Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fastsettelse av Zeta Potensielle via nanopartikkel trans Hastigheter gjennom en fleksibel membran nanopore: Ved hjelp av DNA-modifisert Partikler som et eksempel

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/54577
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemistry, School of Science, Loughborough University, 2Izon Science Limited, 3School of Mathematics and Physics, The University of Queensland

Summary

Her benyttes en polyuretan avstembar nanopore integrert i en resistiv pulsføle teknikk for å karakterisere nanopartikler overflatekjemi via måling av partikkeltrans hastigheter, som kan brukes for å bestemme zeta-potensialet av individuelle nanopartikler.

Abstract

Nanopore teknologi, kjent under samle Resistive pulssensor (RPS), blir brukt til å påvise, kvantifisere og karakterisere proteiner, molekyler og nanopartikler. Fleksibel resistive puls sensing (trps) er en relativt ny tilpasning til RPS som inkorporerer en fleksibel pore som kan endres i sanntid. Her bruker vi trps å overvåke trans tider av DNA-modifiserte nanopartikler som de krysser den avstembare pore membranen som en funksjon av DNA-konsentrasjon og struktur (dvs. enkelt-trådet til dobbeltkjedet DNA).

Trps er basert på to Ag / AgCl-elektroder, atskilt av et elastomert pore membran som etablerer en stabil ionisk strøm på et påtrykt elektrisk felt. I motsetning til forskjellige optiske basert partikkel karakterisering teknologier kan trps karakterisere individuelle partikler blant et utvalg populasjon, slik at for multimodale prøver som skal analyseres med letthet. Her viser vi zeta potensialet målingervia partikkeltrans hastigheter på kjente standarder og bruke disse til å prøve analysetrans ganger, noe som resulterer i å måle zeta potensialet av disse analyttene.

I tillegg til å anskaffe gjennomsnitts Zeta potensielle verdier, er prøvene tatt målt ved hjelp av en partikkel-by-partikkelen perspektiv som viser mer informasjon om en gitt prøve gjennom prøvepopulasjonsfordelinger, for eksempel. Av slikt, demonstrerer denne metoden potensial innenfor sensing programmer for både medisinsk og miljømessige felt.

Introduction

Funksjonnanopartikler blir stadig mer populært som biosensorer i både medisinske og miljømessige felt. Muligheten til å forandre en nanopartikkel er overflatekjemi, med DNA, for eksempel, har vist seg nyttige for målrettet medikamentleveringssystemer 1 og overvåknings DNA-protein interaksjoner 2-4. En stadig vanligere nanopartikkel eiendommen blir brukt ved biologiske og i levering av legemiddel er superparamagnetisme 5. Superparamagnetiske partikler (SPPS) er ekstremt anvendbare for identifisering og fjerning av spesifikke analytter fra komplekse blandinger, og kan gjøre dette med enkle bruk av en enkelt magnet. Når den er fjernet, analytten bundne partikler kan karakteriseres og analyseres passer til formålet.

Tidligere metoder for påvisning og karakterisering av nanopartikler inkluderer optiske teknikker som dynamisk lysspredning (DLS), ellers kjent som fotonkorrelasjonsspektroskopi. Selv om en high gjennomstrømning teknikk blir DLS begrenset til å være en gjennomsnittsbasert teknikk, og ved analyse av multimodale prøver uten tilsetning av spesialprogramvare, vil de større partikler gir et mye mer dominant signal, slik at noen av de mindre partiklene helt ubemerket 6,7. Partikkel-for-partikkel-karakteriseringsteknikker er derfor mye mer fordelaktig å analysere nanopartikler og nanopartikkel funksjonaliserte systemer.

RPS baserte teknologier er basert rundt påføre et elektrisk felt til en prøve, og overvåkning av transportmekanismen av partiklene gjennom en syntetisk eller biologisk nanopore. En forholdsvis ny nanopartikkel påvisning og karakterisering teknikk basert på RPS er fleksibel resistive puls sensing (trps) 8-16. Trps er et to-elektrodesystem adskilt av en elastomer, fleksibel membran pore. En avstembar pore fremgangsmåte gjør det mulig for analytter av et utvalg av form 17 og størrelse som skal måles, via deres transportmekanismer gjennom pore. Avstembare porene har tidligere vært anvendt for påvisning av små partikler (70-95 nm diameter) fremstilling av sammenlignbare resultater til andre teknikker som for eksempel transmisjons-elektronspektroskopi (TEM) 10. Når et elektrisk felt påtrykkes, er en ionisk strøm observert og som partikler / molekyler passere gjennom porene, de midlertidig å blokkere pore, forårsaker en reduksjon av strømmen som kan defineres som en "blokade hendelse". Hver blokade arrangement er representativ for en enkelt partikkel, slik at hver partikkel i en prøve kan karakteriseres individuelt basert på blokaden størrelse, Δ ligning 1 Og full bredde halvt maksimum, FWHM, så vel som andre egenskaper blokade. Analysere individuelle partiklene når de passerer gjennom en nanopore er fordelaktig for multimodale prøver som trps kan vellykket og effektivt skille mellom en rekke partikkelstørrelser AmonGST en enkelt prøve. Fleksibel resistive puls sensing fullstørrelse 10, Zeta potensielle 12,18 og konsentrasjon 15 målinger samtidig i ett enkelt løp, og kan derfor fortsatt skille prøver av lik, om ikke den samme størrelsen av deres overflateladning 19; en fordel over alternative dimensjonering teknikker.

Zeta potensial er definert som det elektrostatiske potensial på planet av skjær 20, og beregnes ut fra partikkelhastigheter som de krysser en pore 19. Zeta potensial målinger av individuelle partikler gir dermed innsikt i trans mekanismer og oppførselen til nanopartikkel-systemer i løsningen, verdifull informasjon for fremtiden til nanopartikkel analyse design for en rekke bruksområder. Particle-by-partikkel analyse av en slik art gjør det også mulig for spredning og distribusjon av Zeta potensielle verdier blant et utvalg befolkningen til å bli utforsket, noe som åpner for mer informasjon on reaksjonskinetikk (enkelt-trådet til dobbeltkjedet DNA, for eksempel) og partikkel-stabiliteter i oppløsning som skal oppnås.

Her beskriver vi en teknikk som oppdager og karakteriserer både umodifiserte og DNA-modifisert SPP overflater. Protokollen er beskrevet heri kan anvendes på en rekke uorganiske og biologiske nanopartikler, men vi demonstrere fremgangsmåten ved bruk av DNA-modifiserte overflater på grunn av deres brede spekter av applikasjoner. Teknikken gjør det mulig for brukeren å skille mellom enkelt-trådede og dobbelt-trådede DNA mål på en nanopartikkel overflate, basert på partikkeltranshastigheter gjennom et poresystemet og dermed deres zeta-potensialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Gjør Fosfatbufret saltløsning med Tween-20 (PBST) Buffer

  1. Oppløse en tablett PBS (0,01 M fosfatbuffer, 0,0027 M kaliumklorid, 0,137 M natriumklorid, pH 7,4) i 200 ml deionisert vann (18,2 Megohm cm).
  2. Tilsett 100 ul (0,05 (v / v))% Tween-20 i 200 ml bufferoppløsning som et overflateaktivt middel.

2. Forbereder karboksylsidekjeden polystyren Partikkel Standards

  1. Vortex kalibrerings partikler for 30 sekunder før ultralydbehandling i 2 minutter ved 80 watt for å skape monodispersitet av partiklene.
  2. Fortynn kalibreringspartiklene 1 i 100 til en konsentrasjon på 1x10 10 partikler / ml i PBST-buffer og virvle i 30 sek.

3. Forbereder Streptavidin belagte partiklene

  1. Vortex partiklene i 30 sekunder før ultralydbehandling i 2 minutter ved 80 watt for å sikre monodispersitet.
  2. Fortynn streptavidin belagt partikler 1 av 100 i PBST buffer til achieve en resulterende konsentrasjon på 1x10 9 partikler / ml og virvle i 30 sek.
    Merk: En typisk prøvevolum er 200 mikroliter. Hvis for eksempel undersøker fem DNA-konsentrasjoner fremstille 1 ml av fortynnet streptavidin belagte partikler.

4. Utarbeidelse av Oligonukleotider

  1. Rekonstituer oligonukleotider med avionisert vann til en resulterende konsentrasjon på 100 uM.

5. Tilsetting av Capture Probe (CP) DNA til Streptavidin belagte partiklene

  1. Før DNA-binding, vortex-streptavidin belagte partikler (200 pl prøvevolum) i 30 sekunder etterfulgt av en 2 minutters sonikering ved 80 watt.
  2. Basert på bindingskapasiteten gitt av leverandøren (4352 pmol / mg), tilsett passende konsentrasjon av DNA til partiklene for resulterende konsentrasjoner på 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140, og 210 nM DNA.
  3. Vortex prøvene i 10 sekunder og sted på et roterende hjul ved romtemperaturi 30 min for å tillate DNA bindes til partikkeloverflatene via en streptavidin-biotin interaksjon.
  4. Når fangst DNA har blitt tilsatt og inkubert med streptavidin belagte partikler, fjerne overflødig DNA i oppløsning via magnetisk separasjon ved å plassere prøvene på et magnetisk stativ i 30 minutter.
  5. Fjern supernatanten, tar seg ikke å forstyrre den nyopprettede klynge av partikler nærmest magnet, og erstatte med samme volum av ny PBST buffer.

6. hybridisering komplementær DNA til CP-partikler

  1. Legge til den nødvendige mengden av mål-DNA (i overskudd ved 500 nM) for å sikre størst mulig mål binding ble oppnådd.
  2. Vortex prøvene i 10 sekunder og sted på et roterende hjul ved romtemperatur i 30 min.
  3. Når hybridiseringen er fullført, fjernes overskudd av mål-DNA via magnetisk separasjon ved å plassere prøvene på et magnetisk stativ i 30 minutter.
  4. Fjern supernatanten, Tar seg ikke å forstyrre den nyopprettede klynge av partikler nærmest magnet, og erstatte med samme volum av ny PBST buffer.
  5. Gjenta trinn 6.1 til 6.4 for dobbeltprøver og plassere disse prøvene på et roterende hjul ved romtemperatur i 16 timer for å undersøke DNA-hybridiserings-tider.

7. trps Setup

  1. Plugg inn instrumentet inn i et datasystem med programvare på plass.
  2. Kalibrere den første strekningen ved hjelp av en caliper.
    1. Mål avstanden mellom utsiden av to parallelle kjever.
    2. Innspill til programvaren ved å skrive strekningen i "stretch-feltet i kategorien" Instrument Innstillinger "og klikke" kalibrere strekke "under fanen.
  3. Lateralt passe en polyuretan nanopore membran av passende størrelse for analyse på kjevene med nanopore ID-nummer vendt oppover. Deretter strekke kjevene til strekningen som kreves for analyse ved hjelp avstrekning justeringshåndtak på siden av apparatet. Strekk kjevene mellom 43 og 48 mm.
    Merk: Den nøyaktige verdien av strekningen bestemmes sammen med påtrykt spenning slik at kalibreringen partikkel blokader er minst 0,3 nA i størrelse. Strekningen er allerede matet inn i programmet i trinn 7.2, og vil automatisk justere som kjevene er strukket.
  4. Plassere 80 ul PBST-buffer i det nedre fluidcellen, under nanopore, slik det ikke er noen bobler tilstede som kan påvirke målingen. Hvis det er bobler sett, fjerne og erstatte bufferen.
  5. Klikk på den øvre fluidcellen på plass og plassere 40 ul buffer inn i det, på nytt sikrer det ikke er noen bobler tilstede. Hvis bobler er til stede i det øvre fluidcellen, fjerne dem ved å erstatte væsken.
  6. Når en reproduserbar referansestrøm er nådd fra å erstatte den øvre fluidcellen med buffer, tilsett 40 ul av prøven til den øvre fluidcelle og måle ved å klikke "stkunst 'i' kategorien Data Acquisition "på skjermbildet.
    Merk: datainnsamlingen er ferdig med en frekvens på 50 kHz med en blokade magnitude nedre grense på 0,05 NA, selv om dette kan endres ved hjelp av programvaren via fanen Analyse Data '(under "Analyse Innstillinger" og "Resistive blokader') .
  7. Plassere et Faraday-bur over toppen av fluidcellesystem for å redusere elektrisk bakgrunnsstøy på målingene.
  8. Bruke en variabel trykkmodul (VPM) for å anvende trykk eller vakuum til prøvene.
    1. Hvis du vil bruke et eksternt press koble munnstykket til øvre væske cellen, og roter trykket arm og klikker på plass (avhengig av om et positivt trykk (PRE) eller et vakuum (VAC) vil bli brukt).
    2. Press i en 'cm' eller 'mm' skala ved hjelp av høytrykks scenen knott som ligger på toppen av VPM. Trykk på bryteren ned for å legge press på 'cm' skala og trekk den oppover to legge press på 'mm' skala.

8. Forbereder Prøver for trps Analysis

  1. Vortex prøver for 30 sek og sonikere i 2 minutter ved 80 watt før trps analyse.

9. Kalibrering av nanopore for Zeta Analysis

  1. Etter å ha plassert 40 ul kalibrerings partikler (1x10 10 partikler / ml) i den øvre væske celle, fullføre en trps måling (oppsett som i kapittel 7) på 3 søkt spenninger. Endre spenningen ved å klikke på '+' og '-' knapper på spenningen skalaen i 'Instrument Settings "-fanen i programvaren.
  2. Sjekk at de 3 spenninger tilbake bakgrunn strømmer på ca 140, 110, og 80 nA. Sørge for at på mellomspenningskalibrerings partiklene gir et gjennomsnitt blokade størrelsesorden på minst 0,3 nA.
  3. Påfør et trykk slik at den gjennomsnittlige fulle bredde halv maksimum (FWHM) varigheten av kalibrerings partikler er minst0,15 msek. Gjøres manuelt ved hjelp av trykkarmen er festet til den variable trykkmodulen. Velg trykk (PRE) eller vakuum (VAC) ved å rotere armen til den klikker i ønsket posisjon og gjelde tilsvar følgende oppsett instruksjonene i trinn 7.8.2. Når disse forholdene har blitt oppnådd, starte kjøringen ved å klikke på "Start" på programvaren i kategorien 'Data Acquisition ".
  4. Fullfør løp ved å trykke på "stopp" i kategorien "Data Acquisition" når minst 500 partikler har blitt målt (se "Particle Count" nederst i skjermbildet for programvare under målingen) og oppkjøringen har oversteget 30 sek (se ' Run Time 'også mot bunnen av skjermen).
  5. Kalibrere systemet ved å fullføre en kalibrerings løp som beskrevet hver gang en ny nanopore er innført eller for hver ny dag med analyse ved å fullføre trinn 09.01 til 09.04.

10. Kjøre en Sample

  1. Kjør prøvene på høyeste ellernest høyeste spenning som kalibreringsprøvene på å sikre en lignende (± 10 nA), hvis ikke det samme, baseline strøm.
    1. Når riktig referansestrøm er oppnådd, erstatte elektrolytten i det øvre fluidcellen med 40 ul prøve. Når en prøve er innført, vil blokade sees på signalet spor. Start prøven kjøres ved å klikke på "Start" i kategorien "Data Acquisition" og ta opp minst 500 partikler (sjekk "Particle Count 'ligger under signal spor) og sikre kjøretiden er minst 30 sek (se' Run Time 'også ligger under signal spor).
    2. For å fullføre målingen, klikk "stopp" i kategorien Data Acquisition "og lagre datafilen.
  2. Hvis du vil lagre filen, inn filinformasjon i følgende format; 'Investigation "er mappen filen skal lagres i,' nanopore ID 'er serienummeret til pore blir brukt,' Part # 'is type pore (dvs. NP150 / NP200), er "Sample ID 'navnet på prøven," Kalibrering eller prøve' detaljer om det er en måling kalibrering eller prøve, "fortynning" brukes hvis prøven ble fortynnet ( Type 100 hvis prøven ble fortynnet 100-ganger), "Pressure" er det anvendte trykket på prøven (i cm - se avsnitt 7.8), er "Elektrolytt-ID 'navnet på den buffer prøven består i, og' Merknader 'er personlige notater om prøven eller løpe.
  3. Mellom hver prøve løp, vask systemet ved å plassere 40 ul PBST-buffer inn i det øvre fluidcellen flere ganger, og å anvende forskjellige trykk (vanligvis ved -10, -5 cm (vakuum), og 5 og 10 cm (overtrykk)) inntil ikke mer blokade hendelser er til stede, slik at det ikke er noen gjenværende partikler som er igjen i systemet og derfor ingen kryssforurensning mellom prøvene. Kjør prøver i tre eksemplarer med dette vasketrinn fullført mellom hver rapport prøve kjøres som well som mellom forskjellige prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1
Figur 1. Skjematisk fremstilling av prosesser av magnetiske rensing og et trps måling. A) Eksempel på magnetisk rensing av prøven starter med en prøve inneholdende overskudd av ubundet capture probe DNA. B) trps måling eksempel i) Partikkel passerer gjennom nanopore og ii) Blokade arrangement fremstilt fra partikkel midlertidig tyggende ioner i pore forårsaker en midlertidig reduksjon i gjeldende; Informasjon som brukes til å beregne partikkeltrans hastigheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fjerning av overskudd av DNA som ikke er bundet til partikler overflate fra prøvene er viktig før trps analyse, at man ikke rapportere noe'falske positive resultater. Muligheten til å bruke en magnet for å trekke ut og vaske SPPS er en stor fordel for trps (figur 1A). Figur 1B beskriver en grunnleggende eksempel på en trps måling og et eksempel 'blokade event' oppnådd som en partikkel går gjennom pore. For det første har man vist at trps er en høy gjennomstrømning teknikk som kan skille mellom prøver av en tilsvarende størrelse, men på en vesentlig forskjellig ladning. Dens evne til å fullføre både størrelse og ladning analyse samtidig i en enkelt måling kan sees i figur 2. Figur 2 er et eksempel på a) størrelse og b) zetapotensial analyse av streptavidin-belagte partikler med noen modifikasjoner (blekrosa datasett) og streptavidin belagte partikler mettet med enkelttrådet DNA på overflaten (blå datasett). Selv om begge prøvene var av samme størrelse, zeta-potensialet var signifikant forskjellige, og mye større når DNA var funksjonelleonalized på partikkelens overflate.

Figur 2
Figur 2. Størrelse og Zeta potensial analyse av DNA-modifisert og umodifisert streptavidin belagt nanopartikler. De lyserosa søylene representerer umodifiserte streptavidin belagte partiklene og de blå søylene representerer DNA-modifiserte partikler. A) Frekvens (%) vs partikkeldiameter (nm). B) Hyppighet (%) vs zeta-potensial (mV). Figur tilpasset fra supplerende data i Blundell et al. 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ikke bare kan den teknikk som skille mellom partikler umodifisert og modifisert med DNA, kan trps også skille mellom prøver med forskjellige konsentrasjoner av DNA hybridisert til den parisponflate. Figur 3 viser størrelsen og zeta potensialet data utstilt for prøver med lavest (10 nM, lys grønn datasett) og høyest (210 nM, blå datasett) konsentrasjoner av DNA hybridiserte til streptavidin belagte partikler. En større zeta potensialet verdi blir registrert for partikler hybridisert med en høyere konsentrasjon av DNA.

Figur 3
Figur 3. Samtidig størrelse og Zeta potensielle data tatt fra en enkelt trps måling. De blå barer / datapunktene er representative for streptavidin belagt partikler hybridiserte med 210 nM CP DNA og lysegrønne barer / datapunktene representerer streptavidin belagt partikler hybridiserte med 10 nM CP DNA. Figur tilpasset fra Blundell et al. 19. Klikk her for å seen større versjon av dette tallet.

Det er nyttig å merke seg at hvert datapunkt i punktplottet representerer en enkelt partikkel blant et utvalg populasjon, slik at for i dybden partikkel-til-partikkelanalyse med hver prøve. Figur 4 støtter teknikk effektivitet i å bestemme mindre endringer i DNA-strukturen ( enkelt-strandet og dobbel-strandet DNA), samt identifisere forskjeller i prøver med target DNA av samme størrelse, men bundet til et annet område av fangst sonden viser høye nivåer av følsomhet (dvs. Middle bindende og slutten bindende mål vist i figur 4). Partiklene som er vist i figur 4 er de med de følgende overflatemodifiseringer, fra venstre mot høyre; capture probe (CP) DNA bare, CP og en fullstendig komplementær DNA-mål, CP og en midtre bindende DNA-mål, CP og en endefeste DNA-mål, CP og en overhengende DNA-mål.


Fig. 4. Relativ endring i zeta-potensial målt med hensyn til DNA-modifiserte partikler med en rekke DNA-mål Endring i zeta potensial, mV, fra i) CP funksjonalisert partikkel til en rekke DNA-mål; ii) Fullt utfyllende, iii) Middle bindende, iv) End binding, v) rager mål. Feilstolpene representerer standardavvik der n = 3. Figur tilpasset fra Blundell et al. 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Beregningen for zeta potensialet brukt en kalibreringsbasert metode relatert til arbeid med Arjmandi et al. 21. Varigheten av translokasjon av partikler som de krysser et nanopore måles som en funksjon av påtrykt spenning, ved hjelp av en gjennomsnittlig elektriske felt og partikkelhastigheter over helheten av en vanlig konisk pore. Den elektroforetiske mobilitet er den deriverte av 1 / T (hvor T er varigheten blokaden) med hensyn til spenning, multiplisert med kvadratet av avfølingssonen lengde, l. Gjennomsnittlig hastigheter på flere referansepunkter gjennom følesonen måles for å tillate minimal feil i beregning av zeta potensial ved hjelp av denne metoden.

Kalibreringen av pore er basert på linearitet av 1 / T vs spenning, V, i hvert referansepunkt i avfølingssonen. De elektropartikkelhastigheter for kalibrering og prøvepartiklene,opplasting / 54577 / 54577eq2.jpg "/> og ligning 3 henholdsvis er knyttet til deres zeta-potensialer ligning 4 og ligning 5 Som vist i ligning 1, forutsatt at et lineært forhold mellom de to som er angitt i Smoluchowski tilnærmelse 12,20. Netto zeta potensialet verdiene for både kalibrering og prøven er forskjellene i partikkel zeta potensial og membranen zeta potensial, ligning 6 . Zeta-potensialet av polyuretan pore ble målt ved bruk av strømningspotensialet teknikker 12,18 som -11 mV i PBS i denne studien.

ligning 7 (1)

Zeta-potensialet av hver enkelt partikkel, i, ligning 8 er posisjonen av partikkelen i poren etter tidspunktet t = T x, og ligning 10 er partikkelhastigheten av enkelt prøve partikkel i ved relative posisjoner l x; ligning 12 , ligning 14 , P, og V er elektrokinehastighet per enhet spenning, konvektive hastighet per enhet trykk, utøvet trykk og spenning for prøven renner henholdsvis en fullstendig avledning av denne ligningen kan finnes i arbeidet av Blundell et al., 19.

ligning 16

Ved binding av fangst probe DNA til streptavidin belagte nanopartikler, er det viktig at forskeren fjerner overflødig, ubundet capture probe-DNA er igjen i løsningen. Dette gjøres enkelt ved å bruke SPPS og en enkelt magnet som tillater rask og enkel utskifting av supernatanten med nye PBST-buffer. Hvis overskytende fange DNA som er igjen i oppløsning og mål-DNA tilsatt, den mål-DNA kan bindes til den frie fange DNA i oppløsning, i stedet for som på SPP overflaten. En endring i partikkelhastighet og zeta-potensialet vil bare observeres når mål-DNA bindes til fange sonde tilstede på partikkelens overflate.

Analyse og sammenligning av et stort antall prøver på tvers av mange dager ved hjelp av trps kan kreve bruk av mer enn én pore membran. Noen porene kan ha noen mindre forskjeller i størrelse på grunn av produksjonsprosessen og i disse tilfellene, må brukeren sørge for grunnlinjen nåværende forblir identisk på tvers av alle runs. Hvis det samme utgangsstrøm er observert, de oppnådde resultater er sammenlignbare mellom porene. Når grunnlinjen er den samme som tidligere kjøringer, er det viktig at brukeren holder strekningen uendret mellom kalibrering og prøve løper for å tillate nøyaktig bestemmelse av partikkeltrans hastigheter som de traversere pore.

Den trps teknologien har et forholdsvis enkelt satt opp, noe som kan demonteres enkelt og hurtig i løpet av et eksperiment. Hvis du feilsøker problemer, kan dette gjøre prosessen mye enklere. For eksempel, er det viktig ikke å tillate noen bobler i den nedre fluidcellen eller øvre fluid celle når gjennomføre analysen. Dette vil føre til en ustabil baseline strøm. Hvis bobler er til stede i det øvre fluidcellen, kan prøven tas ut og erstattes. Dersom det oppstår bobler i den nedre fluidcellen, må buffer fjernes og erstattes med frisk buffer. Hvis boblene er et vedvarende problem, så det kan være for mye surfaktanti oppløsningen slik at dette kan måtte reduseres 16 (vi bruker bare 0,05% Tween-20). Enkelte prøver kan blokkere porene hvis deres størrelse overskrider porestørrelse, eller dersom konsentrasjonen av prøven er for høy. For å rette på dette, kan porestørrelsen økes ved å øke strekningen eller prøven kan fortynnes til en lavere partikkelkonsentrasjon 16. For enkeltpartikkelanalyse, kan prøven også blokkere poren hvis det finnes en rekke av store aggregater til stede, er det viktig å vortex og sonikere prøven før løper den gjennom trps.

Blant andre metoder, har trps forskjellige fordeler, inkludert muligheten til å fullføre størrelse og kostnad målinger av individuelle partikler samtidig; slik at for multimodale prøver som skal analyseres effektivt ved hjelp av denne metoden. En fordel er signal / blokader produsert kan optimaliseres i minutter for en bestemt prøve ved å endre strekningen og spenning for å få en blokade magnitude, Δ </ Em> ligning 1 , Betydelig større enn bakgrunnsstøy (blokkader er av nA skala i forhold til bakgrunnsstøy <10 pA). Å være i stand til å endre den strekning av pore gjør fremgangsmåten mer allsidig enn solid-state pore teknikker som porestørrelsen kan justeres med hensyn til størrelsen av analytten i spørsmålet; spesielt nyttig når undersøke effekter som aggregering og DNA-proteinbinding som kan resultere i analyse størrelser som overstiger den opprinnelige solid-state pore størrelse. Et annet fordelaktig aspekt av trps er graden av følsomhet fra teknikken. Evnen til å påvise små forskjeller i DNA-binding (hvor den samme mengde DNA er blitt tilsatt (samme mengde av tilsatt charge), og prøvene er av samme størrelse) basert på posisjonen av mål-DNA-binding er ganske dyp i dette området av analyse og vil være til stor nytte for fremtidige nanopartikkel-analysedesignplattformer. Hver subtil avvikeence kan påvises og isoleres ved å bruke en partikkel-til-partikkel natur trps teknologi. Denne analysen er høyere enn for ensemble teknikker som dynamisk lysspredning eller fotonkorrelasjonsspektroskopi som vil bare gage et gjennomsnitt av prøven populasjon analysert og kan ikke skille i tilfeller av multimodale prøver 6,7.

Små solid-state nanopores (100-200 nm) er også blitt anvendt til å overvåke partikkel dynamikk og har funnet at partikkelmobilitet kan bli påvirket som diameteren til partikkelen begynner å nærme seg den av nanopore 22,23. Nanopores mye større enn partiklene som blir analysert (som brukt i denne undersøkelsen) har mindre effekt på partikkel mobilitet og dermed trans dynamikken i poren. Porene brukt i denne studien er imidlertid begrenset til sine analysestørrelsesklasser, et NP150 for eksempel har en størrelse spekter av 60-480 nm så hvis en multimodal Utvalget besto av partikler innenfor og utover dettegrense, kan de ikke bli analysert på samme pore som pore kan da bli blokkert. Det er også viktig å merke seg at måling av en bimodal prøve inneholdende 60 og 480 nm partikler (de ved den absolutte lavere og høyere grenser av pore), for eksempel, vil kreve forskjellige strekk og spenningsbetingelser, selv om begge er innenfor størrelsesanalyseområde av pore. Dette er fordi den strekning som kreves for de større partikler vil resultere i de mindre partikler som har en særlig liten blokade størrelse (basert på den reduserte motstand) som kan betraktes som bakgrunnsstøy og således ikke nødvendigvis, målt i løpet av en prøvekjøringen.

Bobler kan være et problem med prøvemålinger som bobler i nedre eller øvre væske celle vil skape en ustabil baseline strøm, som prøve løper ikke kan gjennomføres. Elektrolytter av en sprudlende natur (noen svært konsentrerte biologiske medier, for eksempel) kan være vanskelig å kjøre og dermed prøver requiring suspensjon i disse spesifikke mediene kan vise seg problematisk. De fleste prøvene derimot, kan bli kraftig utvannet eller suspendert i alternative buffere før trps analyse.

Fremgangsmåten er tilpasningsdyktig og kan brukes til å analysere en rekke av nanopartikkel-baserte analytter, inkludert analyse av proteiner, DNA, små molekyler, aggregasjon analyser 17,24 og biologisk relevante partikler. Allsidigheten trps i karakter et bredt utvalg av analytter viser teknikkene mulige i en rekke områder som stoffet levering 1,25, biosensing 26-28, og miljøtesting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ELCJB støttes av Izon Science Ltd.

Acknowledgments

Forfatterne takker Izon Science Ltd for deres støtte. Arbeidet ble støttet av EU-kommisjonen for forskning (PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered Saline (PBS) Sigma Aldrich, UK P4417 1 tablet dissolved in 200 ml deionized water to make buffer solution.
Tween-20 Sigma Aldrich, UK P1379 0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles Bangs Laboratories, US CPC200 Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1 x 1012 particles/ml, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2 x 1019 C/nm2.
Streptavidin coated nanoparticles Ademtech, France 3121 Batch had binding capacity of 4,352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1 x 1011 particles/ml.
Biotinylated oligonucleotides Sigma Aldrich, UK VC00001 Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides Sigma Aldrich, UK VC00001 Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano Izon Science, NZ Inherent pressure on system of 47 Pa
Izon Variable Pressure Module (VPM) Izon Science, NZ Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 100 Pa.
Polyurethane nanopore membranes Izon Science, NZ NP150 Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch. 
Magrack 6 GE Healthcare, UK 28-9489-64
Sonic Bath Fisher Scientific, UK 10692353 80 Watts
Vortexer IKA, Germany 0003365000
Rotary Wheel  Labnet International, US H5500-230 V

