Metoder för att studera<em> B. subtilis</em> Biofilmer som en modell för att karakterisera Small Molecule Biofilm hämmare

Summary

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Abstract

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Introduction

Flercelliga bakteriesamhällen spelar viktiga roller i naturliga och antropogena miljöer, och kan vara till nytta eller mycket skadlig. Dessa flercelliga kolonier kallas biofilmer, varvid de enskilda cellerna är inbäddade i en egenproducerade extracellulära polymera substanser (EPS) matris. EPS kraftigt vidhäfta cellerna till ytan de kolonisera. De fungerar som en sköld mot mekaniska och kemiska krafter och skapa en nära kontakt mellan angränsande celler, vilket underlättar cellulär kommunikation ^1. En biofilm kan ses som ett differentierat samhälle, där celler använder starkt reglerad, iscensatt processer för att samordna sina insatser i samhället, liksom över arter ^2-5. Övergången från ett plankton fritt levande läge för tillväxt till en biofilm tillstånd förknippas ofta med utvecklingsprocesser. Ett bra exempel är de grampositiva jordbakterien Bacillus subtilis och därför en undomesticated stam fungerar som en robust modellorganism för att studera utvecklingsstadier som leder till biofilmbildning. I denna bakterie, rörliga celler organiserar sig i iögonfallande flercelliga strukturer som utför specialiserade arbetsuppgifter ^4. En grupp av celler, den matris producenterna utsöndrar exopolysackarider ^6, den amyloidprotein Tasa ^7,8, och ytan hydrofobicitet proteinet BslA ^9,10; vilka alla deltar i sammansättningen av de EPS ^11-13.

Med tanke på överflödet av biofilmer i naturliga och antropogena nischer och den förmodade dödliga skador de kan orsaka, det finns ett trängande behov av att hitta sätt att förhindra deras bildning. Småmolekylinhibitorer kan underlätta upptäckten av nya regulatoriska vägar, enzymer och strukturella proteiner involverade i biofilmbildning, och därigenom främja insikter i komplexa processer av flercelliga gemenskap enheten. Som B. subtilis är en väl studerad modell för biofilmbildning ^14,15, kan den användas för att utvärdera effekterna av olika biofilm hämmare. Denna studie behandlar fyra grundläggande metoder som är viktiga för att utvärdera svaret av biofilmer på småmolekylinhibitorer. För det första att se till att dessa hämmare har en biofilm-specifikt mål, är separationen av effekten på planktontillväxt från effekten på biofilm formation kritisk. De flesta antibakteriella medel målceller i deras plankton tillväxtfas, men molekyler som riktar sig mot biofilmen livsstil är sällsynta. Dessutom, eftersom molekyler som inte påverkar planktontillväxt är inte giftig, kan de minska selektionstryck gynnar antibiotikaresistenta mutanter ^16. Till exempel när biofilmer behandlas med D-aminosyror eller vissa andra cellvägg störande molekyler, de antingen störs eller demonteras, men dessa inhibitorer endast milt påverkar planktontillväxt ^12,17. Däremot många antibiotika dramatiskt försämra planktontillväxt, med little eller ingen effekt på bildning av biofilm ^17.

För det andra, är avgörande om upprättande av en konsekvent och robust experimentell ram för att studera effekten av små molekyler. Vi observerade att den aktiva koncentrationsområdet av småmolekylinhibitorer var känslig för de pre-odlingsbetingelser och i den experimentuppställning som används för att studera effekten av dessa småmolekylära inhibitorer. Olika rapporter, särskilt de som studerar B. subtilis, visade variationer i koncentrationsintervall vid vilket D-aminosyror hämmar bildningen av pellicles – de flytande bakteriella biofilmer ^12,17-19. Resultaten som presenteras här tyder på att följande faktorer hänsyn till skillnader i den aktiva koncentrationsintervall: pre-odlingsbetingelser (logaritmisk ^12,17 kontra sen stationär ²⁰ tillväxtfas), tillväxtmediet som används i pre-odlingsbetingelser (rik, odefinierat [Luria Broth, LB] kontra definieras [natriumglutamat-glycerol, MSgg]), inokuleringen förhållandet och i synnerhet avlägsnandet av den pre-kulturmedium före ympning. Temperaturen av statisk hinna tillväxt visade en mindre viktig roll i aktivitetsintervallet för den lilla molekylen hämmaren D-leucin, en representativ D-aminosyra som används i denna studie.

Slutligen, när de biofilmer behandlas med specifika biofilm inhibitorer, robusta och informativa metoder krävs för att karakterisera verkningarna av dessa inhibitorer på biofilm fitness. Här används två metoder för att självständigt karakteriserar effekten av småmolekylära inhibitorer beskrivs i detalj: (1) Effekten på enskilda celler inom en biofilm koloni och deras motståndskraft mot antimikrobiella medel. Celler i biofilmer är vanligtvis mer resistenta mot antibiotika jämfört med fritt levande bakterier ^21-23. Även om detta fenomen är multifaktoriell, har förmåga EPS för att minska antibiotika penetration ofta betraktas som en tilltalande förklaring ²⁴ </sup>. Denna metod bedömer överlevnad förutbestämda biofilmceller efter exponering för antibakteriella ämnen. (2) Effekten på biofilmen koloni arkitektur, från det stora till det lilla skalan. Biofilm kolonier kännetecknas av sin tredimensionella struktur och närvaron av EPS. Med hjälp av svepelektronmikroskop, kan förändringar i cellmorfologi, biofilm koloni struktur och arkitektur och överflöd av EPS visualiseras från den stora (mm) till den lilla skalan (nm).

Protocol

1. Att bedöma effekten av småmolekylinhibitorer på hinnan och Biofilm kolonibildning Bered en 2x lösning av definierade biofilm framkallande MSgg mediet 25 utan kalciumklorid och järn (III) klorid hexahydrat. Efter filtersterilisering, tillsätt kalciumklorid. Mediet är klar att använda direkt eller den kan lagras vid 4 ° C i mörker. Förbered 1x MSgg utspädning på dagen för experimentet. Späd 2x MSgg mediet till 1x med sterilt destillerat vatten (pellicles) eller st…

Representative Results

Pellikeln-analysen är en metod för att studera de starkt reglerade och dynamiska processer av B. subtilis flercellighet. Förutom detta är pellikeln assay lämpad för att testa ett intervall av antingen pre-starter villkor eller små molekylära koncentrationer i en enda cell-kultur multidish platta i ett experiment. Emellertid B. subtilis hinna bildning är känslig för de pre-odlingsbetingelser (t.ex., tillväxtmedium av pre-kulturen och dess tillväxtfasen), inokuleringen förhållande…

Discussion

Bacillus subtilis bildar robusta och mycket strukturerade biofilmer både i flytande (pellicles) och på fast medium (kolonier). Därför fungerar den som en idealisk modellorganism för att karaktärisera verkningsmekanismen för specifika biofilm hämmare. På fasta medier, celler bildar flercelliga strukturer med särdrag som inte är uppenbart i pellicles, som rynkor som strålar ut från centrum till kanten. Således pellicles och kolonier är kompletterande system för att studera B. subtilis fle…

Materials

Luria Broth, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G
potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher Scientific, 209.27 g/mol	BP308-500
magnesium chloride hexahydrate	Merck, 203.30 g/mol	1.05833.0250
calcium chloride anhydrous	J.T. Baker, 110.98 g/mol	1311-01
manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma, 197.91 g/mol	31422-250G-R
iron(III) chloride hexahydrate	Sigma, 270.30 g/mo)	F2877-500G
zinc chloride anhydrous	Acros Organics, 136.29 g/mol	424592500
thiamine hydrochloride	Sigma, 337.27 g/mol	T1270-100G
L-tryptophan	Fisher Scientific, 204.1 g/mol	BP395-100
L-phenylalanine	Sigma, 165.19 g/mol	P5482-100G
L-threonine	Sigma, 119.12 g/mol	T8625-100G
glycerol anhydrous	Bio-Lab Itd	712022300
L-glutamic acid monosodium salts hydrate	Sigma, 169.11 g/mol	G1626-1KG
D-leucine	Sigma, 169.11 g/mol	855448-10G
ethanol anhydrous	Gadot	830000054
razor blade	Eddison	NA
circular cellulose filter papers	Whatman, 90 mm	1001-090
glutaraldehyde	EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water	16220
paraformaldehyde	EMS, 16% in water	15710
sodium cacodylate	Merck, 214.05 g/mol	8.2067
calcium chloride 2-hydrate	Merck, 147.02 g/mol	1172113
stub-aluminium mount	EMS, sloted head	75230
carbon adhesive tape	EMS	77825-12
Shaker 37°C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Centrifuge	Eppendorf table top centrifuge 5424	NA
Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip	Branson	NA
Incubator 30 °C	Binder	NA
Incubator 23 °C	Binder	NA
Filter System, 500 ml, polystyrene	Cornig Incorporated	NA
Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 Sputter Coater	Edwards	NA
CPD 030 Critical Point Dryer	BAL-TEC	NA
Environmental Scanning Electron Microscope	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA