Summary
Este artículo presenta un método para la detección y cuantificación de ácidos orgánicos a partir de material vegetal utilizando electroforesis capilar zonal libre. Un ejemplo de la aplicación potencial de este método, la determinación de los efectos de una fermentación secundaria en los niveles de ácido orgánicos en semillas de café, se proporciona.
Abstract
Los ácidos carboxílicos son los ácidos orgánicos que contienen uno o más terminales carboxilo (COOH) grupos funcionales. ácidos carboxílicos de cadena corta (SCCAs; ácidos carboxílicos que contienen de tres a seis átomos de carbono), tales como malato y citrato, son fundamentales para el buen funcionamiento de muchos sistemas biológicos, donde funcionan en la respiración celular y pueden servir como indicadores de la salud de las células. En los alimentos, el contenido de ácido orgánico puede tener un impacto significativo en el sabor, con un aumento de los niveles de SCCA que resulta en un sabor "ácido" o amargo. Debido a esto, los métodos para el análisis rápido de los niveles de ácido orgánicos son de particular interés para las industrias de alimentos y bebidas. Desafortunadamente, sin embargo, la mayoría de los métodos utilizados para la cuantificación SCCA dependen de protocolos consumen mucho tiempo que requieren la derivatización de las muestras con reactivos peligrosos, seguido de cromatografía costoso y / o espectrometría de masas. Este método detalla un método alternativo para la detección y cuantificación de orgAnic ácidos a partir de material vegetal y las muestras de alimentos utilizando electroforesis capilar de zona libre (CZE), a veces denominado simplemente electroforesis capilar (CE). CZE proporciona un método rentable para medir SCCAs con un bajo límite de detección (0,005 mg / ml). En este artículo se detalla la extracción y cuantificación de SCCAs a partir de muestras de plantas. Mientras que el método proporcionado se centra en la medición de SCCAs de granos de café, el método proporcionado se puede aplicar a múltiples materiales de alimentos de origen vegetal.
Protocol
1. Preparación de muestras
- Montar las muestras para la extracción de ácido carboxílico de cadena corta (SCCA). Preparar 1,0 g de semillas de café a la vez para asegurar que la muestra lo suficientemente permanecerá después del procesamiento.
- Si las muestras se congelaron antes del proceso de molienda, mantener el tejido congelado en todo el procesamiento para evitar congelación / descongelación daño y la oxidación de la muestra. Retirar la muestra del congelador o el almacenamiento bajo cero sólo cuando sea necesario para la molienda.
- congelación de flash muestras frescas en nitrógeno líquido inmediatamente antes de probar la molienda. Para reducir al mínimo la manipulación de muestras, las muestras de congelación de flash colocándolos en un mortero pre-llena de nitrógeno líquido.
- Analizar muestras de líquido inmediatamente después de la generación, o la congelación de flash en nitrógeno líquido y se almacena a -20 ºC o -80 ºC hasta su análisis. Antes del análisis, extraer muestras congeladas de almacenamiento y permitir que se descongele. Para muestras líquidas continúe en el paso (3.5) para su procesamiento.
- Use aproequipos de protección individual proceda (por ejemplo gafas protectoras, guantes y bata de laboratorio) antes de trabajar con nitrógeno líquido.
- Muestras de tejido triple de molienda hasta obtener un polvo fino uniforme (es decir, del tamaño de partícula uniforme) en nitrógeno líquido utilizando un mortero y una maja de cerámica.
NOTA: La consecución de un tamaño de partícula uniforme es esencial para maximizar la eficiencia de extracción de SCCA.- Pre-enfriar el mortero y mortero con nitrógeno líquido antes de la adición de la muestra. Mantenga el mortero lleno de un pequeño volumen de nitrógeno líquido como se añade la muestra.
- Usando una cuchara, agregue suficiente nitrógeno líquido para el mortero para sumergir completamente la muestra.
- Añadir fácilmente muestras molidas, tales como hojas o el café tostado, al nitrógeno líquido y aplastar con un movimiento de molienda circular. Comenzar a moler muestras cuando el nivel de nitrógeno líquido ha disminuido hasta el punto en que apenas cubre las muestras.
- Añadir difícil de moler muestras, por ejemplo unas semillas de café crudos, a nitrógeno líquido y permita que se congelen durante 10-30 segundos (o hasta que el nitrógeno líquido deja hervir vigorosamente) antes de la molienda. Romper el tejido en fragmentos más pequeños con un movimiento de aplastamiento vertical, y el tejido continuación completa de molienda usando un movimiento circular de molienda.
- Repetir los pasos 1.3.2-1.3.4 dos veces más, por lo que las muestras se molieron con un total de tres veces. Típicamente, tres rondas sucesivas de molienda reducirán muestras a un polvo con una consistencia de harina similares.
- Si no se logra una consistencia de harina-como, repita los pasos 1.3.2-1.3.4 hasta que las muestras se reducen a un polvo de tamaño de partícula uniformemente pequeño (eficacia de la extracción es inversamente proporcional al tamaño de partícula).
- Transferir el polvo a viales de vidrio o tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Iniciar el procesamiento aguas abajo inmediatamente después de la molienda (recomendado), o las muestras almacenadas a -80 ºC hasta que las muestras están listas para la extracción.
- Si las muestras deben almacenarse antesanálisis, dividir la muestra en partes alícuotas de 500 mg (o 500 ml de alícuotas de muestras líquidas) y dividir entre varios tubos para el almacenamiento. Evitar someter las muestras a ciclos de congelación / descongelación repetidos, ya que pueden alterar la composición de la muestra e impactar negativamente en futuras mediciones de muestras.
2. Preparación estándar de ácido orgánico
- Montar patrones auténticos de los SCCAs de interés. Estos se pueden usar para crear soluciones estándar externos e internos para uso en la determinación de concentraciones de SCCA. Para muestras de café incluyen cítrico, málico, acético, y ácido láctico como ácidos de interés y ácido adípico como el estándar interno.
- Asegúrese de asegurarse de que el patrón interno seleccionado no se encuentra naturalmente en la muestra, y que la norma no co-eluyen con otros picos en el perfil de la muestra.
- Ejecutar las curvas de calibración para cada SCCA de interés, y determinar el intervalo de respuesta lineal para cada SCCA (véase la sección 4 para el funcionamiento de instjaleos). Asegúrese de hacer pasar las curvas de calibración para cada SCCA a medir en la muestra.
NOTA: Las curvas de calibración se pueden ejecutar en cualquier tampón o el fondo de la muestra a ensayar. En el segundo caso ( "adición estándar"), los valores para el área del pico de cada punto de la curva estándar se determinan restando distancia el fondo de la muestra. - Pre-etiqueta de todos los tubos necesarios y cristalería con el nombre de SCCA ácido, la concentración y la fecha del ensayo.
- Preparar soluciones madre para cada estándar a una concentración conocida (10 mg / ml) utilizando un matraz aforado para garantizar la precisión durante la preparación estándar.
- Disolver normas SCCA sólidos (ácido cítrico y ácido málico) en agua ultrapura (18,2 mO) para alcanzar la concentración deseada para la solución de reserva.
- Crear una 10 mg solución / ml de stock mediante la adición de 100 mg de estándar a un matraz volumétrico de 10 ml. Llenar el matraz hasta la marca de 10 ml con agua ultrapura para dissolve el ácido.
- Crear una menor concentración de ácido estándar o calentar suavemente los frascos para conducir difíciles de disolver las normas de SCCA, como el ácido adípico, en la solución.
- Diluir los estándares de ácido fase líquida (ácido acético y ácido láctico) en agua ultrapura para lograr la concentración deseada.
- Pre-llenar un matraz volumétrico con 5 ml de agua ultrapura. Añadir ácido suficiente para preparar una solución de 10 mg / ml (calculado utilizando la densidad del ácido proporcionado por el proveedor) al matraz, y luego añadir agua suficiente para llevar el volumen final de la solución a 10 ml.
- Disolver normas SCCA sólidos (ácido cítrico y ácido málico) en agua ultrapura (18,2 mO) para alcanzar la concentración deseada para la solución de reserva.
- Transferir cada solución madre a un tubo de vidrio de 15 ml limpio, con un politetrafluoroetileno (PTFE) forrada gorra, y sellar con una película de plástico de parafina. Las soluciones madre se pueden almacenar en tubos sellados a 4 ºC durante 1 semana.
- Garantizar que las normas de SCCA no han precipitado en la solución antes de su uso si las soluciones madre han sido refrigerados después de preparación. Drive precipita de nuevo en solución a través de un calentamiento suave.
- Preparar la solución de extracción SCCA. Incluir el patrón interno a una concentración suficiente para la detección en las muestras (0,05 mg / ml). Preparar suficiente solución para extraer todas las muestras.
- Preparar 50 ml de solución de extracción SCCA por dilución de la solución madre de patrón interno a 0,05 mg / ml en agua ultrapura. Añadir 250 l de la solución madre de patrón interno (10 mg / ml) a 49,75 ml de agua.
- Si el extracto necesita ser diluida, ajustar la concentración de patrón interno en la solución de extracción de modo que la concentración final caerá dentro de los límites de cuantificación (dando un detectable, pero no sobre-saturado, pico, ver 5.2.2 más adelante) de la sistema de CE después de la dilución (0,05 mg / ml).
- Preparar la solución de extracción fresco para cada serie de extracciones (es decir, para cada serie experimental).
- Preparar muestras de la curva estándar(Una serie de diluciones apropiadas) para SCCAs de interés, utilizando un mínimo de al menos 5 puntos. Las concentraciones de la curva estándar empleadas tendrán que estar en el rango de respuesta lineal para un determinado SCCA, y abarcan las concentraciones de SCCA que se esperan de las muestras.
- Incluir el patrón interno seleccionado en las soluciones de la curva estándar para permitir la cuantificación del patrón interno en las muestras. El estándar interno se utiliza para ayudar en la identificación de los picos y calcular la eficiencia de extracción (sección 6).
- Diluir cada SCCA a las concentraciones determinadas anteriormente (0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 mg / ml; ver más arriba, 2.4.2) en nuevos tubos de microcentrífuga (uno para cada punto de la curva de concentración / estándar) usando agua ultrapura. Preparar 1 ml de solución para cada punto de concentración curva estándar. Asegúrese de que cada punto de concentración contiene las cuatro normas de ácido y el patrón interno en la concentración correcta.
- Preparar nuevos puntos de la curva estándar para cada conjuntode muestras que deben ejecutarse en el sistema de electroforesis capilar. Mantenga las muestras patrón de curva de SCCA a 4 ºC hasta su análisis, lo que ocurrirá después de la extracción de SCCAs de tejidos diana (sección 3).
3. Orgánica extracción ácida
- tubos de muestra Pre-etiqueta, la preparación de al menos un tubo para cada muestra a extraer.
- Eliminar las muestras que se extraen de almacenamiento y colocarlos en hielo, mientras que el pesado de material para la extracción.
- Pesar 100 mg de muestra para la extracción de SCCA.
- Después de pesar cada muestra, la transferencia de tejido a un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml. Medir una cantidad de muestra de lo más cercano a la masa objetivo como sea posible para reducir la variabilidad.
- Realizar un seguimiento de la masa de cada muestra medida, ya que las cantidades de SCCAs detectados se normalizaron mediante la masa de la muestra (véase el apartado 6.5.2, a continuación).
- Después de sopesar todas las muestras, añadir 1 ml de solución de extracción (el tardíor + mezcla de patrón interno de la etapa 2.4) a cada uno de los tubos de muestra. Mantener la relación de solución de extracción de la masa de tejido de la misma a través de todas las extracciones (en este caso 1 ml de 100 ± 5 mg de tejido). Mezclar bien por vórtice durante 10 s.
- Dejar que las muestras en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Durante esta hora, la mezcla cada tubo cada 15 minutos como en el paso 3.4.
- Después de 1 h de extracción, mezclar las muestras una vez final y transferir tubos de muestra a una microcentrífuga. Centrifugar las muestras a 4 ° C, 10.000 xg durante 10 minutos para precipitar material sólido (paredes celulares, partículas, etc.).
- Al procesar muestras líquidas, añadir la concentración adecuada de patrón interno, brevemente y centrifugar la mezcla. Después de la centrifugación, el tratamiento de muestras líquidas de forma idéntica al extracto de muestras sólidas.
- Comprobar el pH de las muestras para confirmar que son compatibles con la gama de pH del tampón se ejecuta en el kit de detección (paso 4.6) o sistema tampón ser empLoyed. Como los volúmenes de muestra son por lo general bastante pequeñas, pH puede monitorizarse usando papel de pH.
- Prepárese para filtrar las muestras usando filtros de disco de jeringa montado en (3.8).
NOTA: Evitar la pérdida de la muestra, asegurando que cada filtro está correctamente fijada a una jeringa antes de transferir el sobrenadante. Preparar una jeringa equipada con un filtro de disco para cada muestra a analizar (incluyendo muestras de la curva estándar). - Después de la centrifugación de las muestras y preparación de los filtros de jeringa, transferir el sobrenadante de cada muestra a una jeringa de 3 ml equipada con un filtro de jeringa de 0,2 micras. Use un filtro nuevo y la jeringa para cada muestra. Filtro de todas las muestras, incluyendo muestras de la curva estándar y controles de tampón, antes de que se ejecuta en el sistema de CE.
- Filtrar la muestra directamente en un tubo de microcentrífuga limpio. Después de la filtración, el filtrado cerrar tubo que contiene el aparato y desechar la jeringa / filtro.
- Inmediatamente colocar muestras filtradasen el sistema de la CE para la detección de SCCA; o las muestras se almacenan a 4 ° C durante la noche. Si las muestras se almacenaron durante una noche, sellar los tubos con película de parafina de plástico para evitar el intercambio de gases y la evaporación de la muestra.
- Si las muestras se deben almacenar más de un día después de la filtración, extractos de congelación de flash en nitrógeno líquido o congelación a -20 ºC. Después de la descongelación, sin embargo, asegúrese de que cada muestra se examina para la formación de precipitado y el filtro si es necesario (como en el paso 3.6).
4. Ajuste de la detección Ejecutar SCCA
- Consulte el manual del usuario para obtener más detalles PROGRAMACION- CE y de control específicas de software.
- Preparar los viales de muestra de electroforesis capilar (CE) para la detección de SCCA. Asegurar viales se etiquetan, limpias y libres de defectos.
- Lavar y secar los tapones de los viales de la CE antes de su uso.
- Lavar las tapas sumergiéndolas en agua ultrapura y que les permite remojo la noche anterior. Después de remojar las tapas, desechar el remojoing solución y enjuague las tapas de dos veces más con agua ultrapura.
- Transferencia enjuaga tapas a una superficie de secado limpio forrado con paño libre de pelusa y permita que se seque al aire. Asegurar las tapas estén completamente secas antes de su uso para evitar fallos de presión.
- Transferir 1 ml de muestra a cada vial CE, teniendo cuidado de evitar salpicaduras de la muestra en el cuello del vial accidentalmente. Después de la transferencia, coloque una tapa de la CE en el vial.
- Si se necesita una dilución, diluir las muestras de semillas de café 1:10 o 1: 100 directamente en el vial CE usando agua ultrapura. Para diluciones superiores a 1: 100, crear una dilución intermedia para evitar los errores de pipeteo.
- Preparar un vial para cada punto de la curva estándar mediante la transferencia de las soluciones de la curva estándar (1,0 ml) de la Etapa 2.5 a viales de CE. Tapar cada tubo después de la transferencia.
- Preparar una solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0,1 M mediante la adición de 0,04 g de NaOH a un vaso de precipitados que contiene 90 ml de agua ultrapura y permitiendo que los gránulos de to disolverse. Transferir la solución 0,1 M de NaOH a un matraz aforado de 100 ml y llevar el volumen total a 100 ml.
- Añadir 1 ml de solución de NaOH 0,1 M a un vial limpio CE y la tapa.
- Preparar viales tampón CE para cada lote de muestras que se ejecutan en el sistema de la CE. Kits de separación están disponibles o tampones personalizados se pueden utilizar 13.
- Preparar 1 vial con 1 ml de solución tampón de partida y la tapa.
- Preparar tres viales con 1 ml de cada una de ejecutar la solución tampón y la tapa. Sustituir el tampón de desarrollo antes de cada lote de muestras y puntos de la curva estándar, o después de 35 muestras, lo que ocurra primero.
- Llenar tres frascos adicionales con 1 ml de agua ultrapura y la tapa cada vial.
- Preparar 1 vial vacío "residuos" con el casquillo.
- Después de preparar los viales descrito en la etapa 4.8, la carga de los viales que contienen los tampones y el agua, así como los viales de residuos (de los pasos 4.8.2-5) en la bandeja de amortiguamiento de la electroforesis capilar sysTEM, según las instrucciones de fabricante 15. Con cuidado, tenga en cuenta la posición de cada vial para la programación muestreador automático.
- Cargar los viales que contienen los puntos de la curva estándar y los viales que contienen las muestras a ensayar en la bandeja de entrada de la muestra, como se describe en las instrucciones del fabricante. Tenga en cuenta la posición de cada vial para la programación muestreador automático (consulte los pasos 4.11.1 abajo).
- Preparar acondicionado y métodos de separación de muestra (programas para estos se proporcionan en las Tablas 1 y 2, respectivamente), y escribir un archivo de secuencia de la muestra según el manual de instrucciones del instrumento. Usar el método de separación se detalla en la Tabla 2: enjuagar la columna con iniciador (20 psi) durante 0,2 min; enjuague con acelerador (20 psi) durante 0,5 min, inyectar muestras (0,5 psi) en la columna de 0,09 min, muestras separadas a 20 kV durante 12 minutos, enjuague con NaOH (20 psi) durante 0,5 minutos, y finalmente enjuagar con agua ( 20 psi) durante 0,5 min.
- Using el software de control CE, escribir la secuencia de muestras en funcionamiento (es decir, la lista de trabajo; un archivo de lista que detalla el orden en el que se analizarán las muestras, y el método que se utilizará para separar cada muestra) mediante la interfaz de hoja de cálculo "secuencia". Cada fila en la hoja de cálculo corresponderá a una muestra de ejecución y producir un único archivo de datos.
- Asegúrese de que al escribir el archivo de secuencia, las muestras se identifican utilizando la posición correcta en la bandeja de muestreo. Asegúrese de que cada archivo de datos tiene un nombre único para evitar que el software sobrescribir los archivos anteriores. Programa de CE capilares acondicionado se ejecuta como una secuencia separada antes de realizar la secuencia que contiene el método de separación de muestras.
- Comience la secuencia de muestras correr con las soluciones de la curva estándar, seguido por las muestras de SCCA, y terminar con una segunda ejecución de las soluciones de la curva estándar. Esto permitirá un cálculo del grado de pérdida de señal que ocurren durante los análisis de la muestra. </ Ol>
- Using el software de control CE, escribir la secuencia de muestras en funcionamiento (es decir, la lista de trabajo; un archivo de lista que detalla el orden en el que se analizarán las muestras, y el método que se utilizará para separar cada muestra) mediante la interfaz de hoja de cálculo "secuencia". Cada fila en la hoja de cálculo corresponderá a una muestra de ejecución y producir un único archivo de datos.
Tabla 1: Programa método acondicionado usado para preparar el capilar para la separación de cadena corta de ácido carboxílico a través de electroforesis capilar a.
Tabla 2: Programa de Separación método utilizado para los análisis de ácidos carboxílicos de cadena corta mediante electroforesis capilar a.
5. Detección de SCCA Run Ejecución y Recolección de Datos
- Comenzar las carreras de acondicionamiento capilar. Esperar para acondicionar el capilar dos o tres veces antes de la columna está lista para la separación de la muestra. Acondicionamiento de la columna debe realizarse como se describe en la Tabla 1. En pocas palabras, lavar la columna con NaOH 0,1 M (20 psi) durante 1 min, enjuagar con agua (20 psi) durante1 min, enjuague con iniciador (20 psi) durante 0,5 min, se aclaró con acelerador (20 psi) durante 0,5 min, acelerador por separado en 30 kV durante 10 minutos, enjuague columna con M NaOH 0,1 (20 psi) durante 0,5 min, y finalmente lavar la columna con agua (20 psi) durante 0,5 min.
- Condicionar el capilar antes de cada secuencia de muestras de ejecución. Lograr un acondicionamiento adecuado, manteniendo la tensión de separación es constante a lo largo de la carrera y la observación de una línea de base plana sobre la traza de red de fotodiodos.
- Después del acondicionamiento, iniciar la separación de la muestra, abra el menú "Control" en el software y la selección (es decir, al hacer clic en) "secuencia de ejecución." Monitorear la traza de red de fotodiodos (PDA) para asegurar la separación adecuada.
- Observar la primera traza y garantizar que cuenta con una línea de base plana y limpia resolvió (resolución de línea de base), los picos de ácido individuales. Más cargadas las muestras presentarán colas de largo pico, o colas de los picos, y tendrán que ser diluidos (figura 1).
Figura 1:. Una comparación de los rastros de PDA destacando una muestra sobrecargado medida que aumenta la concentración de analito, la geometría pico individual puede empezar a ser asimétrica. En (a) 0,05 mg / ml, ácido acético presenta un pico bien definido, de forma bilateral simétrica. Como aumenta la concentración de ácido acético a (b) 0,07 mg / ml y (c) 0,10 mg / ml, se forma un pico de cola (flechas). Este colas de los picos es una buena indicación de que la muestra está sobrecargado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Al término de la secuencia de ejecución, abra los archivos de datos de uno en uno en el software de análisis de la CE e integrar los picos.
- Integrar picos de muestra.
- Abre el primer archivoy establecer los pasos de integración automática para excluir la primera 3 min de la carrera (donde la tensión, y por lo tanto la dirección de flujo de la columna, se invierte tal como se describe en la Tabla 1). En el mismo menú, establecer criterios de selección de pico a una anchura de pico mínimo de 50 unidades y el área del pico de 100 unidades (o la configuración predeterminada por el fabricante) para proporcionar un nivel moderadamente alto de selectividad, que separa los picos de ácido del ruido de fondo en la traza.
- comprobar manualmente los límites máximos y líneas de base para cada traza PDA para asegurar la integración de picos adecuado. Picos inadecuadamente integrados (es decir, un pico SEAC ligeramente asimétrica que se ha integrado como dos picos separados por el software automatizado) tendrán que ser re-integrado de forma manual.
- Integrar picos de muestra.
- Después de la integración, ver el informe de porcentaje de área, a continuación, seleccionar y copiar el informe de porcentaje de área y pegarlo en una hoja de cálculo separada. Repita este procedimiento para cada muestra para construir el pico repor carrera completat con cada fila representa un único pico (es decir., cada pico debe contener un solo compuesto, si la separación está funcionando bien).
Análisis 6. Datos
- Preparar los datos para el análisis usando la hoja de cálculo construido en (5,4). Comienza el análisis mediante el etiquetado de los estándares de ácido para cada uno de los puntos de la curva estándar, incluyendo el patrón interno.
- Calcular un índice de retención de cada pico dividiendo el tiempo de retención para cada pico en la muestra por el tiempo de retención del patrón interno en la muestra. Clasificar los datos establecidos por el índice de retención resultante para identificar los picos de interés en cada muestra.
- Después de identificar el pico para cada ácido de interés, la construcción de las curvas de calibración para cada ácido usando los puntos de la curva estándar externos.
- Generar una curva estándar (concentración) para cada estándar SCCA mediante la determinación del área de pico para cada concentración de los estándares de SCCA, y que representa la concentración en el xaxis vs. área de pico en el eje y. Trazar la regresión lineal para cada curva estándar SCCA y definir la ecuación de la pendiente (y = mx + b).
- Asegúrese de que los valores de R 2 de las regresiones lineales son 0,90 o superior como las cuantificaciones se realizan con mayor precisión en el rango lineal de la curva estándar.
- Calcular la concentración de ácido para un determinado SCCA en una muestra usando el área del pico y la ecuación de la pendiente de la recta de regresión lineal de la curva estándar (calculado en 6.3.2 anterior). Brevemente, se divide el área de pico observada para un ácido dado por la pendiente de la línea de regresión para la curva estándar de que el ácido.
- Corregir los valores de concentración primas calculadas en el paso 6.4 para la pérdida de muestra durante el procesamiento utilizando el estándar interno (paso 6.5).
- Calcular el factor de corrección para cada muestra utilizando el patrón interno.
- Divida la concentración real de la norma interna (es decir, KNOcantidad wn añadido al inicio del experimento) por el valor observado del patrón interno en la muestra (es decir, la cantidad calculada mediante la ecuación de la pendiente de la curva estándar para el estándar interno). Multiplicar los valores de concentración de cada primas SCCA en la muestra por este factor de corrección.
- Divida el estándar interno corregido concentración SCCA por la masa de la muestra utilizada para la extracción para corregir cualquier variación en la masa de la muestra. Este cálculo produce cantidad de analito por masa de muestra (mg SCCA por mg café molido en este ejemplo), que luego se puede convertir a las unidades apropiadas para el estudio dado (mg / mg, mg / g, g / g, etc. ).
- Después de calcular las concentraciones de SCCA (normalizado a cualquiera de la masa [para muestras sólidas o líquidas] o volumen [para muestras líquidas]), utilizar estos valores para el análisis estadístico según las exigencias del diseño y las cuestiones de interés experimental.
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Representative Results
Este protocolo ha sido utilizado con éxito para medir los efectos de los tratamientos de semillas sobre el contenido SCCA de las semillas de café verde. En este experimento, los seis tratamientos fueron: una suspensión microbiana saturada de Leuconostoc pseudomesenteroides GCP674 cepa en su medio de crecimiento (1), una suspensión acuosa de GCP674 microbios en agua (2), una solución acuosa de ácido acético y ácido láctico (0,15 y 0,4 mg / ml, respectivamente) (3), un tratamiento medio de crecimiento gastado M1 (4), dH 2 O agua (5), y un control-un tratado (sin sustancia añadida a las semillas) (6). Los tratamientos se aplicaron y se dejan fermentar durante 24 horas. Cuatro repeticiones independientes se evaluaron para cada tratamiento. El análisis se llevó a cabo para cítrico (C), málico (M), ácido acético (A) y los niveles láctico (L) de ácido usando ácido adípico como un estándar interno.
Para cada SCCA y el patrón interno, las curvas de calibración que abarca tél rango de concentraciones prevé que sea en muestras de café (5, 10, 20, 40, 60, y 80 ng / l) fueron generados. Como era de esperar, cada ácido mostró una respuesta lineal para este intervalo de concentración con valores de R-cuadrado de 0,9876 para el ácido cítrico, 0,9987 para el ácido málico, 0,9998 para el ácido acético, y 0,9999 para el ácido láctico. El patrón interno (ácido adípico) también mostraron una respuesta lineal en este intervalo de concentración, obteniéndose un valor de R cuadrado de 0.9984. Antes de análisis de muestras, se determinaron los límites de detección (LOD) y los límites de cuantificación (LOQ) para cada SCCA y el patrón interno (ácido adípico). El límite de detección de cítrico, málico, acético, y ácido adípico fue 1 ng / l; y el límite de detección para el ácido láctico fue de 2 ng / l. El límite de cuantificación de cítrico, adípico, ácido acético, y ácido láctico fue de 4 ng / l; y el límite de cuantificación para el ácido málico fue de 2 ng / l. Para calcular el porcentaje de recuperación SCCAs y ácido adípico, el café se enriquece con SCCAs individuales o ácido adípico y processed utilizando el protocolo descrito anteriormente. A continuación, el porcentaje de recuperación se calculó utilizando la siguiente fórmula ([{área de pico de pinchos muestra - pico de la muestra de control de área} / área de pico teórico de la concentración calculada de muestra enriquecida {generado mediante el análisis de tampón + SCCA / pico de ácido adípico}] x 100) . Utilizando este método, se calculó por ciento recuperaciones de 106.08% ± 12,66 para el ácido cítrico, el 98,35% ± 1,15 para el ácido málico, el 91,94% ± 3,07 para el ácido acético, el 97,42% ± 1,48 para el ácido láctico, y 100.19% ± 2,57 para el ácido adípico.
Para determinar la precisión del método, la variabilidad intra e inter-día de las mediciones realizadas utilizando CZE También se calculó. Para determinar la variabilidad intra-día, se midieron muestras de cada SCCA y ácido adípico a partir de una sola muestra de café cinco veces a través de un periodo de 24 horas, y los coeficientes de variabilidad (COV, que se calcula dividiendo la desviación estándar en el área de los picos [o concentración] for cada SCCA por el área de pico promedio [o concentración] para que SCCA, y luego multiplicando el resultado por 100) para cada compuesto se calcularon usando el área de pico. Para evaluar la importancia de la corrección de muestras usando el patrón interno, el coeficiente de varianza para cada SCCA también se calculó utilizando las concentraciones de cada SCCA calculados usando ácido adípico como un estándar interno. Como era de esperar, la electroforesis capilar fue capaz de medir con precisión SCCAs y ácido adípico, con COVs de 3,02% para el ácido cítrico, 2,64% para el ácido málico, el 3,74% de ácido acético y 2,01% para el ácido adípico (ácido láctico estaba por debajo de LOD / LOQ para todas las muestras de café medido). Estas mediciones se repitieron a través de un período de cinco días, y los CV oscilaron entre 02.11-05.25% para el ácido cítrico, 2,01 a 5,32% para el ácido málico, 1,72 a 3,74% de ácido acético y 1,26 a 3,82% para el ácido adípico. Cuando áreas de los picos se corrigieron utilizando el patrón interno y las concentraciones de SCCA calculados se utilizaron para calcular COVs, los COVs intradiarios oscilaron from 1.8 a 4.17% de ácido cítrico, 1,47 a 3,40% de ácido málico, y 2,68 a 5,10% para el ácido acético. Para evaluar la variabilidad entre días, SCCAs en una sola muestra de café se midieron una vez al día a través de un período de cinco días. A continuación, este experimento se repitió cinco veces para cada SCCA y ácido adípico. El COV para cada SCCA a continuación, se calculó dividiendo la desviación estándar en el área del pico (o concentración) para cada SCCA por el área de pico promedio (o concentración) para que SCCA y multiplicando por 100. Para evaluar la importancia de las muestras de la corrección usando el interior estándar, COVs también se calcularon utilizando las concentraciones de cada SCCA calculados usando ácido adípico como un estándar interno. El método de CZE fue capaz de reproducir de forma fiable mediciones SCCA, con COVs que van desde 5,24 hasta 10,02% para el ácido cítrico, 6,55-9,47% de ácido málico, 7,67-8,63% de ácido acético, y 3,08 a 6,57% para el ácido adípico. Cuando las áreas de pico se corrigieron utilizando el patrón interno y las concentraciones de SCCA calculados se utilizaron para caCOVs lculated, los COVs inter-día variaron desde 4,56 hasta 6,23% para el ácido cítrico, 3,39-4,99% de ácido málico, y 9,5 a 10,94% para el ácido acético.
Figura 2: Ejemplo PDA traza con picos indicados a muestras de café verde se diluido 1:10 antes de cargar en viales CE.. Los ácidos de interés se indican:. Ácido acético (A), ácido cítrico (C), ácido láctico (L), ácido málico (M) y el patrón interno, ácido adípico (IS) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El análisis estadístico se llevó a cabo en las concentraciones de ácido corregidos utilizando un modelo lineal general (GLM) para determinar si es o no tratamientos alteran los niveles de ácidos orgánicos. Un modelo que incorporen "tratamiento" x "run" (codificado como un factor aleatorio) era REALIZACIÓN ted para el GLM. Se utilizaron las comparaciones por pares de Tukey al 95% de confianza para determinar la direccionalidad de cambios.
El tratamiento altera las concentraciones de SCCA en el café verde. El ácido acético fue significativamente enriquecido en todos los tratamientos sobre el control sin tratamiento (GLM, p <0,0001).
Figura 3:. Impacto del tratamiento sobre los niveles de ácidos orgánicos en el café verde El tratamiento no tuvo impacto en (a) cítrico o ácido málico niveles en el café verde. Sin embargo, todos los tratamientos aumentaron significativamente (b) los niveles de ácido acético en comparación con los controles sin tratamiento (GLM, p <0,001). Los aumentos en los niveles de ácido acético fueron mayores con el microbio + tratamiento medio. Las letras indican diferencias significativas por las comparaciones por pares de Tukey al 95%.e.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Se observó el mayor aumento en el microbio + medio de tratamiento, que aumentó 0,25 veces (0,5 vs 0,4 mg / g de café en GCP674 vs. NT). Una tendencia similar se observó en los niveles de ácido láctico, a pesar de que no fueron significativamente diferentes. No hubo cambios o tendencias significativas en los otros ácidos de orugas (ácido cítrico y málico).
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Discussion
Al igual que con cualquier técnica analítica, hay varios factores críticos que pueden afectar significativamente la calidad y la fiabilidad de los datos generados. En primer lugar, es importante procesar las muestras de manera eficiente, con un mínimo de ciclos de congelación / descongelación. Congelación y descongelación repetida pueden comprometer la composición química de la muestra antes de su procesamiento o análisis. En segundo lugar, es fundamental para aplicar las medidas de este protocolo para todas las muestras de manera consistente y uniforme. Los errores técnicos derivados de la preparación de la muestra inconsistente y manejo pueden afectar significativamente la calidad de los datos generados, y el resultado en un aumento de "ruido" en las mediciones de SCCA. Por ejemplo, el tamaño de partícula de la post-molienda de la muestra tendrá un impacto en la velocidad y la eficiencia de la extracción de SCCA. Por tanto, es fundamental para garantizar que las muestras se muelen hasta un tamaño de partícula uniforme, ya que esto mantendrá la eficiencia de extracción a través de muestras y ayudar a reducir la variabilidad de muestra a muestra. Similarly, la medición precisa y pipeteo durante la preparación de soluciones estándar, medida exacta de las masas de la muestra, y un control cuidadoso (y normalización) de veces de extracción dará lugar a la generación de datos más uniformes. Tomando tiempo para normalizar cuidadosamente, medir y registrar cada uno de estos parámetros se asegurará la fiabilidad de los datos y permitir la corrección precisa del post-análisis de los datos para cualquier error de procesamiento que pueden ocurrir. En tercer lugar, es crítico para seleccionar y utilizar un patrón interno apropiado. Los cálculos de la concentración de analito definitiva dependerán en gran medida de la corrección precisa basada en el área del pico del patrón interno observado en cada muestra. Debido a esto, es crítico que el patrón interno sea ambos medidos con exactitud y precisión; e idealmente no debe ocurrir de forma natural en la muestra o co-eluyen con otros compuestos. No sólo la selección y el uso de un patrón interno en todas las muestras adecuado permiten que el investigador para controlar for cambios en los niveles de metabolitos observados debido a diferencias en eficacia de la extracción; También simplifica en gran medida el procesamiento aguas abajo y la identificación de picos. Finalmente, es necesario controlar la identificación de los picos y el proceso de integración. Mientras que los algoritmos de tratamiento automatizado son útiles, no son perfectos. Los datos generados por esta técnica se basan en la precisión de la integración, y las trazas deben comprobarse manualmente para asegurar la calidad de los eventos de integración, en particular la definición de los límites máximos y líneas de base.
Al igual que con cualquier procedimiento analítico, es importante establecer que el método CZE que aquí se presenta es: a. precisa: capaz de determinar la cantidad de un determinado SCCA presente; segundo. preciso: capaz de cuantificar de forma reproducible SCCAs dentro del mismo día y en las mediciones realizadas a través de varios días de análisis; y C. robusto: capaz de recuperar la mayor parte del SCCAs presente en las muestras que se analiza. Como se muestra arriba en las res representativosULTS, el método descrito aquí es capaz de determinar con precisión las cantidades de SCCAs presente en las muestras. Toda la medida (cítrico, málico, acético, y ácido láctico) SCCAs y el patrón interno (ácido adípico) mostraron una respuesta lineal en el intervalo de concentración de 0-80 ng / l. Además, los LOQ y LD para estos ácidos oscilaron 2-4 de ng / l y 1-2 ng / l, respectivamente. El método también era preciso, ya que todos los SCCAs medidos y el patrón interno ácido adípico exhibió baja variabilidad intra-día, cae entre 2,0 a 5,5% del área del pico (o entre 1,0 a 5,2% de la concentración calculada) para todos los SCCAs mesurado. La variabilidad entre días de mediciones SCCA también fue relativamente bajo, comprendido entre 03.05 a 10.10% del área del pico (o entre 3,30 a 10,95% de la concentración calculada) para todos los SCCAs medidos. Curiosamente, con la excepción de ácido acético, que fue consistentemente en o cerca del límite de detección / cuantificación en todas las muestras de café analyzed, la corrección de muestras usando ácido adípico como un estándar interno dio lugar a mediciones más reproducibles y una disminución en el coeficiente de variabilidad (ver resultados representativos, más arriba). Estos datos son consistentes con los resultados publicados anteriormente que indica que la corrección con un patrón interno es esencial para mantener la precisión en los análisis de CE en el tiempo 16. Si bien algunos métodos han empleado iones inorgánicos como patrón interno, nos pareció que el ácido adípico era un estándar más apropiado para el método CZE presenta aquí, ya que es un ácido orgánico y, por tanto, más propensos a experimentar la pérdida de la preparación de la muestra los pasos similar a la experimentado por los SCCAs de interés en la muestra. El ácido adípico tenía las ventajas adicionales de no estar presente en las muestras de café que se examinaron, exhibiendo una respuesta lineal a través de las mismas concentraciones utilizadas para SCCAs en este estudio, que presenta relativamente baja LOD valores / LOQ (1 ng / l y 4 ng / l, respectivamente), unada de alta por ciento de recuperación de la matriz de café (100,19 ± 2,57%), lo que es un estándar útil para cuantificar SCCAs en muestras de café. Curiosamente, la recuperación de alto por ciento observada para ácido adípico era alcanzable para todos los ácidos orgánicos medidos en este estudio, que presentaban valores de porcentaje de recuperación que van desde 91.94-106.08%. Estos datos indican que el método de CZE que aquí se presenta es capaz de recuperar la mayor parte del SCCAs presente en muestras de café.
La adaptación de este protocolo para nuevos tipos de muestras requiere la recopilación de datos preliminar, basado en la literatura o la evidencia empírica, en relación con las cantidades que se espera de analitos específicos. Esta información ayudará a guiar el diseño experimental, la preparación de la muestra, y la construcción curva estándar. La determinación de la dilución de la muestra correcta de usar que se puede lograr fácilmente empíricamente mediante la ejecución de una serie de diluciones de un extracto de prueba para encontrar una dilución de trabajo adecuada. Este protocolo fue diseñado para detectar laSCCAs se indica en los resultados de ejemplo, pero podría ser fácilmente adaptado para detectar otros SCCAs mediante la alteración de los parámetros de separación, tales como tensión de la separación, la presión, o el tiempo. Es importante recordar, sin embargo, que la alteración de los parámetros de separación puede alterar el número de carreras que se pueden lograr en un solo juego de tampones de separación ya que estos tampones se degradan con el uso. la degradación de la línea de base o cambios en la corriente son a menudo manifestaciones de sobre-utilizado tampones / agotados. Sustitución de la gestión de amortiguación y reacondicionamiento del capilar a menudo puede resolver estos problemas. Después de un uso prolongado, la capacidad del capilar para resolver analitos disminuirá también. Disminución de la estabilidad de línea de base, los cambios drásticos en el tiempo de retención, y la resolución de los picos reducida, son signos que pueden necesitar ser reemplazado el capilar. También es posible recibir un error de la presión resultante de sellado inadecuado entre el vial de muestra y el capilar debido a un tapón del vial mal colocada o un vial defectuoso. Asegurarlas tapas encajan perfectamente en los viales de muestra para evitar este error.
Tradicionalmente, los métodos cromatográficos tales como GC-MS, GC-FID, o HPLC se han utilizado para detectar SCCAs en una amplia gama de matrices, incluyendo aire, agua, suelo, y muestras de plantas 14. Aunque eficaz, un inconveniente importante en estos métodos es la necesidad de derivatizar SCCAs antes de la detección. La derivatización utiliza reactivos peligrosos del límite de detección es a menudo afectada por la eficiencia de la reacción de derivatización 13,14. La detección de SCCAs no derivatizado a través de CZE evita la pérdida de analito durante el procesamiento, la exposición a agentes de derivación peligrosos, y reduce el tiempo de preparación de la muestra. Estos beneficios se pueden ver en las tasas de recuperación alto porcentaje (entre el 91,94 hasta 106,08%) calculado para todos los SCCAs medidos en este estudio. Además, CZE cuantificación de SCCAs alcanza los límites de detección comparables a los reportados en la literatura para GC-MS, GC-FID, y HPLC, en el rango of partes por millón de partes por mil millones a 13,14. Cuando se combina con los tiempos de ejecución de alta velocidad, poder de separación de alta resolución, los protocolos de procesamiento de muestras sencillas entre las empleadas por este método de análisis, la sensibilidad y la comodidad de CZE lo convierten en una alternativa atractiva a los métodos GC o HPLC tradicionales.
Sin embargo, es importante señalar que, mientras que CZE proporciona varias ventajas sobre GC-MS HPLC, o basado LC-MS / MS métodos de análisis SCCA, no es apropiado para todos los análisis de SCCA. Por ejemplo, ya que el método CZE descrito aquí se basa únicamente en la detección espectrofotométrica, que no permite la identificación de SCCAs desconocidos presentes en la muestra, o la confirmación de la identidad SCCA a través de perfiles de espectro de masas. Debido a esto, los métodos de GC-MS o LC-MS / MS serían más adecuados para los análisis de SCCA en muestras que contienen un gran número de SCCAs desconocidos, o muestras en las que es fundamental para confirmar la identidad de todos los presentes SCCAs.Además, los métodos basados como se informó anteriormente LC-MS / MS permiten límites inferiores de detección (LD) -on promedio, 0,05 g / ml para LC-MS / MS 17 vs. el 1 mg / ml para CZE obtenida usando el método presentado aquí-LC-MS / MS cuantificación basado de SCCAs puede ser más apropiado para muestras en las que SCCAs están presentes en muy bajas o trazas.
El protocolo que se presenta aquí se centra en la extracción y cuantificación de ácidos carboxílicos de cadena corta (SCCAs) de tejidos de la planta. La obtención de habilidad en esta técnica se abrirá la puerta a una amplia gama de aplicaciones de esta tecnología para el investigador individual. Esta técnica, con ligeras variaciones en la metodología, se ha empleado con éxito en el análisis de SCCAs en una población diversa de muestras y sustratos, que van desde alimentos y muestras de tejidos al agua del medio ambiente y las muestras de suelo 8. Además, la obtención de familiaridad con los principios químicos que subyaceesta tecnología, aunque este protocolo proporcionará a los investigadores con la base de conocimientos necesaria para intentar el análisis de otros compuestos, como los hidratos de carbono o metales 8,13. La flexibilidad de análisis de electroforesis capilar hace que sea una extraordinariamente poderosa herramienta adecuada para una miríada de aplicaciones experimentales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ceramic Moarter and Pestle | Coorstek | 60310 | |
| Beckman Coulter P/ACE MDQ CE system | Beckman Coulter | Various | |
| Glass sample vials | Fisher Inc. | 033917D | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Inc. | 02-681-5 | |
| LC/MS grade water | Fisher Inc. | W6-1 | Milli-Q water (18.2 MΩ·cm) is also acceptable |
| 15 ml glass tube/ Teflon lined cap | Fisher Inc. | 14-93331A | |
| Parafilm M | Fisher Inc. | 13-374-12 | |
| CElixirOA detection Kit pH 5.4 | MicroSolv | 06100-5.4 | |
| BD Safety-Lok syringes | Fisher Inc. | 14-829-32 | |
| 17 mm Target Syringe filter, PTFE | Fisher Inc. | 3377154 | |
| 32 Karat, V. 8.0 control software | Beckman Coulter | 285512 | |
| capillary electrophoresis (CE) sample vials | Beckman Coulter | 144980 | |
| caps for CE vials | Beckman Coulter | 144648 | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | Liquid nitrogen is available from most facilities services |
References
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