Summary
Questo articolo presenta un metodo per l'individuazione e la quantificazione di acidi organici provenienti da materiale vegetale che utilizzano gratuitamente zonale elettroforesi capillare. Un esempio del potenziale applicazione di questo metodo, determinare gli effetti di una fermentazione secondaria sui livelli di acidi organici in semi di caffè, è fornito.
Abstract
Acidi carbossilici sono acidi organici contenenti uno o più terminale carbossilico (COOH) gruppi funzionali. A catena corta acidi carbossilici (SCCAs; acidi carbossilici contenenti da tre a sei atomi di carbonio), come malato e citrato, sono fondamentali per il corretto funzionamento di molti sistemi biologici, in cui funzionano nella respirazione cellulare e può servire come indicatori di salute delle cellule. Negli alimenti, contenuto in acidi organici può avere un impatto significativo sul gusto, con un aumento dei livelli di SCCA risultante in un gusto "acide" acida o. Per questo motivo, i metodi per l'analisi rapida dei livelli di acidi organici sono di particolare interesse per le industrie alimentari e bevande. Sfortunatamente, tuttavia, la maggior parte dei metodi impiegati per SCCA quantificazione dipendono protocolli in termini di tempo che richiedono la derivatizzazione dei campioni con reagenti pericolosi, una costosa cromatografica e / o analisi di spettrometria di massa. Questo metodo dettagli un metodo alternativo per l'individuazione e la quantificazione dei orgGli acidi Anic da materiale vegetale e campioni di prodotti alimentari che utilizzano gratuitamente elettroforesi capillare zonale (CZE), a volte semplicemente indicato come elettroforesi capillare (CE). CZE fornisce un metodo conveniente per la misurazione SCCAs con un limite inferiore di rilevazione (0,005 mg / ml). Questo articolo descrive l'estrazione e la quantificazione dei SCCAs da campioni vegetali. Mentre il metodo fornito concentra sulla misura della SCCAs da chicchi di caffè, il metodo fornito può essere applicato a diversi materiali alimentari di origine vegetale.
Protocol
Preparazione 1. Esempio
- Montare campioni per acido carbossilico (SCCA) di estrazione a catena corta. Preparare 1,0 g di semi di caffè alla volta per assicurare che sufficiente campione rimarrà dopo l'elaborazione.
- Se i campioni sono stati congelati prima del processo di rettifica, mantenere il tessuto congelato durante la lavorazione per impedire il congelamento / disgelo danni e l'ossidazione del campione. Rimuovere il campione dal congelatore o sotto zero di stoccaggio solo se necessario per la macinazione.
- Flash congelare i campioni freschi in azoto liquido immediatamente prima di assaggiare la macinazione. Per ridurre al minimo la manipolazione del campione, congelare i campioni istantanei mettendoli in un mortaio pre-riempite con azoto liquido.
- Analizzare i campioni liquidi immediatamente dopo generazione, o congelare il flash in azoto liquido e conservare a -20 ° C o -80 ° C fino al momento dell'analisi. Prima di analisi, rimuovere i campioni congelati dallo stoccaggio e lasciar scongelare. Per i campioni di liquido procedere al punto (3,5) per l'elaborazione.
- indossare approdispositivi di protezione individuale oppor- (inclusi occhiali di protezione, guanti e camice da laboratorio) prima di intervenire con l'azoto liquido.
- Campioni di tessuto Triple-macinare una uniforme polvere fine (cioè, di uniformità delle particelle) in azoto liquido utilizzando una ceramica mortaio e pestello.
NOTA: Il raggiungimento di una granulometria uniforme, è essenziale per massimizzare l'efficienza di estrazione SCCA.- Pre-raffreddare la mortaio e pestello con azoto liquido prima dell'aggiunta del campione. Mantenere il mortaio riempito con un piccolo volume di azoto liquido viene aggiunto il campione.
- Utilizzando un mestolo, aggiungere abbastanza azoto liquido per la malta per sommergere completamente il campione.
- Aggiungere esempi facilmente terra, come foglie o caffè tostato, per l'azoto liquido e schiacciare con un movimento circolare di rettifica. Inizia a macinare campioni quando il livello di azoto liquido è diminuita al punto in cui esso copre appena i campioni.
- Aggiungere difficile da macinare campioni, come ad esempio uns semi del caffè crudo, per azoto liquido e consentire loro di congelare per 10-30 secondi (o fino a quando il azoto liquido smette vigorosamente bollente) prima della macinazione. Rompere il tessuto in frammenti più piccoli con un movimento di frantumazione in verticale, e il tessuto quindi completo di macinazione con un movimento circolare di rettifica.
- Ripetere passaggi 1.3.2-1.3.4 altre due volte, in modo che i campioni vengono macinati un totale di tre volte. Tipicamente, tre turni successivi di rettifica ridurranno campioni in polvere con una consistenza di farina simile.
- Se una consistenza farinosa non viene raggiunta, ripetere i punti 1.3.2-1.3.4 fino campioni vengono ridotti ad una polvere di dimensioni uniformemente piccole particelle (efficienza di estrazione è inversamente proporzionale alla dimensione delle particelle).
- Trasferimento in polvere a fiale di vetro o provette da 1,5 ml microcentrifuga. Iniziato il trattamento a valle subito dopo la macinazione (consigliato), o conservare i campioni a -80 ° C, finché i campioni sono pronti per l'estrazione.
- Se i campioni devono essere conservati primaanalisi, dividere il campione in 500 aliquote mg (o 500 aliquote microlitri per campioni liquidi) e dividere tra più tubi per lo stoccaggio. Evitare di sottoporre i campioni a cicli di gelo / disgelo ripetuti, in quanto questi possono alterare la composizione del campione e avere un impatto negativo misure dei campioni future.
2. Acido Organic Preparazione standard
- Montare gli standard autentici per i SCCAs di interesse. Questi saranno utilizzati per creare soluzioni standard interni ed esterni per l'uso per determinare le concentrazioni SCCA. Per i campioni di caffè includono citrico, malico, acetico e acido lattico come acidi di interesse e acido adipico come standard interno.
- Assicurarsi assicurarsi che lo standard interno selezionato non si trova naturalmente nel campione, e che la norma non co-eluire con altri picchi nel profilo campione.
- Eseguire le curve standard per ogni SCCA di interesse, e di determinare la gamma di risposta lineare per ogni SCCA (vedere la sezione 4 per l'esecuzione di istructions). Assicurarsi di eseguire curve standard per ogni SCCA da misurare nel campione.
NOTA: Le curve standard possono essere eseguiti sia in tampone o lo sfondo del campione da dosare. Nel secondo caso ( "aggiunta standard"), i valori per l'area del picco di ciascun punto curva standard sarà determinato sottraendo via lo sfondo del campione. - Pre-label tutti i tubi e vetreria necessari con il nome SCCA acido, la concentrazione e la data del test.
- Preparare soluzioni per ogni standard a concentrazione nota (10 mg / ml) utilizzando un pallone tarato per assicurare la precisione durante la preparazione standard.
- Sciogliere standard solidi SCCA (acido citrico e acido malico) in acqua ultrapura (18,2 MW) per raggiungere la concentrazione desiderata per la soluzione di riserva.
- Creare un 10 mg / ml soluzione madre con l'aggiunta di 100 mg di standard per un pallone tarato da 10 ml. Riempire il pallone tarato alla linea 10 ml di acqua ultrapura per dissolve l'acido.
- Creare una minore concentrazione di standard di acido o leggermente riscaldare i flaconi di guidare difficili da sciogliere standard SCCA, come l'acido adipico, in soluzione.
- Diluire standard acidi in fase liquida (acido acetico e acido lattico) in acqua ultrapura per ottenere la concentrazione desiderata.
- Pre-riempire un pallone tarato con 5 ml di acqua ultrapura. Aggiungere abbastanza acido per preparare una soluzione di 10 mg / ml (calcolata utilizzando la densità dell'acido fornito dal fornitore) al pallone e quindi aggiungere acqua sufficiente per portare il volume finale della soluzione a 10 ml.
- Sciogliere standard solidi SCCA (acido citrico e acido malico) in acqua ultrapura (18,2 MW) per raggiungere la concentrazione desiderata per la soluzione di riserva.
- Trasferire ogni soluzione madre in una provetta pulita di vetro da 15 ml, con un politetrafluoroetilene (PTFE) rivestito tappo, e sigillare con la pellicola di paraffina plastica. Le soluzioni madre possono essere memorizzati in tubi sigillati a 4 ° C per 1 settimana.
- Garantire che le norme SCCA non hanno precipitato dalla soluzione prima dell'uso se soluzioni madre sono state in frigorifero dopo preparzione. Unità precipita di nuovo in soluzione attraverso il riscaldamento delicato.
- Preparare la soluzione di estrazione SCCA. Include standard interno ad una concentrazione sufficiente per la rilevazione nei campioni (0,05 mg / ml). Preparare abbastanza soluzione per estrarre tutti i campioni.
- Preparare 50 ml di soluzione di estrazione SCCA diluendo la soluzione madre standard interno a 0,05 mg / ml in acqua ultrapura. Aggiungere 250 ml di soluzione madre standard interno (10 mg / ml) a 49,75 ml di acqua.
- Se l'estratto deve essere diluito, regolare la concentrazione standard interno nella soluzione di estrazione in modo che la concentrazione finale rientrare nei limiti di quantificazione (dando un rilevabile, ma non troppo saturi, picco, vedi 5.2.2) del sistema CE dopo diluizione (0,05 mg / ml).
- Preparare la soluzione di estrazione fresca per ogni serie di estrazioni (cioè, per ogni serie sperimentale).
- Preparare i campioni della curva standard(Una serie di diluizioni appropriate) per SCCAs di interesse, utilizzando un minimo di almeno 5 punti. Le concentrazioni curva standard impiegate dovranno essere nell'intervallo risposta lineare per un dato SCCA, e misurano le concentrazioni SCCA attese nei campioni.
- Include standard interno selezionato nelle soluzioni curva standard per consentire la quantificazione dello standard interno in campioni. Lo standard interno sarà utilizzato per aiutare nella identificazione dei picchi e calcolando l'efficienza di estrazione (sezione 6).
- Diluire ciascun SCCA alle concentrazioni sopra determinato (0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 mg / ml, vedi sopra, 2.4.2) in nuove provette da microcentrifuga (una per ciascuna concentrazione / punto curva standard) con acqua ultrapura. Preparare 1 ml di soluzione per ogni punto di concentrazione curva standard. Assicurarsi che ogni punto di concentrazione contiene tutti e quattro gli standard di acido e lo standard interno alla concentrazione corretta.
- Preparare nuovi punti curva standard per ogni setdi campioni da eseguire sul sistema elettroforesi capillare. Tenere i campioni standard curva SCCA a 4 ° C fino al momento dell'analisi, che avverrà dopo l'estrazione di SCCAs da tessuti bersaglio (sezione 3).
3. Organic Acid Extraction
- provette dei campioni pre-etichetta, la preparazione almeno un tubo per ogni campione da estrarre.
- Rimuovere i campioni da estrarre dal magazzino e disporli sul ghiaccio durante la pesatura fuori materiale per l'estrazione.
- Pesare 100 mg di campione per l'estrazione SCCA.
- Dopo la pesatura ogni campione, il trasferimento di tessuto ad un 1,5 ml provetta pulita. Misurare una quantità di campione più vicino alla massa bersaglio possibile per ridurre la variabilità.
- Tenere traccia della massa di ciascun campione misurato, come la quantità di SCCAs rilevati verranno normalizzati utilizzando la massa del campione (vedi 6.5.2, di seguito).
- Dopo aver soppesato tutti i campioni, aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione (il water + miscela standard interno dal punto 2.4) a ciascuno dei tubi di campione. Mantenere il rapporto di soluzione di estrazione di massa del tessuto stesso in tutte le estrazioni (in questo caso 1 ml per 100 ± 5 mg di tessuto). Mescolare bene vortex per 10 secondi.
- Lasciare che i campioni di sedersi a temperatura ambiente per 1 ora. Durante questa ora, mescolare ogni tubo ogni 15 minuti come al punto 3.4.
- Dopo 1 ora di estrazione, mescolare i campioni un'ultima volta e trasferire le provette dei campioni a una microcentrifuga. Centrifugare i campioni a 4 ° C, 10.000 xg per 10 minuti per precipitare materiale solido (pareti cellulari, particelle, ecc).
- Durante l'elaborazione di campioni liquidi, aggiungere la giusta concentrazione dello standard interno, mescolare brevemente e centrifugare. Dopo centrifugazione, il trattamento di campioni liquidi identico al estratto da campioni solidi.
- Controllare il pH dei campioni per confermare che siano compatibili con l'intervallo di pH del tampone di corsa nel kit di rilevamento (passo 4.6) o un sistema tampone essendo employed. Poiché i volumi di campione sono di solito piuttosto piccola, pH può essere monitorato utilizzando carta pH.
- Preparatevi a filtrare i campioni utilizzando filtri a disco siringa montati (3.8).
NOTA: Prevenire la perdita del campione, assicurando che ogni filtro sia correttamente collegato a una siringa prima di trasferire il surnatante. Preparare una siringa dotata di un filtro disco per ogni campione da analizzare (compresi i campioni curva standard). - Dopo centrifugazione dei campioni e preparazione dei filtri per siringa, trasferire il supernatante da ogni campione a una siringa da 3 ml dotata di un filtro a siringa da 0,2 micron. Utilizzare un nuovo filtro e la siringa per ogni campione. Filtrare tutti i campioni, compresi i campioni curva standard e controlli tampone, prima esecuzione sul sistema CE.
- Filtrare il campione direttamente in una provetta pulita. Dopo il filtraggio, chiudere il tubo contenente filtrato e scartare l'apparato della siringa / filtro.
- Porre immediatamente campioni filtratinel sistema CE per il rilevamento SCCA; o campioni Conservare a 4 ° C durante la notte. Se i campioni devono essere conservati durante la notte, sigillare i tubi con la pellicola di paraffina plastica per evitare lo scambio di gas e l'evaporazione del campione.
- Se i campioni devono essere conservati più di un giorno dopo la filtrazione, estratti Flash congelare in azoto liquido o il congelamento a -20 ° C. Dopo lo scongelamento, tuttavia, garantire che ogni campione viene esaminato per la formazione precipitato e il filtro, se necessario (come nel passaggio 3.6).
4. Configurazione della SCCA Detection Run
- Consultare il manuale utente del CE per i dettagli specifici del software programming- e controllo.
- Preparare capillari vial elettroforesi (CE) per il rilevamento SCCA. Assicurarsi che le fiale siano adeguatamente etichettati, pulito e privo di difetti.
- Lavare e asciugare i tappi dei flaconi CE prima dell'uso.
- Lavare le protezioni da loro immergendo in acqua ultrapura e consentendo loro di ammollo durante la notte. Dopo l'immersione i tappi, scartare il immergereing soluzione e sciacquare i tappi per altre due volte con acqua ultrapura.
- Trasferimento risciacquato tappi per una superficie di essiccazione pulita foderato con tessuto privo di lanugine e lasciare asciugare all'aria. Assicurarsi che le protezioni sono completamente asciutti prima dell'uso, per evitare errori di pressione.
- Trasferire 1 ml di campione per ogni fiala CE, facendo attenzione ad evitare accidentalmente spruzzi il campione nel collo del flacone. Dopo il trasferimento, mettere un tappo CE su ogni fiala.
- Se è necessaria una diluizione, diluire i campioni di semi di caffè 1:10 o 1: 100 direttamente nella fiala CE con acqua ultrapura. Per diluizioni maggiori di 1: 100, creare un diluizione intermedia per evitare errori di pipettamento.
- Preparare un flacone per ogni punto curva standard con il trasferimento di soluzioni curva standard (1,0 ml) dal punto 2.5 a fiale CE. Cap ciascun tubo dopo il trasferimento.
- Preparare una soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 0,1 M aggiungendo 0,04 g di NaOH in un becher contenente 90 ml di acqua ultrapura e permettendo ai pellets to sciogliere. Trasferire la soluzione 0,1 M di NaOH in un pallone tarato ml 100 e portare il volume totale di 100 ml.
- Aggiungere 1 ml di soluzione 0,1 M di NaOH ad una fiala pulita e CE cap.
- Preparare fiale tampone CE per ogni lotto di campioni da eseguire sul sistema CE. Kit di separazione sono disponibili o tamponi personalizzati possono essere utilizzati 13.
- Preparare 1 flacone con 1 ml di soluzione tampone di partenza e cappuccio.
- Preparare tre fiale con 1 ml ciascuno di correre soluzione tampone e cappuccio. Sostituire il tampone di corsa prima di ogni lotto di campioni e dei punti della curva standard, o dopo 35 campioni, a seconda di quale si verifica prima.
- Riempire tre fiale supplementari con 1 ml di acqua ultrapura e tappare ogni fiala.
- Preparare 1 vuoto fiala di "rifiuto" con tappo.
- Dopo aver preparato le fiale descritti al punto 4.8, caricare le fiale contenenti i buffer e acqua, nonché le fiale rifiuti (da gradini 4.8.2-5) nella vasca del buffer dei SYS elettroforesi capillareTEM, come da istruzioni del produttore 15. nota con attenzione la posizione di ogni fiala per la programmazione automatica-campionatore.
- Caricare le fiale contenenti i punti della curva standard e le fiale contenenti i campioni da dosare nel vassoio campioni di ingresso, come descritto nelle istruzioni del produttore. Nota la posizione di ogni fiala per la programmazione automatica-campionatore (vedere i passaggi 4.11.1 sotto).
- Preparare condizionata e metodi di separazione del campione (programmi per questi sono forniti nelle tabelle, rispettivamente, 1 e 2,), e scrivere un file di sequenza di esempio come da istruzioni per l'uso dello strumento. Utilizzare il metodo di separazione descritto in Tabella 2: lavare la colonna con iniziatore (20 psi) per 0,2 min; lavare con acceleratore (20 psi) per 0,5 min, l'iniezione di campioni (0,5 psi) sulla colonna per 0,09 min, campioni separati a 20 kV per 12 min, lavare con NaOH (20 psi) per 0,5 min, ed infine risciacquare con acqua ( 20 psi) per 0,5 min.
- Using il software di controllo CE, prego scrivere la sequenza-campione esecuzione (cioè, l'elenco di lavoro; un file elenco dettagliato l'ordine in cui saranno analizzati i campioni, e il metodo da utilizzare per separare ogni campione) utilizzando l'interfaccia foglio "sequenza". Ogni riga sul foglio elettronico sarà conforme a una corsa del campione e produrre un singolo file di dati.
- Assicurarsi che durante la scrittura del file di sequenza, i campioni vengono identificati utilizzando la corretta posizione nel vassoio di campionamento. Assicurarsi che ogni file di dati ha un nome univoco per evitare che il software di sovrascrivere i file precedenti. capillare condizionamento programma viene eseguito CE come una sequenza separata prima della corsa sequenza contenente il metodo di separazione del campione.
- Iniziare la sequenza di campionamento eseguito con le soluzioni della curva standard, seguito da campioni SCCA, e terminare con una seconda serie di soluzioni curva standard. Ciò consentirà un calcolo del grado di perdita di segnale che si verifica durante analisi dei campioni. </ Ol>
- Using il software di controllo CE, prego scrivere la sequenza-campione esecuzione (cioè, l'elenco di lavoro; un file elenco dettagliato l'ordine in cui saranno analizzati i campioni, e il metodo da utilizzare per separare ogni campione) utilizzando l'interfaccia foglio "sequenza". Ogni riga sul foglio elettronico sarà conforme a una corsa del campione e produrre un singolo file di dati.
Tabella 1: Condizionata programma di metodo utilizzato per preparare il capillare per filiera corta separazione acido carbossilico tramite elettroforesi capillare a.
Tabella 2: programma di metodo di separazione utilizzato per le analisi a catena corta acidi carbossilici tramite elettroforesi capillare a.
5. SCCA Detection Run esecuzione e raccolta dati
- Avviare percorsi di condizionamento capillari. Aspettatevi di condizionare il capillare due o tre volte prima che la colonna è pronta per la separazione del campione. Colonna condizionamento deve essere eseguita come descritto in Tabella 1. Brevemente, risciacquare colonna con 0,1 M di NaOH (20 psi) per 1 min, lavare con acqua (20 psi) per1 min, risciacquare con iniziatore (20 psi) per 0,5 min, sciacquati con acceleratore (20 psi) per 0,5 min, acceleratore separato 30 kV per 10 minuti, risciacquare colonna con 0,1 M di NaOH (20 psi) per 0,5 min, ed infine lavare la colonna con acqua (20 psi) per 0,5 min.
- Condizionare la capillare prima di ogni esecuzione sequenza di campioni. Raggiungere condizionamento adeguato, mantenendo la tensione di separazione è costante per tutta la corsa e osservando una linea di base piatta sulla traccia fotodiodi.
- Dopo il condizionamento, avviare la separazione del campione aprendo il menu "controllo" del software e selezionare (ad esempio, cliccando su) "sequenza di esecuzione." Monitorare la traccia fotodiodi (PDA) per garantire la separazione corretta.
- Osservare la prima traccia e far sì che esso ha una linea di base piatta e pulita risolto (risoluzione di base), singoli picchi di acido. Over-caricati i campioni mostreranno coda lunga di picco, o di picco tailing, e dovranno essere diluito (figura 1).
Figura 1:. Un confronto tra PDA tracce evidenziando un campione di sovraccarico Con l'aumento della concentrazione di analiti, la geometria picco individuo può cominciare a diventare asimmetrica. A (a) 0,05 mg / ml, acido acetico presenta un ben definito, picco simmetria bilaterale. Come aumenta la concentrazione di acido acetico (b) 0,07 mg / ml e (c) 0,10 mg / ml, si forma un picco di coda (frecce). Questo tailing picco è una buona indicazione che il campione è in sovraccarico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Al termine della corsa di sequenza, aprire i file di dati uno alla volta nel software di analisi CE e integrare i picchi.
- Integrare i picchi del campione.
- Aprire il primo filee impostare la procedura di integrazione automatici per escludere la prima 3 min della corsa (in cui la tensione, e quindi la direzione di flusso della colonna, viene invertito come descritto nella Tabella 1). Nello stesso menu, impostare i criteri di selezione di punta per una larghezza di picco minimo di 50 unità e l'area di picco di 100 unità (o le impostazioni di default del produttore) per fornire un moderatamente elevato livello di selettività, che separa i picchi di acido dal rumore di fondo nella traccia.
- Verificare manualmente i confini di punta e linee di base per ogni traccia PDA per garantire una corretta integrazione di picco. Picchi non correttamente integrati (per esempio, un picco SSCA leggermente asimmetrica che è stato integrato da due picchi separati da parte del software automatizzato) dovranno essere nuovamente integrati manualmente.
- Integrare i picchi del campione.
- Dopo l'integrazione, visualizzare il report zona per cento, quindi evidenziare e copiare il rapporto zona per cento e incollarlo in un foglio di calcolo separato. Ripetere l'operazione per ogni campione per costruire il picco RELAZIONE piena corsat con ogni riga rappresenta un singolo picco (es., ogni picco dovrebbe contenere un singolo composto se la separazione funziona bene).
Analisi 6. Dati
- Preparare i dati per l'analisi utilizzando il foglio di calcolo costruito in (5.4). Iniziare analisi etichettando norme acido per ciascuno dei punti della curva standard, compreso lo standard interno.
- Calcolare un indice di conservazione per ogni picco dividendo il tempo di ritenzione per ogni picco del campione per il tempo di ritenzione dello standard interno in quel campione. Ordinare i set di dati per l'indice di ritenzione risultante per identificare i picchi di interesse in ogni campione.
- Dopo aver identificato il picco per ogni acido di interesse, costruire le curve standard per ogni acido utilizzando i punti della curva standard esterno.
- Generare una curva standard (concentrazione) per ciascuno standard SCCA determinando l'area di picco per ciascuna concentrazione degli standard SCCA, e riportando concentrazione sul xaxis vs area del picco sulla y. Tracciare la regressione lineare per ogni curva standard SCCA e definire l'equazione pendenza (y = mx + b).
- Assicurarsi che R 2 valori delle regressioni lineari sono 0,90 o superiore, come quantificazioni sono più accuratamente eseguite nella gamma lineare della curva standard.
- Calcolare la concentrazione di acido per un dato SCCA in un campione mediante l'area di picco e l'equazione pendenza della retta di regressione lineare della curva standard (calcolati in 6.3.2 sopra). Brevemente, dividere l'area del picco osservata per un dato acido dalla pendenza della linea di regressione per la curva standard di acido.
- Correggere i valori di concentrazione grezzi calcolati al punto 6.4 per la perdita di campione durante la lavorazione utilizzando lo standard interno (punto 6.5).
- Calcolare il fattore di correzione per ogni campione mediante standard interno.
- Dividere la concentrazione effettiva dello standard interno (cioè, il knoquantità wn aggiunto all'inizio dell'esperimento) dal valore osservato dello standard interno nel campione (cioè la quantità calcolata utilizzando l'equazione pendenza della curva standard per lo standard interno). Moltiplicare i valori di concentrazione prime di ciascun SCCA nel campione per questo fattore di correzione.
- Dividere la standard interno concentrazione corretta SCCA dalla massa del campione utilizzato per l'estrazione per correggere eventuali variazioni in massa del campione. Questo calcolo produce quantità di analita per massa del campione (mg per mg SCCA caffè macinato in questo esempio), che possono poi essere convertito nelle unità appropriate per il dato studio (mg / mg, mg / g, g / g, etc. ).
- Dopo aver calcolato concentrazioni SCCA (normalizzata a uno massa [per campioni solidi o liquidi] o volume [per campioni liquidi]), utilizzare questi valori per l'analisi statistica secondo le esigenze del disegno sperimentale e domande di interesse.
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Representative Results
Questo protocollo è stato utilizzato con successo per misurare gli effetti dei trattamenti di semi al contenuto SCCA di semi di caffè verde. In questo esperimento, i sei trattamenti erano: una sospensione microbica satura di Leuconostoc pseudomesenteroides ceppo GCP674 nel suo mezzo di coltura (1), una sospensione acquosa di GCP674 microbi in acqua (2), una soluzione acquosa di acido acetico e acido lattico (0,15 e 0,4 mg / ml) (3), un trascorso M1 trattamento terreno di crescita (4), dH 2 O acqua (5), e un controllo non trattato (senza sostanza aggiunta ai semi) (6). I trattamenti sono stati applicati e lasciato fermentare per 24 ore. Quattro repliche indipendenti sono stati valutati per ogni trattamento. L'analisi è stata condotta per citrico (C), malico (M), acetico (A) e livelli lattico (L) acido con acido adipico come standard interno.
Per ogni SCCA e lo standard interno, curve standard che abbracciano tegli gamma di concentrazioni prevede essere in campioni di caffè (5, 10, 20, 40, 60, e 80 ng / mL) sono stati generati. Come previsto, ogni acido mostrato una risposta lineare per questa gamma di concentrazione con valori di R-squared di 0,9876 per l'acido citrico, 0,9987 per acido malico, 0.9998 per l'acido acetico, e 0,9999 per l'acido lattico. Lo standard interno (acido adipico) anche mostrato una risposta lineare su questo intervallo di concentrazione, ottenendo un valore di R al quadrato di 0,9984. Prima della analisi dei campioni, limiti di rilevabilità (LOD) e limite di quantificazione (LOQ) sono stati determinati per ciascun SCCA e lo standard interno (acido adipico). Il limite di rivelazione di citrico, malico, acetico e acido adipico è 1 ng / ml; e il LOD per acido lattico era di 2 ng / ml. Il limite di quantificazione di citrico, adipico, acido acetico e acido lattico era di 4 ng / ml; e il LOQ per l'acido malico è 2 ng / ml. Per calcolare la percentuale di recupero SCCAs e acido adipico, il caffè è stata aggiunta una singoli SCCAs o acido adipico e processed utilizzando il protocollo descritto sopra. La percentuale di recupero è stato quindi calcolato utilizzando la seguente formula ([{area del picco spillo campione - campione di controllo area del picco} / teorica area del picco di concentrazione calcolata di campione spillo {generato attraverso l'analisi del buffer + SCCA / adipico picco acido}] x 100) . Utilizzando questo metodo, abbiamo calcolato recuperi per cento dei 106.08% ± 12.66 per l'acido citrico, 98.35% ± 1,15 per l'acido malico, 91.94% ± 3.07 per l'acido acetico, 97.42% ± 1,48 per l'acido lattico, e 100.19% ± 2.57 per l'acido adipico.
Per determinare la precisione del metodo, la variabilità intra e inter-giorni di misurazioni effettuate con CZE stato anche calcolato. Per determinare la variabilità intra-day, campioni di ogni SCCA e acido adipico sono stati misurati da un campione di caffè singolo cinque volte in un periodo di 24 ore, e coefficienti di variabilità (COV; calcolato dividendo la deviazione standard in area del picco [o la concentrazione] for ogni SCCA dalla superficie media di picco [o la concentrazione] per quella SCCA, e moltiplicando il risultato per 100) per ciascun composto sono stati calcolati utilizzando l'area del picco. Per valutare l'importanza di correggere campioni utilizzando standard interno, il coefficiente di varianza per ciascun SCCA stato anche calcolato utilizzando le concentrazioni di ciascun SCCA calcolati utilizzando acido adipico come standard interno. Come previsto, il metodo CZE era in grado di misurare con precisione SCCAs e acido adipico, con COV di 3,02% per l'acido citrico, 2,64% per l'acido malico, 3,74% di acido acetico e 2,01% per l'acido adipico (acido lattico era inferiore LOD / LOQ per tutti i campioni di caffè misurato). Queste misure sono state ripetute su un periodo di cinque giorni, e il CV variava 2,11-5,25% per l'acido citrico, 2,01-5,32% per l'acido malico, 1,72-3,74% per l'acido acetico, e 1,26-3,82% per l'acido adipico. Quando le aree dei picchi sono stati corretti utilizzando lo standard interno e calcolate le concentrazioni di SCCA sono stati utilizzati per il calcolo COV, i COV intra-day variava from 1,08-4,17% per l'acido citrico, 1,47-3,40% per l'acido malico, e 2,68-5,10% per l'acido acetico. Per valutare la variabilità inter-giorno, SCCAs in un campione di caffè singolo sono stati misurati una volta al giorno su un periodo di cinque giorni. Questo esperimento è stato poi ripetuto cinque volte per ogni SCCA e acido adipico. Il COV per ogni SCCA è stato quindi calcolato dividendo la deviazione standard in area del picco (o concentrazione) per ogni SCCA dalla superficie media di picco (o concentrazione) per tale SCCA e moltiplicando per 100. Per valutare l'importanza di campioni correzione usando l'interno standard COV sono stati anche calcolati utilizzando le concentrazioni di ciascun SCCA calcolati utilizzando acido adipico come standard interno. Il metodo CZE era in grado di riprodurre in modo affidabile misurazioni SCCA, con COV vanno dal 5.24-10.02% per l'acido citrico, 6,55-9,47% per l'acido malico, 7,67-8,63% per l'acido acetico, e 3,08-6,57% per l'acido adipico. Quando le aree dei picchi sono stati corretti utilizzando lo standard interno e concentrazioni di SCCA calcolati sono stati utilizzati per caCOV lculated, i COV inter-giorno variava 4,56-6,23% per l'acido citrico, 3,39-4,99% per l'acido malico e 9,5-10,94% per l'acido acetico.
Figura 2: esempio PDA ripercorre con picchi indicati i campioni di caffè verde sono stati diluiti 1:10 prima di caricare in fiale CE.. Acidi di interesse sono indicati:. Acido acetico (A), acido citrico (C), acido lattico (L), acido malico (M) e lo standard interno, acido adipico (IS) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
L'analisi statistica è stata condotta su concentrazioni di acido corretti utilizzando un modello lineare generale (GLM) per determinare se i trattamenti alterati livelli di acidi organici. Un modello che incorpora "trattamento" x "run" (codificato come un fattore casuale) è stato implemen Ted per la GLM. confronti a coppie Tukey al 95% sono stati utilizzati per determinare la direzionalità dei cambiamenti.
Il trattamento alterato le concentrazioni di SCCA nel caffè verde. L'acido acetico è stato significativamente arricchito in tutti i trattamenti sopra il alcun controllo trattamento (GLM, p <0,0001).
Figura 3:. Impatto del trattamento sui livelli di acidi organici nel caffè verde Il trattamento ha avuto alcun impatto sulla (a) citrico o acido malico livelli nel caffè verde. Tuttavia, tutti i trattamenti significativamente aumentati (b) i livelli di acido acetico rispetto ai controlli di trattamento (GLM, p <0.001). Aumenti dei livelli di acido acetico sono state maggiori con il trattamento di media microbo +. Le lettere indicano differenza significativa per confronti a coppie Tukey al 95%.e.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
L'incremento maggiore è stato osservato nel microbo + mezzi di trattamento, che ha aumentato 0,25 volte (0,5 vs 0,4 mg / g di caffè in GCP674 vs. NT). Una tendenza simile è stata osservata nei livelli di acido lattico, anche se non erano significativamente differenti. Non ci sono stati cambiamenti significativi o tendenze negli altri acidi cingolati (citrico e acido malico).
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Discussion
Come con qualsiasi tecnica analitica, ci sono diversi fattori critici che possono influenzare significativamente la qualità e l'affidabilità dei dati generati. In primo luogo, è importante trattare i campioni in modo efficiente, con un minimo di cicli di congelamento / scongelamento. Ripetuti di congelamento e scongelamento possono compromettere la composizione chimica del campione prima della trasformazione o analisi. In secondo luogo, è fondamentale applicare i passi di questo protocollo per tutti i campioni in modo coerente e uniforme. Errori tecnici derivanti dalla preparazione dei campioni incoerente e la manipolazione possono influenzare in modo significativo la qualità dei dati generati, e provocare un aumento della "rumore" nelle misure SCCA. Ad esempio, la dimensione delle particelle del campione post-macinazione urterà la velocità e l'efficienza di estrazione SCCA. È pertanto fondamentale garantire che i campioni vengono macinati ad una granulometria uniforme, in quanto ciò mantenere l'efficienza di estrazione di tutti i campioni e contribuire a ridurre la variabilità del campione a campione. Similarly, misurazione accurata e pipettaggio durante la preparazione di soluzioni standard, misurazione accurata delle masse campione, e un attento monitoraggio (e la normalizzazione) dei tempi di estrazione si tradurrà nella generazione di dati più uniformi. Prendendo tempo per normalizzare con attenzione, misura e registra ciascuno di questi parametri sarà garantire l'affidabilità dei dati e consentire accurata correzione post-run dei dati per eventuali errori di elaborazione che possono verificarsi. In terzo luogo, è fondamentale per selezionare e utilizzare uno standard interno adeguato. I calcoli della concentrazione dell'analita finale si baserà molto sulla correzione accurata sulla base l'area del picco dello standard interno osservata in ogni campione. Per questo motivo, è fondamentale che lo standard interno sia entrambe misurate con accuratezza e precisione; e non dovrebbe idealmente verificarsi naturalmente nel campione o co-eluire con altri composti. Non solo la scelta corretta e l'uso di uno standard interno in tutti i campioni consentono al ricercatore di controllo FOr cambiamenti nei livelli dei metaboliti osservati a causa delle differenze in termini di efficienza di estrazione; ma anche semplifica notevolmente l'elaborazione a valle e l'identificazione di picco. Infine, è necessario monitorare l'identificazione dei picchi e processo di integrazione. Mentre algoritmi di elaborazione automatizzati sono utili, non sono perfetti. I dati generati da questa tecnica si basano sulla precisione di integrazione, e le tracce devono essere controllati manualmente per garantire la qualità di eventi di integrazione, in particolare la definizione dei confini di punta e linee di base.
Come con qualsiasi procedura di analisi, è importante stabilire che il metodo CZE qui presentato è: a. accurate: in grado di determinare la quantità di un dato SCCA presente; b. preciso: in grado di quantificare in modo riproducibile SCCAs entro lo stesso giorno e per le misurazioni effettuate attraverso diversi giorni di analisi; e c. robusto: grado di recuperare gran parte del SCCAs presente nei campioni da analizzare. Come indicato sopra nei res rappresentativiULT, il metodo qui descritto è in grado di determinare con precisione la quantità di SCCAs presente nei campioni. Tutto il SCCAs misurata (citrico, malico, acetico e acido lattico) e dello standard interno (acido adipico) hanno mostrato una risposta lineare nell'intervallo di concentrazione 0-80 ng / ml. Inoltre, i LOQ e limiti di determinazione per questi acidi variava 2-4 ng / ml e 1-2 ng / ml, rispettivamente. Il metodo è stato anche preciso, come tutti i SCCAs misurati e lo standard interno acido adipico esposto bassa variabilità intra-day, che cade tra il 2,0-5,5% dell'area del picco (o tra 1,0-5,2% della concentrazione calcolata) per tutte le SCCAs misurato. La variabilità inter-giorno delle misurazioni SCCA è stato anche relativamente bassa, compresa tra 3,05-10,10% dell'area del picco (o tra 3,30-10,95% della concentrazione calcolata) per tutti SCCAs misurati. È interessante notare che, con l'eccezione di acido acetico, che era costantemente in corrispondenza o prossimità del limite di rilevazione / quantificazione in tutti i campioni di caffè analyzed, correggendo campioni utilizzando acido adipico come standard interno comportato misure più riproducibili e una diminuzione del coefficiente di variabilità (vedi Risultati rappresentativi, sopra). Questi dati sono in linea con i risultati precedentemente pubblicati indicano che la correzione di uno standard interno è essenziale per mantenere la precisione in CE analisi nel tempo 16. Mentre alcuni metodi sono impiegati ioni inorganici come standard interno, riteniamo che l'acido adipico era un livello più appropriato per il metodo CZE qui presentato, in quanto è un acido organico e quindi più probabile che si verifichino perdite nella preparazione del campione passaggi simile a quella sperimentata dai SCCAs di interesse nel campione. L'acido adipico aveva i vantaggi supplementari di non essere presenti nei campioni di caffè in esame, esibendo una risposta lineare attraverso le stesse concentrazioni utilizzate per SCCAs in questo studio, esibendo relativamente basso LOD / valori LOQ (1 ng / ml e 4 ng / ml, rispettivamente), unda alta percentuale di recuperabilità dalla matrice caffè (100.19% ± 2,57), che lo rende uno standard utile per quantificare SCCAs in campioni di caffè. È interessante notare che il recupero alta percentuale osservata per l'acido adipico è stato raggiungibile per tutti gli acidi organici rilevati in questo studio, che esibivano i valori percentuale di recupero che vanno 91,94-106,08%. Questi dati indicano che il metodo CZE qui presentato è in grado di recuperare gran parte del SCCAs presente nei campioni di caffè.
Adattamento questo protocollo per nuovi tipi di campione richiede la raccolta di dati preliminari, sulla base della letteratura o l'evidenza empirica, per quanto riguarda gli importi attesi di analiti mirati. Queste informazioni vi aiuteranno a guidare il disegno sperimentale, la preparazione del campione, e la costruzione curva standard. Determinazione della diluizione del campione corretto da utilizzare può essere facilmente realizzata empiricamente eseguendo una serie di diluizioni di un estratto di prova per trovare una diluizione funzionamento adeguato. Questo protocollo è stato progettato per rilevare laSCCAs delineato in risultati di esempio, ma può essere facilmente adattato per rilevare altre SCCAs alterando i parametri di separazione, quali la tensione di separazione, pressione, o il tempo. È importante ricordare, tuttavia, che modifica i parametri di separazione può modificare il numero di cicli che possono essere realizzate in un unico insieme di buffer di separazione come questi buffer degradano con l'uso. il degrado di base o cambiamenti di corrente sono spesso manifestazioni di oltre-usato / buffer impoverito. Sostituzione del tampone di corsa e ricondizionamento del capillare può spesso risolvere questi problemi. Dopo un uso prolungato, la capacità del capillare per risolvere analiti diminuirà pure. Diminuzione della stabilità della linea di base, cambiamenti drastici in tempo di ritenzione e risoluzione ridotta picco sono tutti segni che il capillare può avere bisogno di essere sostituito. È anche possibile ricevere un errore di pressione risultante dalla sigillatura impropria tra la fiala di campione e il capillare a causa di un cappuccio della fiala malato-montaggio o un flacone difettoso. Garantirei tappi adattano perfettamente nelle fiale del campione per evitare questo errore.
Tradizionalmente, metodi cromatografici quali GC-MS, GC-FID o HPLC sono stati utilizzati per rilevare SCCAs in una vasta gamma di matrici, come aria, acqua, suolo, e campioni vegetali 14. Mentre efficace, un grave inconveniente in questi metodi è la necessità di derivatize SCCAs prima del rilevamento. Derivatizzazione utilizza reagenti pericolosi al limite di rilevazione è spesso influenzata dalla efficienza della reazione di derivatizzazione 13,14. Il rilevamento di SCCAs non derivatizzati attraverso CZE evita la perdita di analiti durante la lavorazione, l'esposizione ad agenti derivatizzazione pericolosi, e riduce i tempi di preparazione del campione. Questi benefici possono essere visti nei tassi di recupero ad alta percentuale (che variano tra 91,94-106,08%) calcolati per tutti SCCAs misurati in questo studio. Inoltre, CZE quantificazione SCCAs raggiunge limiti di rilevabilità paragonabili a quelli riportati in letteratura per GC-MS, GC-FID e HPLC, nell'intervallo oparti per milione F a parti per miliardo 13,14. Se combinato con tempi di esecuzione ad alta velocità, potenza di separazione ad alta risoluzione, i protocolli di trattamento del campione straight-forward impiegati da questo metodo di analisi, la sensibilità e la convenienza di CZE ne fanno una valida alternativa ai metodi GC o HPLC tradizionali.
Tuttavia, è importante notare che, mentre CZE fornisce diversi vantaggi rispetto GC-MS HPLC o in base LC-MS / MS metodi di analisi SCCA, non è appropriato per tutte le analisi SCCA. Ad esempio, dato che il metodo CZE qui descritto si basa unicamente sulla rilevazione spettrofotometrica, che non consente l'identificazione di SCCAs sconosciuti presenti nel campione, o la conferma SCCA identità tramite profili spettrali di massa. A causa di questo, GC-MS o LC-MS / MS metodi sarebbe più adatto per SCCA analisi in campioni contenenti un gran numero di SCCAs sconosciuti, o campioni nei quali è fondamentale per confermare l'identità di tutti i SCCAs presenti.Inoltre, i metodi basati come riportato in precedenza LC-MS / MS permettono di limiti più bassi di rilevazione (LOD) media -on, 0,05 mg / ml per LC-MS / MS 17 vs. il 1 mg / ml per CZE ottenuti utilizzando il metodo presentato qui-LC-MS / MS quantificazione basata su SCCAs può essere più appropriato per i campioni in cui SCCAs sono presenti in quantità molto basse o in tracce.
Il protocollo presentato qui si concentra sull'estrazione e la quantificazione degli acidi carbossilici a catena corta (SCCAs) da tessuti vegetali. Ottenere competenza in questa tecnica si aprirà la porta a una vasta gamma di applicazioni di questa tecnologia per l'individuo ricercatore. Questa tecnica, con solo lievi variazioni nella metodologia, è stato impiegato con successo nell'analisi di SCCAs in una popolazione eterogenea di campioni e substrati, che vanno dai prodotti alimentari e campioni di tessuto all'acqua ambientale e campioni di terreno 8. Inoltre, guadagnando la familiarità con i principi chimici sottostantiquesta tecnologia anche se questo protocollo sarà fornire ai ricercatori la base di conoscenze necessaria per tentare l'analisi di altri composti, come i carboidrati o metalli 8,13. La flessibilità analitica di elettroforesi capillare rende uno strumento straordinariamente potente adatto per una miriade di applicazioni sperimentali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ceramic Moarter and Pestle | Coorstek | 60310 | |
| Beckman Coulter P/ACE MDQ CE system | Beckman Coulter | Various | |
| Glass sample vials | Fisher Inc. | 033917D | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Inc. | 02-681-5 | |
| LC/MS grade water | Fisher Inc. | W6-1 | Milli-Q water (18.2 MΩ·cm) is also acceptable |
| 15 ml glass tube/ Teflon lined cap | Fisher Inc. | 14-93331A | |
| Parafilm M | Fisher Inc. | 13-374-12 | |
| CElixirOA detection Kit pH 5.4 | MicroSolv | 06100-5.4 | |
| BD Safety-Lok syringes | Fisher Inc. | 14-829-32 | |
| 17 mm Target Syringe filter, PTFE | Fisher Inc. | 3377154 | |
| 32 Karat, V. 8.0 control software | Beckman Coulter | 285512 | |
| capillary electrophoresis (CE) sample vials | Beckman Coulter | 144980 | |
| caps for CE vials | Beckman Coulter | 144648 | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | Liquid nitrogen is available from most facilities services |
References
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