Methodologien für das Studium<em> B. subtilis</em> Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

Summary

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Abstract

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Introduction

Mehrzelligen Bakteriengemeinschaften spielen eine bedeutende Rolle in natürlichen und anthropogenen Umgebungen und kann vorteilhaft oder sehr schädlich sein. Diese mehrzelligen Kolonien werden als Biofilm bekannt ist, wobei die einzelnen Zellen in einer selbst hergestellten extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) Matrix eingebettet sind. Die EPS haften stark die Zellen an der Oberfläche sie besiedeln. Sie dienen als Schutzschild gegen mechanische und chemische Kräfte und schaffen einen engen Kontakt zwischen benachbarten Zellen, die Erleichterung zellulären Kommunikation ^1. Ein Biofilm kann als differenzierte Gemeinschaft betrachtet werden, in denen Zellen stark regulierten verwenden, Prozesse orchestriert ihre Aktivitäten innerhalb der Gemeinschaft zu koordinieren, sowie über Artgrenzen ^2-5. Der Übergang von einer planktonischen, wird freilebenden Modus des Wachstums eines Biofilms Zustand oft mit Entwicklungsprozessen verbunden. Ein gutes Beispiel ist die Gram-positiven Bodenbakteriums Bacillus subtilis, und daher ein undomesticated Stamm dient als robuster Organismus Modell die Entwicklungsstadien, die zu Biofilmbildung zu untersuchen. In diesem Bakterium, sich in auffälliger vielzelligen Strukturen bewegliche Zellen organisieren , die spezielle Aufgaben ⁴ auszuführen. Eine Gruppe von Zellen, die matrix-Erzeuger sekretieren Exopolysaccharide ^6, das Amyloid – Protein tasa ^7,8, und die Oberfläche Hydrophobizität Protein BSLA ^9,10; von denen alle mit bei der Montage der EPS ^11-13.

Angesichts der Fülle von Biofilmen in natürlichen und anthropogenen Nischen und die vermeintliche tödlichen Schaden, den sie verursachen können, gibt es eine dringende Notwendigkeit, Wege zu finden, ihre Bildung zu verhindern. Kleine Molekül-Inhibitoren können in der Entdeckung neuer Regulationswege unterstützen, Enzyme und Struktur der Biofilmbildung beteiligten Proteine ​​und damit fördern Einblicke in die komplexen Prozesse der vielzelligen Gemeindeversammlung. Als B. subtilis ist ein gut untersuchtes Modell für BioFilmbildung ^14,15, kann es verwendet werden , um die Wirkungen verschiedener Biofilm Inhibitoren zu bewerten. Diese Studie befasst sich vier grundlegende Methoden, die für die Bewertung der Reaktion von Biofilmen zu kleinen Molekül-Inhibitoren sind der Schlüssel. Erstens, um sicherzustellen, dass diese Inhibitoren haben einen Biofilm-spezifischen Ziel, die Trennung der planktonischen Wirkung auf das Wachstum von der Wirkung auf die Bildung von Biofilmen ist kritisch. Die meisten antibakterielle Mittel Zielzellen in ihre planktonischen Wachstumsphase, sondern Moleküle, die die Biofilm Lebensstil Ziel sind selten. Zusätzlich kann , wie Moleküle , die nicht toxisch nicht planktonischen Wachstum beeinflussen, können sie den Selektionsdruck begünstigt antibiotische resistente Mutanten ¹⁶ reduzieren. Wenn zum Beispiel Biofilme mit D-Aminosäuren oder bestimmten anderen Zellwand-störenden Molekülen behandelt werden, werden sie entweder gestört oder zerlegt werden , aber diese Inhibitoren leicht nur planktonischen Wachstums ^12,17 beeinflussen. Im Gegensatz dazu beeinträchtigen viele Antibiotika dramatisch Planktonwachstum, mit lenig oder keine Wirkung auf die Bildung von Biofilmen ^17.

Zweitens, eine konsistente und robuste experimentellen Rahmen zur Gründung der Wirkung der kleinen Moleküle zu untersuchen ist von entscheidender Bedeutung. Wir haben beobachtet, dass die aktive Konzentrationsbereich von kleinen Molekül-Inhibitoren war empfindlich auf die Vorkultur Bedingungen und zu den experimentellen Aufbau die Wirkung dieser kleinen Molekül-Inhibitoren zu untersuchen verwendet. Verschiedene Berichte, insbesondere solche B. das Studium subtilis zeigten Variationen in dem Konzentrationsbereich , bei der D-Aminosäuren , die Bildung von Häutchen hemmen – die schwimmenden bakteriellen Biofilmen ^12,17-19. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin , dass die folgenden Faktoren für Unterschiede in der aktiven Konzentrationsbereich ausmachen: Die Vorkultur Bedingungen (logarithmische ^12,17 im Vergleich zu späten stationären Wachstumsphase ^20), das Wachstumsmedium in der Vorkultur Zustand verwendet (reich, undefined [Luria Broth, LB] gegen definiert [Natriumglutamatglycerin, MSgg]), das Verhältnis der Inokulation und insbesondere die Entfernung des Vorkulturmediums vor der Inokulation. Die Temperatur des statischen Pellicle Wachstum zeigten eine weniger wichtige Rolle bei der Aktivitätsbereich des kleinen Molekül-Hemmstoff D-Leucin, einer repräsentativen D-Aminosäure in dieser Studie verwendet.

Schließlich, nachdem die Biofilme mit spezifischen Biofilm-Inhibitoren behandelt, robust und informative Verfahren erforderlich sind, um die Auswirkungen dieser Inhibitoren auf Biofilm Fitness zu charakterisieren. Hier sind zwei Methoden, unabhängig die Wirkung von niedermolekularen Inhibitoren kennzeichnen, sind im einzelnen beschrieben: (1) Die Wirkung auf die einzelnen Zellen innerhalb eines Biofilms Kolonie und ihre Resistenz gegen antimikrobielle Mittel. Die Zellen in Biofilmen sind in der Regel resistent gegen Antibiotika im Vergleich zu den Bakterien freilebenden ^21-23. Während dieses Phänomen multifaktoriell ist, wurde die Fähigkeit der EPS – Antibiotikum Penetration zu reduzieren oft als attraktiver Erklärung ²⁴ betrachtet </sup>. Diese Methode bewertet das Überleben der vorher festgelegten Biofilm-Zellen nach der Exposition gegenüber antibakterielle Substanzen. (2) Die Wirkung auf die Biofilm-Kolonie-Architektur von der großen zur kleinen Maßstab. Biofilm-Kolonien werden durch ihre dreidimensionale Struktur und die Anwesenheit der EPS gekennzeichnet. Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie, Veränderungen in der Zellmorphologie, Biofilm Koloniestruktur und die Architektur und die Abundanz der EPS kann aus der großen (mm) sichtbar gemacht werden, um die kleinen Maßstab (um).

Protocol

1. Die Beurteilung der Wirkung von niedermolekularen Inhibitoren auf Pellicle und Biofilm Koloniebildung Bereiten Sie eine 2x Lösung definierter Biofilm-induzierenden MSgg Medium 25 ohne Calciumchlorid und Eisen (III) -chlorid – Hexahydrat. Nach Filtersterilisation, das Calciumchlorid hinzu. Das Medium bereit ist, direkt zu verwenden, oder es kann in der Dunkelheit bei 4 ° C gelagert werden. Bereiten Sie die 1x MSgg Verdünnungs am Tag des Experiments. Verdünne die 2x MSgg Med…

Representative Results

Das Häutchen – Test ist eine Methode , die stark reguliert und dynamische Prozesse von B. zu studieren subtilis Vielzelligkeit. Außerdem wird der Pellicle-Assay eine Reihe von entweder pre-starter Bedingungen oder kleine Molekülkonzentrationen in einer einzigen Zellkultur Multidish Platte in einem Experiment zum Testen geeignet. Jedoch B. subtilis Pellikelbildung ist empfindlich für die Vorkultur Bedingungen (zB Wachstumsmedium der Vorkultur und der Wachstumsphase), der Inokulatio…

Discussion

Bacillus subtilis Formen robust und stark strukturierte Biofilmen sowohl in flüssiger (Häutchen) und auf festem Medium (Kolonien). Daher dient sie als ideale Modellorganismus der Wirkungsweise von spezifischen Inhibitoren Biofilm zu charakterisieren. Auf festen Medien bilden Zellen mehrzelliger Strukturen mit charakteristischen Eigenschaften, die nicht offensichtlich in Häutchen sind, wie Falten von der Mitte zum Rand hin ausstrahlen. So sind Häutchen und Kolonien ergänzende Systeme zu studieren B. sub…

Materials

Luria Broth, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G
potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher Scientific, 209.27 g/mol	BP308-500
magnesium chloride hexahydrate	Merck, 203.30 g/mol	1.05833.0250
calcium chloride anhydrous	J.T. Baker, 110.98 g/mol	1311-01
manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma, 197.91 g/mol	31422-250G-R
iron(III) chloride hexahydrate	Sigma, 270.30 g/mo)	F2877-500G
zinc chloride anhydrous	Acros Organics, 136.29 g/mol	424592500
thiamine hydrochloride	Sigma, 337.27 g/mol	T1270-100G
L-tryptophan	Fisher Scientific, 204.1 g/mol	BP395-100
L-phenylalanine	Sigma, 165.19 g/mol	P5482-100G
L-threonine	Sigma, 119.12 g/mol	T8625-100G
glycerol anhydrous	Bio-Lab Itd	712022300
L-glutamic acid monosodium salts hydrate	Sigma, 169.11 g/mol	G1626-1KG
D-leucine	Sigma, 169.11 g/mol	855448-10G
ethanol anhydrous	Gadot	830000054
razor blade	Eddison	NA
circular cellulose filter papers	Whatman, 90 mm	1001-090
glutaraldehyde	EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water	16220
paraformaldehyde	EMS, 16% in water	15710
sodium cacodylate	Merck, 214.05 g/mol	8.2067
calcium chloride 2-hydrate	Merck, 147.02 g/mol	1172113
stub-aluminium mount	EMS, sloted head	75230
carbon adhesive tape	EMS	77825-12
Shaker 37°C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Centrifuge	Eppendorf table top centrifuge 5424	NA
Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip	Branson	NA
Incubator 30 °C	Binder	NA
Incubator 23 °C	Binder	NA
Filter System, 500 ml, polystyrene	Cornig Incorporated	NA
Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 Sputter Coater	Edwards	NA
CPD 030 Critical Point Dryer	BAL-TEC	NA
Environmental Scanning Electron Microscope	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA