This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.
This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.
Multi-cellulære bakterielle samfund spiller en væsentlig rolle i naturlige og menneskeskabte miljøer, og kan være en fordel eller meget skadelig. Disse flercellede kolonier er kendt som biofilm, hvor de enkelte celler er indlejret i en egenproducerede ekstracellulære polymere stoffer (EPS) matrix. EPS kraftigt klæbe cellerne til overfladen, de koloniserer. De tjener som et skjold mod mekaniske og kemiske kræfter og skabe tæt kontakt mellem de omkringliggende celler, lette cellulær kommunikation 1. En biofilm kan ses som et differentieret samfund, hvor cellerne bruger stærkt reguleret, orkestreret processer for at koordinere deres aktiviteter i samfundet, samt på tværs af arter 2-5. Overgangen fra et planktoniske, fritlevende tilstand af vækst til en biofilm tilstand er ofte forbundet med udviklingsprocesser. Et godt eksempel er den grampositive jordbakterie Bacillus subtilis, og derfor et undomesticated belastning tjener som en robust model organisme for at studere de udviklingsmæssige stadier indtil biofilmdannelse. I denne bakterie, bevægelige celler organiserer sig i iøjnefaldende flercellede strukturer, der udfører specialiserede opgaver 4. En gruppe af celler, de matrix-producenter udskiller exopolysaccharider 6, det amyloid protein Tasa 7,8, og overfladen hydrofobicitet protein BslA 9,10; som alle deltager i samling af EPS 11-13.
I betragtning af den overflod af biofilm i naturlige og menneskeskabte nicher og den formodede fatale skader, de kan forårsage, er der et presserende behov for at finde måder at forebygge deres dannelse. Små molekyleinhibitorer kan støtte i opdagelsen af nye regulatoriske veje, enzymer og strukturelle proteiner involveret i biofilm dannelse, og dermed fremme indsigt i de komplekse processer flercellede samfund forsamling. Som B. subtilis er en velundersøgte model for biofilmdannelse 14,15, kan det bruges til at vurdere effekten af forskellige biofilm hæmmere. Denne undersøgelse tackler fire grundlæggende metoder, der er nøglen til evaluering af respons biofilm på inhibitorer med små molekyler. For det første at sikre, at disse inhibitorer har en biofilm-specifikt mål, adskillelse af effekten på planktoniske vækst fra effekten på biofilmdannelse er kritisk. De fleste antibakterielle midler målceller i deres planktoniske vækstfase, men molekyler, der er målrettet biofilmen livsstil er sjældne. Derudover, som molekyler, som ikke påvirker planktoniske vækst er ikke giftige, kan de reducere det selektive pres begunstige antibiotiske resistente mutanter 16. For eksempel, når biofilm behandles med D-aminosyrer eller visse andre cellevæg-interfererende molekyler, de er enten forstyrres eller skilles ad, men disse inhibitorer kun mildt påvirke planktoniske vækst 12,17. I modsætning hertil mange antibiotika drastisk forringe planktoniske vækst, med little eller ingen virkning på biofilmdannelse 17.
For det andet er afgørende indførelse af en homogen og robust eksperimentel rammer at undersøge virkningen af de små molekyler. Vi observerede, at den aktive koncentrationsområde småmolekylære inhibitorer var følsom over for de før-dyrkningsbetingelser og forsøgsopstillingen anvendes til at undersøge virkningen af disse inhibitorer med små molekyler. Forskellige rapporter, især studerer B. subtilis, afslørede variationer i koncentrationsområdet, hvor D-aminosyrer inhiberer dannelsen af pellikeler – de flydende bakterielle biofilm 12,17-19. Resultaterne præsenteres her tyder på, at følgende faktorer tegner sig for forskelle i den aktive koncentrationsområde: pre-dyrkningsbetingelser (logaritmisk 12,17 versus sen-stationær fase 20 vækst), vækstmediet anvendt i præ-kultur tilstand (rig, undefined [Luria Broth, LB] versus defineret [mononatriumglutamatglycerol, MSgg]), inokulationen forholdet og især fjernelse af præ-dyrkningsmediet inden inokulering. Temperaturen af statisk hinde vækst viste en mindre vigtig rolle i aktivitetsområdet af den lille molekyle inhibitor D-leucin, en repræsentativ D-aminosyre anvendes i denne undersøgelse.
Endelig, når de biofilm behandles med specifikke biofilm inhibitorer, der kræves robuste og informative metoder til at karakterisere effekten af disse inhibitorer på biofilm fitness. Her er to metoder til selvstændigt karakteriserer virkningen af småmolekylære inhibitorer beskrevet detaljeret: (1) Virkningen på enkeltceller i en biofilm koloni og deres resistens over for antimikrobielle midler. Celler i biofilm er typisk mere resistente over for antibiotika sammenlignet med fritlevende bakterier 21-23. Mens dette fænomen er multifaktoriel, blev evnen af EPS til at reducere antibiotikum penetration ofte betragtes som en tiltalende forklaring 24 </sup>. Denne metode vurderer overlevelsen af forud fastsatte biofilm celler efter udsættelse for antibakterielle stoffer. (2) Effekten på biofilmen koloni arkitektur, fra den store til den lille skala. Biofilm kolonier karakteriseret ved deres tredimensionale struktur og tilstedeværelsen af EPS. Ved hjælp af scanningselektronmikroskopi, kan ændringer i cellemorfologien, biofilm koloni struktur og arkitekturen og overflod af EPS visualiseres fra den store (mm) til lille skala (um).
Bacillus subtilis formularer robuste og meget strukturerede biofilm både i flydende (pellikeler) og på fast medium (kolonier). Derfor tjener det som en ideel model organisme at karakterisere virkningsmåden af specifikke biofilm inhibitorer. På faste medier, celler danner flercellede strukturer med særlige kendetegn, som ikke er tydelig i pellikeler, ligesom rynker udstråler fra midten til kanten. Således pellikeler og kolonier er supplerende systemer til at studere B. subtilis multicellula…
The authors have nothing to disclose.
Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation – Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.
Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
Bacto Agar | Difco | 214010 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
razor blade | Eddison | NA | |
circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
Shaker 37°C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
Incubator 30 °C | Binder | NA | |
Incubator 23 °C | Binder | NA | |
Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |