This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.
HIV-1-kappeproteiner engagere beslægtede receptorer på målcellen overflade, hvilket fører til viral-cellemembranen fusion efterfulgt af frigivelsen af det virale capsid (CA) kerne ind i cytoplasmaet. Efterfølgende den virale reverse transkriptase (RT), som en del af en navnebror nukleoprotein kompleks betegnes revers transkription Complex (RTC), konverterer det virale enkeltstrenget RNA-genom ind i en dobbeltstrenget DNA-kopi (vDNA). Dette fører til biogenesen af anden nukleoprotein kompleks, betegnet præ-integration komplekset (PIC), sammensat af vDNA og associerede virusproteiner og vært faktorer. PIC-associeret viral integrase (IN) orchestrates integrering af vDNA i værtens kromosomale DNA i en tidsmæssigt og rumligt reguleret totrinsproces. For det første har i processer 3'-enderne af vDNA i cytoplasmaet, dels efter PIC trafikker til kernen, den medierer integration af det forarbejdede vDNA i det kromosomale DNA. De ansvarlige isoleretfra målceller akut inficeret med HIV-1 er funktionelle in vitro, da de er kompetente til at integrere den tilknyttede vDNA til et exogent tilsat heterologt mål-DNA. En sådan PIC-baserede in vitro integration analyser har bidraget væsentligt til at afgrænse de mekanistiske detaljer i retroviral integration og til at opdage IN hæmmere. I denne rapport, vi uddybe en opdateret HIV-1 PIC assay, der anvender en indlejret real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) -baseret strategi til måling af in vitro-integration aktivitet af isolerede indfødte ansvarlige.
HIV-1-replikation i målcellen involverer flere trin, generelt inddeles i to faser: tidlige og sene begivenheder. De tidlige begivenheder begynder, når HIV-1 sekventielt binder til målet celleoverfladereceptoren CD4 og en af de to co-receptorer (CCR5 eller CXCR4) 1. Følgelig virus-celle membraner lunte, og det virale capsid (CA) kerne frigives til cytoplasmaet 2. CA kerne indeholder det virale genomiske enkeltstrenget RNA (ssRNA) og adskillige proteiner, både virale og cellulære oprindelse. Ca-associerede virale proteiner indbefatter revers transkriptase (RT) og integrase (IN), to enzymer, der medierer kritiske trin i de tidlige begivenheder i virusreplikation. RT og IN-funktionen i forbindelse med nukleoprotein komplekser, nemlig revers transkription Complex (RTC) og præ-integration komplekset (PIC), henholdsvis 3, 4, 5 <sup>, 6. Enderne af det virale genom ssRNA harbour terminale gentagelse (R) elementer støder op til de unikke sekvenser U5 (ved 5'-enden) og U3 (ved 3 'enden). RTC konverterer det virale ssRNA genomet i en dobbeltstrenget (ds) DNA-kopi (vDNA). Denne revers transkription proces resulterer også i overlapning af U5 og U3 sekvenser, hvorved der genereres lange terminale gentagelser (LTR) ved begge ender af vDNA 7, 8. Efterfølgende PIC-associerede IN katalyserer to sekventielle biokemiske reaktioner, der muliggør integrationen af vDNA i værtskromosomet 9, 10, 11. Først, i cytoplasmaet, IN multimerer engagere både LTR'er 12 og spalte en dinukleotid fra hver af de 3'-terminale ender. Dette 3'-end behandling genererer en hydroxylgruppe ved hver 3'-ende (CA OH) i vDNA.Dernæst PIC trafikker til kernen, hvor i anvender vDNA CA OH som en nukleofil til at skære begge strenge af det kromosomale DNA i en forskudt måde. Samtidig IN splejsninger koordineret begge ender af vDNA til de resulterende phosphodiesterbindinger på modsatte strenge af det kromosomale DNA. Efter denne streng transfer trin, værtscellen maskiner fjerner to uparrede nukleotider i 5'enderne af vDNA og reparationer de følgende enkeltstrengede huller ved krydset af integrationen site. De tidlige begivenheder således kulminere med etableringen af et integreret DNA-kopi (provirus) af HIV-1-genomet. Proviruset tilvejebringer et egnet miljø for effektiv viral genekspression, som initierer senere begivenheder, herunder ekspressionen af virus-kodede proteiner; samling af umodne virus; og spirende, frigivelse, og modning i infektiøse viruspartikler 13.
Renset rekombinant retroviral IN er kompetent til atudføre, in vitro, både 3'-end forarbejdning og streng transferaktiviteter på eksogent leveret LTR-lignende substrat DNA. Biokemiske undersøgelser under anvendelse sådan oprenset rekombinant IN har afsløret kritiske aspekter af vDNA integration 14, 15, 16, 17. Men i modsætning til i naturlig infektion, dette in vitro biokemisk reaktion understøtter ikke samordnede integration af begge ender af substrat-DNA ind i mål-DNA. I modsætning hertil retrovirale PIC'er isoleret fra akut inficerede celler samordnet for at integrere begge ender af det endogene vDNA til heterolog mål-DNA. Dette førte til udbredt anvendelse og efterfølgende justeringer af I n Vitro Integration (IVI) analyser ved hjælp isolerede indfødte ansvarlige.
I den første rapporterede retrovirale IVI assay cytoplasmatiske ekstrakter fra celler inficeret med en rekombinant murinLeukæmi Virus (MLV) huser E. coli supF-genet i sin LTR tjent som kilden til IN-aktivitet, og DNA'et af en mutant lambda-fag defekt i lytisk vækst blev eksogent leveret som target-DNA'et. Vellykket integration af det rekombinante MLV DNA kopiere, i fag-DNA'et og den efterfølgende supF ekspression førte til restaurering af plaque-dannende evne af de rekombinante fager. Men denne eksperimentelle strategi er besværlig og foranstaltninger integration på en indirekte måde. For at imødegå sådanne forbehold, blev en Southern blot-baserede indirekte ende-mærkning assay, der kvantificerer PIC-associerede IVI aktivitet som et mål for den endogene vDNA integreret i eksogen lineariserede bakteriofag phiX174 DNA, udviklet 6, 7, 18. Selv om denne metode giver et direkte mål for integration begivenheder, er relativt høje mængder af PIC forberedelse kræves, som stadig er et teknisk udfordrendebestræbelse. For at omgå dette, blev indlejrede PCR-baserede analyser, der kræver kun beskedne mængder af PIC'er udviklet 4, 5, 19.
I denne rapport beskriver vi en opdateret version af et nested PCR-baserede in vitro-metode udviklet til at rekapitulere HIV-1 PIC-medieret integration aktivitet forekommer under naturlig infektion. Denne metode anvender cytoplasmatiske ekstrakter af HIV-1-inficerede målceller som en kilde til endogen PIC-aktivitet, som måles med en real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR). Procedurerne for at isolere ansvarlige og måle deres integrationsaktiviteter tilpasses, med modifikationer, fra protokoller offentliggjort af Engelman laboratoriet 20. Ved denne fremgangsmåde er PIC-associerede integration aktivitet initieres ved at tilvejebringe en eksogen lineær mål-DNA 21, og DNA, der stammer fradenne integration reaktion oprenses og anvendes som udgangsmateriale til efterfølgende PCR-baserede kvantificering. I første runde konventionel PCR er de virale-mål-DNA junctions amplificeret ved anvendelse af passende primere. I anden runde qPCR, er LTR-specifikke primere anvendes til specifikt at berige vDNA befolkning fra første runde PCR-produkter. Se afsnittet protokol for en detaljeret beskrivelse af denne metode.
In vitro studier med retrovirale ansvarlige har ført til betydelige fremskridt i vores forståelse af mekanismen for retroviral DNA integration og i udviklingen af IN-hæmmere. Baseret på den seneste øget fokus på kortlægning af HIV-1 integration sites, bestemme rolle af virale og vært faktorer i HIV-1 integration, og udvikle nye antivirale lægemidler til bekæmpelse af resistens, vi forestiller en øget interesse i og udbredt brug af IVI assays , som den er beskrevet i denne rapport. Dette vil igen, vil føre tilfremtidige forbedringer i metoden, og dermed diversificere omfanget af dets applikationer.
Biokemiske analyser af retrovirale PIC'er har givet kritiske indsigt i mekanismen for retroviral DNA-integration. Måling af integration aktivitet af retrovirale PIC'er kan opnås ved plakdannelse assay Southern blot-analyse, og nested qPCR. Den eksperimentelle strategi af plak-assay er besværlig og udnytter en indirekte metode til måling af integration 6, 7, 18. Southern blot assays foranstaltning integration direkte…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er delvist støttet af tilskud DA024558, DA30896, DA033892, og DA021471 fra Nida / NIH til CD. Vi anerkender også RCMI tilskud G12MD007586, Vanderbilt CTSA give UL1RR024975, den Meharry Translationel Research Center (MeTRC) CTSA tilskud U54 RR026140 fra NCRR / NIH, at U54 tilskud MD007593 fra NIMHD / NIH, og Tennessee CFAR tilskud P30 AI110527.
Fetal bovine serum (FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10437-028 |
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10438-026 |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) |
GIBCO/Invitrogen |
11995-065 |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium |
GIBCO/Invitrogen |
11875-093 |
Phosphate buffered saline (PBS) (1X) |
GIBCO/Invitrogen |
20012-027 |
Trypsin-EDTA (0.25%) |
GIBCO/Invitrogen |
25200-056 |
Penicillin-Streptomycin solution (100x) |
Cellgro/Mediatech |
30-002-CI |
HEK293T cells (293T) |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-3216 |
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3 |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
114 |
PolyFect transfection reagent |
Qiagen |
301107 |
DNase |
Calbiochem/Merckmillipore |
260913 |
Immulon 2HB 96-well plates |
Thermo Scientific |
3455 |
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
T9284 |
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
1513 |
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS) |
— |
— |
Donor bovine serum |
Gibco/Invitrogen |
16030074 |
Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use. |
— |
— |
Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C. |
— |
— |
Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-) |
Dr. Wesley Sundquist |
— |
HIV IgG |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 |
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate |
Pierce/ThermoFisher |
31412 |
TMB Microwell Peroxidase substrate system |
KPL, Inc. |
50-76-00 |
SupT1 cells |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-1942 |
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution) |
GIBCO/Invitrogen |
15630-080 |
Potassium chloride (KCl) solution |
Sigma-Aldrich |
60142 |
Magnesium chloride (MgCl2) solution |
Sigma-Aldrich |
M1028 |
Dithiothreitol (DTT) |
Sigma-Aldrich |
43815 |
Aprotinin |
Sigma-Aldrich |
A6106 |
Digitonin |
Sigma-Aldrich |
D141 |
RNase A |
Invitrogen |
12091-021 |
Sucrose |
Sigma-Aldrich |
S0389 |
phiX174 Replicative Form 1 DNA |
Promega |
D1531 |
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
|
dNTP mix |
Promega |
U1515 |
Go Taq DNA Polymerase |
Promega |
M3005 |
Qiaquick gel extraction kit |
Qiagen |
28706 |
Ultrapure distilled water |
Invitrogen |
10977-015 |
Tris-EDTA (TE) buffer (100X) |
Sigma-Aldrich |
T9285 |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 |
Sigma-Aldrich |
E7889 |
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution) |
Qiagen |
19131 |
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA) |
Sigma-Aldrich |
P4557 |
Chloroform |
Sigma-Aldrich |
288306 |
Glycogen (5 mg/ml solution) |
Ambion/Invitrogen |
AM9510 |
Sodium acetate (3M, pH 5.2) |
Sigma-Aldrich |
57899 |
Ethanol |
Sigma-Aldrich |
E7023 |
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe: 5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
iQ Supermix |
Bio-Rad |
170-8862 |