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexander, C. M., Maye, M. M., Dabrowiak, J. C. DNA-capped nanoparticles designed for doxorubicin drug delivery. Chem Commun. 47 (12), 3418-3420 (2011).
  2. Billinge, E. R., Platt, M. Aptamer based dispersion assay using tunable resistive pulse sensing (TRPS). Anal Methods. 7 (20), 8534-8538 (2015).
  3. Bulyk, M. L. Protein Binding Microarrays for the Characterization of Protein-DNA Interactions. Adv Biochem Eng Biotechnol. 104, 65-85 (2007).
  4. Platt, M., Rowe, W., Knowles, J., Day, P. J., Kell, D. B. Analysis of aptamer sequence activity relationships. Integr Biol. 1 (1), 116-122 (2009).
  5. Ruiz-Hernández, E., Baeza, A., Vallet-Regí, M. Smart Drug Delivery through DNA/Magnetic Nanoparticle Gates. ACS Nano. 5 (2), 1259-1266 (2011).
  6. Murdock, R. C., Braydich-stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of Nanomaterial Dispersion in Solution Prior to In Vitro Exposure Using Dynamic Light Scattering Technique. Toxicol Sci. 101 (2), 239-253 (2008).
  7. Hupfield, S., Holsaeter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow fractionation. J Nanosci Nanotechnol. 6 (7), 3025-3031 (2006).
  8. Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosens Bioelectron. 31 (1), 17-25 (2012).
  9. Roberts, G. S., Kozak, D., Anderson, W., Broom, M. F., Vogel, R., Trau, M. Tunable nano/micropores for particle detection and discrimination: scanning ion occlusion spectroscopy. Small. 6 (23), 2653-2658 (2010).
  10. Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Anal Chem. 83 (9), 3499-3506 (2011).
  11. Booth, M. A., Vogel, R., Curran, J. M., Harbison, S., Travas-Sejdic, J. Detection of target-probe oligonucleotide hybridization using synthetic nanopore resistive pulse sensing. Biosens Bioelectron. 45, 136-140 (2013).
  12. Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Chen, S. Simultaneous size and ζ-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS Nano. 6 (8), 6990-6997 (2012).
  13. Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Trau, M. Advances in Resistive Pulse Sensors: Devices bridging the void between molecular and microscopic detection. Nano Today. 6 (5), 531-545 (2011).
  14. Weatherall, E., Willmott, G. R. Applications of tunable resistive pulse sensing. Analyst. 140, 3318-3334 (2015).
  15. Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. J Phys Condens Matter. 22 (45), 454116 (2010).
  16. Blundell, E. L. C. J., Mayne, L. J., Billinge, E. R., Platt, M. Emergence of tunable resistive pulse sensing as a biosensor. Anal Methods. 7, 7055-7066 (2015).
  17. Platt, M., Willmott, G. R., Lee, G. U. Resistive Pulse Sensing of Analyte-Induced Multicomponent Rod Aggregation Using Tunable Pores. Small. 8 (15), 2436-2444 (2012).
  18. Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Anal Chem. 84 (7), 3125-3131 (2012).
  19. Blundell, E. L. C. J., Vogel, R., Platt, M. Particle-by-Particle Charge Analysis of DNA-Modified Nanoparticles Using Tunable Resistive Pulse Sensing. Langmuir. 32 (4), (2016).
  20. Hunter, R. J. Zeta Potential in Colloid Science: Principles and Applications. , Academic Press. New York. (1981).
  21. Arjmandi, N., Van Roy, W., Lagae, L., Borghs, G. Measuring the electric charge and zeta potential of nanometer-sized objects using pyramidal-shaped nanopores. Anal Chem. 84 (20), 8490-8496 (2012).
  22. Bacri, L., et al. Dynamics of colloids in single solid-state nanopores. J Phys Chem B. 115 (12), 2890-2898 (2011).
  23. Cabello-Aguilar, S., et al. Dynamics of polymer nanoparticles through a single artificial nanopore with a high-aspect-ratio. Soft Matter. 10 (42), 8413-8419 (2014).
  24. Billinge, E. R., Muzard, J., Platt, M. Tunable resistive pulse sensing as a tool to monitor analyte induced particle aggregation. Nanomater Nanosci. 1 (1), 11 (2013).
  25. Li, J., Fan, C., Pei, H., Shi, J., Huang, Q. Smart Drug Delivery Nanocarriers with Self-Assembled DNA Nanostructures. Adv Mater. 25 (32), 4386-4396 (2013).
  26. Billinge, E. R., Broom, M., Platt, M. Monitoring aptamer-protein interactions using tunable resistive pulse sensing. Anal Chem. 86 (2), 1030-1037 (2014).
  27. Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
  28. Park, S. -J., Taton, T. A., Mirkin, C. A. Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle Probes. Science. 295 (5559), 1503-1506 (2002).

Tags

Bioteknologi biosensor trps nanopore Zeta potensial DNA superparamagnetiske partikler
Fastsettelse av Zeta Potensielle via nanopartikkel trans Hastigheter gjennom en fleksibel membran nanopore: Ved hjelp av DNA-modifisert Partikler som et eksempel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blundell, E. L. C. J., Vogel, R.,… More

Blundell, E. L. C. J., Vogel, R., Platt, M. Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example. J. Vis. Exp. (116), e54577, doi:10.3791/54577 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter