 6J com a estirpe de L. monocytogenes EGD e para medir a produção de IFN-γ pelas células NK, células NKT, e adaptativas linfócitos por citometria de fluxo. Além disso, os procedimentos são descritos em: (1) crescimento e preparar as bactérias para inoculação, (2) medir a carga bacteriana no baço e no fígado, e (3) medida a sobrevivência dos animais a pontos finais. Os dados representativos são também fornecidos para ilustrar a forma como este modelo de infecção pode ser utilizado para testar o efeito de agentes específicos nas respostas de IFN-gama para L. monocytogenes e sobrevivência dos ratinhos com esta infecção.

Introduction

IFN-γ é uma citocina que é crucial para mediar a imunidade contra os agentes patogénicos intracelulares e para controlar o crescimento do tumor 5. A importância desta citocina na resistência bacteriana é evidente na observação de que os seres humanos com mutações na via de sinalização de IFN-γ são altamente susceptíveis à infecção com micobactérias e salmonelas 6. De modo semelhante, os ratinhos deficientes em IFN-γ ou os defeitos exibem receptor de IFN-γ na resistência à micobactérias 7-9 e outros patogénios intracelulares, incluindo L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, 13 Salmonella typhimurium, e certos vírus 11. Em adição aos agentes patogénicos que combatem, IFN-γ desempenha um papel fundamental na defesa contra hospedeiro-14 tumores. Embora uma maior produção de IFN-γ é benéfica no contexto da infecção ou cancro, a produção prolongada desta citocina tem sido associada to o desenvolvimento de auto-imunidade sistémica 15-17 e a aceleração da diabetes do tipo I no modelo de ratinho diabético não obeso 18.

As principais fontes de IFN-γ incluem células NK, células NKT, γδ células T, células T auxiliares 1 (Th1), e linfócitos T citotóxicos (CTL) 5,19,20. IFN-γ aumenta tanto a imunidade inata e adaptativa por: (1) para cima de regulação de complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e expressão II, (2) aumento da expressão de moléculas co-estimulatórias em células que apresentam antigénios, (3) de macrófagos aumentando factores de fagocitose e a produção de citocinas pró-inflamatórias e microbicidas (por exemplo, óxido nítrico e espécies reactivas de oxigénio), (4) promover a diferenciação de células T CD4 + naive em células efectoras Th1, (5) promover a troca de classe de anticorpo para a imunoglobulina ( Ig) 2a e IgG3 (no rato), (6) indução da produção de quimiocinas para recrutar células imunes para os locais de Infection, e (7) o aumento de células NK e respostas CTL 5,19. Dada a importância crucial de IFN-γ na resposta do hospedeiro a infecções e tumores, recombinante IFN-γ foi testado como um tratamento para várias infecções e doenças malignas (revisto em 19). No entanto, porque a administração sistémica de IFN-γ ou promover a citoquina Th1 interleucina-12 (IL-12) está associada a efeitos colaterais e toxicidade relacionada com a dose 19,21, há interesse no desenvolvimento de estratégias alternativas para aumentar a produção de IFN-γ pela células do sistema imunológico. O desenvolvimento de novos produtos biológicos e moléculas pequenas requer em ferramentas de rastreio in vivo para testar se tais agentes de aumento da produção de IFN-γ durante uma resposta imune e se isto traduz-se efeitos biológicos significativos, tais como aumentos de sobrevivência do animal.

A infecção experimental de ratinhos com a bactéria L. monocytogenes gram-positiva tem sido um modelo para instrumentaldecifrar o papel do IFN-γ no hospedeiro-imunidade contra os agentes patogénicos intracelulares 1,22. Infecção de camundongos com o patógeno por via intravenosa ou por via intraperitoneal (ip) leva à rápida disseminação da bactéria para o baço e fígado, onde eles se tornam internalizadas pelos macrófagos residentes e hepatócitos com cargas bacterianas pico no baço ocorrem entre 3 e 4 dias pós- infecção 1,3,22. Produção de IFN-γ por células NK é importante para a activação de macrófagos e resistência precoce contra o agente patogénico 3; No entanto, em doses infecciosas elevados, a produção de IFN-γ também pode ser prejudicial para a depuração de agentes patogénicos 23. As células NKT são também uma fonte de IFN-γ no baço e no fígado durante o controlo de início de patógenos 2,24 e essa produção foi mostrado para amplificar a produção de IFN-γ por outros tipos de células, incluindo células NK 2. Por outro lado, mais tarde, que actuam linfócitos T adaptativos, células T CD8 + em particular, são importantes para mediar a folga do patógeno ea protecção contra 1,4,22 re-infecção.

Este modelo de infecção tem sido atraente para os investigadores para uma série de razões (revisto em 1). Em primeiro lugar, a infecção com o agente patogénico é altamente reprodutível e induz uma forte resposta imunitária Th1 e celular. Em segundo lugar, durante a infecção subletal, carga bacteriana está concentrado no fígado e baço, onde ele pode ser facilmente medido. Em terceiro lugar, o agente patogénico pode ser manuseado com segurança sob condições de segurança biológica de nível 2 (BSL2). Em quarto lugar, o organismo e a resposta imune que gera têm sido extensivamente caracterizados. Finalmente, uma variedade de estirpes mutantes e geneticamente modificadas têm sido desenvolvidos que estão disponíveis para uso.

Descrito aqui é um protocolo básico para inoculação de camundongos C57BL / 6J com a estirpe EGD de L. monocytogenes 25 e para medir IFN - γ rerespos- por NK, NKT, e os linfócitos adaptativos pós-infecção. Também é descrito como para medir a carga bacteriana no baço e no fígado após a infecção subletal e para realizar estudos de sobrevivência após a infecção com uma dose de LD 50 modificada do agente patogénico. Finalmente, os dados representativos são mostrados de como este protocolo pode ser utilizado para pesquisar o efeito de novos tratamentos sobre as respostas de IFN-y e sobrevivência do ratinho de infecção por L. monocytogenes.

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Protocol

Declaração de segurança

Este protocolo descreve a infecção de ratinhos com L. monocytogenes vivo. O patógeno é tratado com segurança sob condições BSL2 por pessoal treinado que não estão imunocomprometidos. pessoas imunodeprimidas incluem mulheres grávidas, idosos e indivíduos que estão infectadas pelo HIV ou que tenham condições crônicas que necessitam de tratamento com terapia imunossupressora. O pessoal deve vestir um revestimento protetor laboratório ou vestido, luvas, máscara e proteção para os olhos ao manusear amostras infectadas. O trabalho aqui descrito foi realizado sob condições BSL2 abrigo de um certificado (# 32876) que foi emitido pela University Health Network (UHN) Biossegurança escritório. Carcaças de camundongos infectados ou quaisquer tecidos não utilizados foram duplamente ensacados e eliminados de resíduos de risco biológico. Gaiolas de camundongos infectados também foram descontaminados em autoclave.

Declaração de ética

Os ratos foram mantidos e infectados em um quarasala de ntine dentro de instalações para animais UHN e foram tratados de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Canadian Council on Animal Care. Todos os procedimentos em ratos foram realizadas sob uso de animais protocolo número 3214 que foi aprovado pelo comitê de cuidados com os animais UHN. Devido a considerações éticas, a morte não foi utilizada como um ponto final para estudos de sobrevivência. A dose LD 50 modificado descrito aqui para L. monocytogenes infecção foi determinada como sendo a dose para a qual 50% dos ratos alcançado parâmetros específicos, que consistia em uma perda de 20% no peso do corpo ou que mostra, pelo menos, dois dos seguintes sinais clínicos: letargia, pele arrepiou, postura arqueada, dificuldade para respirar, olhos baços ou afundados. Os ratos foram sacrificados quando chegaram endpoints através de exposição ao dióxido de carbono (CO 2), de acordo com as diretrizes da instalação UHN.

1. Preparação de Stocks glicerol para armazenamento a longo prazo

NOTA: Este procedimento descreve como stocks de glicerol daEGD estirpe de L. monocytogenes são preparados a partir de um estoque de glicerol originais. Passos que têm o potencial de gerar aerossóis deve ser realizada dentro de uma cabine de segurança biológica certificada (BSC).

  1. Prepare placas de agar de infusão de cérebro e coração (BHI) para o crescimento bacteriano. Para este adicionar 3,8% (w / v) de caldo de BHI e 1,5% (w / v) de agar para bidestilada H2O (ddH2O). líquido autoclave. Uma vez que o ágar arrefecer para 50 ° C, distribuir líquido em placas de petri bacterianas (25 mL / prato) e deixou placas secas (descoberta) na BSC, durante 1 h.
    NOTA: Transferência de agar BHI em um banho de água a 50 ° C após a autoclavagem para evitar a solidificação antes do vazamento placas. Armazene placas BHI a 4 ° C de cabeça para baixo (com o lado da mídia em cima) até que esteja pronto para uso.
  2. Prepare a mídia de BHI líquido. Para isso, misturar 3,8% (w / v) de caldo BHI em ddH 2 O. autoclave.
  3. Remover estoque de glicerol congelados da estirpe L. monocytogenes EGD do congelamento -80 ° CR e descongelação até à temperatura ambiente.
  4. Mergulhe uma ponta de pipeta estéril no estoque de glicerol descongelados e imediatamente raia a ponta e para trás através de uma seção de uma placa BHI. Esta é a raia primário.
  5. Vire a placa de 90 ° C e utilizando uma nova ponta de pipeta, arraste através da primeira etapa e espalhá-lo para o próximo ¼ da placa (esta é a raia secundário). Repita mais uma vez para fazer a raia terciário.
  6. Ligue placa de cabeça para baixo e incubar a 37 ° C durante a noite. colónias uniformes individuais devem ser obtidos no último conjunto de estrias e visível entre 16 e 24 horas.
  7. Dispensar 10 ml de caldo BHI estéril em uma ventilada 50 tubo estéril ml. Escolha uma colônia de L. monocytogenes a partir da placa utilizando uma ponta de pipeta estéril e inocular o caldo. Incubar a cultura numa incubadora a 37 ° C com agitação orbital durante a noite ou até DO600 = 1,0 com configurações a 225 rotações por minuto (rpm).
    NOTA: O vidro ou pla descartávelbalões de Erlenmeyer de STIC pode também ser utilizado para cultura de bactérias. Independentemente do tipo de recipiente utilizado, certifique-se de que é estéril, ventilado e que o volume de cultura não exceda 20% do volume total do recipiente para garantir arejamento adequado das bactérias.
  8. Preparar stocks de glicerol estéril através da mistura de glicerol a 100% com a cultura bacteriana líquida durante a noite a uma razão de 1: 1. Distribua a mistura bacteriana / glicerol em 2 ml frascos criogênicos (500 mL / frasco) e frascos de transferência para -80 ° C congelador para armazenamento.
    NOTA: Os métodos de banco de grânulo pode também ser usado em lugar dos stocks de glicerol para armazenar bactérias. Por este método, microesferas porosas são inoculadas com uma cultura pura de L. monocytogenes e são armazenadas a -80 ° C. Cada grânulo pode ser utilizada para inocular uma cultura fresco conforme necessário. Veja a lista de materiais para mais informações.

2. Determinação da curva de crescimento de L. monocytogenes em Cultura Dia NOTA: Este procedimento descreve como gerar a curva de crescimento de L. monocytogenes que é utilizado para estimar as unidades formadoras de colónias (CFU) para os estudos de infecção. Todos os passos que têm o potencial de gerar aerossóis deve ser realizada dentro de um BSC certificada.

  1. Tome 100? L de cultura durante a noite gerado no Passo 1,7-10 mL de meio BHI num tubo ventilado de 50 ml e crescer a 37 ° C numa incubadora com agitação (225 rpm, inclinada em ângulo de 45 °). Utilizar um tubo não inoculado como controlo.
  2. Aqui amostras de 0,5 ml da cultura em intervalos de hora em hora (1, 2, 3, 4, 5, 6 h, etc.). Dilui-se cada aliquota de 1: 1 (v / v) com meio BHI numa cuvete de plástico. Pipeta cima e para baixo para misturar. Medir a densidade óptica (OD) a 600 nm (OD600) usando um espectrómetro. Continuar a cultura de bactérias até DO600 = 1.
  3. Ao mesmo tempo, tomar uma amostra de 100 ul da cultura e diluiu-se com 900 ul de meios BHI numa esterilizado de 1,5 mL MICRocentrifuge tubo (esta é a diluição 10 -1). Centrifugar as bactérias a 6000 xg durante 5 min, e o sobrenadante aspirado.
  4. Lavar as bactérias duas vezes por ressuspensão do sedimento em 1 ml de meio BHI, a centrifugação durante 5 min a 6000 xg, e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 1 ml de mídia BHI. Prepara-se uma série de diluições de 10 vezes desta amostra em meio BHI (10 -2 a 10 -9). Espalhe 100 ul de cada diluente em placas de agar BHI separadas. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C em uma incubadora.
  5. No dia seguinte, escolher placas que têm entre 30-300 colônias. Descartar o resto. Contar as colónias sobre estas placas. A Tabela 1 mostra um exemplo de contagens obtidas na aliquota que foi feita quando DO600 = 0,84. Neste exemplo, uma das placas (isto é, 10 -6 diluição) tinham contagens de colónias entre 30-300 e foi utilizado para a CFU / ml cálculo.
    NOTA: Placas com maiorde 300 colônias não são utilizados, uma vez que a superlotação pode impedir o crescimento de bactérias e também torna difícil discernir e enumerar as colónias individuais. Placas com contagens <30 também não são usados, porque os pequenos erros na técnica de diluição ou à presença de contaminantes pode ter um grande impacto sobre a precisão das contagens na extremidade inferior do intervalo.
  6. Dividir o número de colónias por o volume plaqueadas e depois multiplicar pelo factor de diluição para obter o valor / ml CFU por uma diluição em particular. No exemplo na Tabela 1, a contagem na diluição de 10 foi -6 70. dividir este valor por 0,1 ml para obter o valor / ml CFU para a cultura diluída. Em seguida, multiplicar esse valor pelo factor de diluição (10 6) para se obter o valor / ml CFU da cultura não diluída (7,0 x 10 8).
  7. Traça-se a DO600 (eixo y) em função do tempo em horas (eixo do x) para identificar a fase logarítmica de crescimento de 26.
    NOTA: Este Curv crescimentoe fornece uma estimativa da CFU / ml de cultura dia quando cultivados a uma certa leitura OD. Escolha uma OD 600 de leitura que está na fase logarítmica de crescimento que pode ser utilizado como um alvo OD 600 para o cultivo de culturas dia. Estes dados podem ser agora utilizados para estimar o CFU em uma cultura de inoculo para a preparação (Processo 3).

3. Preparação do inóculo para a Infecção experimental com L. monocytogenes

NOTA: Este processo descreve a preparação do inoculo infeccioso a partir de uma cultura dia em que foi iniciada a partir de uma cultura durante a noite (preparado no Processo 2). Todos estes passos são realizados na BSC, a menos que indicado de outra forma.

  1. Calcular o número de CFU necessária para a infecção com base no número de ratinhos e desenho experimental do estudo. Adicionar um volume adequado de meios BHI para um balão de Erlenmeyer ou cultura em tubo ventilado estéril.
    NOTA: O UFC de bactérias prepared será dependente do tipo de experiência realizada. Para estudar NK e respostas de células NKT durante a infecção, cada rato é inoculado com 10 5 CFU de bactérias (Processo 6). Se estudar as respostas de células T à infecção ou adaptativas medindo a carga bacteriana, cada rato é inoculado com 2 x 10 4 CFU de bactérias (Processo 8). Se estudar a sobrevivência de endpoints, cada rato é inoculado com a dose LD 50 do patógeno (que é de 10 5 CFU para o sexo masculino e 1,5 x 10 5 CFU para o sexo feminino, consulte Procedimento 9).
  2. Inocular o tubo contendo meio BHI com 100? L de cultura durante a noite. Incubar a cultura numa incubadora a 37 ° C agitação orbital (225 rpm) até 600 OD de destino for atingido. Transferir o conteúdo da cultura para um tubo de centrífuga estéril.
  3. Centrífuga bactérias em um sedimento durante 5 min a 6000 x g utilizando uma centrífuga. Aspirar o sobrenadante utilizando um vácuo ligada a um balão de armadilha contendo lixívia.
  4. Lave o peletizado duas vezes com solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS), a centrifugação (5 min a 6000 xg) em meio.
  5. Aspirar a segunda lavagem e dilui-se bactérias na concentração apropriada em PBS 1x para entregar o CFU de interesse para cada rato num volume de 200 ul.
    NOTA: É melhor utilizar uma fonte comercial de estéril 1x PBS para as bactérias de lavagem e para a preparação do inoculo, uma vez que material de vidro de laboratório pode introduzir contaminantes imunológicas, tais como lipopolissacáridos.

4. Infecção experimental de camundongos com L. monocytogenes

NOTA: Este procedimento descreve como para infectar ratos com o inóculo preparado no Procedimento 3 e como verificar a CFU entregues no inoculo. Manipulação de ratos e injeções são realizadas em um BSC.

  1. Encomendar um número suficiente de camundongos C57BL masculino ou feminino / 6J para a sua experiência. encomendar também camundongos para servir como controles não infectados.
  2. Permitir ratos paraaclimatizar durante uma semana antes da inoculação bacteriana.
    NOTA: Este é porque o estresse associado com o transporte dos animais pode desencadear um aumento transitório na produção de hormônios de estresse e linfopenia 27,28.
  3. No dia da inoculação, obter um peso corporal basal para cada rato e gravá-lo no caderno de anotações.
  4. No BSC, misturar a suspensão bacteriana para cima e para baixo usando uma pipeta esterilizada para assegurar que as bactérias estão uniformemente distribuídos e, em seguida, tomar-se 200 uL do inoculo para uma seringa de 1 ml de engenharia de segurança equipada com uma agulha 25 G.
  5. Injectar um rato ip com 200 ul de inoculo preparada (por exemplo, 10 5 CFU por infecção de células NK, Processo 6). Para este procedimento, Scruff camundongos com a mão menos dominante, agarrando a pele solta em volta dos ombros do rato. Depois de garantir que o mouse é bem contido, injetar o mouse no quadrante inferior do abdómen, imediatamente lateral à midline para evitar a bexiga.
  6. Descarte a agulha e seringa em um recipiente de risco biológico farelos.
  7. Repita os passos 4,3-4,6 até que todos os ratinhos são injectados. Realizar passos semelhantes com 1x PBS injetado ratos (controles não-infectados).
    NOTA: Uma vez que o UFC é uma estimativa baseada na curva de crescimento, também é uma boa prática para verificar o UFC real no inóculo. Por isso, se preparar 3 - 4 diluições diferentes de inoculo preparada (utilizando uma série de diluição de 10 vezes) que se espera irá resultar em colónias contáveis. Espalhe 100 ul de cada diluente numa placa de agar BHI e incuba-se durante a noite a 37 ° C. Contar as colónias e calcular os reais CFU / ml tal como descrito no Procedimento 2.

5. Preparação de L. monocytogenes mortas pelo calor de Estudos imunitário

NOTA: Todos os passos que têm o potencial de gerar aerossóis são realizadas dentro do BSC.

  1. Crescer cultura dia até OD 600 valores are chegou a essa estão dentro da fase logarítmica. Dispense cultura em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga.
  2. Incubar os tubos em um 70 ° C num banho de água durante 1 hora para matar as bactérias.
  3. Lavar as bactérias duas vezes com PBS 1x como nos Passos 3.3 e 3.4. Ressuspender em meio RPMI completo estéreis, contendo soro fetal de vitelo (FCS) (ver arquivo suplementar para uma receita) a uma concentração de 4 x 10 6 / ml. Aliquota bactérias mortas em frascos de 2 mL estéreis criogénicos e armazenar a -80 ° C.
  4. Confirmar a morte das bactérias por difusão 100 ul de preparação de bactérias mortas por calor em placas de agar de BHI e incubou-se durante a noite a 37 ° C.
    NOTA: Estas bactérias mortas pelo calor deve estar pronto para estimular linfócitos em cultura no Procedimento 8. Se houver colônias que crescem na placa de ágar BHI, repita procedimento de matar de calor.

6. Medição de respostas de IFN-gama por células NK e NKT durante a infecção

NOTA: Este procedimento descreve como medir as respostas de IFN-gama por células NK e NKT em ratinhos às 24 h após a infecção com 10 5 UFC de L. monocytogenes. Esta dose é utilizado porque induz fortes respostas de IFN-gama por células NK e NKT no baço 24. Realizar todas as etapas do BSC. Para ajudar a manter a viabilidade celular, manter as células em gelo, sempre que possível e usar tampões geladas.

  1. Inocular ratinhos, tal como descrito no Procedimento 4, com 10 5 CFU de L. monocytogenes. Ao mesmo tempo, injectar os ratinhos de controlo não infectados ip com um volume igual de PBS 1x.
  2. Euthanize ratos às 24 h após a inoculação por inalação de CO2 de acordo com as diretrizes institucionais.
  3. Deite-se cada rato em seu lado direito e molhar a pele com etanol 70% usando uma garrafa.
  4. Utilizando uma pinça assépticas ou estéreis e tesouras difíceis de corte, inciso a pele logo abaixo da parte inferior da caixa torácica.
  5. Spray para baixoa camada de músculo exposta com 70% de etanol. O baço deve ser visível debaixo da camada muscular (ponta de seta aberta na Figura 1).
  6. Utilizando uma pinça assépticas ou estéreis e uma tesoura fina, inciso a camada muscular para revelar o baço. Agarram delicadamente o baço com a pinça e usar uma tesoura fina para cortar o baço longe da envolvente do tecido conjuntivo.
  7. Coloque o baço em um tubo cônico de 15 ml contendo estéril 1x PBS.
  8. Half-encher os pratos de Petri com estéril 1x PBS. Dissociar o baço através de um coador de células de nylon de 70 uM para a placa de petri usando a extremidade plana de uma seringa estéril de 3 ml.
  9. Transferir a suspensão de esplenócitos em um tubo de 15 ml estéril limpo usando um estéril 10 ml pipeta sorológica.
  10. Centrifugar as amostras a 335 xg durante 10 min a 4 ° C.
  11. Aspirar o sobrenadante para um balão de armadilha contendo lixívia. Solte o pellet celular sacudindo o tubo com um dedo ou arrastando o tubo inferiorfrente e para trás ao longo de uma superfície ondulada (por exemplo, o fluxo de entrada de ar no BSC).
  12. Lisar glóbulos vermelhos por adição de 1,5 ml de cloreto de amónio-potássio-(ACK) tampão de lise (ver Suplementar Arquivo 1 para a receita) para cada baço. Após exactamente 1 min e 15 segundos, encher o tubo com 1x PBS para parar a lise celular.
  13. Centrifugar as células tal como descrito no passo 6.10. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de células activadas por fluorescência (FACS) Buffer (1 x PBS estéril contendo 2% de FCS).
  14. Contar as células usando um hemocitômetro. Por isso, tomar duas alíquotas de suspensão de células para contagem. Adicionar 15 ul de cada suspensão de célula a um volume igual de azul de tripano (0,04%, feito por diluição de solução de azul de tripano a 0,4% em ddH2O). Carga de 15 ul de cada suspensão de célula azul / Tripano para dentro da câmara do hemocitómetro (ou seja, um na câmara de topo, uma câmara na parte inferior).
  15. Usando um microscópio, contar todas as células não-azuis emcinco grandes quadrados da grade central em cada uma das câmaras (Figura 2). Tome essa contagem e dividi-lo por 10 para obter o número de células em 10 6 / ml. No exemplo da Figura 2, a contagem de células é de 215 nos 5 quadrados; Portanto, a concentração de células é de 21,5 x 10 6 / ml. Calcular a média da concentração de células obtidos a partir das duas amostras.
  16. Semente 1 x 10 6 culas por po / mancha numa placa de 96 poços de fundo redondo para a coloração de citometria de fluxo. Certifique-se também semear células para imaculado e menos de fluorescência um controles (FMO). Ver fluxo recomendado citometria painel coloração na Tabela 2.
    NOTA: Para os passos seguintes, recomenda-se manter as células em gelo ou a 4 ° C e para proteger as células da luz com folha de fluorocromos quando estão presentes. Uma pipeta de canais múltiplos pode ser utilizado para dispensar líquidos de coloração em placas de 96 poços para acelerar o processamento. Tenha cuidado para não perturbar o pellet celular quandoaspiração do sobrenadante a partir da placa centrifugada. A coloração pode também ser feito em tubos de FACS se a centrífuga não está equipada com adaptadores de placas. Todos os passos de centrifugação a partir deste ponto são realizadas em 456 xg durante 5 min a 4 ° C.
  17. Centrifugar a placa e, em seguida, lavar as células duas vezes com tampão FACS. Uma lavagem é realizado por adição de 200 uL de tampão de SCAF a cada poço, a placa de centrifugação, e em seguida, aspirar o sobrenadante.
  18. Efectuar o passo de bloqueio, adicionando 50 uL / ​​poço de tampão FACS contendo anti-ratinho de CD16 / CD32 (bloco Fc purificado) (0,5 ug). Incube as células a 4 ° C durante 15 min. Lave as células uma vez em PBS 1x, como descrito acima.
  19. Adicionam-se 100 ul de corante de viabilidade (corante de viabilidade fixável diluído 1: 1000 em 1X PBS) às células. Stain células a 4 ° C no escuro (no refrigerador) durante 30 min. Lavar as células duas vezes em tampão de SCAF, tal como descrito acima.
  20. Após uma segunda lavagem, adicionar 100 ul de anticorpos da superfície celular ou para tetrâmeros respectivos poços de acordo com tO painel de coloração descrito na Tabela 2. Stain células a 4 ° C no escuro (no refrigerador) durante 30 min. Neste momento, também adicionar anticorpos individuais para a coloração de controlos positivos e FMO.
    Observação: Em relação controlos positivos individuais, recomenda-se a utilização quer de esplenócitos que são corados com o fluorocromo várias versões do anticorpo CD4 ou esferas de compensação comerciais que são coradas com os anticorpos utilizados no painel. Antes de realizar este procedimento de coloração, todos os anticorpos FACS deve ser titulado em estudos de teste para determinar as concentrações ideais para coloração.
  21. Lavar as células duas vezes em tampão de SCAF, tal como descrito acima e, em seguida fixar as células por ressuspensão em 50 uL de paraformaldeído a 4% (da paraformaldeído 16% diluído em ddH2O) e incubando durante 10 minutos à temperatura ambiente. CUIDADO: O paraformaldeído é tóxico e só deve ser tratado da coifa.
  22. Lave as células duas vezes in tampão FACS, centrifugar no meio. Ressuspender as células em tampão de SCAF. Continue a próxima etapa células ou guarde na geladeira protegido da luz por até três dias.
  23. centrifugar células, remover o sobrenadante e lavar as células duas vezes com 150 mL de tampão de lavagem 1X / permeabilização (Perm tampão / Wash), centrifugação no meio. O tampão de Perm / Wash é preparado a partir de um estoque de 10x por diluição de 1: 9 (v / v) em ddH 2 O.
  24. Após a segunda lavagem, ressuspender as células em 150 ul de tampão de Perm / Wash e incubar durante 15 min a 4 ° C no escuro.
  25. células Centrifugar novamente e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 50 ul de tampão 1x Perm / Wash contendo anti-IFN-γ e incubar durante 1 hora a 4 ° C no escuro.
  26. Lave as células duas vezes com tampão 1x Perm / Wash, centrifugação no meio. Ressuspender as células em 250 ul de tampão de SCAF e depois transferir células para tubos FACS.
  27. Avance para citometria de fluxo aquisição usando uma cytomet fluxoer que tem uma configuração de laser e filtro de conjunto apropriado para discriminar fluorocromos utilizados no painel de coloração descrito na Tabela 2 29. Colete pelo menos 200.000 eventos por amostra e 10.000 eventos para controles de compensação.
  28. Aplicar matriz de compensação e analisar dados usando o software de análise de citometria de fluxo 30.

7. Medição da carga bacteriana no baço e fígado no momento da infecção Peak

NOTA: Todos os passos são realizados dentro de um BSC, a menos que indicado de outra maneira.

  1. Inocular ratinhos ip com 2 x 10 4 CFU do agente patogénico utilizando os procedimentos descritos no Procedimento 4.
  2. No dia 3 após a infecção, preparar 1,5 ml estéreis tubos de microcentrífuga, cada um contendo 500 mL de gelo-frio estéril 0,1% de Triton X-100 em PBS 1x e de 0,2 - 0,3 g de 1,5 - esferas de vidro estéreis lavado com ácido 2 mm. Pesar cada tubo.
    NOTA: Contas de vidro são lavadas com ácido por incubating em ácido acético a 10% num copo num agitador magnético durante 1 h. Estes grânulos são, então, extensivamente lavadas com ddH2O para remover o ácido, são secas ao ar, e a seguir autoclavadas antes da utilização.
  3. Euthanize ratos por exposição ao CO 2.
  4. Para dissecção dos órgãos, coloque o animal à sua volta em uma placa de dissecação e fixar os membros do mouse para a placa utilizando 25 g de agulhas. Desinfectar a pele molhando com etanol 70%.
  5. Usando estéreis tesoura de corte difíceis, fazer uma incisão mediana na pele desde a virilha até meados do peito e, em seguida, a partir de meados da virilha no sentido de cada joelho e de meados do peito em direção cada cotovelo. dissecar Blunt e refletir de volta a pele, prendendo-a aberta usando 25 g de agulhas.
  6. Desinfectar camada muscular humedecendo-a com 70% de etanol e, em seguida, utilizando uma tesoura fina estéreis fazer uma incisão na linha média na parede peritoneal. Agarre o processo xifóide com uma pinça. Em seguida, usando as mesmas tesouras finas, fazer cortes na parede peritoneal do proce xifóideSS lateralmente em cada lado, na sequência da caixa torácica, logo abaixo do diafragma para revelar o fígado.
  7. Corte um pedaço mg ~ 100 do fígado (use o mesmo lobo para todos os ratos), utilizando uma tesoura esterilizada e coloque-o em um tubo de 1,5 ml de microcentrífuga pré-pesado.
  8. Use uma pinça para empurrar suavemente de lado os órgãos no lado esquerdo da cavidade peritoneal para visualizar o baço. Agarram delicadamente o baço com um par de fórceps e liberá-lo a partir da cavidade peritoneal com a retirada do tecido conjuntivo circundante.
  9. Colocar o baço no tubo pré-pesado de microcentrífuga de 1,5 ml contendo grânulos. Transporte tecidos até ao laboratório em um recipiente contendo gelo à prova de vazamentos. Re-pesar os tubos que contêm os órgãos para determinar os pesos dos tecidos em mg.
  10. Homogeneizar os tecidos por agitação dos tubos utilizando um moinho de esferas homogeneizador durante 3 minutos a uma frequência de 30 Hertz.
    NOTA: O método de moinho de esferas é o preferido para a homogeneização, uma vez que é favorável para procescante um grande número de amostras e cria menos confusão e potencial exposição ao agente patogénico. No entanto, homogeneizadores automáticas ou autoclavada 2 ml homogeneizadores de tecido manual de vidro poderiam ser utilizadas como uma alternativa.
  11. Prepara-se uma série de diluições de 10 vezes dos homogeneizados em 0,1% Triton-X-100 em PBS 1x, variando a partir de (variando de não diluído a 10 -7).
  12. Espalhe 100 uL de cada homogenato diluído numa placa de agar BHI (em duplicado) utilizando um espalhador estéril. Transferência de placas para uma incubadora a 37 ° C e incubar durante a noite.
  13. Mantenha as placas que contêm entre 30 e 300 colónias / placa, descartar o resto. Contagem das colónias em cada placa e determinar o número médio de colónias em duplicado para barrar.
  14. Calcule o UFC / mg de acordo com a seguinte equação:
    CFU / mg = CFU / ml no homogenato, multiplicado pelas ml de homogenato preparado, dividido pelo peso mg de tecido homogeneizado.
    NOTA: Por exemplo, se uma média de 30 colonies foram contadas após o plaqueamento 100 ul de 10 -2 homogenato diluído preparado a partir de um pedaço de 120 mg de fígado que foi homogeneizada em 0,5 ml, os cálculos seriam como se segue:
    (Factor de diluição) / ml = 30 colónias x 100 CFU / 0,1 ml (volume de propagação) = 30,000 CFU / ml.
    CFU / mg = 30,000 CFU / ml x 0,5 ml de homogenato / 120 mg de tecido = 125 CFU / mg.

8. Efeitos de L. monocytogenes em respostas de IFN-gama por linfócitos T CD4 + e CD8 +

NOTA: Este procedimento descreve como para medir a produção de IFN-γ por esplénica CD4 + e células efectoras CD8 + colhidas na altura do pico da resposta adaptativa imune (~ 7 d pós-infecção), utilizando dois métodos: (1) o fluxo de citometria para medir IFN-gama por linfócitos T CD4 + e CD8 + através de coloração de citocinas intracelulares, e (2) ELISA para medir os níveis totais de IFN-γ produzidos por esplenócitos (inclui todas as células T). procedimentossão realizadas dentro do BSC.

  1. Infect ratos por injecção IP com 2 x 10 4 CFU do agente patogénico utilizando os procedimentos descritos no Procedimento 4.
  2. No dia 7 após a infecção, eutanásia ratos por inalação de CO2 de acordo com as diretrizes institucionais.
  3. Dissecar do baço (como descrito acima) e colocar num tubo cónico de 15 ml contendo estéril 1x PBS. Transportar os tubos para o laboratório num recipiente contendo gelo à prova de fugas.
  4. Processar os baços numa suspensão de células individuais, lisar as células vermelhas do sangue, tal como descrito na secção 6, e, em seguida, ressuspender as células em meio RPMI completo contendo 10% de FCS. Contagem de células utilizando um hemocitómetro.
  5. Configurar culturas para medição de respostas IFN-y. Para esta células de dispensa (4 x 10 6 em 1 ml / poço) em placas de 24 poços em conjunto com e igual número (4 x 10 6 ou 1 ml / poço) de L. monocytogenes mortas pelo calor descongeladas (preparada no Procedimento 5) . Transferência de células a um 37° C incubadora.
  6. Após 20 horas de incubação, adicionar 0,66 ul / ml de inibidor de transporte de proteínas aos poços e as incubações continuam.
  7. Quatro horas mais tarde, a placa de transferência BSC e recolher 500 uL de sobrenadante de cultura e de congelação (-80 ° C) durante a medição depois de os níveis de IFN-gama usando um estojo de ensaio de imunossorvente ligado a enzima comercial (ELISA) 31. Em seguida recolher células para um tubo estéril de 15 ml. Lave os poços com PBS 1x e piscina esta lavagem juntamente com células coletadas.
  8. Realizar a coloração da superfície celular e coloração intracelular para o IFN-γ em CD4 + e CD8 +, tal como descrito no Procedimento 6, excepto usar o painel de coloração descrito na Tabela 3. Avance para o citômetro de fluxo de aquisição (coleta de 200.000 eventos / amostra) e analisar dados de 29 usando citometria de fluxo de software de análise 30.

9. Medir mouse Sobrevivência para Endpoints depois de L. monocytogenes Infecção

NOTA: Este processo descreve o efeito de um agente de sobrevivência do ratinho para pontos finais após a infecção com o LD 50 a dose modificada do agente patogénico. Todos estes procedimentos são realizados no BSC na instalação para animais.

  1. Injectar ratinhos ip com o LD 50 a dose modificada de L. monocytogenes como descrito no Processo 4. Esta foi determinada para ser de 10 5 UFC (para o sexo masculino) ou 1,5 x 10 5 CFU (por fêmea) 31.
  2. Siga ratos duas vezes por dia para os sinais clínicos e registrar estes sinais e peso corporal dos animais em um caderno de anotações. Euthanize ratos se eles mostram uma perda de 20% no peso corporal ou dois sinais clínicos de listeriose (letargia, pele arrepiou, postura curvada, dificuldade para respirar, olhos baços ou afundados).
  3. Após 14 dias, os ratinhos sobreviventes eutanásia por meio de inalação de CO 2.
  4. Prepare gráficos de Kaplan-Meier dos dados traçando a sobrevivência por cento de cada grupo contra o tempo 32.
    (Figura 7).

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Representative Results

A Figura 3 apresenta algum fluxo típico citometria de coloração de IFN-γ em células NK e NKT esplénicas às 24 h pós-infecção com 10 5 CFU de o agente patogénico. Esta figura também ilustra a estratégia de propagação para o painel de coloração descrito na Tabela 2. A Figura 4 mostra alguns dados representativos que foram obtidos numa experiência em que ratos machos foram tratados com o antagonista de PPAR? IS001 ou veículo de controlo, infectadas com 10 5 CFU de L. monocytogenes, e, em seguida, analisados para o IFN-γ em células NK e NKT após 24 hr . Esta figura mostra que o tratamento com IS001 impulsionado respostas de IFN-y por células NKT, mas não células NK após a infecção com o patogénio. A Figura 5 mostra a coloração representativo para o IFN-γ em células T CD8 + do baço CD4 + e aos 7 dias após a infecção após a re-estimulação ex vivo com PA morta pelo calorthogen. Esta figura também mostra a estratégia de propagação para o painel de coloração descrito na Tabela 3. Figura 6 mostra dados representativos que foram obtidos numa experiência em que ratos machos foram tratados diariamente com o antagonista IS001 ou veículo de controlo PPARa, infectados com uma dose subletal de L. monocytogenes, e analisados aos 7 dias pós-infecção. Esta experiência mostra que o tratamento com IS001 aumentou as respostas de IFN-gama por CD4 + e CD8 + linfócitos. A Figura 7 mostra dados representativos de um estudo que investigou o efeito do antagonista IS001 PPARa na sobrevivência do ratinho para pontos finais após a infecção com o LD 50 a dose modificada do agente patogénico. Plotados é a porcentagem de sobrevivência de ratinhos contra a infecção pós-tempo. Esta figura mostra que o tratamento com IS001 aumentou a sobrevivência de ratinhos macho de terminais. Em conjunto, estes dados ilustram como este modelo pode ser aplicado para investigaros efeitos de novos medicamentos ou tratamentos sobre respostas de IFN-γ in vivo e para explorar como estas mudanças imunes afetar a sobrevivência dos animais da infecção.

figura 1
Figura 1. Dissecando o baços de ratinhos infectados. Esta série de fotos mostra como dissecar o baço de um rato morto. (a) Deite o mouse em seu lado direito e spray para baixo a pele com etanol 70%. (b) Utilizando uma pinça assépticas ou estéreis e tesouras difíceis de corte, inciso a pele logo abaixo da parte inferior da caixa torácica. (C) do pulverizador para baixo da camada de músculo exposta com 70% de etanol. O baço deve ser visível debaixo da camada muscular (ponta de seta aberta). (d) Utilizando uma pinça assépticas ou estéreis e uma tesoura fina, inciso a camada muscular para revelar o baço. (e) Com cuidado, pegue o baço com a pinça e uSE finas tesouras para cortar o baço de distância a partir de em torno do tecido conjuntivo. (f) Colocar o baço em um tubo cónico de 15 ml contendo estéril 1x PBS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Os esplenócitos de contagem utilizando um hemocitómetro. (a) mostra a rede central do hemocitómetro. (b) mostra uma vista ampliada da grelha central que contém 25 grandes quadrados (que contêm cada um 16 quadrados mais pequenos). Os cinco grandes quadrados utilizados para contagem são realçadas em cinza (4 quadrados de canto mais o quadrado central na grade central). (c) mostra uma vista aumentada de um dos grandes quadrados cinzentos. Para determinar o volume da célula em 10 6 / ml, primeira contagemtodas as células viáveis ​​dentro dos cinco grandes quadrados cinzentos. No exemplo mostrado, essa contagem é 215. Quando a contagem, certifique-se de contar apenas todas as células claras (não-azul), incluindo aqueles que estão tocando as linhas duplas à direita e na parte inferior da grade. Não conte as células que tocam as linhas duplas do lado esquerdo e superior da grade. Leve o total de cinco contagem quadrado e dividi-lo por 10 para obter o número de células em 10 6 / ml. No exemplo, 215 dividido por 10 é de 21,5 x 10 6 células / ml. Note-se que estes cálculos só funcionam se você está contando 5 das grandes praças como destacado e diluir as células 1: 1 em azul de tripano. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Supressão Estratégia para a detecção de IFN-γ Produção em células NK e NKT. Primeiro portão em linfócitos em FSC-A por SSC-A trama. Então gate nesses eventos que estão na diagonal sobre o FSC-H / FSC-A trama. Estes são os singuletos. Então portão ao vivo (AmCyan -) e CD8 - células. Em seguida, traçar a coloração tetrâmero contra TCRβ. As células NKT estão dentro da população positiva dupla e as células NK são dentro da população dupla negativa. Portão nas células positivas duplas, e enredo NKp46 contra FSC. Porta na população negativa NKp46, que são as células NKT (esta porta pode ser definido por encontrar o ponto de divisão em duas populações de trama de células NK). As células NK são a tetrâmero - TCRβ - NKp46 + população. Dentro de portões de células NK e NKT, as células + IFN-y no canal PE são identificados depois de estabelecer um portão com base no controlo de FMO. Por favor cliqueaqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Os dados representativos obtidos para as frequências de células NK e NKT IFN-γ + às 24 h pós-infecção. Nesta experiência, ratos machos C57BL / 6J (n = 3-4 / grupo) foram infectados IP com 10 5 CFU de L. monocytogenes ou ficaram infectados-un. Os murganhos também foram administrados a IS001 droga ou veículo (0,5% de carboximetil celulose), ao mesmo tempo da inoculação e 12 horas mais tarde. Vinte e quatro horas após a inoculação, os ratinhos foram sacrificados e os baços foram removidos e foram processadas individualmente e coradas para citometria de fluxo. Mostrado são a média ± SEM de frequência de IFN-γ + células na NK (um) ou portões de células NKT (b) em ratinhos não infectados ou infectados após o tratamento com um veículo ou a droga IS001. *Indicarsa diferença (P <0,05) a partir do controlo do veículo por bicaudal t-teste. Os dados são re-impressas a partir de 31, com a permissão do Journal of Immunology (volume 195, pp. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Supressão Estratégia para a detecção da produção de IFN-γ em células T CD4 e CD8. Primeiro portão em linfócitos em FSC-A por parcelas SSC-A. Então gate nesses eventos que estão na diagonal sobre o FSC-H / FSC-A trama. Estes são os singuletos. Dentro deste portão, portão (AmCyan -) ao vivo células CD45 +. Então portão sobre as populações, quer CD8 + ou CD4 +. Dentro de cada porta, o IFN-γ +células no canal PE são identificados, comparando a coloração com o controlo FMO. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. Os dados representativos obtidos para as freqüências de células CD4 + e CD8 + IFN-γ + a 7 dias após a infecção com L. monocytogenes (estirpe EGD). Nesta experiência, ratos machos C57BL / 6J foram infectados ip com 2 x 10 4 CFU de L. monocytogenes (n = 7 / grupo) ou foram deixadas não infectado (N = 3 / grupo). Os murganhos também foram administrados a IS001 droga ou veículo (0,5% de carboximetil celulose) de partida duas vezes ao dia no dia da inoculação. Sete dias mais tarde, os ratinhos foram sacrificados e os baços foram removidos e foram processadas individualmente paracultura de células. As células mononucleares de esplenócitos foram estimulados durante 24 horas com mortas pelo calor com L. monocytogenes transporte proteína inibidora adicionados para a 4 h finais de cultura. As células foram então coradas para citometria de fluxo. Mostrado são a média ± SEM de frequência de IFN-γ + células T CD4 + no (a) ou portões de células T CD8 + (B) em ratinhos não infectados ou infectados após o tratamento com um veículo (carboximetilcelulose a 0,5%) ou o fármaco IS001. * Indica uma diferença significativa (P <0,05) a partir do correspondente controlo do veículo, conforme determinado pelo teste t de duas caudas. Os dados são re-impressas a partir de 31, com a permissão do Journal of Immunology (volume 195, pp. 5189-5202, 2015) .Copyright 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 7. Dados representativos obtidos durante um experimento que comparou o efeito de um PPAR Antagonista 1S001 no rato Sobrevivência para Endpoints após a infecção do macho C57BL / 6J com L. monocytogenes (estirpe EGD). Nesta experiência, ratos machos C57BL / 6J (n = 10 ratinhos / grupo) foram infectados IP com o LD 50 a dose modificada do agente patogénico (10 5 CFU) de L. monocytogenes. Os murganhos também foram administrados a IS001 droga ou veículo (0,5% de carboximetil celulose) de partida duas vezes ao dia no dia da inoculação. Os ratos foram acompanhados diariamente por sinais clínicos e foram eutanasiados se os terminais humanas foram atendidas. É mostrada a percentagem de sobrevivência de murganhos de terminais ao longo do tempo * indica uma diferença na sobrevivência entre os grupos tal como determinado pelo teste de log-rank (P <0,05). Os dados são re-impressas a partir de 31, com a permissão do Jornal of Imunologia (volume 195, pp. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tabela 1
Tabela 1: mostra alguns cálculos representativos para a determinação de CFU em uma alíquota de cultura em dia. Neste exemplo, uma alíquota de cultura em dias e foi feita foi diluída 1: 1 com meio BHI. A DO600 desta amostra diluída foi determinada como sendo 0,84. Além disso, uma alíquota de 100 ul foi feita para a determinação de CFU. Esta amostra foi diluída com 900 ul de meio BHI (10 -1) e foi lavado e ressuspenso em 1 ml BHI. Uma série de diluições de 10 vezes desta amostra foi preparada (10 a 10 -2 -9) e amostras diluídas foram semeadas em BHI AGAr placas (apenas para valores de 10 -4 a 10 -9 são mostrados). As colônias dia seguinte foram contados. Somente aquelas placas que tinham números de colónias entre 30-300 foram considerados para o cálculo (ou seja, 10 -6 placa, destacada em amarelo). O número de colónias sobre esta placa (70) foi, em seguida, dividido por 0,1 (o volume em ml chapeado) para obter o CFU / ml de amostra diluída. Este valor foi multiplicado pelo factor de diluição (10 6) para se obter a leitura / ml CFU da cultura não diluída. TMTC = demais para contar.

mesa 2
Tabela 2: Painel de coloração para detecção de IFN- γ em células NK e NKT. Note-se que tanto esferas de compensação coradas com os anticorpos de fluxo usado no painel ou esplenócitos coradas com fluorocromos diferentes versões de CD4 GK1.1 clone de anticorpo podem ser utilizadas como controlos positivos individuais.

tabela 3
Tabela 3: Painel A coloração para detecção de IFN-γ em células T CD4 + e CD8 +. Note-se que tanto esferas de compensação coradas com os anticorpos de fluxo usado no painel ou esplenócitos coradas com fluorocromos diferentes versões de CD4 GK1.1 clone de anticorpo podem ser utilizadas como controlos positivos individuais.

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Discussion

Descrevemos aqui um protocolo de como levar a cabo uma infecção experimental de base com a estirpe de L. monocytogenes EGD de 25 em camundongos C57BL / 6J machos ou fêmeas. Este protocolo foi criado com a finalidade de estudar o efeito de uma molécula pequena novela IS001 sobre a produção de IFN-γ por linfócitos inata e adaptativa in vivo 31. Ao monitorar depuração bacteriana e sobrevivência pós-infecção, percepções foram obtidas em como essas mudanças em IFN-γ comprometido a capacidade do hospedeiro para controlar a infecção.

Considerações críticas no protocolo

Uma consideração importante na concepção deste tipo de estudo é que cada experimento ser devidamente alimentado e adequadamente controlada. Devido à variação biológica da resposta imune à infecção (ver Figuras 4 e 6), recomenda-se que N = 4-5 ratinhos por grupo deverá ser utilizado para os estudos imunológicos iniciais. Se umepois estes estudos há uma tendência nos dados, mas não houve diferença significativa aparente entre os grupos, um cálculo de energia poderia ser feito para determinar o menor número de animais necessários em estudos posteriores para alcançar significância estatística. No que diz respeito controlos, é importante incluir controlos não infectados por determinação das respostas de IFN-y da linha de base para estudos imunológicos e controla veículo para ajudar a distinguir o efeito do tratamento do stress relacionado com a administração do tratamento. Outra consideração importante é o tempo de tratamento. Uma vez que a resposta inata para L. monocytogenes é muito rápida, recomenda-se que o primeiro tratamento seja administrado no dia antes de, ou ao mesmo tempo que, a inoculação, a fim de assegurar que os níveis terapêuticos de o reagente ser conseguida antes da iniciação da resposta imune inata.

Ainda uma outra consideração importante é a dose do agente patogénico a ser utilizado para INFECTIOn. Uma dose subletal é recomendado para a medição da carga bacteriana, uma vez que aumenta a probabilidade de que o agente patogénico será concentrada no baço e no fígado, permitindo a enumeração mais preciso das bactérias. Uma dose subletal é também recomendado para enumerar as respostas de IFN-gama por linfócitos adaptativos para assegurar que os animais não sucumbir à listeriose antes do tempo de expansão de células T de pico. Em contraste, recomenda-se que uma dose mais elevada infeccioso ser utilizado para a medição da resposta precoce das células NK e NKT às 24 h, a fim de maximizar a produção de IFN-γ por estas células.

O LD clássico 50 é a dose de agente patogénico que resulta em 50% de letalidade de ratos. Desde a morte não era um desfecho aceitável em nossa instituição e uma vez que muitos sintomas da listeriose pode prever se um animal é provável a sucumbir a uma infecção, usamos uma lista definida de sinais clínicos, em vez de morte como desfecho em nossos estudos. Using este método, determinou-se que a LD 50 modificado foi de 10 5 UFC para o macho de 8 semanas de idade e 1,5 x 10 5 CFU para 8 semanas de idade, fêmea C57BL / 6J 31. Estes LD 50 doses foram determinadas através da medição da percentagem de sobrevivência de ratinhos para terminais em estudos de escalada de dose passo a passo (n = 5 estudos no total) que cada um continha N = 8 ratinhos por grupo (por exemplo, os ratinhos foram infectados em primeiro lugar com 10 mil CFU , em seguida, um segundo lote com 20.000 CFU, etc). O cálculo de LD 50 foi determinada a partir de uma trama de regressão do logaritmo (CFU) (eixo dos X) em relação ao probit dos valores de percentagem de sobrevivência (eixo y) (site: userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit /ProbitAnalysis.pdf).

Note-se que a LD 50 a dose modificada determinada no nosso laboratório pode ser diferente do que em outro laboratório, mesmo quando infectar ratinhos com a mesma estirpe de L. monocytogenes. Parte dessa variabilidade pode estar relacionada com a natureza o subjetivaf monitorização dos sinais clínicos de listeriose em comparação com o ponto de extremidade mais absoluta de morte. variabilidade adicional pode resultar de diferentes fatores ambientais tais como a dieta do rato ou a microbiota ou diferenças na preparação do inóculo entre laboratórios. Assim, recomenda-se que antes de iniciar os estudos de sobrevivência, um estudo piloto ser realizado onde os ratos do sexo feminino (n = 8 ratinhos / grupo) são infectados com 1,5 x 10 5 CFU da mesma estirpe de L. monocytogenes como utilizado neste estudar e sintomas monitorizados para determinar se esta dose de fato resulta na sobrevivência de 50% para pontos finais. Se a sobrevivência é inferior ou superior a 50% neste CFU, de escalonamento de dose passo a passo ou de dose estudos de escalonamento de-poderia ser realizada para reduzir rapidamente em sobre a dose LD 50.

Outra consideração importante é a tensão ou subestirpe de ratos utilizados para estudos de infecção. Este protocolo descreve infecção do comumente usado pura estirpe de ratinhos C57BL / 6J. este estirpe é bem adequado para a medição das respostas de IFN-y do rato uma vez que esta é considerada como sendo uma estirpe de tipo Th1 propensos 33 e, como resultado, é relativamente resistente à infecção por L. monocytogenes (em comparação com estirpes de Th2 propensas rato, tais como ratinhos BALB / c) 34,35. Adaptar este protocolo para outras linhagens de camundongos exigirá conhecimento da dose infecciosa do patógeno para a estirpe particular. Também é recomendável usar ratos da mesma idade, sexo e fornecedor, conforme descrito neste protocolo, a fim de reduzir a quantidade de solução de problemas envolvidos na criação do modelo. Por exemplo, ratinhos C57BL / 6 solicitados de um fornecedor (por exemplo, ratinhos C57BL / 6J) podem apresentar diferenças genéticas que C67BL / 6 ratos ordenadas de outro fornecedor (por exemplo, ratinhos C57BL / 6NTac) 36. Além disso, a microbiota intestinal difere entre C57BL / 6 subestirpes obtidos a partir de diferentes fornecedores, o que pode influenciar o equilíbrio das respostas Th1 e Th17 no rato 37.

ove_title "> Modificações Potenciais à técnica

Os ratinhos são mais comumente inoculados ip quer por via intravenosa, em oposição à via natural de infecção em seres humanos, que é através do tracto gastrointestinal. Infecções orais são menos comuns porque cepas padrão de L. monocytogenes de forma ineficiente infectar o epitélio intestinal de ratos 38. Isto é porque existe uma única alteração de aminoácido na sequência de E-caderina de rato a partir de E-caderina humana que resulta em perda de reconhecimento da E-caderina por a proteína invasão listeriais, internalin A (INIA) 39. Para ultrapassar esta barreira, os investigadores usam ratos que são transgénicos para a proteína E-caderina humana ou usam Listeria que foram manipuladas para expressar uma sequência mutada de INIA (INIA mut) que se liga ao rato E-caderina com a mesma afinidade que a WT EGD para E-caderina 40 humano. Assim, uma modificação do potencial desta técnica é para infectar ratos por via oral. O leitor é remetido para outra publicação JoVE que descreve métodos de inoculação orais 38. Note-se que alterando o modo de infecção irá afectar a dose infecciosa, bem como a cinética de difusão do agente patogénico.

Este protocolo descreve o uso de Listeria morta pelo calor para induzir a produção de IFN-γ por células T CD4 + e CD8 +. L. monocytogenes morta pelo calor foi escolhido como um estímulo nos nossos estudos, porque este antigénio é barato e porque o nosso laboratório estava principalmente interessado em respostas de células T CD4 + para o agente patogénico. Uma limitação é que as bactérias mortas pelo calor não eficientemente respostas de células T CD8 + primos, quer in vitro ou in vivo 41 42,43 infecção. Assim, a produção de células T CD8 + IFN-γ que observamos por esplenócitos colhidos no pico da infecção (isto é, a Figura 6) é provável em resposta à residualbactérias vivas presentes nas culturas de esplenócitos ou foi induzidos como resultado de citocina induzida por libertação de citoquinas 41. Como uma alternativa para Listeria morta pelo calor, pode-se também induzem respostas de IFN-y ex vivo por exposição das células T a péptidos que codificam epitopos em proteínas listeriais. De facto, os epítopos para listeriolisina O e a hidrolase p60 imunodominante de MHC de classe II restrito e têm sido descritos para os epitopos imunodominantes de MHC de Classe I C57BL / 6 e BALB / c fêmeas e têm sido descritos para ratinhos BALB / c 44. Ainda uma outra abordagem é para infectar murganhos com estirpes de L. monocytogenes que foram manipuladas para expressar antigénios modelos, como a ovalbumina ou antigénios virais, a fim de tirar vantagem de MHC de Classe I e MHC de Classe II reagentes tetrero-existente para enumerar específica de antigénio As células T em camundongos infectados 45,46.

Outras limitações do protocolo

Outra limitação deste modelo é que ele oprodução medidas NLY IFN-γ pelas células imunitárias do baço. Em adição à utilização de tetrâmeros para enumerar células T específicas de antigénio (ovalbumina-de expressar variantes de L. monocytogenes), citometria de fluxo painéis de coloração aqui descritas poderia ser facilmente modificado para medir a produção de outras citocinas, tais como TNF ou IL-2 ou moléculas efectoras que participam em células T CD8 ou morte de NK mediada do agente patogénico, tal como perforina ou granzima B. além disso, este protocolo pode também ser adaptado para examinar o IFN-γ produzido por células do sistema imunológico no fígado.

Aplicações futuras

Uma vez que este protocolo é dominado, ele pode servir como um simples modelo in vivo para examinar os efeitos de vários agentes ou genes sobre Th1 e imunidade celular.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion Broth, Modified BD 299070 any brand should be appropriate
Agar BD 214010 any brand should be appropriate
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 any brand should be appropriate
1x PBS Sigma D8537 any brand should be appropriate
TissueLyser II Qiagen 85300 any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl) any brand should be appropriate
KHCO3 any brand should be appropriate
Na2EDTA any brand should be appropriate
RPMI 1640 Gibco 22400089 any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum  Gibco 12483 Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine Gibco 25030 any brand should be appropriate
Non-essential amino acids Gibco 11140 any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD 554724 Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaldehye Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS
10x Perm/Wash buffer BD 554723 Dilute 1x in ddH2O
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506 eBioscience 65-0866 Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) eBioscience 15-0041 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) eBioscience 11-0081 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC NIH Tetramer Core Facility N/A Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) eBioscience 25-5961 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) eBioscience 47-3351 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) eBioscience 25-0451 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) eBioscience 12-7311 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads eBioscience 01-1111 Use one drop per stain
Mouse IFN gamma ELISA kit eBioscience 88-7314 Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 ml vented tubes for culture Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes any brand should be appropriate
bacterial petri dishes any brand should be appropriate
2 ml cyrovials any brand should be appropriate
UV spectrometer any brand should be appropriate
safety engineered needles any brand should be appropriate
C57BL/6J Jackson laboratories Stock#000664 Order for arrival at 7 weeks
Bleach For decontamination
70% Ethanol For decontamination
Glass beads any brand should be appropriate
Centrifuge rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge any brand should be appropriate
Sterile Glycerol any brand should be appropriate
Pipette Tips any brand should be appropriate
Pipette any brand should be appropriate
Surgical instruments any brand should be appropriate
70 micron strainers any brand should be appropriate
3 ml syringe any brand should be appropriate
Pipette gun any brand should be appropriate
Filtration Units any brand should be appropriate
Trypan Blue Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate
Hemocytometer any brand should be appropriate
Round bottomed plates any brand should be appropriate
FACs tubes Fisher Scientific 14-959-5
BD LSR II BD Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software Treestar Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0 - 300 µl) Eppendorf Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System Pro-lab Diagnostics Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria

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Infecção experimental com<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y
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Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, M. A., Mallevaey, T., Dunn, S. E. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (117), e54554, doi:10.3791/54554 (2016).

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