Summary
Hier gebruiken we een polyurethaan afstembare nanopore geïntegreerd in een weerstandsbelasting puls detectie techniek nanodeeltjes oppervlaktechemie gekenmerkt via de meting van het translocatie snelheden, die kunnen worden gebruikt om het zeta potentieel van individuele nanodeeltjes bepalen.
Abstract
Nanopore technologieën, gezamenlijk bekend als resistieve pulssensoren (RPS), worden gebruikt voor het detecteren, kwantificeren en karakteriseren van eiwitten, moleculen en nanodeeltjes. Afstembare resistieve pulse sensing (TRPS) is een relatief recente aanpassing RPT dat een afstembare porie die kunnen worden gewijzigd in real time opgenomen. We gebruiken hier TRPS de translocatie tijden van DNA-gemodificeerde nanodeeltjes bewaken zijn bij het doorkruisen de afstembare porie membraan als functie van de DNA-concentratie en de structuur (dat wil zeggen enkelstrengs aan dubbelstrengs DNA).
TRPS is gebaseerd op twee Ag / AgCl-elektroden gescheiden door een elastomeer membraan porie dat een stabiele ionenstroom op een aangelegd elektrisch veld bepaalt. In tegenstelling tot diverse optische gebaseerde deeltjes karakterisering technologieën, kunnen TRPS individuele deeltjes te karakteriseren onder een steekproef bevolking, waardoor voor multimodaal monsters worden geanalyseerd met gemak. Hier tonen we zetapotentiaal metingendeeltje via translocatie snelheden van bekende standaarden en toepassen op analyt translocatie maal monster, hetgeen resulteert in de meting van de zeta-potentiaal van deze analyten.
Te verschaffen, om gemiddelde zeta potentiaal waarden worden de monsters allemaal gemeten onder toepassing van een deeltje per deeltje perspectief vertoont meer informatie over een bepaald monster door monster populatieverdelingen bijvoorbeeld. Van een dergelijke, deze methode toont potentieel binnen sensing toepassingen zowel medische en milieugebied voor.
Introduction
Gefunctionaliseerde nanodeeltjes worden steeds populairder als biosensoren zowel medische en milieu velden. Het vermogen om een nanodeeltje de oppervlaktechemie te veranderen, met DNA, bijvoorbeeld, is nuttig voor gerichte geneesmiddelafgiftesystemen 1 en controle DNA-eiwit interacties 2-4 blijkt. Een steeds vaker voorkomende nanodeeltjes pand wordt gebruikt in bioassays en in de levering van geneesmiddelen is superparamagnetisme 5. Superparamagnetische deeltjes (POD) zijn zeer bruikbaar bij het identificeren en verwijderen van specifieke analyten uit complexe mengsels en kan dit met de eenvoudige bediening van een enkele magneet. De verwijderde de analyt gebonden deeltjes kunnen worden gekarakteriseerd en geanalyseerd geschikt voor het doel.
Vorige methoden voor de detectie en karakterisering van nanodeeltjes omvatten optische technieken zoals dynamische lichtverstrooiing (DLS), alias fotoncorrelatiespectroscopie. Hoewel een high throughput techniek DLS beperkt tot zijnde een gemiddelde gebaseerde techniek en bij de analyse van multimodale monsters zonder toevoeging van gespecialiseerde software, zal de grotere deeltjes een meer dominante signaal te produceren, waardoor sommige van de kleinere deeltjes volledig onopgemerkt 6,7. Particle-by-deeltjes karakterisering technieken zijn daarom veel gunstiger voor nanodeeltjes en gefunctionaliseerde nanodeeltjes te analyseren.
RPS gebaseerde technologieën zijn gebaseerd op het aanleggen van een elektrisch veld aan een monster en controle op de transportmechanisme van de deeltjes door een synthetisch of biologisch nanopore. Een relatief recente nanodeeltjes detectie en typering techniek op basis van RPS is instelbaar resistieve pulse sensing (TRPS) 8-16. TRPS Twee-elektrodensysteem gescheiden door een elastomeer, afstembare membraan poriën. Afstembaar porie werkwijze maakt analyten verschillende vorm 17 en afmetingen te meten via de transpoort mechanismen door de porie. Afstembare poriën zijn eerder gebruikt voor de detectie van kleine deeltjes (70-95 nm diameter) produceren vergelijkbare resultaten met andere technieken zoals transmissie elektronen spectroscopie (TEM) 10. Wanneer een elektrisch veld wordt toegepast, wordt een ionenstroom waargenomen en als deeltjes / moleculen door de poriën passeren, zij tijdelijk de poriën blokkeren, waardoor een verlaging van de stroom die kan worden gedefinieerd als een "blokkade event. Elke blokkade gebeurtenis representeert een enkel deeltje zodat elk deeltje in een monster afzonderlijk kenmerk kan worden gebaseerd op de blokkade magnitude, Δ 
En volle breedte half maximum, FWHM, evenals andere eigenschappen blokkade. Het analyseren van individuele deeltjes als ze door een nanogaatje passeren is voordelig voor multimodaal monsters als TRPS succesvol en effectief een bereik kan onderscheiden van deeltjesgrootte AmonGST een enkel monster. Tunable resistieve pulse sensing voltooit maat 10, zetapotentiaal 12,18 en concentratie 15 metingen tegelijk in een enkele run en kan dus nog differentiëren monsters van soortgelijke, zo niet dezelfde grootte van hun oppervlakte lading 19; een voordeel ten opzichte van alternatieve dimensionering technieken.
Zeta potentieel wordt gedefinieerd als de elektrostatische potentiaal op het vlak van afschuiving 20, en wordt berekend uit deeltjessnelheden mocht steken een porie 19. Zeta potentiaal metingen van afzonderlijke geeft dus inzicht in de mechanismen translocatie en het gedrag van nanodeeltjes systemen in oplossing waardevolle informatie voor de toekomst van nanodeeltjes test ontwerpen voor verschillende toepassingen. Deeltje per deeltje analyse van dergelijke aard maakt ook de verspreiding en verspreiding van zeta potentiaal waarden bij een steekproef worden onderzocht, waardoor meer informatie on reactiekinetiek (enkelstrengs aan dubbelstrengs DNA, bijvoorbeeld) en deeltjes stabiliteiten in oplossing te bereiken.
We beschrijven een techniek die detecteert en kenmerkend zowel ongemodificeerde en gemodificeerde DNA-SPP oppervlakken. De hierin beschreven protocol is toepasbaar op een reeks van anorganische en biologische nanodeeltjes, maar we tonen de procedure via DNA-gemodificeerde oppervlakken vanwege hun breed toepassingsgebied. De techniek kan de gebruiker onderscheid tussen enkelstrengs en dubbelstrengs DNA doelen op een nanodeeltje oppervlak, gebaseerd op deeltjes translocatie snelheden door een poriënsysteem en zo hun zeta potentieel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het maken van de fosfaat gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (PBST) Buffer
- Ontbinden één tablet PBS (0,01 M fosfaatbuffer, 0,0027 M kaliumchloride, 0,137 M natriumchloride, pH 7,4) in 200 ml gedeïoniseerd water (18,2 MQ cm).
- Voeg 100 ul (0,05 (v / v)%) Tween-20 aan de 200 ml bufferoplossing als surfactant.
2. De voorbereiding van de Carboxyl polystyreen Particle Standards
- Vortex de kalibratie deeltjes gedurende 30 seconden voordat sonicatie gedurende 2 minuten bij 80 watt monodispersiteit van de deeltjes te creëren.
- Verdun de kalibratie deeltjes 1 in 100 tot een concentratie van 1x10 10 deeltjes / ml in PBST buffer en vortex gedurende 30 seconden.
3. Voorbereiden van Streptavidine gecoate deeltjes
- Vortex de deeltjes gedurende 30 seconden voordat sonicatie gedurende 2 minuten bij 80 Watt monodispersiteit waarborgen.
- Verdun de streptavidine beklede deeltjes 1 in 100 in PBST buffer achieve een resulterende concentratie van 1x10 9 deeltjes / ml en vortex gedurende 30 seconden.
Opmerking: Een typische monstervolume is 200 pi. Wanneer bijvoorbeeld vijf onderzoeken DNA concentraties te bereiden 1 ml verdunde streptavidine beklede deeltjes.
4. Bereiding van Oligonucleotiden
- Reconstitueren oligonucleotiden met gedeïoniseerd water tot een resulterende concentratie van 100 uM.
5. Toevoeging van vangprobe (CP) DNA aan de streptavidine beklede deeltjes
- Voorafgaand aan DNA binden, vortex streptavidine gecoate deeltjes (200 pi monstervolume) gedurende 30 seconden gevolgd door een 2 minuten sonicatie bij 80 watt.
- Gebaseerd op de bindingscapaciteit van de leverancier (4352 pmol / mg), voeg de juiste concentratie van DNA aan de deeltjes voor resulterende concentraties van 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 en 210 nM DNA.
- Vortex de monsters gedurende 10 seconden en leg ze op een roterend wiel bij kamertemperatuurgedurende 30 minuten om het DNA via een streptavidine-biotine interactie binden aan het deeltjesoppervlak.
- Zodra de capture DNA werd toegevoegd en geïncubeerd met streptavidine beklede deeltjes, het overtollige DNA in oplossing via magnetische scheiding door het plaatsen van de monsters op een magnetische rek voor 30 min.
- Verwijder het supernatant, verzorgen de nieuw gevormde cluster deeltjes dichtste bij de magneet niet te verstoren, en vervangen door hetzelfde volume van nieuwe PBST buffer.
6. Hybridiserende Complementair DNA aan de CP-deeltjes
- Voeg de vereiste hoeveelheid doel-DNA (meer dan 500 nM) bij het optimaliseren doelwitbindingsgebied bereikt waarborgen.
- Vortex de monsters gedurende 10 sec en plaats op een roterend wiel bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Zodra de hybridisatie voltooid is, het overtollige target DNA via magnetische scheiding door het plaatsen van de monsters op een magnetische rek voor 30 min.
- Verwijder het supernatant, Zorg ervoor dat u de nieuw gevormde cluster van deeltjes die het dichtst bij de magneet te verstoren, en te vervangen door hetzelfde volume van de nieuwe PBST buffer.
- Herhaal stap 6,1-6,4 voor duplo monsters en plaats deze monsters op een roterend wiel bij kamertemperatuur gedurende 16 uur aan DNA hybridisatie keer te onderzoeken.
7. TRPS Setup
- Steek de stekker in het instrument in een computer-systeem met software op zijn plaats.
- IJk de eerste stuk met behulp van een schuifmaat.
- Meet de afstand tussen de buitenzijde van twee parallelle bekken.
- Input in de software door het intikken van de rek in het veld 'stretch' in het tabblad 'Instrument Settings' en te klikken op 'kalibreren stretch' onder het tabblad.
- Zijdelings past een polyurethaan nanogaatje membraan van de juiste maatvoering voor analyse op de kaken van de nanogaatje ID-nummer naar boven. Vervolgens strekken de kaken de rek die nodig is voor analyse met behulp vanstretch aanpassingshandvat aan de zijkant van het apparaat. Strek de kaken tussen de 43 en 48 mm.
Opmerking: De exacte waarde van de rek bepaald langs aangelegde spanning zodat kalibratie deeltjes blokkades tenminste 0,3 nA groot. Het traject is al ingevoerd in de software in stap 7.2 en zal automatisch aan te passen als de kaken worden uitgerekt. - Plaats 80 ul van PBST buffer in de onderste vloeistof cel, onder de nanogaatje, zodat er geen luchtbellen aanwezig zijn die de meting kunnen beïnvloeden. Als er luchtbellen te zien, verwijderen en vervangen van de buffer.
- Klik op de bovenste vloeistof cel op zijn plaats en plaats 40 pi buffer erin, weer zodat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Indien luchtbellen aanwezig in de bovenste vloeistof cel zijn, verwijder ze door het vervangen van de vloeistof.
- Wanneer een reproduceerbare stroom basislijn is bereikt door het vervangen van de bovenste fluïdumcel met buffer, voeg 40 ul van het monster op de bovenste fluïdumcel en meet de pagina 'stkunst 'in het tabblad' Data Acquisition 'van de software het scherm.
Opmerking: De data acquisitie is afgerond met een frequentie van 50 kHz met een blokkade magnitude ondergrens van 0,05 nA, hoewel dit kan worden veranderd met behulp van de software via het tabblad Analyse Data '(onder' Analyse Settings 'en' resistief Blokkades) . - Plaats een kooi van Faraday over de bovenkant van het fluïdum celsysteem elektrische ruis op de metingen te reduceren.
- Gebruik een variabele drukmodule (VPM) een druk of vacuüm toegepast op de monsters.
- Voor het aanvragen van een externe druk sluit het pijpje in de bovenste vloeistof cel en draai de druk arm en vastklikken (afhankelijk van de vraag of een positieve druk (PRE) of een vacuüm (VAC) zal worden toegepast).
- Toepassen druk in een "cm" of "mm" schaalconstructie volgens de druktrap knop gelegen bovenop de VPM. Druk op de knop omlaag om druk uit te oefenen op de 'cm' schaal en trek hem omhoog to toe te passen druk op de 'mm' schaal.
8. Voorbereiding Monsters voor TRPS Analyse
- Vortex monsters voor 30 sec en ultrasone trillingen gedurende 2 minuten bij 80 Watt vóór TRPS analyse.
9. Het kalibreren van de Nanopore voor Zeta Analyse
- Na het plaatsen van 40 ui kalibratie deeltjes (1x10 10 deeltjes / ml) in de bovenste vloeistof cel, compleet een TRPS meting (opstelling als in hoofdstuk 7) op 3 aangelegde spanningen. Verander de spanning door te klikken op de '+' en '-' knoppen op het voltage schaal op het tabblad 'Instrument Settings' op de software.
- Controleer of de 3 spanningen terug achtergrond stromingen van ongeveer 140, 110 en 80 nA. Zorg ervoor dat op het middenspanning de kalibratie deeltjes produceren een gemiddelde blokkade magnitude van ten minste 0,3 nA.
- Breng een druk zodat de gemiddelde maximale volle breedte de helft (FWHM) duur van de kalibratie deeltjes ten minste0,15 msec. Doe dit handmatig met de drukarm aan de variabele drukmodule. Select druk (PRE) of vacuüm (VAC) door het draaien van de arm tot het vastklikt in de gewenste positie en overeenkomstige toepassing volgende set-up instructies in stap 7.8.2. Zodra deze voorwaarden zijn bereikt, start de run door te klikken op 'start' van de software in het tabblad 'Data Acquisition'.
- Voltooi de gerund door in het tabblad 'Data Acquisition' op 'stop' als ten minste 500 deeltjes zijn gemeten (zie 'Particle Count' aan de onderkant van de software het scherm tijdens de meting) en de run is 30 sec overschreden (zie ' Run Time 'ook naar de onderkant van het scherm).
- Kalibreer het systeem door het invullen van een kalibratie run zoals beschreven elke keer een nieuw nanogaatje wordt geïntroduceerd of voor elke nieuwe dag van de analyse door het invullen stap 9,1-9,4.
10. Het runnen van een steekproef
- Run de monsters bij de hoogste ofna hoogste spanning als de kalibratie monsters die een vergelijkbare (± 10 nA), indien verschillend, basislijn stroom.
- Zodra aan de basislijn stroom bereikt, vervangt de elektrolyt in de bovenste fluïdumcel met 40 pl monster. Wanneer een monster wordt ingebracht, wordt blokkades te zien op het signaal traceren. Start het monster gerund door te klikken op 'Start' in het tabblad 'Data Acquisition' en een minimum van 500 deeltjes op te nemen (check 'Particle Count' gelegen onder het signaal sporen) en zorgen voor de looptijd is een minimum van 30 sec (zie 'Run Time 'ook gelegen onder het signaal sporen).
- Om de meting te voltooien, klikt u op 'stop' in het 'Data Acquisition tab' en sla het bestand.
- Om het bestand, het invoeren van de file informatie in de volgende indeling op te slaan; 'Onderzoek' is de map het bestand wordt opgeslagen in, 'Nanopore ID' is het serienummer van de porie wordt gebruikt, 'Part #' iis de aard van de poriën (dat wil zeggen, NP150 / NP200), 'Sample ID' is de naam van het monster, "Calibration of sample gegevens van of het een kalibratie of monster meting, 'verdunning' wordt gebruikt wanneer het monster werd verdund ( type 100 als het monster werd 100-voudig verdund), "Pressure is de uitgeoefende druk op het monster (in cm - zie paragraaf 7.8)," Elektrolyt ID "is de naam van de buffer het monster bereid in, en ' Notes 'zijn geen persoonlijke opmerkingen over het monster of lopen.
- Tussen elk monster run, was het systeem door het plaatsen van 40 ul van PBST buffer in de bovenste vloeistof cel meerdere malen en het toepassen van verschillende drukken (meestal op -10, -5 cm (vacuüm), en 5 en 10 cm (positieve druk)) tot niet meer blokkade evenementen aanwezig, zodat er geen achtergebleven deeltjes blijven in het systeem waardoor geen kruisbesmetting tussen monsters. Run monsters in drievoud met deze wasstap voltooid tussen elke herhaling monster lopen als well als tussen de verschillende monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1. Schematische weergave van het proces van zuivering en een magnetische TRPS meting. A) Voorbeeld van magnetische zuivering van het monster te beginnen met een monster dat teveel, ongebonden vangprobe DNA. B) TRP meet bijvoorbeeld i) Deeltjes die door de nanogaatje en ii) Blockade event geproduceerd uit deeltjes tijdelijk occlusie ionen in de porie veroorzaakt een tijdelijke daling in de huidige; Informatie van die wordt gebruikt om deeltjes translocatie snelheden te berekenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het verwijderen van overtollig DNA dat niet gebonden is aan de deeltjes oppervlak van de monsters van belang vóór TRPS analyse om geen verslag'Vals-positieve' resultaten. De mogelijkheid om een magneet te gebruiken extraheren en was de POD is een groot voordeel voor TRPS (Figuur 1A). Figuur 1B beschrijft een eenvoudig voorbeeld van een meet- en TRPS voorbeeld 'blokkade event bereikte een deeltje doorloopt de poriën. Ten eerste hebben we aangetoond dat TRPS een hoge doorvoer techniek die onderscheid kan maken tussen monsters van dezelfde grootte, maar van een aanmerkelijk verschillende lading. De mogelijkheid om zowel grootte en lading analyse gelijktijdig voltooien in een enkele meting te zien in figuur 2. Figuur 2 is een voorbeeld van a) shape and b) zetapotentiaal analyse van streptavidine beklede deeltjes zonder modificaties (lichtroze gegevensset) en streptavidine beklede deeltjes verzadigd met enkelstrengs DNA op het oppervlak (blauwe gegevensset). Hoewel beide monsters waren van een vergelijkbare grootte, het zeta potentieel significant verschilde en veel groter wanneer DNA werd functionalized op het oppervlak van het deeltje.
