Summary
Här använder vi en polyuretan avstämbar nanopore integreras i en resistiv puls avkänningsteknik för att karaktärisera nanopartiklar ytkemi via mätningen av partikelslokahastigheter, som kan användas för att bestämma zeta-potentialen för individuella nanopartiklar.
Abstract
Nanopore teknik, som tillsammans benämns Resistiva pulssensorer (RPS), som används för att upptäcka, kvantifiera och karaktärisera proteiner, molekyler och nanopartiklar. Avstämbara resistiv pulsanalys (TRPS) är en relativt ny anpassning till RPS som innehåller en avstämbar por som kan ändras i realtid. Här använder vi TRPS att övervaka sloka tider av DNA-modifierade nanopartiklar när de korsar den avstämbara pore membranet som en funktion av DNA-koncentration och struktur (dvs enkelsträngat till dubbelsträngad DNA).
TRPS bygger på två Ag / AgCl elektroder, åtskilda av ett elastomer por membran som etablerar en stabil jonström på ett pålagt elektriskt fält. Till skillnad från olika optiska baserad partikelkarakteriseringstekniker, kan TRPS karaktärisera individuella partiklar bland en provpopulation, vilket möjliggör multimodala prover som skall analyseras med lätthet. Här visar vi Zeta-potential mätningarvia partikelslokahastigheter av kända standarder och tillämpa dessa på provanalytet transloka gånger, vilket resulterar i att mäta zeta-potentialen för dessa analyter.
Samt förvärva medelzetapotential värden proverna alla mäts med en partikel-by-partikel perspektiv uppvisar mer information om ett givet prov genom provbefolkningsfördelningar, till exempel. Sådan, visar potential inom sensorapplikationer för både medicinska och miljöområdet denna metod.
Introduction
Funktionaliserade nanopartiklar blir allt populärare som biosensorer i både medicinska och miljöområdet. Förmågan att förändra en nanopartikel yta kemi, med DNA, till exempel, har visat sig användbara för målinriktade läkemedelsadministreringssystem 1 och övervaknings DNA-proteininteraktioner 2-4. En allt vanligare nanopartiklar egendom som används i bioanalyser och leverans av läkemedel är superpara 5. Superparamagnetiska partiklar (SPPS) är mycket användbara för att identifiera och ta bort specifika analyter från komplexa blandningar och kan göra det med den enkla användningen av en enda magnet. Efter uttagningen de analytbundna partiklar kan karakteriseras och analyseras passar för ändamålet.
Tidigare förfaranden som används för detektion och karakterisering av nanopartiklar inkluderar optiska tekniker såsom dynamisk ljusspridning (DLS), annars känd som fotonkorrelationsspektroskopi. Även om en high genomströmning teknik, är DLS begränsad till att vara en medelvärdes baserad teknik och vid analys av multimodala prover utan tillsats av specialiserade program, kommer de större partiklarna producera en mycket mer dominerande signal, lämnar några av de mindre partiklarna helt obemärkt 6,7. Partikel-by-partikelkarakteriseringstekniker är därför mycket mer fördelaktigt att analysera nanopartiklar och funktionnanopartiklar system.
RPS baserad teknik är uppbyggd kring att applicera ett elektriskt fält till ett prov och övervakning av transportmekanismen av partiklarna genom en syntetisk eller biologisk nanopore. En relativt ny nanopartikel upptäckt och karakterisering teknik baserad på RPS är avstämbar resistiv pulsanalys (TRPS) 8-16. TRPS är en två-elektrodsystem åtskilda av en elastomer, avstämbara por membran. En avstämbar por metod möjliggör analyter av en rad form 17 och storlek som skall mätas via deras transmekanismer hamn genom poren. Avstämbara porer har tidigare använts för detektering av små partiklar (70-95 nm i diameter) som producerar jämförbara resultat till andra tekniker såsom transmissionselektronspektroskopi (TEM) 10. När ett elektriskt fält anbringas, är en jonisk ström observeras och som partiklar / molekyler passerar genom poren, de tillfälligt blockera poren, vilket orsakar en minskning av den ström som kan definieras som en "blockad händelse". Varje blockad händelse är representativ för en enda partikel, så att varje partikel i ett prov kan karakteriseras individuellt utifrån blockaden storlek, Δ 
Och full bredd halv-maximum, FWHM, liksom andra blockad egenskaper. Analysera enskilda partiklar när de passerar genom en nanopore är fördelaktigt för multimodala prover såsom TRPS framgångsrikt och effektivt kan urskilja en rad partikelstorlekar amonGST ett enda prov. Avstämbara resistiv puls avkänning avslutar storlek 10, zeta-potential 12,18 och koncentration 15 mätningar samtidigt i en enda körning och kan därför fortfarande skilja prover av liknande, om inte samma storlek genom deras ytladdning 19; en fördel gentemot alternativa limningsmetoder.
Zeta-potential definieras som den elektrostatiska potentialen vid planet för skjuvning 20, och beräknas från partikelhastigheter som de korsar en por 19. Zeta-potential mätningar av enskilda partiklar ger således inblick i transloka mekanismer och beteende nanopartiklar system i lösning, värdefull information för framtidens nanopartiklar analys designs för en rad olika tillämpningar. Partikel-by-partikelanalys av sådan art gör det också möjligt för spridning och distribution av zetapotentialen värden bland en provpopulation som skall undersökas, vilket möjliggör mer information on reaktionskinetik (enkelsträngade till dubbelsträngat DNA, till exempel) och partikel stabiliteter i lösning som skall uppnås.
Här beskriver vi en teknik som upptäcker och karakteriserar både omodifierade och DNA-modifierade SPP ytor. Protokollet som beskrivs häri kan tillämpas på en rad olika oorganiska och biologiska nanopartiklar, men vi visar det förfarande med användning av DNA-modifierade ytor på grund av deras breda spektrum av tillämpningar. Tekniken gör det möjligt för användaren att skilja mellan enkelsträngade och dubbelsträngade DNA-mål på en nanopartikel yta, som baseras på partikelslokahastigheter genom ett porsystem och därmed deras z-potentialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Att göra den fosfatbuffrade saltlösning med Tween-20 (PBST) Buffert
- Lös upp en PBS-tablett (0,01 M fosfatbuffert, 0,0027 M kaliumklorid, 0,137 M natriumklorid, pH 7,4) i 200 ml avjoniserat vatten (18,2 MQ cm).
- Tillsätt 100 | il (0,05 (vol / vol)%) Tween-20 till 200 ml buffertlösning som ett ytaktivt medel.
2. Förbereda Karboxyl polystyrenpartikel Standards
- Vortexa kalibreringspartiklar för 30 sek före sonikering under 2 min vid 80 watt för att skapa monodispersitet av partiklarna.
- Späd kalibreringspartiklarna en i 100 till en koncentration av 1x10 10 partiklar / ml i PBST-buffert och skaka i 30 sekunder.
3. Förberedelse Streptavidin belagda partiklarna
- Vortexa partiklar för 30 sek före sonikering under 2 min vid 80 watt för att säkerställa monodispersitet.
- Späd de streptavidinbelagda partiklar 1 i 100 i PBST-buffert till achieve en resulterande koncentration av 1x10 9 partiklar / ml och skaka i 30 sekunder.
Obs: Ett typiskt provvolym är 200 l. Till exempel om att undersöka fem DNA-koncentrationer förbereda 1 ml utspädda streptavidinbelagda partiklar.
4. Framställning av oligonukleotider
- Rekonstituera oligonukleotider med avjoniserat vatten till en resulterande koncentration av 100 ^ M.
5. Tillsats av infångningsprob (CP) DNA till de streptavidinbelagda Partiklar
- Före DNA-bindning, virvel de streptavidinbelagda partiklar (200 | il provvolym) för 30 sek, följt av en 2 min sonikering på 80 watt.
- Baserat på den bindningskapacitet som tillhandahålls av leverantören (4352 pmol / mg), tillsätt lämplig koncentration av DNA till partiklarna för resulterande koncentrationer av 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140, och 210 nM DNA.
- Vortexa proverna för 10 sek och placera på ett roterande hjul vid rumstemperaturunder 30 min för att möjliggöra för DNA att binda till partikelytorna via en streptavidin-biotin-interaktion.
- När väl infångnings DNA har tillsatts och inkuberades med de streptavidinbelagda partiklar, ta bort överskottet DNA i lösning via magnetisk separation genom att placera proverna på en magnetställning under 30 min.
- Avlägsna supernatanten, noga med att inte störa den nybildade kluster av partiklar närmast magneten och ersätt med samma volym ny PBST-buffert.
6. hybridiserande Kompletterande DNA till CP-partiklarna
- Tillsätt erforderlig mängd mål-DNA (i överskott på 500 nM) för att säkerställa högsta möjliga målbindande uppnåddes.
- Vortex proverna för 10 sek och placera på ett roterande hjul vid rumstemperatur under 30 min.
- När väl hybridisering är klar, ta bort överskott av mål-DNA via magnetisk separation genom att placera proverna på en magnetställning under 30 min.
- Avlägsna supernatantenNoga med att inte störa den nybildade kluster av partiklar närmast magneten och ersätt med samma volym ny PBST-buffert.
- Upprepa steg 6,1-6,4 för duplikatprov och placera dessa prover på en roterande hjul vid rumstemperatur under 16 timmar för att undersöka DNA hybridiseringstider.
7. TRPS Setup
- Anslut instrumentet till en dator med programvara på plats.
- Kalibrera ursprunglig sträckning med användning av ett skjutmått.
- Mäta avståndet mellan utsidan av två parallella käftar.
- Ingång i programmet genom att skriva sträckan i "stretch" fältet i fliken "Instrument Settings" och klicka på "Kalibrera stretch" under fliken.
- Sidled passa en polyuretan nanopore membran av lämplig dimensionering för analys på käftarna med nanopore ID-numret uppåt. Sedan sträcka käftarna till sträckan som krävs för analys med hjälp avstretch justeringsställare på sidan av instrumentet. Sträck käftarna mellan 43 och 48 mm.
Obs: Det exakta värdet av sträckan bestäms vid sidan anbringad spänning så att kalibreringspartikel blockader är minst 0,3 nA i storlek. Sträckan är redan matas in i programmet i steg 7,2 och justerar automatiskt när käftarna är sträckta. - Placera 80 | il PBST-buffert i den nedre vätske cellen, under nanopore, vilket garanterar att det inte finns några bubblor närvarande som kan påverka mätningen. Om det finns bubblor sett, ta bort och ersätta bufferten.
- Klicka på den övre vätske cellen på plats och placera 40 pl buffert i det återigen att ingen ska bubblor. Om bubblor är närvarande i det övre fluid cell, ta bort dem genom att ersätta vätskan.
- När en reproducerbar baslinje strömmen har nåtts från att ersätta den övre vätske cellen med buffert, tillsätt 40 pl av provet till den övre vätske cellen och mått genom att klicka på stkonst "i" Data Acquisition "fliken på programmet skärmen.
Obs: Datainsamlings är klar med en frekvens på 50 kHz med en blockad storleksordning lägre gräns på 0,05 nA, även om detta kan ändras med hjälp av programvara via fliken "Analysera data" (under analys Inställningar "och" resistiv blockader) . - Placera en Faradays bur över toppen av fluidcellsystemet för att reducera effekterna av elektriska bakgrundsbruset på mätningarna.
- Använd en variabelt tryck modul (VPM) för att applicera ett tryck eller vakuum till proverna.
- Om du vill använda ett externt tryck ansluta munstycket till den övre vätske cellen, vrid sedan tryckarmen och klickar på plats (beroende på huruvida ett positivt tryck (PRE) eller ett vakuum (VAC) kommer att tillämpas).
- Utöva påtryckningar på en "cm" eller "mm" skala med hjälp av trycksteget ratten ligger på toppen av VPM. Tryck ner ratten för att utöva påtryckningar på "cm" skala och dra uppåt to utöva påtryckningar på "mm" skala.
8. Förbereda Prover för TRPS Analys
- Virvel prover för 30 sek och sonikeras under 2 min vid 80 watt före TRPS analys.
9. Kalibrera nanopore för Zeta analys
- Efter att ha placerat 40 pl kalibreringspartiklar (1x10 10 partiklar / ml) i den övre vätske cell, fyll en TRPS mätning (inställning som i punkt 7) på 3 tillämpad spänningar. Ändra spänningen genom att klicka på "+" och "-" knapparna på spännings skala i "Instrument Settings fliken på programvaran.
- Kontrollera att 3 spänningarna tillbaka bakgrundsströmmar cirka 140, 110, och 80 nA. Se till att vid mellanspänningskalibreringspartiklarna producera en genomsnittlig blockad storleken på åtminstone 0,3 nA.
- Applicera ett tryck så den genomsnittliga fullständiga bredd halv maximal (FWHM) löptider kalibreringspartiklarna är åtminstone0,15 ms. Gör detta manuellt med hjälp av tryckarmen fäst vid varierande tryck modulen. Välj tryck (PRE) eller vakuum (VAC) genom att vrida armen tills det klickar i det önskade läget och tillämpas i enlighet följande inrättas instruktioner i steg 7.8.2. När dessa villkor har uppnåtts, startar körningen genom att klicka på "start" på programvaran i fliken "Data Acquisition".
- Slutföra körningen genom att trycka "stopp" i fliken "Data Acquisition" när minst 500 partiklar har uppmätts (se 'Partikel Count' vid botten av programvaran skärmen under mätningen) och körningen har överskridit 30 sekunder (se ' Kör Time "också mot botten av skärmen).
- Kalibrera systemet genom att fylla i en kalibreringskörning som beskrivs varje gång en ny nanopore införs eller för varje ny dag av analys genom att fylla i steg från 9,1 till 9,4.
10. Köra ett prov
- Kör proverna på högsta ellernäst högsta spänning som kalibreringsproven till att säkerställa en liknande (± 10 nA), om inte samma, baslinjen ström.
- När den lämpliga baslinjeströmmen uppnås, ersätta elektrolyten i den övre fluid cell med 40 fil prov. När ett prov införs kommer blockader ses på signalspåret. Starta provet körs genom att klicka på "Start" i fliken "Data Acquisition" och spela minst 500 partiklar (se "Partikel Count" ligger under signalen spår) och se till att körtiden är minst 30 sekunder (se "Kör tid "ligger också under signalspår).
- För att slutföra mätningen, klicka på "stopp" i "Data Acquisition fliken och spara datafilen.
- Om du vill spara filen, mata in informationen filen i följande format; "Investigation" är den mapp filen sparas i "nanopore ID" är serienumret av porer som används, "Del # 'iär den typ av porer (dvs NP150 / NP200), är "Sample ID" namn av provet, kalibrering eller prov "detaljer om det är en kalibrering eller provmätning," Utspädning "används om provet späddes ( typ 100 om provet späddes 100-faldigt), är "Pressure" det pålagda trycket på provet (i cm - se avsnitt 7.8), är "Elektrolyt ID" namnet på bufferten provet består i, och " Anmärkningar "finns några personliga anteckningar om provet eller springa.
- Mellan varje provkörning, tvätta systemet genom att placera 40 pl PBST-buffert in i den övre fluid cellen flera gånger och att applicera olika tryck (vanligtvis vid -10, -5 cm (vakuum), och 5 och 10 cm (positivt tryck)) tills inga fler blockad händelser förekommer, vilket garanterar det inte finns några restpartiklar som finns kvar i systemet och därmed ingen korskontaminering mellan prover. Kör prover i tre exemplar med detta tvättsteg genomfördes mellan varje nytt prov körs som well mellan olika prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. Schematisk representation av processerna för magnetisk rening och en TRPS mätning. A) Exempel på magnetisk rening av provet med början med ett prov innehållande överskott, obundet infångningsprob-DNA. B) TRPS mätning exempel i) Partikel passerar genom nanopore och ii) Blockade händelse framställts av partikel temporärt ockludera joner i poren förorsakar en tillfällig minskning i nuvarande; Information från vilken används för att beräkna partikeltranslokahastigheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Avlägsnandet av eventuellt överskott av DNA som inte har bundit till partiklar ytan från proverna är viktigt före TRPS analys, för att inte rapportera alla"falskt positiva resultat. Möjligheten att använda en magnet för att extrahera och tvätta SPPS är en enorm fördel för TRPS (Figur 1A). Figur 1B beskriver en grundläggande exempel på en TRPS mätning och ett exempel "blockad händelse uppnås som en partikel passerar porerna. För det första har vi visat att TRPS är en hög genomströmning teknik som kan skilja mellan prover av en liknande storlek men av en avsevärt annorlunda laddning. Dess förmåga att slutföra både storlek och laddning analys samtidigt i en enda mätning kan ses i figur 2. Figur 2 är ett exempel på en) storlek och b) zetapotential analys av streptavidin belagda partiklar med några ändringar (ljusrosa datauppsättning) och streptavidinbelagda partiklar mättade med enkelsträngat DNA på ytan (blå datauppsättning). Även om båda proverna var av liknande storlek, zeta-potentialen var signifikant annorlunda och mycket större när DNA var functionalized på partikelns yta.
Figur 2. Storlek och Zeta potential analys av DNA-modifierad och omodifierad streptavidinbelagda nanopartiklar. De ljusrosa staplarna representerar omodifierade streptavidinbelagda partiklar och de blå staplarna representerar DNA-modifierade partiklar. A) Frekvens (%) jämfört med partikeldiameter (nm). B) Frekvens (%) vs zeta-potential (mV). Figur anpassad från tilläggsdata i et al. Blundell 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Inte bara kan tekniken skilja mellan partiklar omodifierade och modifierade med DNA, kan TRPS också differentiera mellan prover med olika koncentrationer av DNA hybridiserade till det nominellakel yta. Figur 3 visar storleken och zetapotentialen uppgifter uppvisade för prover med lägst (10 nm, ljusgrön datauppsättning) och den högsta (210 nM, blå datamängd) koncentrationer av DNA hybridiserade till streptavidinbelagda partiklar. Ett större zeta-potentialen värde registreras för partiklar hybridiserade med en högre koncentration av DNA.
Figur 3. Samtidig storlek och zetapotentialen data som samlats in från en enda TRPS mätning. De blå barer / datapunkter är representativa för streptavidinbelagda partiklar hybridiserade med 210 nM CP DNA och ljusgröna staplarna / datapunkter representerar streptavidinbelagda partiklar hybridiserade med 10 nM CP DNA. Figur anpassad från Blundell et al. 19. Klicka här för att seen större version av denna siffra.
Det är användbart att notera att varje datapunkt i spridningsdiagram representerar en enda partikel bland en provpopulation, vilket möjliggör djupgående partikel-för-partikelanalys med varje prov. Figur 4 stödjer tekniken effektivitet i att bestämma mindre förändringar i DNA-strukturen ( enkelsträngade och dubbelsträngade DNA), samt att identifiera skillnader i prover med mål-DNA av samma storlek, men bundet till en annan del av infångningsproben visar höga nivåer av känslighet (dvs USA bindande och end bindande mål visas i figur 4). Partiklarna som visas i figur 4 är de med de följande ytmodifieringar, från vänster till höger; infångningsprob (CP) endast DNA, CP och en helt komplementär DNA-mål, CP och en mitten bindande DNA-mål, CP och ett slut bindande DNA-mål, CP och en överhängande DNA-mål.
. Figur 4. Relativ förändring i zetapotential mättes för DNA-modifierade partiklar med ett område av DNA-mål Förändring av zeta-potential, mV, från i) CP funktionaliserad partikel till ett område av DNA-mål; ii) helt komplementär, iii) USA bindning, iv) end bindande, v) Utskjutande mål. Felstaplarna representerar standardavvikelsen där n = 3. Figur anpassad från et al. Blundell 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beräkningen för zetapotentialen används en kalibrerings baserad metod relaterad till arbete genom Arjmandi et al. 21. Varaktigheten av den translokation av partiklarna då de löpa en nanopore mäts som en funktion av pålagd spänning, med hjälp av en genomsnittlig elektriska fält och partikelhastigheter över helheten av en regelbunden konisk por. Den elektroforetiska mobiliteten är derivatan av en / T (där T är blockaden varaktighet) med avseende på spänning, multiplicerad med kvadraten på avkänningszonen längd, l. Genomsnittliga hastigheter på flera referenspunkter genom avkänningszonen mäts för att möjliggöra minimala fel i beräkningen av zetapotential med denna metod.
Kalibreringen av poren är baserad på lineariteten hos en / T vs spänning, V, vid varje referenspunkt i avkänningszonen. De elektrokinetiska partikelhastigheter av kalibrering och provpartiklar,upload / 54.577 / 54577eq2.jpg "/> och 
respektive, är relaterade till deras zetapotentialer, 
och 
, Såsom visas i ekvation 1, under antagande av ett linjärt samband mellan de två samma som angivits i Smoluchowski approximation 12,20. Netto Zeta-potential värden för både kalibrering och prov är skillnaderna i partikelzetapotential och membranzetapotential, 
. Zeta-potentialen för den polyuretan pore mättes med användning av strömmande potentiella tekniker 12,18 som -11 mV i PBS under denna studie.
(1)
Zeta-potentialen för varje individuell partikel, i, ![ekvation 8]("/files/ftp_upload/54577/54577eq8.jpg")
är positionen för partikeln i porerna efter gång, t = T x, och 
är partikelhastigheten av enstaka prov partikel i vid relativa positioner l x; 
, 
, P, och V är elektrokinetiska hastighet per enhet spänning, konvektiva hastigheten per enhetstryck, pålagt tryck och spänning för provet körs respektive en fullständig härledning av denna ekvation kan hittas i arbetet av Blundell et al. 19.
Vid bindning infångningsproben DNA till de streptavidinbelagda nanopartiklar, är det viktigt att forskaren tar bort överflödig, obundet infångningsprob-DNA kvar i lösning. Detta görs enkelt med hjälp av SPPs och en enkel magnet möjliggör snabb och enkelt byte av supernatanten med nya PBST-buffert. Om överflödigt capture DNA är kvar i lösning och mål-DNA tillsätts, mål-DNA kan binda till det fria infångnings DNA i lösning, i stället för att det på SPP ytan. En förändring i partikelhastigheten och zeta-potentialen kommer endast observeras om mål-DNA binder till infångningssonden är närvarande på partikelns yta.
Analys och jämförelse av ett stort antal prover på många dagar med TRPS kan kräva användning av mer än en por membran. Vissa porer kan ha vissa mindre skillnader i deras storlek på grund av tillverkningsprocessen och i dessa fall måste användaren se till baslinjen strömmen förblir identisk i alla runs. Om samma baslinje ström observeras, de erhållna resultaten är jämförbara mellan porer. När baslinjen är densamma som tidigare körningar, är det viktigt att användaren håller sträckan oförändrad mellan kalibrerings- och provkörningar för att möjliggöra noggrann bestämning av partikeltransloka hastigheter som de korsa porerna.
Den TRPS tekniken har en relativt enkel installation, som kan demonteras snabbt och enkelt under ett experiment. Om felsökning av problem, kan detta göra processen mycket enklare. Till exempel är det viktigt att inte tillåta några bubblor i den nedre vätske cell eller övre vätskecell när företaget analys. Detta kommer att leda till en instabil baslinjen ström. Om bubblor är närvarande i det övre fluid cellen, kan provet tas bort och ersättas. Om bubblor förekommer i den nedre vätskecell, bör bufferten avlägsnas och ersattes med färsk buffert. Om bubblorna är ett ständigt problem, då det kan vara för mycket tensidi lösningen så att detta kan behöva minskas 16 (vi bara använda 0,05% Tween-20). Några prover kan blockera porerna, om deras storlek är större än porstorleken eller om koncentrationen av provet är för hög. Att rätta till detta, kan porstorleken ökas genom att öka sträckningen eller provet kan spädas till en lägre partikelkoncentrations 16. För enkelpartikelanalys kan provet också blockera pore om det finns en hel del stora aggregat närvarande, är det viktigt att virvel och sonikera provet innan du kör den genom TRPS.
Bland andra metoder, har TRPS olika fördelar inklusive möjligheten att slutföra storlek och laddning mätningar av individuella partiklar samtidigt; möjliggör multimodala prover som ska analyseras effektivt med denna metod. En fördel är signal / blockader som produceras kan optimeras i minuter för ett visst prov genom att helt enkelt ändra sträckning och spänningen för att erhålla en blockad magnitud, Δ </ Em> , Betydligt större än bakgrundsbruset (blockad är av nA skala i jämförelse med bakgrundsbruset <10 pA). Att kunna förändra den sträcka av poren gör metoden mer mångsidig över solid-state pore tekniker som porstorleken kan justeras med avseende på storleken av analyten i fråga; särskilt användbart när man undersöker effekter såsom aggregering och DNA-proteinbindning som kan resultera i analyt storlekar över den ursprungliga solid-state porstorlek intervall. En annan fördelaktig aspekt av TRPS är nivån av känslighet från tekniken. Förmågan att detektera subtila skillnader i DNA-bindning (där samma mängd DNA har tillsatts (samma mängd tillsatt avgift) och proverna är av samma storlek) baserat på positionen av mål-DNA-bindning är ganska djupa i detta område i analys och kommer att vara till stor nytta för framtida nanopartikel-analys konstruktioner. Varje subtila skiljerhet kan detekteras och isoleras med användning av en partikel-för-partikel natur TRPS teknik. Denna analys högre än värdet av ensemble tekniker såsom dynamisk ljusspridning eller fotonkorrelationsspektroskopi som endast kommer att gage ett genomsnitt av provpopulationen analyseras och kan inte skilja i fallen med multimodala prover 6,7.
Små solid-state nanopores (100-200 nm) har också använts för att övervaka partikeldynamik och har funnit att partikel rörlighet kan påverkas som diametern på partikeln börjar närma sig den nanopore 22,23. Nanoporer mycket större än de partiklar som analyseras (som används i denna studie) har mindre effekt på rörligheten partikeln och därmed transloka dynamiken i porerna. Porerna används i denna studie är dock begränsade till sin analyt storleksintervall, ett NP150 till exempel har ett storleksintervall av 60-480 nm så om en multimodal Urvalet bestod av partiklar inom och överträffa dettagräns, kan de inte analyseras på samma porer som poren kan sedan blockeras. Det är också viktigt att notera att mäta en bimodal prov innehållande 60 och 480 nm partiklar (de på den absoluta lägre och högre gränser för por), till exempel, kommer att kräva olika stretch och spänningsförhållanden, även om båda är inom storleksanalys intervall av poren. Detta beror på att sträckan som krävs för de större partiklarna kommer att resultera i de mindre partiklar som har en särskilt liten blockad magnitud (baserad på minskat motstånd) som kan betraktas som bakgrundsbrus och således inte nödvändigtvis som uppmätts under en provkörning.
Bubblor kan vara ett problem med provmätningar som bubblor i den nedre eller övre vätskecell skapar en instabil baslinjen ström, till vilken provkörningar inte kan slutföras. Elektrolyter av en brus karaktär (vissa högkoncentrerade biologiska medier, till exempel) kan vara svårt att köra och därmed prover requiring suspension i dessa specifika medier kan vara problematiskt. De flesta prover kan dock kraftigt utspädd eller suspenderas i alternativa buffertar före TRPS analys.
Metoden är anpassningsbara och kan användas för att analysera en rad nanopartikelbaserade analyter, inklusive analys av proteiner, DNA, små molekyler, aggregeringsanalyser 17,24 och biologiskt relevanta partiklar. Mångsidigheten TRPS i karakterisera ett stort antal analyter visar teknikerna potential i en rad områden såsom drug delivery 1,25, biosensing 26-28, och miljömässig testning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ELCJB stöds av Izon Science Ltd.
Acknowledgments
Författarna tackar Izon Science Ltd för deras stöd. Arbetet stöddes av Europeiska kommissionen för forskning (PCIG11-GA-2012 till 321.836 Nano4Bio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich, UK | P4417 | 1 tablet dissolved in 200 ml deionized water to make buffer solution. |
| Tween-20 | Sigma Aldrich, UK | P1379 | 0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant |
| Carboxyl polystyrene nanoparticles | Bangs Laboratories, US | CPC200 | Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1 x 1012 particles/ml, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2 x 1019 C/nm2. |
| Streptavidin coated nanoparticles | Ademtech, France | 3121 | Batch had binding capacity of 4,352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1 x 1011 particles/ml. |
| Biotinylated oligonucleotides | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3' |
| Standard olignonucleotides | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'. |
| Izon qNano | Izon Science, NZ | Inherent pressure on system of 47 Pa | |
| Izon Variable Pressure Module (VPM) | Izon Science, NZ | Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 100 Pa. | |
| Polyurethane nanopore membranes | Izon Science, NZ | NP150 | Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch. |
| Magrack 6 | GE Healthcare, UK | 28-9489-64 | |
| Sonic Bath | Fisher Scientific, UK | 10692353 | 80 Watts |
| Vortexer | IKA, Germany | 0003365000 | |
| Rotary Wheel | Labnet International, US | H5500-230 V |
References
- Alexander, C. M., Maye, M. M., Dabrowiak, J. C. DNA-capped nanoparticles designed for doxorubicin drug delivery. Chem Commun. 47 (12), 3418-3420 (2011).
- Billinge, E. R., Platt, M. Aptamer based dispersion assay using tunable resistive pulse sensing (TRPS). Anal Methods. 7 (20), 8534-8538 (2015).
- Bulyk, M. L. Protein Binding Microarrays for the Characterization of Protein-DNA Interactions. Adv Biochem Eng Biotechnol. 104, 65-85 (2007).
- Platt, M., Rowe, W., Knowles, J., Day, P. J., Kell, D. B. Analysis of aptamer sequence activity relationships. Integr Biol. 1 (1), 116-122 (2009).
- Ruiz-Hernández, E., Baeza, A., Vallet-Regí, M. Smart Drug Delivery through DNA/Magnetic Nanoparticle Gates. ACS Nano. 5 (2), 1259-1266 (2011).
- Murdock, R. C., Braydich-stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of Nanomaterial Dispersion in Solution Prior to In Vitro Exposure Using Dynamic Light Scattering Technique. Toxicol Sci. 101 (2), 239-253 (2008).
- Hupfield, S., Holsaeter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow fractionation. J Nanosci Nanotechnol. 6 (7), 3025-3031 (2006).
- Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosens Bioelectron. 31 (1), 17-25 (2012).
- Roberts, G. S., Kozak, D., Anderson, W., Broom, M. F., Vogel, R., Trau, M. Tunable nano/micropores for particle detection and discrimination: scanning ion occlusion spectroscopy. Small. 6 (23), 2653-2658 (2010).
- Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Anal Chem. 83 (9), 3499-3506 (2011).
- Booth, M. A., Vogel, R., Curran, J. M., Harbison, S., Travas-Sejdic, J. Detection of target-probe oligonucleotide hybridization using synthetic nanopore resistive pulse sensing. Biosens Bioelectron. 45, 136-140 (2013).
- Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Chen, S. Simultaneous size and ζ-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS Nano. 6 (8), 6990-6997 (2012).
- Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Trau, M. Advances in Resistive Pulse Sensors: Devices bridging the void between molecular and microscopic detection. Nano Today. 6 (5), 531-545 (2011).
- Weatherall, E., Willmott, G. R. Applications of tunable resistive pulse sensing. Analyst. 140, 3318-3334 (2015).
- Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. J Phys Condens Matter. 22 (45), 454116 (2010).
- Blundell, E. L. C. J., Mayne, L. J., Billinge, E. R., Platt, M. Emergence of tunable resistive pulse sensing as a biosensor. Anal Methods. 7, 7055-7066 (2015).
- Platt, M., Willmott, G. R., Lee, G. U. Resistive Pulse Sensing of Analyte-Induced Multicomponent Rod Aggregation Using Tunable Pores. Small. 8 (15), 2436-2444 (2012).
- Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Anal Chem. 84 (7), 3125-3131 (2012).
- Blundell, E. L. C. J., Vogel, R., Platt, M. Particle-by-Particle Charge Analysis of DNA-Modified Nanoparticles Using Tunable Resistive Pulse Sensing. Langmuir. 32 (4), (2016).
- Hunter, R. J. Zeta Potential in Colloid Science: Principles and Applications. , Academic Press. New York. (1981).
- Arjmandi, N., Van Roy, W., Lagae, L., Borghs, G. Measuring the electric charge and zeta potential of nanometer-sized objects using pyramidal-shaped nanopores. Anal Chem. 84 (20), 8490-8496 (2012).
- Bacri, L., et al. Dynamics of colloids in single solid-state nanopores. J Phys Chem B. 115 (12), 2890-2898 (2011).
- Cabello-Aguilar, S., et al. Dynamics of polymer nanoparticles through a single artificial nanopore with a high-aspect-ratio. Soft Matter. 10 (42), 8413-8419 (2014).
- Billinge, E. R., Muzard, J., Platt, M. Tunable resistive pulse sensing as a tool to monitor analyte induced particle aggregation. Nanomater Nanosci. 1 (1), 11 (2013).
- Li, J., Fan, C., Pei, H., Shi, J., Huang, Q. Smart Drug Delivery Nanocarriers with Self-Assembled DNA Nanostructures. Adv Mater. 25 (32), 4386-4396 (2013).
- Billinge, E. R., Broom, M., Platt, M. Monitoring aptamer-protein interactions using tunable resistive pulse sensing. Anal Chem. 86 (2), 1030-1037 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Park, S. -J., Taton, T. A., Mirkin, C. A. Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle Probes. Science. 295 (5559), 1503-1506 (2002).
