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Bioengineering

Determinación del Potencial Zeta a través de nanopartículas de translocación velocidades a través de un sintonizable nanoporos: El uso de partículas de ADN modificado como ejemplo

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/54577
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemistry, School of Science, Loughborough University, 2Izon Science Limited, 3School of Mathematics and Physics, The University of Queensland

Summary

Aquí se utiliza un nanopore sintonizable de poliuretano integrado en una técnica de detección de impulsos resistiva para caracterizar las nanopartículas química de la superficie a través de la medición de las velocidades de translocación de partículas, que se puede utilizar para determinar el potencial zeta de las nanopartículas individuales.

Abstract

tecnologías de nanoporos, conocidos colectivamente como sensores de pulso resistivas (RPS), están siendo utilizados para detectar, cuantificar y caracterizar las proteínas, las moléculas y nanopartículas. detección de pulso resistiva sintonizable (TRPS) es una adaptación relativamente reciente al PRC que incorpora un poro ajustable que puede ser alterado en tiempo real. Aquí, nosotros usamos TRPS para controlar los tiempos de translocación de las nanopartículas de ADN modificado a medida que atraviesan la membrana de poro sintonizable como una función de la concentración de ADN y la estructura (es decir, de una sola cadena en ADN de doble cadena).

TRPS se basa en dos electrodos de Ag / AgCl, separadas por una membrana de poro de elastómero que establece una corriente iónica estable a un campo eléctrico aplicado. A diferencia de las diversas tecnologías de caracterización de partículas basado en la óptica, TRPS pueden caracterizar partículas individuales en una población de la muestra, lo que permite muestras multimodales para ser analizados con facilidad. Aquí, demostramos medidas de potencial zetaa través de las velocidades de translocación de partículas de estándares conocidos y aplicar estos a la muestra tiempos de translocación de analito, lo que resulta en la medición del potencial zeta de los analitos.

Así como la adquisición de valores del potencial zeta medias, las muestras se miden utilizando una perspectiva de partícula por partícula que exhibe más información sobre una muestra dada por medio de distribuciones de la población de la muestra, por ejemplo. De tal, este método demuestra potencial dentro de aplicaciones de detección para ambos campos de la medicina y ambientales.

Introduction

nanopartículas funcionalizadas se están convirtiendo cada vez más popular como biosensores en ambos campos de la medicina y ambientales. La capacidad de alterar la química de la superficie de una nanopartícula, con el ADN, por ejemplo, está demostrando útil para sistemas de administración de fármacos dirigidos 1 y monitoreo interacciones ADN-proteína 2-4. Una propiedad de nanopartículas cada vez más común siendo utilizado en los bioensayos y en la entrega de la terapéutica es superparamagnetismo 5. partículas superparamagnéticas (SPP) son extremadamente útiles en la identificación y eliminación de sustancias específicas de análisis a partir de mezclas complejas y pueden hacerlo con el simple uso de un solo imán. Una vez extraídas, las partículas de analito unido se pueden caracterizar y analizar adecuado para el propósito.

Los métodos anteriores utilizados para la detección y caracterización de nanopartículas incluyen técnicas ópticas tales como la dispersión dinámica de luz (DLS), también conocida como espectroscopía de correlación de fotones. Aunque un hitécnica de rendimiento gh, DLS se limita a ser una técnica basada promediado y en el análisis de muestras multimodales sin la adición de un software especializado, las partículas más grandes producirán una señal mucho más dominante, dejando algunos de las partículas más pequeñas totalmente desapercibido 6,7. Partícula por partícula técnicas de caracterización, por tanto, son mucho más favorables para analizar los sistemas de nanopartículas funcionalizadas de nanopartículas y.

tecnologías basadas RPS se basan en la aplicación de un campo eléctrico a una muestra y el seguimiento del mecanismo de transporte de las partículas a través de un nanopore sintético o biológico. Una técnica de detección y caracterización de nanopartículas relativamente reciente basado en RPS es la detección de pulso resistiva sintonizable (TRPS) 8-16. TRPS es un sistema de dos electrodos separados por una membrana de poros elastomérico, sintonizable. Un método sintonizable de poros permite analitos de una gama de 17 forma y tamaño para ser medido a través de su transmecanismos de puerto a través del poro. Poros sintonizables anteriormente se han utilizado para la detección de partículas pequeñas (70 a 95 nm de diámetro) que produce resultados comparables a otras técnicas como la espectroscopía electrónica de transmisión (TEM) 10. Cuando se aplica un campo eléctrico, se observa una corriente iónica y como partículas / moléculas pasan a través del poro, que bloquean temporalmente el poro, causando una reducción en la corriente que se puede definir como un "evento bloqueo '. Cada evento bloqueo es representante de una sola partícula de manera que cada partícula dentro de una muestra se pueden caracterizar individualmente basa en la magnitud bloqueo, Δ Ecuación 1 , Y la anchura total media-máxima, FWHM, así como otras propiedades del bloqueo. El análisis de las partículas individuales a medida que pasan a través de un nanopore es ventajoso para muestras multimodales como TRPS con éxito y eficacia pueden distinguir una gama de tamaños de partícula amonGST una sola muestra. Detección de pulso resistiva sintonizable completa tamaño 10, potencial zeta 12,18 y la concentración de 15 mediciones simultáneamente en una única ejecución y por lo tanto puede todavía diferenciar muestras de similar, si no el mismo tamaño por su carga de superficie 19; una ventaja sobre las técnicas de encolado alternativos.

El potencial zeta se define como el potencial electrostático en el plano de cizallamiento 20, y se calcula a partir de velocidades de las partículas a medida que atraviesan un poro 19. mediciones de potencial zeta de las partículas individuales de este modo da una idea de los mecanismos y comportamiento de los sistemas de nanopartículas en solución, información valiosa para el futuro de los diseños de ensayo de nanopartículas para una gama de aplicaciones de translocación. análisis de partículas por partícula de tal naturaleza también permite la propagación y la distribución de los valores de potencial zeta entre una población de muestra para ser explorado, lo que permite más información ocinética de la reacción n (monocatenario a ADN de doble cadena, por ejemplo) y estabilidades de partículas en solución que hay que alcanzar.

A continuación, describimos una técnica que detecta y caracteriza a ambas superficies modificadas y no modificadas de ADN SPP. El protocolo descrito en el presente documento es aplicable a una gama de nanopartículas inorgánicas y biológicas, pero se demuestra el procedimiento de uso de superficies de ADN modificado debido a su amplia gama de aplicaciones. La técnica permite al usuario distinguir entre dianas de ADN de una sola hebra y de doble cadena en una superficie de las nanopartículas, basado en las velocidades de translocación de partículas a través de un sistema de poros y por lo tanto sus potenciales zeta.

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Protocol

1. Hacer la solución tampón fosfato con Tween-20 (PBST) Buffer

  1. Disolver un comprimido de PBS (tampón fosfato 0,01 M, 0,0027 M cloruro de potasio, 0,137 M de cloruro de sodio, pH 7,4) en 200 ml de agua desionizada (18,2 mO cm).
  2. Añadir 100 ml (0,05 (v / v)%) de Tween-20 a la solución 200 ml de tampón como un agente tensioactivo.

2. Preparación de las Normas de partículas de poliestireno carboxilo

  1. Vortex las partículas de calibración para 30 segundos antes de la sonicación durante 2 minutos a 80 vatios para crear monodispersidad de las partículas.
  2. Diluir las partículas de calibración 1 en 100 a una concentración de 1x10 10 partículas / ml en tampón PBST y agitar durante 30 seg.

3. Preparación de partículas recubiertas con estreptavidina

  1. Vortex las partículas durante 30 segundos antes de la sonicación durante 2 minutos a 80 vatios para asegurar monodispersidad.
  2. Diluir las partículas recubiertas con estreptavidina 1 en 100 en tampón PBST para achieve como resultado una concentración de 1x10 9 partículas / ml y agitar durante 30 segundos.
    Nota: Un volumen de muestra típica es de 200 l. Por ejemplo, si la investigación de cinco concentraciones de ADN se preparan 1 ml de partículas recubiertas con estreptavidina diluidas.

4. Preparación de oligonucleótidos

  1. Reconstituir oligonucleótidos con agua desionizada a una concentración resultante de 100 mM.

5. La adición de ADN de captura de sonda (CP) a las partículas recubiertas con estreptavidina

  1. Antes de la unión a ADN, vórtice las partículas recubiertas con estreptavidina (200 l de volumen de la muestra) durante 30 segundos seguido de un tratamiento con ultrasonidos 2 min a 80 vatios.
  2. Sobre la base de la capacidad de unión proporcionada por el proveedor (4352 pmol / mg), añadir la concentración apropiada de ADN a las partículas para las concentraciones resultantes de, DNA 10, 20, 30, 40, 47 95, 140, y 210 nM.
  3. Vortex las muestras durante 10 segundos y colocar en una rueda giratoria a temperatura ambientedurante 30 min para permitir el ADN se una a las superficies de las partículas a través de una interacción de estreptavidina-biotina.
  4. Una vez que el ADN de captura se ha añadido y se incubaron con las partículas recubiertas con estreptavidina, eliminar el exceso de ADN en solución a través de la separación magnética mediante la colocación de las muestras sobre una rejilla magnética durante 30 min.
  5. Eliminar el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar el clúster recién formado de partículas más cercanos al imán, y reemplazar con el mismo volumen de tampón PBST nueva.

6. Hibridación de ADN complementario al CP-partículas

  1. Añadir la cantidad requerida de ADN diana (en exceso a 500 nm) para asegurar el objetivo máximo posible la unión fue alcanzado.
  2. Vortex las muestras durante 10 segundos y colocar en una rueda giratoria a temperatura ambiente durante 30 min.
  3. Una vez que la hibridación es completa, eliminar el exceso de ADN diana mediante separación magnética mediante la colocación de las muestras sobre una rejilla magnética durante 30 minutos.
  4. Eliminar el sobrenadante, Teniendo cuidado de no alterar el clúster recién formado de partículas más cercanos al imán, y reemplazar con el mismo volumen de tampón PBST nueva.
  5. Repetir los pasos 6.1 a 6.4 para muestras duplicadas y colocar estas muestras en una rueda giratoria a temperatura ambiente durante 16 horas para investigar tiempos de hibridación de ADN.

7. Configuración TRPS

  1. Enchufe el instrumento en un sistema informático con el software en su lugar.
  2. Calibrar el tramo inicial utilizando un calibrador.
    1. Medir la distancia entre la parte exterior de dos mordazas paralelas.
    2. De entrada en el software escribiendo el estiramiento en el campo 'estiramiento' en la pestaña "Configuración del instrumento" y hacer clic en "Calibrar tramo 'debajo de la lengüeta.
  3. ajustarse lateralmente una membrana de poliuretano nanoporos de dimensionamiento adecuado para el análisis en las mandíbulas con el número de identificación de nanoporos hacia arriba. A continuación, se extienden las mordazas para el estiramiento necesario para el análisis utilizando lamanija de ajuste de estiramiento en el lado del instrumento. Estirar las mandíbulas entre 43 y 48 mm.
    Nota: El valor exacto de la recta se determina junto con la tensión aplicada de modo que los bloqueos de partículas de calibración son al menos 0,3 nA en tamaño. El tramo ya se introduce en el software en el paso 7.2 y ajustará automáticamente a medida que las mandíbulas se estiran.
  4. Colocar 80 l de tampón PBST en la celda de fluido inferior, debajo de la nanoporos, asegurando que no hay burbujas presentes que pueden afectar a la medición. Si hay burbujas vistos, remover y reemplazar el tampón.
  5. Haga clic en la celda de fluido superior en su lugar y colocar 40 l de tampón en ella, asegurando de nuevo que no hay burbujas presentes. Si hay burbujas presentes en la célula fluido superior, eliminarlos mediante la sustitución del líquido.
  6. Cuando una corriente de línea de base reproducible se ha alcanzado de la sustitución de la célula de fluido superior con tampón, añadir 40 l de la muestra a la celda de fluido superior y la medida haciendo clic 'starte "de la pestaña" Adquisición de datos "en la pantalla del software.
    Nota: La adquisición de datos se completa con una frecuencia de 50 kHz con límite de una magnitud bloqueo inferior de 0,05 nA, aunque esto puede ser alterado mediante el software a través de la pestaña "Análisis de Datos" (bajo "Configuración de análisis" y "resistente bloqueos ') .
  7. Colocar una jaula de Faraday sobre la parte superior del sistema de pila de fluido para reducir el ruido de fondo eléctrico en las mediciones.
  8. Utilice un módulo de presión variable (VPM) para aplicar una presión o vacío a las muestras.
    1. Para aplicar una presión externa conectar la boquilla a la celda de fluido superior, a continuación, girar el brazo de presión y haga clic en su lugar (dependiendo de si se aplica una presión positiva (PRE) o un vacío (VAC)).
    2. Aplicar presión en un 'cm' o la escala "mm" con el mando de nivel de presión situado en la parte superior de la VPM. Presione el botón de abajo para aplicar presión sobre la escala 'cm' y tire de él hacia arriba to aplicar presión en la escala de "mm".

8. Preparación de muestras para el análisis de TRPS

  1. muestras de vórtice durante 30 segundos y se somete a ultrasonidos durante 2 minutos a 80 vatios antes del análisis TRPS.

9. Calibración de la nanoporos para el Análisis Zeta

  1. Después de colocar 40 l partículas de calibración (1x10 10 partículas / ml) en la célula fluido superior, completar una medición TRPS (instalación como en la sección 7) a las 3 tensiones aplicadas. Alterar el voltaje haciendo clic en los botones "+" y "-" situados en la escala de tensión en la pestaña "Configuración del instrumento" en el software.
  2. Compruebe que las 3 tensiones vuelven corrientes de fondo de aproximadamente 140, 110 y 80 nA. Asegúrese de que en la media tensión las partículas de calibración producen una magnitud media bloqueo de al menos 0,3 nA.
  3. Aplicar una presión por lo que el promedio de ancho total a media altura (FWHM) duraciones de las partículas de calibración son, al menos,0,15 mseg. Hacer esto de forma manual mediante el brazo de presión unida al módulo de presión variable. Seleccione la presión (PRE) o vacío (VAC) haciendo girar el brazo hasta que encaje en la posición deseada y aplicar en consecuencia siguiente configuración instrucciones en el paso 7.8.2. Una vez que se han alcanzado estas condiciones, iniciar el proceso haciendo clic en "inicio" en el software en la pestaña 'Adquisición de Datos'.
  4. Completar la ejecución pulsando 'parada' en la pestaña 'Adquisición de Datos "cuando al menos 500 partículas se han medido (ver" El recuento de partículas' en la parte inferior de la pantalla del software durante la medición) y la carrera ha superado los 30 segundos (ver " Run Time 'también hacia la parte inferior de la pantalla).
  5. Calibrar el sistema completando una fase de calibración como se describe cada vez que se introduce un nuevo nanoporos o para cada nuevo día de análisis por parte de completar el paso 9.1-9.4.

10. La ejecución de una Muestra

  1. Ejecutar las muestras al más alto osegundo voltaje más alto que las muestras de calibración a garantizar un similar (± 10 nA), si no la misma corriente, la línea de base.
    1. Una vez que se consigue la corriente de base de referencia, sustituir el electrolito en la celda de fluido superior con 40 l de muestra. Cuando se introduce una muestra, los bloqueos se pueden ver en la traza de la señal. Comience la muestra ejecutar haciendo clic en "Inicio" en la pestaña "Adquisición de Datos 'y registrar un mínimo de 500 partículas (marque' recuento de partículas 'situado debajo de la traza de la señal) y asegurar el tiempo de ejecución es de un mínimo de 30 segundos (véase" Ejecutar tiempo también situada por debajo de la traza de la señal).
    2. Para completar la medición, haga clic en "stop" en la pestaña "Data Acquisition" y guardar el archivo de datos.
  2. Para guardar el archivo, introduzca la información del archivo en el siguiente formato; 'Investigación' es la carpeta del archivo se guardará en "nanoporos ID 'es el número de serie del poro siendo utilizado,' Parte # 'iEs el tipo de poros (es decir, NP150 / NP200), 'ID de la muestra' es el nombre de la muestra, 'calibración o de la muestra' detalles sobre si se trata de una calibración o muestra de medición, "dilución" se utiliza si se diluyó la muestra ( escriba 100 si la muestra se diluyó 100 veces), "presión" es la presión aplicada a la muestra (en cm - ver sección 7.8), 'el electrolito ID' es el nombre de la memoria intermedia de la muestra se compone de, y ' notas 'son las notas personales sobre la muestra o correr.
  3. Entre cada muestra de ejecución, se lava el sistema mediante la colocación de 40 l de PBST tampón en la célula fluido superior varias veces y la aplicación de varias presiones (generalmente a -10, -5 cm (de vacío), y 5 y 10 cm (presión positiva)) hasta hay más eventos de bloqueo están presentes, asegurando que no hay partículas residuales que quedan en el sistema y, por tanto, no haya contaminación cruzada entre las muestras. muestras por triplicado con este paso de lavado completado entre cada repetición de la muestra se ejecutan como well como entre diferentes muestras.

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Representative Results

Figura 1
Figura 1. Representación esquemática de los procesos de purificación magnética y una medición TRPS. A) Ejemplo de purificación magnética de la muestra a partir de una muestra que contiene exceso, sin unir ADN sonda de captura. B) TRPS ejemplo de medición i) de partículas que pasa por el nanoporos y ii) evento bloqueo producido a partir de partículas de iones de oclusión temporal en el poro que causa una disminución temporal en la corriente; Información que se utiliza para calcular las velocidades de translocación de partículas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La eliminación de cualquier exceso de ADN que no se ha unido a la superficie de las partículas de las muestras es importante antes del análisis TRPS, para no informar de cualquierResultados de 'falsos positivos'. La capacidad de utilizar un imán para extraer y lavar los SPPs es un gran beneficio para TRPS (Figura 1A). La figura 1B describe un ejemplo básico de una medición TRPS y un ejemplo "evento bloqueo 'alcanzado como una partícula atraviesa el poro. En primer lugar, hemos demostrado que TRPS es una técnica de alto rendimiento que puede distinguir entre muestras de un tamaño similar, pero de una carga considerablemente diferentes. Su capacidad para completar tanto el tamaño y la carga de análisis de forma simultánea en una sola medición se puede ver en la Figura 2. La Figura 2 es un ejemplo de un tamaño) y b) análisis del potencial zeta de estreptavidina partículas recubiertas sin modificaciones (luz del conjunto de datos de color rosa) y partículas recubiertas con estreptavidina saturados con el ADN de una sola cadena en la superficie (conjunto de datos azul). Aunque ambas muestras eran de un tamaño similar, el potencial zeta fue significativamente diferente y mucho más grande cuando el ADN fue functionalized sobre la superficie de la partícula.

Figura 2
Figura 2. El tamaño y el análisis del potencial zeta de las nanopartículas de ADN ha sido modificado y no modificado con estreptavidina revestido. Las barras de color rosa claro representan partículas recubiertas de estreptavidina no modificadas y las barras azules representan las partículas de ADN ha sido modificado. A) Frecuencia (%) vs diámetro de partícula (nm). B) Frecuencia (%) vs potencial zeta (mV). Figura adaptada de datos suplementarios en Blundell et al. 19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

No sólo puede diferenciar la técnica entre las partículas no modificados y modificados con el ADN, TRPS también puede diferenciar entre muestras con diferentes concentraciones de ADN hibrida con el partículo superficie. La Figura 3 muestra el tamaño y la zeta de datos posibles exhibidas en las muestras con el más bajo (10 nm, de conjuntos de datos de color verde claro) y la más alta concentración de ADN hibridado con las partículas recubiertas con estreptavidina (210 nm, conjunto de datos azul). Un valor potencial zeta mayor se registra para las partículas hibridadas con una mayor concentración de ADN.

figura 3
Figura 3. tamaño simultánea y datos de potencial zeta capturadas desde una sola medición TRPS. Los azules bares / puntos de datos son representativos de las partículas recubiertas con estreptavidina hibridada con 210 nM de ADN CP y las barras de color verde claro / puntos de datos representan las partículas recubiertas con estreptavidina hibridados con ADN CP 10 nM. Figura adaptada de Blundell et al. 19. Haga clic aquí para veruna versión más grande de esta figura.

Es útil señalar que cada punto de datos en el gráfico de dispersión representa una sola partícula entre una población de muestra, lo que permite en profundidad el análisis de partículas por partículas con cada muestra. La figura 4 es compatible con la eficacia de la técnica en la determinación de los cambios de menor importancia en la estructura del ADN ( objetivos vinculantes de una sola hebra y de doble cadena de ADN), así como la identificación de las diferencias en las muestras con ADN diana del mismo tamaño, pero unido a un área diferente de la sonda de captura que demuestra los altos niveles de sensibilidad (es decir, de unión a medio y al final muestran en la Figura 4). Las partículas mostradas en la Figura 4 son los que tienen las siguientes modificaciones de la superficie, de izquierda a derecha; sonda de captura (CP) sólo el ADN, CP y una diana de ADN totalmente complementarias, CP y una diana de ADN vinculante media, CP y un objetivo final la unión al ADN, CP y una diana de ADN en voladizo.


. Figura 4. Cambio relativo en el potencial zeta medido para partículas de ADN modificado con una gama de dianas de ADN cambio en el potencial zeta, en mV, desde i) CP funcionalizado de partículas a una gama de dianas de ADN; ii) totalmente complementaria, iii) la unión Media, iv) End de unión, diana v) sobresaliente. Las barras de error representan la desviación estándar en el que n = 3. Figura adaptada de Blundell et al. 19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El cálculo para el potencial zeta utiliza un método basado calibración relacionados con el trabajo por Arjmandi et al. 21. La duración de la translocación de las partículas a medida que atraviesan un nanopore se mide como una función de la tensión aplicada, utilizando un campo y de partículas promedio de las velocidades eléctricos sobre la totalidad de un poro cónica regular. La movilidad electroforética es el derivado de 1 / T (donde T es la duración del bloqueo) con respecto al voltaje, multiplicado por el cuadrado de la longitud de la zona de detección, l. velocidades medias en múltiples puntos de referencia a través de la zona de detección se miden para permitir un mínimo de errores en el cálculo de potencial zeta usando este método.

La calibración del poro se basa en la linealidad de 1 / T vs voltaje, V, en cada punto de referencia en la zona de detección. Las velocidades de las partículas electrocinética de partículas de calibración y la muestra,carga / 54577 / 54577eq2.jpg "/> y Ecuación 3 respectivamente, están relacionados con sus potenciales zeta, Ecuación 4 y Ecuación 5 , Como se muestra en la ecuación 1, suponiendo una relación lineal entre los dos tal como se indica en la aproximación de Smoluchowski 12,20. Los valores del potencial zeta netos tanto para la calibración y la muestra son las diferencias en el potencial zeta de las partículas y el potencial zeta de la membrana, Ecuación 6 . El potencial zeta del poro de poliuretano se midió utilizando la transmisión de técnicas potenciales 12,18 como -11 mV en PBS para este estudio.

Ecuación 7 (1)

El potencial zeta de cada partícula individual, i, Ecuación 8 es la posición de la partícula dentro del poro después del tiempo, t = T x, y Ecuación 10 es la velocidad de la partícula de la partícula única muestra i en posiciones relativas l x; Ecuación 12 , Ecuación 14 , P, y V son la velocidad electrocinética por voltaje de la unidad, la velocidad convectiva por presión de la unidad, la presión aplicada y el voltaje para el ejemplo se ejecuta respectivamente, una derivación completa de esta ecuación se puede encontrar en el trabajo por Blundell et al. 19.

Ecuación 16

Cuando la unión del ADN sonda de captura de las nanopartículas recubiertas con estreptavidina, es vital que el investigador elimina el exceso, sin unir ADN sonda de captura que queda en solución. Esto se realiza fácilmente utilizando la SPPs y un imán simple que permite la sustitución rápida y fácil del sobrenadante con nuevo tampón PBST. Si el exceso de ADN de captura se queda en solución y el ADN diana añadió, el ADN diana se puede unir al ADN de captura libre en solución, en lugar de que en la superficie SPP. sólo se observó un cambio en la velocidad de la partícula y el potencial zeta si el ADN diana se une a la sonda de captura presente en la superficie de la partícula.

Análisis y comparación de un gran número de muestras a través de muchos días utilizando TRPS puede requerir el uso de más de una membrana de poro. Algunos poros pueden tener algunas pequeñas diferencias en su tamaño debido al proceso de fabricación y, en estos casos, el usuario debe asegurarse de la corriente de línea de base sigue siendo idéntica en todos runs. Si se observa la misma corriente de referencia, los resultados obtenidos son comparables entre los poros. Una vez que la línea de base es la misma que las ejecuciones anteriores, es imprescindible que el usuario mantiene el tramo sin cambios entre la calibración y la muestra se ejecuta para permitir la determinación exacta de las velocidades de translocación de partículas a medida que atraviesan el poro.

La tecnología TRPS tiene un conjunto relativamente simple, lo que puede ser desmontado fácilmente y rápidamente durante un experimento. Si la solución de problemas, esto puede hacer que el proceso sea mucho más fácil. Por ejemplo, es importante no permitir que las burbujas en la celda de fluido inferior o célula fluido superior al llevar a cabo el análisis. Esto dará lugar a una corriente de línea de base inestable. Si hay burbujas presentes en la célula fluido superior, la muestra puede ser removido y reemplazado. Si aparecen burbujas en la celda de fluido inferior, la memoria intermedia debe ser eliminado y reemplazado con tampón fresco. Si las burbujas son un problema persistente, entonces no puede ser demasiado surfactanteen la solución por lo que este puede tener que ser reducido 16 (que sólo usar 0,05% de Tween-20). Algunas muestras pueden bloquear el poro si su tamaño supera el tamaño de poro o si la concentración de la muestra es demasiado alto. Para rectificar esto, el tamaño de poro se puede aumentar aumentando el estiramiento o la muestra puede ser diluida a una concentración de partículas inferior 16. Para el análisis de partículas individuales, la muestra también puede bloquear el poro si hay una gran cantidad de grandes agregados presentes, es importante vórtice y someter a ultrasonidos la muestra antes de ejecutarlo a través de TRPS.

Entre otros métodos, TRPS tiene varias ventajas, incluyendo la capacidad para completar las mediciones de tamaño y carga de las partículas individuales de forma simultánea; permitiendo muestras multimodales a analizar con eficacia el uso de este método. Una ventaja es la relación señal / bloqueos producidos pueden ser optimizados en minutos para una muestra particular, simplemente cambiando el estiramiento y la tensión para obtener una magnitud bloqueo, Δ </ Em> Ecuación 1 , Significativamente mayor que el ruido de fondo (bloqueos son de escala nA en comparación con el ruido de fondo <10 pA). Ser capaz de alterar el tramo de la poros hace que el método más versátil sobre las técnicas de poro de estado sólido como el tamaño de los poros se puede ajustar con respecto al tamaño del analito en cuestión; particularmente útil en la investigación de efectos tales como la agregación y vinculante que puede dar lugar a tamaños de analitos que exceden el rango original de tamaño de poro de estado sólido de ADN-proteína. Otro aspecto ventajoso de TRPS es el nivel de sensibilidad de la técnica. La capacidad para detectar diferencias sutiles en el ADN de unión (donde se ha añadido la misma cantidad de ADN (la misma cantidad de carga añadida) y las muestras son del mismo tamaño) en base a la posición de unión de ADN diana es bastante profunda en esta zona de análisis y será de gran utilidad para futuras plataformas de diseño de nanopartículas-ensayo. Cada sutil difierenENCE puede ser detectado y aislado utilizando una naturaleza de partícula por partícula de la tecnología TRPS. Este análisis es superior a la de las técnicas de conjunto tales como la dispersión dinámica de la luz o espectroscopia de correlación de fotones que simplemente se calibrar un promedio de la población de la muestra analizada y no puede diferenciar en los casos de muestras multimodales 6,7.

Nanoporos de estado sólido pequeños (100-200 nm) también se han utilizado para controlar la dinámica de partículas y han encontrado que la movilidad de las partículas puede ser afectada como el diámetro de la partícula comienza a acercarse a la de la nanopore 22,23. Nanoporos mucho más grandes que las partículas que están siendo analizadas (tal como se utiliza en este estudio) tienen menos de un efecto sobre la movilidad de las partículas y por lo tanto la dinámica de translocación dentro del poro. Los poros utilizados en este estudio están sin embargo limitados a sus intervalos de tamaño de analito, una NP150 por ejemplo, tiene un intervalo de tamaño de 60 a 480 nm de modo que si una muestra multimodal consistía en partículas dentro y que exceda estelímite, que no puede ser analizada en el mismo poro poro continuación, se pueden bloquear. También es importante tener en cuenta que la medición de una muestra bimodal que contiene 60 y 480 partículas nm (aquellos en absolutos de los límites inferior y superior del poro), por ejemplo, requerirá diferentes condiciones de estiramiento y de tensión, aunque ambos están dentro del rango de análisis de tamaño de del poro. Esto es porque el estiramiento requerido para las partículas más grandes se traducirá en las partículas más pequeñas que tienen un particularmente pequeño magnitud bloqueo (basado en la resistencia reducida) que podrían ser considerados como ruido de fondo y por lo tanto no necesariamente medidos durante una carrera de la muestra.

Las burbujas pueden ser un problema con las medidas de la muestra en forma de burbujas en la celda de fluido inferior o superior creará una corriente de línea de base inestable, a la que no se puede completar carreras de muestra. Los electrolitos de carácter efervescente (algunos medios biológicos altamente concentradas, por ejemplo) pueden ser difíciles de ejecutar y por lo tanto las muestras requiring suspensión en estos medios específicos puede resultar problemática. Sin embargo la mayoría de las muestras, pueden ser muy diluida o suspendida en tampones alternativos antes del análisis TRPS.

El método es adaptable y puede ser utilizado para analizar una amplia gama de analitos basados en nanopartículas, incluyendo el análisis de proteínas, ADN, moléculas pequeñas, ensayos de agregación 17,24 y partículas biológicamente relevantes. La versatilidad de TRPS en la caracterización de una amplia gama de analitos muestra las técnicas potenciales en una variedad de áreas tales como la administración de fármacos 1,25, biosensores 26-28, y pruebas ambientales.

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Disclosures

ELCJB se apoya en Izon Science Ltd.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Izon Science Ltd por su apoyo. El trabajo fue apoyado por la Comisión Europea para la Investigación (PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered Saline (PBS) Sigma Aldrich, UK P4417 1 tablet dissolved in 200 ml deionized water to make buffer solution.
Tween-20 Sigma Aldrich, UK P1379 0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles Bangs Laboratories, US CPC200 Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1 x 1012 particles/ml, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2 x 1019 C/nm2.
Streptavidin coated nanoparticles Ademtech, France 3121 Batch had binding capacity of 4,352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1 x 1011 particles/ml.
Biotinylated oligonucleotides Sigma Aldrich, UK VC00001 Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides Sigma Aldrich, UK VC00001 Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano Izon Science, NZ Inherent pressure on system of 47 Pa
Izon Variable Pressure Module (VPM) Izon Science, NZ Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 100 Pa.
Polyurethane nanopore membranes Izon Science, NZ NP150 Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch. 
Magrack 6 GE Healthcare, UK 28-9489-64
Sonic Bath Fisher Scientific, UK 10692353 80 Watts
Vortexer IKA, Germany 0003365000
Rotary Wheel  Labnet International, US H5500-230 V

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References

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Bioingeniería No. 116 biosensores TRPS Nanopore potencial zeta el ADN las partículas superparamagnéticas
Determinación del Potencial Zeta a través de nanopartículas de translocación velocidades a través de un sintonizable nanoporos: El uso de partículas de ADN modificado como ejemplo
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