Figuur 2. De grootte en de Zeta potentiële analyse van DNA-gemodificeerde en niet-gemodificeerde streptavidine beklede nanodeeltjes. Het licht roze balken geven ongewijzigde streptavidine gecoate deeltjes en de blauwe balken vertegenwoordigen DNA-gemodificeerde deeltjes. A) Frequentie (%) vs deeltjesdiameter (nm). B) Frequentie (%) versus zeta-potentiaal (mV). Figuur aangepast van aanvullende gegevens in Blundell et al. 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Niet alleen kan de techniek onderscheid tussen deeltjes ongemodificeerd en gemodificeerd met DNA kan TRPS ook onderscheid maken tussen monsters met verschillende concentraties DNA gehybridiseerd met de fractiewaardekel oppervlak. Figuur 3 toont de grootte en zetapotentiaal gegevens getoond voor monsters met de laagste (10 nM, lichtgroen gegevensset) en hoogste (210 nM, blauw dataset) concentraties van DNA gehybridiseerd met de met streptavidine beklede deeltjes. Een grotere zeta potentiaal waarde geconstateerd gedurende deeltjes gehybridiseerd met een hogere concentratie van DNA.
Figuur 3. Gelijktijdig grootte en zetapotentiaal gegevens die zijn vastgelegd van een enkele TRPS meting. De blauwe balken / meetpunten zijn representatief voor streptavidine gecoate deeltjes gehybridiseerd met 210 nm CP DNA en het licht groene bars / datapunten vertegenwoordigen streptavidine gecoate deeltjes gehybridiseerd met 10 nM CP DNA. Figuur aangepast van Blundell et al. 19. Klik hier om te bekijkeneen grotere versie van deze figuur.
Het is nuttig op te merken dat elk gegevenspunt in de puntgrafiek een enkelvoudige deeltje onder een steekproef, waardoor diepgaande deeltjes per deeltjesanalyse bij elk monster. Figuur 4 ondersteunt effectiviteit van deze techniek bij het bepalen van kleine veranderingen in DNA-structuur ( enkelstrengs en dubbelstrengs DNA), en die de verschillen in monsters met doel-DNA van dezelfde grootte, maar gebonden aan een ander deel van de vangprobe tonen hoge gevoeligheid (dwz Midden binden en End bindende targets in figuur 4). De in figuur 4 deeltjes zijn die met de volgende oppervlakmodificaties, van links naar rechts; capture sonde (CP) alleen DNA, CP en een volledig complementair DNA doelwit, CP en een middelste bindende DNA-doel, CP en een eind bindend DNA doelwit, CP en een overhangende DNA doelwit.
. Figuur 4. Relatieve verandering in zetapotentiaal gemeten DNA-gemodificeerde deeltjes met verschillende DNA doelwitten Verandering zeta potentiaal, mV i) CP gefunctionaliseerde deeltje verschillende DNA doelwitten; ii) volledig complementair, iii) Midden-binding, iv) End binding, v) Overhangende doel. De foutbalken standaardafwijking waarbij n = 3. Figuur aangepast van Blundell et al. 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De berekening van de zeta potentiaal gebruikt kalibratie gebaseerde methode gerelateerd werk door Arjmandi et al. 21. De duur van de translocatie deeltjes zijn bij het doorkruisen een nanopore wordt gemeten als een functie van aangelegde spanning, met een gemiddelde elektrisch veld en deeltjessnelheden op het geheel van een regelmatige conische porie. De elektroforetische mobiliteit is de afgeleide van 1 / T (waarin T de duur blokkade) ten opzichte van spanning, vermenigvuldigd met het kwadraat van het detectiegebied lengte, l. Gemiddelde snelheden op meerdere referentiepunten door het detectiegebied worden gemeten om minimale fouten bij de berekening van de zeta potentiaal met deze methode.
De kalibratie van de poriën is gebaseerd op de lineariteit van 1 / T vs spanning V, op elk referentiepunt in het detectiegebied. De elektrokinetische deeltjes snelheden van kalibratie en monster deeltjes,upload / 54577 / 54577eq2.jpg "/> en 
respectievelijk zijn gerelateerd aan hun zeta potentieel, 
en 
, Zoals getoond in formule 1, uitgaande van een lineaire relatie tussen de twee zoals gegeven in de Smoluchowski-benadering 12,20. De netto zeta potentieel-waarden voor zowel de kalibratie en monster zijn de verschillen in de deeltjesfysica zetapotentiaal en het membraan zetapotentiaal, 
. De zeta potentiaal van het polyurethaan porie gemeten met streaming mogelijke technieken 12,18 vanaf -11 mV in PBS voor deze studie.
(1)
Het zeta potentieel van elk individueel deeltje, i, ![vergelijking 8]("/files/ftp_upload/54577/54577eq8.jpg")
is de positie van de deeltjes in de poriën na tijd t = T x, en 
is het deeltje snelheid van één monster deeltje i op relatieve posities l x; 
, 
, P en V zijn elektrokinetische snelheid per eenheid spanning, convectieve snelheid per eenheid druk, toegepaste druk en spanning voor het monster loopt respectievelijk een volledige afleiding van deze vergelijking kan het werk worden gevonden door Blundell et al. 19.
Bij het binden van de capture probe-DNA naar de streptavidine gecoate nanodeeltjes, is het essentieel dat de onderzoeker verwijdert overtollige, ongebonden vangprobe DNA achtergelaten in oplossing. Dit is eenvoudig te doen met behulp van de POD's en een eenvoudige magneet waardoor de snelle en eenvoudige vervanging van de bovenstaande vloeistof met nieuwe PBST buffer. Als er teveel capture DNA achterblijft in oplossing en doel DNA toegevoegd, het doelwit DNA kan binden aan de vrije capture DNA in oplossing, in plaats van dat de SPP oppervlak. Een verandering in deeltjessnelheid en zeta potentiaal wordt alleen waargenomen als het doel-DNA bindt aan de vangprobe aanwezig op het oppervlak van het deeltje.
Analyse en vergelijking van een groot aantal monsters in vele dagen met behulp TRPS kan het gebruik van meer dan één porie membraan vereisen. Sommige poriën kunnen enkele kleine verschillen in omvang als gevolg van het productieproces en in deze gevallen, de gebruiker moet ervoor zorgen de basislijn huidige blijft identiek in alle ruNS. Als dezelfde basislijn stroom wordt waargenomen, de verkregen resultaten vergelijkbaar tussen poriën. Zodra de basislijn is hetzelfde als vorige runs, is het noodzakelijk dat de gebruiker het traject onveranderd tussen kalibratie en monster loopt gaatjes om voor nauwkeurige bepaling van deeltjes translocatie snelheden zijn bij het doorkruisen de porie.
De TRPS technologie heeft een relatief eenvoudige set-up, die gemakkelijk en snel kan worden gedemonteerd tijdens een experiment. Als het oplossen van problemen, kan dit het proces een stuk gemakkelijker te maken. Zo is het belangrijk luchtbelletjes niet toe te staan in het onderste of bovenste fluïdumcel fluïdumcel bij het uitvoeren van analyse. Dit leidt tot een instabiele basislijn stroom. Indien deze aanwezig in de bovenste fluïdum cel, kan het monster worden verwijderd en vervangen. Als belletjes in het onderste fluïdumcel moet de buffer worden verwijderd en vervangen door verse buffer. Als de belletjes zijn een hardnekkig probleem, dan is er mogelijk te veel oppervlakteactievein de oplossing zodat deze kan moeten worden verlaagd 16 (wij gebruiken slechts 0,05% Tween-20). Enkele voorbeelden kan de poriën blokkeren als hun omvang de poriegrootte overschrijdt of indien de concentratie van het monster te hoog. Om dit te corrigeren, kan de poriegrootte worden verhoogd door het stuk of het monster kan worden verdund tot een lagere deeltjesconcentratie 16. Voor enkel deeltje analyse kan het monster ook de poriën te blokkeren als er veel grote aggregaten aanwezig, is het belangrijk om vortex en ultrasone trillingen het monster voor het doornemen TRPS.
Onder andere methoden TRPS diverse voordelen zoals de mogelijkheid om grootte en lading metingen van afzonderlijke gelijktijdig voltooien; waardoor multimodale monsters effectief te analyseren met deze methode. Een voordeel is de signaal / blokkades geproduceerd kan in een paar minuten worden geoptimaliseerd voor een bepaald monster door simpelweg de rek en de spanning te veranderen om een blokkade magnitude, Δ <verkrijgen/ Em> , Aanzienlijk groter dan de achtergrondruis (blokkades van nA schaal ten opzichte van de achtergrondruis <10 pA). Het kunnen het traject van de poriën te veranderen maakt de werkwijze veelzijdiger via solid-state poriën technieken als de poriegrootte kan worden aangepast in de grootte van de analyt in kwestie; bijzonder nuttig bij het onderzoeken van effecten zoals aggregatie en DNA-bindende eiwitten die kunnen leiden analyt afmetingen dan de oorspronkelijke vaste toestand poriegrootte bereik. Een ander voordelig aspect van TRPS is het niveau van gevoeligheid van de techniek. Het vermogen om subtiele verschillen in DNA-binding te detecteren (indien dezelfde hoeveelheid DNA toegevoegd (zelfde hoeveelheid betaling) en de monsters van dezelfde grootte) op basis van de positie van doel DNA binding vrij diep in dit gebied van analyse en zal van groot nut voor toekomstige nanodeeltjes-assay ontwerp platforms. Elke subtiele verschillenlingen kunnen worden gedetecteerd en geïsoleerd onder toepassing van een deeltje per deeltje aard van TRPS technologie. Deze analyse dat van ensemble technieken zoals dynamische lichtverstrooiing of fotoncorrelatiespectroscopie die alleen zal gage een gemiddelde van de steekproef geanalyseerd en kunnen niet onderscheiden in het geval van multimodale monsters 6,7.
Solid-state nanoporiën (100-200 nm) zijn ook gebruikt om deeltjes dynamiek volgen en hebben gevonden dat mobiliteit deeltje kan worden beïnvloed als de diameter van het deeltje begint te benaderen die van de nanoporiën 22,23. Nanoporiën veel groter dan de deeltjes geanalyseerd (zoals gebruikt in deze studie) hebben minder invloed op de mobiliteit deeltje en dus de translocatie dynamiek binnen de porie. De poriën die in deze studie zijn echter beperkt tot de analyt groottewaaiers een NP150 bijvoorbeeld een groottebereik van 60-480 nm dus als een multimodaal monster bestond uit deeltjes in en boven ditbeperken, kunnen ze niet worden geanalyseerd op dezelfde porie als de porie kan dan worden geblokkeerd. Het is ook belangrijk op te merken dat het meten van een bimodale monster bevattende 60 en 480 nm deeltjes (die de absolute onder- en bovengrenzen van de porie), bijvoorbeeld, vereist verschillende rek en voltageproblemen, hoewel beide binnen de omvang analyse range van de porie. Dit komt doordat de rek vereist voor de grotere deeltjes leidt tot de kleinere deeltjes met een bijzonder kleine blokkade magnitude (vanwege de verminderde weerstand) die als achtergrond ruis kan worden beschouwd en dus niet per se gemeten tijdens monsterstap.
Bubbles kan een probleem met het monster metingen belletjes in de onderste of bovenste vloeistof cel zal een onstabiele basislijn stroom te creëren, om welk monster runs niet kan worden voltooid. Elektrolyten van een bruisende karakter (sommige sterk geconcentreerde biologische media, bijvoorbeeld) kan het moeilijk zijn om monsters req werking en dusuiring suspensie in deze specifieke mediums kunnen problematisch blijken. De meeste monsters kan echter sterk worden verdund of opgeschort naar alternatieve buffers voorafgaand aan TRPS analyse.
De werkwijze is aanpasbaar en kan worden gebruikt om een reeks nanodeeltjes gebaseerde analyten te analyseren, waaronder de analyse van eiwitten, DNA, kleine moleculen, aggregatietesten 17,24 en biologisch relevant deeltjes. De veelzijdigheid van TRPS bij het karakteriseren van een breed scala van analyten toont de technieken potentieel in een aantal gebieden, zoals drug delivery 1,25, biosensoren 26-28, en milieu-testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ELCJB wordt ondersteund door Izon Science Ltd.
Acknowledgments
De auteurs danken Izon Science Ltd voor hun steun. Het werk werd gesteund door de Europese Commissie voor onderzoek (PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich, UK | P4417 | 1 tablet dissolved in 200 ml deionized water to make buffer solution. |
| Tween-20 | Sigma Aldrich, UK | P1379 | 0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant |
| Carboxyl polystyrene nanoparticles | Bangs Laboratories, US | CPC200 | Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1 x 1012 particles/ml, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2 x 1019 C/nm2. |
| Streptavidin coated nanoparticles | Ademtech, France | 3121 | Batch had binding capacity of 4,352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1 x 1011 particles/ml. |
| Biotinylated oligonucleotides | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3' |
| Standard olignonucleotides | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'. |
| Izon qNano | Izon Science, NZ | Inherent pressure on system of 47 Pa | |
| Izon Variable Pressure Module (VPM) | Izon Science, NZ | Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 100 Pa. | |
| Polyurethane nanopore membranes | Izon Science, NZ | NP150 | Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch. |
| Magrack 6 | GE Healthcare, UK | 28-9489-64 | |
| Sonic Bath | Fisher Scientific, UK | 10692353 | 80 Watts |
| Vortexer | IKA, Germany | 0003365000 | |
| Rotary Wheel | Labnet International, US | H5500-230 V |
References
- Alexander, C. M., Maye, M. M., Dabrowiak, J. C. DNA-capped nanoparticles designed for doxorubicin drug delivery. Chem Commun. 47 (12), 3418-3420 (2011).
- Billinge, E. R., Platt, M. Aptamer based dispersion assay using tunable resistive pulse sensing (TRPS). Anal Methods. 7 (20), 8534-8538 (2015).
- Bulyk, M. L. Protein Binding Microarrays for the Characterization of Protein-DNA Interactions. Adv Biochem Eng Biotechnol. 104, 65-85 (2007).
- Platt, M., Rowe, W., Knowles, J., Day, P. J., Kell, D. B. Analysis of aptamer sequence activity relationships. Integr Biol. 1 (1), 116-122 (2009).
- Ruiz-Hernández, E., Baeza, A., Vallet-Regí, M. Smart Drug Delivery through DNA/Magnetic Nanoparticle Gates. ACS Nano. 5 (2), 1259-1266 (2011).
- Murdock, R. C., Braydich-stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of Nanomaterial Dispersion in Solution Prior to In Vitro Exposure Using Dynamic Light Scattering Technique. Toxicol Sci. 101 (2), 239-253 (2008).
- Hupfield, S., Holsaeter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow fractionation. J Nanosci Nanotechnol. 6 (7), 3025-3031 (2006).
- Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosens Bioelectron. 31 (1), 17-25 (2012).
- Roberts, G. S., Kozak, D., Anderson, W., Broom, M. F., Vogel, R., Trau, M. Tunable nano/micropores for particle detection and discrimination: scanning ion occlusion spectroscopy. Small. 6 (23), 2653-2658 (2010).
- Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Anal Chem. 83 (9), 3499-3506 (2011).
- Booth, M. A., Vogel, R., Curran, J. M., Harbison, S., Travas-Sejdic, J. Detection of target-probe oligonucleotide hybridization using synthetic nanopore resistive pulse sensing. Biosens Bioelectron. 45, 136-140 (2013).
- Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Chen, S. Simultaneous size and ζ-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS Nano. 6 (8), 6990-6997 (2012).
- Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Trau, M. Advances in Resistive Pulse Sensors: Devices bridging the void between molecular and microscopic detection. Nano Today. 6 (5), 531-545 (2011).
- Weatherall, E., Willmott, G. R. Applications of tunable resistive pulse sensing. Analyst. 140, 3318-3334 (2015).
- Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. J Phys Condens Matter. 22 (45), 454116 (2010).
- Blundell, E. L. C. J., Mayne, L. J., Billinge, E. R., Platt, M. Emergence of tunable resistive pulse sensing as a biosensor. Anal Methods. 7, 7055-7066 (2015).
- Platt, M., Willmott, G. R., Lee, G. U. Resistive Pulse Sensing of Analyte-Induced Multicomponent Rod Aggregation Using Tunable Pores. Small. 8 (15), 2436-2444 (2012).
- Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Anal Chem. 84 (7), 3125-3131 (2012).
- Blundell, E. L. C. J., Vogel, R., Platt, M. Particle-by-Particle Charge Analysis of DNA-Modified Nanoparticles Using Tunable Resistive Pulse Sensing. Langmuir. 32 (4), (2016).
- Hunter, R. J. Zeta Potential in Colloid Science: Principles and Applications. , Academic Press. New York. (1981).
- Arjmandi, N., Van Roy, W., Lagae, L., Borghs, G. Measuring the electric charge and zeta potential of nanometer-sized objects using pyramidal-shaped nanopores. Anal Chem. 84 (20), 8490-8496 (2012).
- Bacri, L., et al. Dynamics of colloids in single solid-state nanopores. J Phys Chem B. 115 (12), 2890-2898 (2011).
- Cabello-Aguilar, S., et al. Dynamics of polymer nanoparticles through a single artificial nanopore with a high-aspect-ratio. Soft Matter. 10 (42), 8413-8419 (2014).
- Billinge, E. R., Muzard, J., Platt, M. Tunable resistive pulse sensing as a tool to monitor analyte induced particle aggregation. Nanomater Nanosci. 1 (1), 11 (2013).
- Li, J., Fan, C., Pei, H., Shi, J., Huang, Q. Smart Drug Delivery Nanocarriers with Self-Assembled DNA Nanostructures. Adv Mater. 25 (32), 4386-4396 (2013).
- Billinge, E. R., Broom, M., Platt, M. Monitoring aptamer-protein interactions using tunable resistive pulse sensing. Anal Chem. 86 (2), 1030-1037 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Park, S. -J., Taton, T. A., Mirkin, C. A. Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle Probes. Science. 295 (5559), 1503-1506 (2002).
