Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Определение дзета-потенциала через наночастицу транслокации через скоростей перестраиваемого нанопор: Использование ДНК-модифицированных частиц, как в примере

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/54577
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemistry, School of Science, Loughborough University, 2Izon Science Limited, 3School of Mathematics and Physics, The University of Queensland

Summary

Здесь мы используем полиуретановые перестраиваемого нанопор интегрированный в резистивном метод импульсного зондирования для характеристики наночастиц химию поверхности с помощью измерения скоростей транслокации частиц, которые могут быть использованы для определения дзета-потенциала отдельных наночастиц.

Abstract

Нанопор технологии, известные под общим названием резистивные датчики импульсов (RPS), используются для обнаружения, количественного определения и характеристики белков, молекул и наночастиц. Настраиваемый резистивный импульса зондирования (TRPS) является относительно недавним адаптации к ПСТ, который включает в себя перестраиваемый поры, который может быть изменен в режиме реального времени. Здесь мы используем TRPS для контроля времени транслокации наночастиц ДНК-модифицированного , как они проходят перестраиваемый пор мембраны в зависимости от концентрации и структуры ДНК (то есть, одноцепочечную к двухцепочечной ДНК).

TRPS основана на двух электродов Ag / AgCl, разделенных эластомерного порами мембраны, устанавливающей стабильный ионный ток при приложенного электрического поля. В отличие от различных оптических технологий на основе определения свойств частиц, TRPS могут характеризовать отдельные частицы среди выборочной совокупности, что позволяет мультимодальные образцы для анализа с легкостью. Здесь мы покажем, дзета-потенциал измеренияс помощью транслокации частиц скоростей известных стандартов и применить их к образцу аналитов раз транслокация, таким образом, в результате чего измерения дзета-потенциала этих аналитов.

А также приобретение средних значений дзета-потенциал, образцы все измеряют с помощью частиц по-частицы перспективу, проявляющего больше информации о данном образце посредством распределения выборки населения, например. Из таких, этот метод демонстрирует потенциал внутри приложений зондирования для медицинских и экологических областях.

Introduction

Функционализированные наночастицы становятся все более популярными в качестве биосенсоров в медицинских и экологических областях. Способность изменять химию поверхности наночастицу, в ДНК, например, оказывается полезным для целевых систем доставки лекарственных средств 1 и мониторинга ДНК-белковых взаимодействий 2-4. Все более и более общее свойство наночастиц быть использованы в биопроб и в доставке терапевтических средств является Суперпарамагнетизм 5. Суперпарамагнитных частиц (SppS) являются чрезвычайно полезными для выявления и устранения конкретных аналитов из сложных смесей и может сделать это с помощью простого использования одного магнита. После удаления, анализируемые переплете частицы могут быть охарактеризованы и проанализированы соответствует своему назначению.

Предыдущие методы, используемые для обнаружения и определения характеристик наночастиц включают в себя оптические методы, такие как динамического рассеяния света (DLS), иначе известный как фотонной корреляционной спектроскопии. Несмотря на то, приветГ.Х. техника пропускная способность , СДО ограничивается будучи метод на основе усреднения и при анализе мультимодальные образцов без добавления специализированного программного обеспечения, более крупные частицы будут производить гораздо более доминирующего сигнала, в результате чего некоторые из более мелких частиц , совершенно незаметно 6,7. Частица за частицей методы определения характеристик, следовательно, гораздо более благоприятными для анализа наночастиц и функционализованных систем наночастиц.

технологии, основанные RPS основаны вокруг приложения электрического поля к образцу и мониторинга транспортного механизма частиц через синтетического или биологического нанопоры. Относительно недавно обнаружения наночастиц и характеристика методика , основанная на RPS перестраивалось резистивный импульса зондирования (TRPS) 8-16. TRPS представляет собой систему из двух электродов, разделенных эластомерного перестраиваемые пор мембраны. Метод перестраиваемый пор позволяет аналитов диапазона формы 17 и размера , чтобы измерить с помощью их трансмеханизмы портов через поры. Перестраиваемые поры использовались ранее для выявления мелких частиц (70-95 нм в диаметре) , производящее сопоставимые результаты с другими методами , например, трансмиссионной электронной спектроскопии (ПЭМ) 10. При приложении электрического поля, наблюдается ионный ток и, как частицы / молекулы проходят через поры, они временно блокировать поры, что вызывает уменьшение тока, который может быть определен как '' блокада события ». Каждое событие блокада является представителем одной частицы таким образом , что каждая частица в образце можно охарактеризовать по отдельности на основании величины блокаде, А Уравнение 1 , А полная ширина полувысоте, FWHM, а также другие свойства блокады. Анализируя отдельные частицы, поскольку они проходят через нанопоры выгодно для мультимодальных образцов, как TRPS может успешно и эффективно различать диапазон частиц размером АмонGST одного образца. Настраиваемый чувствительный резистивный импульс завершается размер 10, дзета - потенциал 12,18 и концентрации 15 измерений одновременно в один проход , и поэтому все еще может дифференцировать образцы аналогичных, если не тот же размер , их поверхностным зарядом 19; преимущество по сравнению с альтернативными методами проклейки.

Дзета - потенциал определяется как электростатический потенциал в плоскости сдвига 20, и вычисляется из скоростей частиц , когда они проходят поры 19. Дзета-потенциал измерения отдельных частиц, таким образом, дает понимание механизмов транслокации и поведения систем наночастиц в растворе, ценную информацию для будущего анализа наночастиц конструкций для целого ряда применений. Частица за частицей анализ такой природы позволяет также распространение и распределение дзета-потенциала ценностей среди населения выборки, чтобы изучить, что позволяет получить дополнительную информацию OКинетика реакции N (Однонитевый с двухцепочечной ДНК, например) и стабиль- частиц в растворе, который необходимо достичь.

Здесь мы описываем технику, которая обнаруживает и характеризует как немодифицированные и ДНК-модифицированных поверхностей SPP. Протокол, описанный в настоящем документе, относится к ряду неорганических и биологических наночастиц, но мы продемонстрировать процедуру с использованием ДНК-модифицированных поверхностей из-за их широкого круга применений. Методика позволяет пользователю различать мишени одноцепочечных и двухцепочечной ДНК на поверхности наночастиц, основанный на скорости транслокации частицы через систему пор и таким образом их дзета-потенциалы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Создание фосфатно-солевом буферном с Tween-20 (PBST), буфер

  1. Растворите PBS таблетку (0,01 М фосфатный буфер, 0,0027 М хлорид калия, 0,137 М хлорида натрия, рН 7,4) в 200 мл деионизированной воды (18,2 МОм).
  2. Добавляют 100 мкл (0,05 (об / об)%) Tween-20 до 200 мл буферного раствора в качестве поверхностно-активного вещества.

2. Подготовка карбоксильной Полистирол Стандарты Particle

  1. Vortex калибровочные частицы в течение 30 секунд перед обработкой ультразвуком в течение 2 мин при 80 Вт, чтобы создать монодисперсность частиц.
  2. Развести калибровка частиц 1 в 100 до концентрации 1x10 10 частиц / мл в буфере PBST и вихре в течение 30 сек.

3. Подготовка покрытых стрептавидином частицы

  1. Вихре частицы в течение 30 сек до обработки ультразвуком в течение 2 мин при 80 Вт для обеспечения монодисперсность.
  2. Развести стрептавидина частицы 1 в 100 в буфере PBST к сети переменногоhieve результирующую концентрацию 1х10 9 частиц / мл и вихрь в течение 30 сек.
    Примечание: Типичный объем образца составляет 200 мкл. Например, если исследовать пять концентрации ДНК готовят 1 мл разведенной частиц, покрытых стрептавидином.

4. Подготовка Олигонуклеотиды

  1. Развести олигонуклеотиды с деионизированной водой до результирующей концентрации 100 мкМ.

5. Добавление захвата зонда (CP) ДНК с покрытыми стрептавидином частиц

  1. До связывания ДНК, воронка стрептавидина частиц (200 мкл объем пробы) в течение 30 секунд, а затем 2 мин при обработке ультразвуком в 80 Вт.
  2. На основании связывающей способности, предоставленной поставщиком (4352 пмоль / мг), добавьте соответствующую концентрацию ДНК частиц для полученных концентраций 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 и 210 ДНК нМ.
  3. Vortex образцы в течение 10 сек и место на роторном колесе при комнатной температурев течение 30 мин, чтобы позволить ДНК связываться с поверхностью частиц посредством взаимодействия стрептавидин-биотин.
  4. После того, как была добавлена ​​ДНК захвата и инкубировали с частицами, покрытых стрептавидином, удалить избыток ДНК в растворе с помощью магнитной сепарации путем размещения образцов на магнитную стойку в течение 30 мин.
  5. Удалить супернатант, следя за тем, чтобы не нарушить новообразованный кластер частиц, наиболее близких к магниту, и заменить с тем же объемом новой порцией буфера PBST.

6. гибридизации комплементарных ДНК для СР-частиц

  1. Добавьте необходимое количество ДНК-мишени (более при 500 нм), чтобы обеспечить максимально возможную мишень-связывающем была достигнута.
  2. Вихревой образцы в течение 10 сек и место на вращающемся колесе при комнатной температуре в течение 30 мин.
  3. После того, как гибридизация завершена, удалить избыток ДНК-мишени с помощью магнитной сепарации путем размещения образцов на магнитную стойку в течение 30 мин.
  4. Удалить супернатантТак, чтобы не мешать новообразованной скопление частиц, наиболее близких к магниту, и заменить с тем же объемом новой порцией буфера PBST.
  5. Повторите шаги 6.1 до 6.4 для двух повторностей и поместить эти образцы на роторном колесе при комнатной температуре в течение 16 часов, чтобы исследовать раз ДНК-гибридизации.

Установка 7. TRPS

  1. Подключите прибор в компьютерную систему с программным обеспечением на месте.
  2. Калибровка начального растяжения с помощью циркуля.
    1. Измерьте расстояние между наружной двумя параллельными губками.
    2. Ввод в программное обеспечение, введя растяжение в поле "растягиваться" на вкладке "Настройки инструмента" и нажав "Калибруйте растягиваться" под вкладкой.
  3. Сбоку соответствовать полиуретановый нанопор мембраны соответствующего размера для анализа на челюсти с нанопор идентификационный номер вверх. Затем растянуть челюсти на участке, необходимого для анализа с помощьюстрейч регулировка ручки на боковой панели прибора. Stretch челюсти от 43 до 48 мм.
    Примечание: Точное значение перегоне определяется наряду с приложенным напряжением, так что блокад калибровки частиц по меньшей мере, 0,3 нА в размере. Отрезок уже вводится в программу на этапе 7.2 и автоматически отрегулирует как челюсти вытянуты.
  4. Поместите 80 мкл буфера PBST в камере ниже жидкости, под нанопор, обеспечивая нет настоящего пузыри, которые могут повлиять на точность измерения. Если есть пузырьки видно, удалить и заменить буфер.
  5. Нажмите на верхнюю ячейку жидкости на место и поместите 40 мкл буфера в него, снова обеспечивая нет пузырьков присутствуют. Если имеются пузырьки в верхней камере жидкости, удалите их путем замены жидкости.
  6. Когда воспроизводимый базовый ток был достигнут от замены верхней ячейки жидкости с буфером, добавляют 40 мкл образца к верхней ячейке жидкости и измерения, нажав кнопку "улискусство 'в закладке' Сбор данных 'на экране программного обеспечения.
    Примечание: Сбор данных завершается при частоте 50 кГц с блокадой величина нижнего предела 0,05 нА, хотя это может быть изменено с помощью программного обеспечения с помощью вкладки "Проанализировать Data '(в разделе' Настройки Analysis 'и' резистивный блокад ') ,
  7. Поместите клетку Фарадея поверх клеточной системы для текучей среды для уменьшения электрического фонового шума на измерения.
  8. Используйте модуль переменного давления (VPM) для применения давления или вакуума к образцам.
    1. Чтобы применить внешнее давление, подключите сопло к верхней ячейке жидкости, а затем поверните рычаг давления и нажмите на место (в зависимости от того, будет ли применяться положительное давление (PRE) или вакуум (VAC)).
    2. Подайте давление в "см" или "мм" шкалы с помощью ручки ступени давления, расположенный на верхней части ВПМ. Нажмите ручку вниз, чтобы оказать давление на шкале "см" и потяните его вверх тO оказать давление на шкале "мм".

8. Подготовка Образцы для анализа TRPS

  1. Образцы вортексе в течение 30 сек и разрушать ультразвуком в течение 2 мин при 80 Вт до анализа TRPS.

9. Калибровка нанопор для анализа Зета

  1. После размещения 40 мкл калибровочных частиц (1x10 10 частиц / мл) в верхнюю ячейку жидкости, выполнить измерение TRPS (установка , как и в разделе 7) при 3 приложенных напряжений. Alter напряжение, нажав на кнопку "+" и "-" кнопки на шкале напряжения на вкладке "Настройки инструмента" на программном обеспечении.
  2. Проверьте, что 3 напряжения возвращают фоновые токи около 140, 110 и 80 нА. Убедитесь в том, что при среднем напряжении калибровочные частицы создают среднюю величину блокады, по меньшей мере, 0,3 нА.
  3. Примените давление таким образом, средняя максимальная полная ширина половины (FWHM) длительности калибровки частиц по меньшей мере,0,15 мс. Делайте это вручную с помощью рычага давления, прикрепленную к модулю переменного давления. Выбор давления (PRE) или вакуум (VAC), повернув рычаг до щелчка в нужном положении и применяются соответственно следующие настройки инструкции на этапе 7.8.2. После того, как эти условия были достигнуты, запустить прогон, нажав кнопку «Пуск» на программном обеспечении на вкладке "Сбор данных".
  4. Выполните прогон, нажав "стоп" на вкладке "Сбор данных", когда по меньшей мере, 500 частиц были измерены (см 'количество частиц "в нижней части экрана программного обеспечения во время измерения) и пробег превысил 30 сек (см' Run Time 'также к нижней части экрана).
  5. Калибровка системы путем заполнения калибровочного процесса, как описано каждый раз, когда новый нанопор вводится или для каждого нового дня анализа, выполнив шаг 9.1-9.4.

10. Запуск образца

  1. Запуск образцов на самом высоком иливторое самое высокое напряжение в качестве калибровочных образцов при обеспечении аналогичной (± 10 нА), если не то же самое, базовый ток.
    1. После того, как соответствующий базовый ток достигается, заменить электролит в верхней камере жидкости с 40 мкл образца. Когда образец вводится, блокад будет видно на трассе сигнала. Запустить пример запуска, нажав кнопку "Пуск" на вкладке "Сбор данных" и записать минимум 500 частиц (проверить 'количество частиц', расположенный под след сигнала) и обеспечивает время работы составляет минимум 30 секунд (см 'Run Время 'также расположена ниже сигнальной дорожки).
    2. Для завершения измерения нажмите кнопку "стоп" в "закладке Сбор данных" и сохраните файл данных.
  2. Чтобы сохранить файл, ввод сведений о файле в следующем формате; "Исследование" папка-файл будет сохранен в 'нанопористых ID' это порядковый номер поры используется I, 'Part #'S тип поры (т.е. NP150 / NP200), 'образец ID' это имя образца, "Калибровка или образец 'детали , является ли это калибровка или образец для измерения," разбавление "используется , если проба была разбавлена ( тип 100, если образец разводили в 100 раз), «давление» равно приложенное давление на образец (в см - см раздел 7.8), 'Электролит ID' это имя буфера образца состоит в, и ' Примечания "являются любые личные заметки о образце или бега.
  3. Между каждым образцом перспективе, промывать систему не помещая 40 мкл PBST буфера в верхней камере жидкости в несколько раз, и применяя различные давления (как правило, при температуре от -10, -5 см (вакуум), а также 5 и 10 см (положительное давление)) до тех пор, больше нет блокады событий присутствуют, обеспечивая нет остаточные частицы, остающиеся в системе и, следовательно, нет перекрестного загрязнения между образцами. Запуск образцов в трех экземплярах с этой стадии промывки между завершенного каждого образца повторного запуска, как вэйл, как между различными образцами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое изображение процессов магнитной очистки и измерения TRPS. А) Пример магнитной очистки образца , начиная с образцом , содержащим избыток, несвязанный ДНК захвата зонда. B) TRPS измерения пример I) частиц , проходящих через нанопоры и II) Блокада событие получают из частиц временно окклюзии ионов в порах вызывает временное снижение в настоящее время; Информация из которых используется для расчета скорости транслокация частиц. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Удаление избыточного количества ДНК, которое не связалось с поверхностью частиц из образцов имеет важное значение перед анализом TRPS, чтобы не сообщать о любых«ложно-положительные» результаты. Возможность использовать магнит для извлечения и мыть SppS является огромным преимуществом для TRPS (рисунок 1А). Фигура 1В описывает базовый пример измерения TRPS и пример «блокады события» , достигнутый как частица проходит через поры. Во-первых, мы показали, что TRPS является высокая техника пропускная способность, которая может различать образцы аналогичного размера, но и значительно различным зарядом. Его способность завершить оба размера и заряда анализа одновременно в одном измерении можно увидеть на рисунке 2. Рисунок 2 представляет собой пример) размера и б) дзета - потенциал анализа стрептавидином частицы , покрытые без каких - либо модификаций (светло - розовый набор данных) и частицы стрептавидина пропитанные одноцепочечной ДНК на поверхности (синий набор данных). Несмотря на то, что оба образца были одинакового размера, что дзета-потенциал был значительно отличается и гораздо больше, когда ДНК была functionalized на поверхности частицы.

фигура 2
Рисунок 2. Размер и Зета анализ потенциала наночастиц ДНК-модифицированных и немодифицированных покрытых стрептавидином. Светло - розовые столбики представляют собой немодифицированные частицы , покрытые стрептавидином и синие полосы представляют собой частицы ДНК-модифицированные. A) Частота (%) в зависимости от диаметра частиц (нм). B) Частота (%) против дзета - потенциал (мВ). Рисунок адаптирован из дополнительных данных в Бланделл и др. 19. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Мало того, что метод дифференциации между частицами немодифицированных и модифицированных ДНК, TRPS может также различать между образцами с различными концентрациями ДНК гибридизуют с номинальнойПоверхность частица. Рисунок 3 показывает размер и дзета - потенциал данных выставлялись для образцов с самым низким (10 нМ, светло - зеленый набор данных) и самый высокий (210 нм, синий набор данных) концентрации ДНК гибридизуют с частицами , покрытых стрептавидином. Большее значение дзета-потенциала записывается для частиц, гибридизированных с более высокой концентрацией ДНК.

Рисунок 3
Рисунок 3. Одновременная размер и дзета - потенциал Данные , полученные из одного измерения TRPS. Синие полосы / точки данных являются репрезентативными частиц, покрытых стрептавидином гибридизировали с 210 нМ CP ДНК и светло-зеленых баров / точек данных представляют собой частицы стрептавидина гибридизировали с ДНК СР 10 нМ. Рисунок адаптирован из Бланделл и др. 19. Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотретьувеличенная версия этой фигуры.

Полезно отметить , что каждая точка данных в диаграммы рассеяния представляет собой одну частицу среди населения образца, что позволяет в глубине частица за частицей анализа с каждого образца. Рисунок 4 поддерживает эффективность технику в определении незначительных изменений в структуре ДНК ( одноцепочечной и двухцепочечной ДНК), а также выявление различий в образцах с ДНК - мишени того же размера, но привязаны к другой области захвата зонда , демонстрирующей высокие уровни чувствительности (то есть, Ближний связывание и в конце связывания мишени показано на рисунке 4). Частицы , показанные на рисунке 4 , являются те , со следующими изменениями поверхности, слева направо; захвата зонда (CP) ДНК только, CP и мишень полностью комплементарной ДНК, CP и ДНК-мишень среднего связывания, CP и мишень-связывающий ДНК конец, CP и мишень нависающий ДНК.


. Рисунок 4. Относительное изменение дзета - потенциала , измеренного для частиц ДНК-модифицированных с диапазоном мишеней ДНК Изменение в дзета - потенциала, мВ, от I) СР функционализированные частицы в диапазоне мишеней ДНК; II) Полностью дополняют друг друга, III) Средний связывание, IV) End связывания, v) нависающих цели. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение, где N = 3. Рисунок адаптирован из Бланделл и др. 19. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Расчет для дзета - потенциал был использован метод , основанный калибровки связано с работой по Arjmandi и др. 21. Продолжительность транслокацию частиц при их прохода по нанопор измеряется в зависимости от приложенного напряжения, используя среднее электрическое поле и частиц скоростей по всей полноте регулярной конической поры. Электрофоретической подвижности является производной от 1 / Т (где Т длительность блокады) по напряжению, умноженной на квадрат длины зоны зондирования, л. Средние скорости в нескольких опорных точках через зону зондирования измеряются для обеспечения минимальных ошибок при вычислении дзета-потенциала с использованием этого метода.

Калибровка пор основывается на линейности 1 / T против напряжения, В, в каждой опорной точке в зоне зондирования. Электрокинетические скорости частиц калибровочных и образцов частиц,загрузить / 54577 / 54577eq2.jpg "/> и Уравнение 3 соответственно, связаны с их дзета-потенциалы, Уравнение 4 а также Уравнение 5 , Как показано в уравнении 1, предполагая линейную зависимость между ними , как в приближении Смолуховского 12,20. Чистые дзета-потенциал значения как для калибровки и образца являются различия в частиц дзета-потенциала и мембранного потенциала дзета, Уравнение 6 , Дзета - потенциал полиуретанового пор измеряют с использованием потенциала течения методов 12,18 , как -11 мВ в PBS для этого исследования.

Уравнение 7 (1)

Дзета - потенциал каждой отдельной частицы, I, Уравнение 8 это положение частицы внутри поры после времени, Т = Т х, и Уравнение 10 является скорость частиц одного образца частицы я в относительных положениях Д х; Уравнение 12 , Уравнение 14 , Р и V являются электрокинетического скорость на единицу напряжения, скорость конвективного на единицу давления, приложенного давления и напряжения для образца прогонов соответственно, полный вывод этого уравнения можно найти в работе Бланделла и др. 19.

Уравнение 16

При связывании ДНК захвата зонда для наночастиц, покрытых стрептавидином, жизненно важно, чтобы исследователь удаляет избыток, несвязанный ДНК захвата зонда осталось в растворе. Это делается легко с помощью SppS и простой магнит, позволяющий быструю и легкую замену супернатанта с новым буфером PBST. Если избыток ДНК захвата остается в растворе и ДНК-мишени добавляют ДНК-мишень может связываться с свободной ДНК захвата в растворе, а не что на поверхности SPP. Изменение скорости частиц и дзета-потенциал будет наблюдаться только в том случае ДНК-мишень связывается с захвата зонда, присутствующей на поверхности частицы.

Анализ и сравнение большого количества образцов во многих дней, используя TRPS может потребовать использования более чем одной поры мембраны. Некоторые поры могут иметь некоторые незначительные различия в их размерах из-за производственного процесса и в этих случаях, пользователь должен обеспечить базовый ток остается одинаковой по всей рунс. Если наблюдается тот же базовый ток, полученные результаты сравнимы между порами. После того, как базовая линия такая же, как предыдущих запусков, крайне важно, чтобы пользователь держит растяжку без изменений между калибровки и образцов трасс для обеспечения точного определения скоростей частиц транслокации, как они пересекают поры.

Технология TRPS имеет относительно простой набор вверх, который может быть разобран легко и быстро во время эксперимента. Если устранении проблем, это может сделать процесс намного проще. Например, важно, чтобы не допустить каких-либо пузырей в камере нижней жидкости или верхней ячейки жидкости при проведении анализа. Это приведет к нестабильной базовой линии тока. Если имеются пузырьки в верхней камере жидкости, образец может быть удален и заменен. Если появляются пузырьки в нижней камере жидкости, буфер должен быть удален и заменен свежим буфером. Если пузырьки являются постоянной проблемой, то может быть слишком много поверхностно-активного веществав растворе , так это может быть уменьшено 16 (мы используем только 0,05% твина-20). Некоторые образцы могут блокировать поры, если их размер превышает размер пор или, если концентрация образца слишком высока. Чтобы исправить эту ситуацию , размер пор может быть увеличена за счет увеличения растяжения или образец может быть разбавлена до более низкой концентрации 16 частиц. Для анализа одной частицы, образец может также блокировать поры, если есть много больших агрегатов присутствует, важно вихря и разрушать ультразвуком образца перед его запуском через TRPS.

Среди других методов, TRPS имеет ряд преимуществ, включая возможность завершить измерения размера и заряда отдельных частиц одновременно; что позволяет мультимодальных анализируемых образцов эффективно с использованием этого метода. Одним из преимуществ является сигнал / блокад , полученные могут быть оптимизированы в течение нескольких минут для конкретного образца, просто изменяя растяжимость и напряжения с целью получения блокады величины, А </ EM> Уравнение 1 , Значительно больше, чем фоновый шум (блокад имеют шкалы нА по сравнению с фоновым шумом <10 Pa). Будучи в состоянии изменять перегоне поры делает способ более универсален над методами твердотельными пор, как размер пор можно регулировать с учетом размера аналита о котором идет речь; особенно полезно при исследовании эффектов, таких как агрегации и ДНК-связывающего белка, который может привести к размерам анализируемых веществ, превышающих первоначальный твердотельный диапазон размеров пор. Другой предпочтительный аспект TRPS является уровень чувствительности от техники. Способность обнаруживать тонкие различия в связывании ДНК (где была добавлена ​​та же количество ДНК (такое же количество добавленного заряда), и образцы того же размера) на основе положения ДНК-мишени связывания достаточно глубоки в этой области анализ и будет иметь большое применение для будущих наночастицами анализа проектных платформ. Каждый тонкий отличаетсяENCE может быть обнаружен и выделен с использованием частиц по-частицы природы TRPS технологии. Этот анализ превосходит ансамбль методов , таких , как динамическое рассеяние света или фотонной корреляционной спектроскопии , который лишь Gage в среднем населения анализируемого образца и не могут дифференцироваться в случаях мультимодальных образцов 6,7.

Небольшие твердые нанопор (100-200 нм) также были использованы для мониторинга динамики частиц и обнаружили , что подвижность частиц может влиять как диаметр частицы начинает приближаться к нанопору 22,23. Нанопоры значительно больше, чем частицы анализируемых (как использовано в данном исследовании) имеют меньшее влияние на подвижность частиц и тем самым динамику транслокации в поры. Поры, используемые в данном исследовании, однако ограничивается их диапазонов размеров аналита, NP150, например, имеет размер в диапазоне от 60-480 нм, так что если мультимодальный образец состоит из частиц в пределах и превышает этотпредел, то они не могут быть проанализированы на той же поры, поры тогда может перекрываться. Важно также отметить, что измерение бимодальный образец, содержащий 60 и 480 нм частиц (те, при абсолютных низких и более высоких пределов пор), например, будет требовать различных растягиваться и напряжения от нормы, хотя оба находятся в пределах диапазона анализа размера поры. Это происходит потому, растяжения, необходимое для более крупных частиц приведет к более мелких частиц, имеющих особенно малую величину блокады (на основе приведенного сопротивления), которые можно было бы рассматривать как фоновый шум и, следовательно, не обязательно измеренных во время выборки прогона.

Пузыри могут быть проблемы с измерениями образца в виде пузырьков в нижней или верхней ячейке жидкости создаст нестабильную базовый ток, к которому образец проходит не может быть завершена. Электролиты шипучей природы (некоторые высококонцентрированные биологических средах, например) может быть трудно работать и таким образом образцы REQuiring суспензии в этих специфических средах может оказаться проблематичным. Однако большинство образцов, могут быть значительно разбавленный или приостановлено в альтернативных буферов перед анализом TRPS.

Метод адаптируется и может быть использован для анализа спектра на основе наночастиц аналитов, в том числе анализ белков, ДНК, небольшие молекулы, агрегация анализов 17,24 и биологически соответствующих частиц. Универсальность TRPS характеризуя широкий спектр аналитов показывает методы , потенциал в ряде областей , таких как доставка лекарственных средств, 1,25 биодат- 26-28 и экологического тестирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ELCJB поддерживается Izon Science Ltd.

Acknowledgments

Авторы благодарят Izon Science Ltd за их поддержку. Работа выполнена при финансовой поддержке Европейской комиссии по научным исследованиям (PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered Saline (PBS) Sigma Aldrich, UK P4417 1 tablet dissolved in 200 ml deionized water to make buffer solution.
Tween-20 Sigma Aldrich, UK P1379 0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles Bangs Laboratories, US CPC200 Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1 x 1012 particles/ml, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2 x 1019 C/nm2.
Streptavidin coated nanoparticles Ademtech, France 3121 Batch had binding capacity of 4,352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1 x 1011 particles/ml.
Biotinylated oligonucleotides Sigma Aldrich, UK VC00001 Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides Sigma Aldrich, UK VC00001 Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano Izon Science, NZ Inherent pressure on system of 47 Pa
Izon Variable Pressure Module (VPM) Izon Science, NZ Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 100 Pa.
Polyurethane nanopore membranes Izon Science, NZ NP150 Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch. 
Magrack 6 GE Healthcare, UK 28-9489-64
Sonic Bath Fisher Scientific, UK 10692353 80 Watts
Vortexer IKA, Germany 0003365000
Rotary Wheel  Labnet International, US H5500-230 V

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexander, C. M., Maye, M. M., Dabrowiak, J. C. DNA-capped nanoparticles designed for doxorubicin drug delivery. Chem Commun. 47 (12), 3418-3420 (2011).
  2. Billinge, E. R., Platt, M. Aptamer based dispersion assay using tunable resistive pulse sensing (TRPS). Anal Methods. 7 (20), 8534-8538 (2015).
  3. Bulyk, M. L. Protein Binding Microarrays for the Characterization of Protein-DNA Interactions. Adv Biochem Eng Biotechnol. 104, 65-85 (2007).
  4. Platt, M., Rowe, W., Knowles, J., Day, P. J., Kell, D. B. Analysis of aptamer sequence activity relationships. Integr Biol. 1 (1), 116-122 (2009).
  5. Ruiz-Hernández, E., Baeza, A., Vallet-Regí, M. Smart Drug Delivery through DNA/Magnetic Nanoparticle Gates. ACS Nano. 5 (2), 1259-1266 (2011).
  6. Murdock, R. C., Braydich-stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of Nanomaterial Dispersion in Solution Prior to In Vitro Exposure Using Dynamic Light Scattering Technique. Toxicol Sci. 101 (2), 239-253 (2008).
  7. Hupfield, S., Holsaeter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow fractionation. J Nanosci Nanotechnol. 6 (7), 3025-3031 (2006).
  8. Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosens Bioelectron. 31 (1), 17-25 (2012).
  9. Roberts, G. S., Kozak, D., Anderson, W., Broom, M. F., Vogel, R., Trau, M. Tunable nano/micropores for particle detection and discrimination: scanning ion occlusion spectroscopy. Small. 6 (23), 2653-2658 (2010).
  10. Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Anal Chem. 83 (9), 3499-3506 (2011).
  11. Booth, M. A., Vogel, R., Curran, J. M., Harbison, S., Travas-Sejdic, J. Detection of target-probe oligonucleotide hybridization using synthetic nanopore resistive pulse sensing. Biosens Bioelectron. 45, 136-140 (2013).
  12. Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Chen, S. Simultaneous size and ζ-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS Nano. 6 (8), 6990-6997 (2012).
  13. Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Trau, M. Advances in Resistive Pulse Sensors: Devices bridging the void between molecular and microscopic detection. Nano Today. 6 (5), 531-545 (2011).
  14. Weatherall, E., Willmott, G. R. Applications of tunable resistive pulse sensing. Analyst. 140, 3318-3334 (2015).
  15. Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. J Phys Condens Matter. 22 (45), 454116 (2010).
  16. Blundell, E. L. C. J., Mayne, L. J., Billinge, E. R., Platt, M. Emergence of tunable resistive pulse sensing as a biosensor. Anal Methods. 7, 7055-7066 (2015).
  17. Platt, M., Willmott, G. R., Lee, G. U. Resistive Pulse Sensing of Analyte-Induced Multicomponent Rod Aggregation Using Tunable Pores. Small. 8 (15), 2436-2444 (2012).
  18. Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Anal Chem. 84 (7), 3125-3131 (2012).
  19. Blundell, E. L. C. J., Vogel, R., Platt, M. Particle-by-Particle Charge Analysis of DNA-Modified Nanoparticles Using Tunable Resistive Pulse Sensing. Langmuir. 32 (4), (2016).
  20. Hunter, R. J. Zeta Potential in Colloid Science: Principles and Applications. , Academic Press. New York. (1981).
  21. Arjmandi, N., Van Roy, W., Lagae, L., Borghs, G. Measuring the electric charge and zeta potential of nanometer-sized objects using pyramidal-shaped nanopores. Anal Chem. 84 (20), 8490-8496 (2012).
  22. Bacri, L., et al. Dynamics of colloids in single solid-state nanopores. J Phys Chem B. 115 (12), 2890-2898 (2011).
  23. Cabello-Aguilar, S., et al. Dynamics of polymer nanoparticles through a single artificial nanopore with a high-aspect-ratio. Soft Matter. 10 (42), 8413-8419 (2014).
  24. Billinge, E. R., Muzard, J., Platt, M. Tunable resistive pulse sensing as a tool to monitor analyte induced particle aggregation. Nanomater Nanosci. 1 (1), 11 (2013).
  25. Li, J., Fan, C., Pei, H., Shi, J., Huang, Q. Smart Drug Delivery Nanocarriers with Self-Assembled DNA Nanostructures. Adv Mater. 25 (32), 4386-4396 (2013).
  26. Billinge, E. R., Broom, M., Platt, M. Monitoring aptamer-protein interactions using tunable resistive pulse sensing. Anal Chem. 86 (2), 1030-1037 (2014).
  27. Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
  28. Park, S. -J., Taton, T. A., Mirkin, C. A. Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle Probes. Science. 295 (5559), 1503-1506 (2002).

Tags

Биоинженерия выпуск 116 биосенсор TRPS нанопористых дзета-потенциал ДНК частицы суперпарамагнитных
Определение дзета-потенциала через наночастицу транслокации через скоростей перестраиваемого нанопор: Использование ДНК-модифицированных частиц, как в примере
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blundell, E. L. C. J., Vogel, R.,… More

Blundell, E. L. C. J., Vogel, R., Platt, M. Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example. J. Vis. Exp. (116), e54577, doi:10.3791/54577 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter