Introduction
Çok hücresel bakteri toplulukları doğal ve antropojenik ortamlarda önemli rol oynarlar ve yararlı ya da son derece zararlı olabilir. Bu çok hücreli koloniler tek tek hücreler, kendi kendine üretilmiş hücre dışı polimerik maddeler (EPS) matrisi içinde gömülü olup, burada biyofilm, şekilde bilinmektedir. EPS kuvvetle onlar kolonize yüzeye hücreleri yapışır. Bunlar mekanik ve kimyasal güçlerine karşı bir kalkan görevi ve hücresel haberleşme 1 kolaylaştırılması, komşu hücreler arasındaki yakın teması oluşturun. Bir biyofilm hücreleri son derece düzenlenir kullanın farklılaştırılmış topluluk olarak görülebilir, türler 2-5 genelinde yanı sıra, toplum içinde kendi faaliyetlerini koordine etmek süreçlerini düzenledi. Bir biyofilm durumuna büyüme planktonik, serbest yaşayan modundan geçiş genellikle gelişim süreçleri ile ilişkilidir. Bunun iyi bir örneği, Gram-pozitif toprak bakterisi Bacillus subtilis, ve bu nedenle undome olansticated gerilme biyofilm oluşumuna yol açan gelişim aşamalarını incelemek için sağlam bir model organizma olarak hizmet vermektedir. Bu bakteride, hareketli hücreler özel görevleri 4 yürütmek göze çarpan çok hücreli yapılara kendilerini organize. Hücre bir grup, matriks-üretici eksopolisakaridleri 6 salgılar amiloid protein tasa 7,8 ve yüzey hidrofobisite proteini BslA 9,10; bütün bunlar EPS 11-13 montajı katılırlar.
Doğal ve insan kaynaklı nişler biyofilm bolluğu ve yol açabilir varsayılan ölümcül hasar göz önüne alındığında, onların oluşumunu önlemek için yollar bulmak için acil bir ihtiyaç vardır. Küçük molekül inhibitörleri yeni düzenleyici yollar, enzimler ve biyofilm oluşumunda rol oynayan yapısal proteinlerin keşfi yardımcı ve böylece çok hücreli topluluk montaj karmaşık süreçlerde anlayışlar teşvik edebilir. B. de subtilis bio için iyi çalışılmış bir modeldirfilm formasyonu 14,15, çeşitli biyofilm inhibitörlerinin etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu çalışma, küçük molekül inhibitörleri ile biyofilm verilen yanıtın değerlendirilmesi için önemli olan dört temel yöntemler ele almaktadır. İlk olarak, bu inhibitörler, bir biyofilm belirli bir hedef sahip olmasını sağlamak için, biyofilm oluşumunu etkisi planktonik büyüme üzerindeki etkisinin ayrılması önemlidir. Çoğu antibakteriyel ajanlar planktonik büyüme fazında hücreleri hedef, ancak biyofilm yaşam tarzı hedef moleküller nadirdir. Planktonik büyümeyi etkilemeyen moleküller toksik değildir Buna ek olarak, antibiyotik dirençli mutantlar 16 lehine seçici basıncı azaltabilir. Biyofilmler, D-amino asitler ya da diğer bazı hücre duvarı etkileşmeyen molekülleri ile muamele edilir, örneğin, bu da rahatsız veya sökülmesi, fakat bu önleyicilerin sadece hafif planktonik büyüme 12,17 etkiler. Bunun aksine, çok sayıda antibiyotik önemli ölçüde l, planktonik büyümesini bozanittle veya biyofilm oluşumu 17 üzerinde hiçbir etkisi.
İkincisi, küçük moleküllerin etkisini araştırmak için tutarlı ve sağlam deneysel çerçevenin oluşturulması çok önemlidir. Bu küçük moleküllü önleyicilerinin etkin bir konsantrasyon aralığı ön kültür koşulları, bu küçük molekül inhibitörlerinin etkisini incelemek için kullanılan deney düzeneği duyarlı olduğu görülmektedir. Özellikle B. okuyan çeşitli raporlar, Kayan bakteriyel biyofilm 12,17-19 - subtilis D-amino asitler ince zarlar oluşumunu inhibe eden konsantrasyon aralığında varyasyonlar ortaya koymuştur. Burada sunulan sonuçlar, aşağıdaki faktörler aktif madde konsantrasyonu aralığı içinde farklılıkları hesaba işaret etmektedir: ön-kültür koşulları (geç durağan 20 büyüme fazının karşı logaritmik 12,17), ön-kültür durumda kullanılan büyüme ortamı (zengin, tanımlanan karşı tanımsız [Luria Broth LB] [monosodyum glutamatgliserol, MSgg]), aşılama oranı ve aşılamadan önce ön-kültür ortamı, özellikle çıkarılması. Statik zar büyüme sıcaklığı küçük molekül inhibitörü, D-lösin, bu çalışmada kullanılan Örnek D-amino asit aktivitesi aralığında daha az önemli bir rol göstermiştir.
Son olarak, bir kez biyofilm belirli bir biyofilm önleyicileri, sağlam ve bilgilendirici yöntemler biyofilm uygunluk bu inhibitörlerinin etkilerini karakterize etmek için gerekli olan ile muamele edilir. Bir biyofilm koloni ve antimikrobiyal ajanlara karşı direnç tek hücre (1) üzerine etki: Burada, bağımsız bir şekilde, küçük moleküllü inhibitörlerinin etkisini karakterize etmek için iki yöntem ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Serbest yaşayan bakteriler 21-23 kıyasla Biyofilmlererde Hücreler genellikle daha dirençli antibiyotiklere vardır. Bu olgu çok faktörlü olmasına rağmen, antibiyotik penetrasyon azaltmak için EPS yeteneği genellikle çekici bir açıklama 24 olarak kabul edildi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. zar ve Biyofilm Colony Oluşumu Üzerine Küçük Molekül İnhibitörlerinin Etkisi Değerlendirilmesi
- Kalsiyum klorür ve demir (III) klorür heksahidrat olmayan tanımlanan biyofilm uyaran MSgg ortamı 25 2x çözeltisi hazırlayın. filtre sterilizasyonu sonra, kalsiyum klorür ilave edin. ortamı, doğrudan kullanıma hazır ya da karanlıkta 4 ° C'de saklanabilir.
- Deney gününde 1 MSgg seyreltme hazırlayın.
- (Steril damıtılmış su (ince zarlar) ya da steril% 3, sıcak (80 ° C) agarı (biyofilm) 1x 50 uM (ince zarlar) ya da 250 uM nihai konsantrasyona kadar demir (III) klorür heksahidrat ekleme 2x MSgg ortamı seyreltilmiş biyofilm). istenen konsantrasyona antibiyotik veya küçük molekül inhibitörleri ekleyin ve iyice karıştırın. Örneğin, zarlarına ya biyofilm tesis 76.3 mM (10 mg / ml) D-lösin stok çözeltisi 196.6 ul 30 ml 0.5 mM, D-lösin bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir.
YOK HAYIRT:. Nihai 1x MSgg bileşimi Tablo 1 'de açıklanan orijinal tarifi 25 ile karşılaştırıldığında, ortamı 50 ug / threonin mi ve katı MSgg ortamı üzerinde biyofilm koloniler büyümeye demir konsantrasyonu buruşuk koloni morfolojisi optimize etmek için 2.5 X yükseltildi ihtiva .
- (Steril damıtılmış su (ince zarlar) ya da steril% 3, sıcak (80 ° C) agarı (biyofilm) 1x 50 uM (ince zarlar) ya da 250 uM nihai konsantrasyona kadar demir (III) klorür heksahidrat ekleme 2x MSgg ortamı seyreltilmiş biyofilm). istenen konsantrasyona antibiyotik veya küçük molekül inhibitörleri ekleyin ve iyice karıştırın. Örneğin, zarlarına ya biyofilm tesis 76.3 mM (10 mg / ml) D-lösin stok çözeltisi 196.6 ul 30 ml 0.5 mM, D-lösin bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir.
- agar Katılaştıktan sonra, aşılama öncesinde 30-45 dakika boyunca, bir biyolojik başlık katı MSgg plakaları kurutunuz.
- Zar oluşumu (Şekil 1) mekanizmalarına müdahale belirli inhibitörleri seçmek için, kullanılan konsantrasyonlar planktonik ve statik büyümeyi etkileyen ekarte.
- Stasyoner büyüme fazında kadar 600 nm'de her saat optik yoğunluk ölçülerek basit bir büyüme eğrisi planktonik büyüme (sıvı kültürde zaman optik yoğunluktaki artış) belirler.
- (CFU), ölçülen kültür bulanıklığı, canlı hücre sayısını temsil onaylamak koloni oluşturan birim sayısının belirlenmesiçeşitli zaman geçtikten sonra bir çalkalama kültürü planktonik büyüme fazında hücre.
- de, aynı koşullar altında kuluçkaya bölümlerde 1.7-1.9 tarif edildiği gibi, bir 24-yuvalı hücre-kültür, 23 ° C'de 3 günlük inkübasyon sonunda, statik pelikül büyümesi, hasat hücreleri üzerinde küçük molekül inhibitörlerinin etkisini değerlendirmek için, ve CFU belirler. Bu kontrol için, hücre dışı matris bileşenleri için kodlama operonlan yoksun bir pelikül eksikliği gerginlik kullanmak (yani, B. subtilis Δ epsH, Δ Tasa).
NOT: Bu soy, statik koşullar altında büyüme yeteneğine sahiptir, ama bir pelikül oluşturucu vahşi tip aksine, bu büyüme, artan oksijen seviyesi 26 tercih edilir, sıvı-hava ara-yüzü, yüzer yeteneği eksiktir. Böylece, bu hücre dışı matris ve zar-eksik suşu statik şartlar altında büyümeyi değerlendirmek için önerilen referans türdür.
NOT: Belirli bir exStandart olmayan D-amino asit D-lösin bol pelikül oluşumu 12,17 ekarte edildi müdahale konsantrasyonlarda, aşağıda planktonik ve statik büyüme üzerinde bir etkisi nitelendirdi. Planktonik ve statik büyüme belirlemek için yöntemler detaylı 17 tarif edilmiştir.
Şekil 1. sağlam bir deney düzeneği tanımlanması için Kavramsal genel biyofilm oluşumunun belirli önlenmesini değerlendirmek için. Planktonik büyüme üzerindeki belirgin etkisi olmadan biyofilm oluşumu ile özel girişime işaret küçük molekül inhibitörleri için seçme kriterleri. Büyük halini görmek için tıklayınız bu rakamın.
- B. dışarı Streak -80 ° C stokundan subtilis (LB Cultu% 20 gliserol içinde dondurulmuştur yeniden 10 9 hücre / ml), steril bir ucu veya kürdan ile LB-% 1.5 agar plakası üzerinde tek koloniler izole etmek.
- 30 ° C'de gece boyunca büyütün.
- KRİTİK ADIM: D-lösin gibi kurallı olmayan D-amino asidi ile güçlü bir pelikül inhibisyonu için, tek bir koloni içinde 4 saat boyunca 37 ° C 'de 3 mi LB suyu LB-% 1.5 agar plakasından aldı büyümeye inkübatör sallayarak (hızı 200 rpm sallayarak). dikkatle Süpernatan uzaklaştırılmış ve 1.5 ml ortam içinde MSgg pelet yeniden süspansiyon, 6000 x g'de, 4 dakika için 1.5 ml başlatıcı kültür santrifüjle aşılamadan önce biyofilm indükleyici MSgg ortamı ile LB suyu değiştirin. kültür geri kalanı iptal edilebilir.
Önemli: sistemin sağlamlığı temin etmek için, yıkanmıştır başlatıcı kültür, 600 nm (OD 600) de optik yoğunluk 0.6 ile 1 arasında olmalıdır. - Başlangıç kültürünün büyüme sırasında, 12-iyi hücre kültür plakası çok kaplı containin hazırlanmasıolmayan veya küçük bir molekül inhibitörü (örneğin, 0.3, 0.5, 1 mM D-lösin 17) bir konsantrasyon aralığı MSgg ortamının g 3 mi. kenar etkileri ekarte etmek, çok kaplı plaka üzerinde farklı konsantrasyonlarda yerini dağıtmak. Seçenek olarak ise, MSgg ortamın 1.5 ml ihtiva eden 24-yuvalı hücre-kültür plakaları çok kaplı kullanımı.
- (: 1000 sulandırma 1) ile yıkandı kültürlü 3 ul 12-yuvalı hücre kültürü çok kaplı plaka boşlukların aşılanması.
NOT: daha düşük seyrelme oranı, örneğin 1: 500 de kullanılabilir. Bu ince zarlar geliştirme süresini azaltır. - Üç gün boyunca statik koşullar altında, 23 ° C'de zarlarına büyütün. bu ince tabakanın nihai yüzey morfolojisini etkileyebilir olarak, bu süre içinde zarlarına hareket ettirmeyin.
- yıldırım binoküler ve homojen pozlama ile resimler elde edin. Alternatif olarak, yüksek çözünürlüklü bir kamera ile ince zarlar bir resim çekin. inconsis kaynaklanan eserler önlemek içinçadır ışık açıları ve gölgeler, bir tripod üzerinde sabit kamera ile yukarıdan aşağıya fotoğraf çekmek ve her iki taraftan 45 ° yumuşak ve büyük ışık kaynağı kullanın.
NOT: B. incelemek için alternatif bir yöntem subtilis multicellularity katı, biyofilm uyaran MSgg ortamında biyofilm koloni testtir. ince zarlar gibi, bu deney, uzaysal işlemler çalışma sağlar. küçük molekül inhibitörleri aktif aralığı tespit edildiğinde, biyofilm koloni oluşumu üzerindeki etkisi incelenebilir. - 8.5 cm çaplı bir Petri tabağı başına 4 damla - biyofilm koloniler büyümek için, simetrik yıkanmamış ön kültür, 1.5 ul bir şablon yardımıyla kurutuldu MSgg% 1.5 agar plakası üzerinde (Aşama 1.7) nokta. damla taşımadan önce plakaya adsorbe edelim.
NOT: Şablon hücreleri yetiştirilen alan içinde biyofilm koloniler eşit dağılımını almak için yardımcı olur. şablonu hazırlamak için, orijinal ölçeklerde büyüme toplam alanı çizmek eşit mezhep bölmekors ve merkezini işaretlemek. 8.5 cm çaplı bir hafta Petri kabı, bu 14 cm2 bir biyofilm koloni atar. - Üç gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin. Bu süre boyunca, biyofilm koloniler geliştirmek ve üç boyutlu, buruşuk bir yapı oluşturur.
- Adım 1.11 olarak fotoğraf çekmek.
2. Etanol Direnç Deneyi
- adımlarda 1.1-1.7 ve 1,12-1,14 açıklandığı gibi biyofilm büyütün.
- 30 ° C'de büyüme 68 saat sonra, bir jilet şablonun yardımıyla iki eşit parçaya biyofilm koloniler kesti.
Şekil 2. Örnek sterilize ajanlara biyofilm koloni hücrelerin direncini değerlendirmek için deneysel tasarım. Petri kabı üzerinde biyofilm kolonilerinin eşit dağılımı için ve kesim için kullanılan (A) Şablon. (B)tedavi edilmemiş vahşi tür biyofilm yukarıdan aşağıya görüntüleri 30 ° C 'de katı tanımlanan biyofilm uyaran MSgg ortamı üzerinde 68 saat için büyütülmüştür. Genişlemenin biyofilm koloni iki eşit parçaya kesilerek nasıl gösterir. (C), iki eşit biyofilm yarıları aynı şekilde (kontrol, PBS) ile muamele veya PBS veya ajanın sterilize ya ile tarif edildiği gibi işlenir. Ölçek çubuğu:. 1 cm bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Dikkatli bir şekilde küçük bir spatula ile agar plakasından biyofilm koloninin her yarım kaldırın ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 500 ul ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü taşıyın. Gerekirse, plakadan kalan hücrelerin kazıma ve de mikrosantrifüj tüpüne transfer edin.
NOT: biyofilm koloninin ikinci yarısında, diferansiyel tedavi, kontrol olmasına bağlı olarak ya da STERI direnci test edilirLizing ajanlar. - Kontrol için, adım 2.3 olarak 500 ul PBS içinde biyofilm koloninin ikinci yarısında kuluçkaya yatmaktadır. , Sterilize edici maddelere karşı direncinin değerlendirilmesi 500 ul% 50 (h / h) etanol ile biyofilm koloni ikinci yarısını aktarın.
NOT: sodyum hipoklorit gibi alternatif sterilize edici maddeler de kullanılabilir. Kullanılan tüm sterilizasyon maddeleri için bir hazırlık deneyinde aktif konsantrasyon ve inkübasyon süresi belirler. - Oda sıcaklığında tezgah üstünde 10 dakika süre ile biyofilm koloniler inkübe edin.
- 18.000 xg'de 5 dakika boyunca biyofilm kolonilerini Santrifüj ve dikkatli bir pipet ile süpernatant kaldırmak. PBS 300 ul ekle.
- Bir sonikatöre bir mikro uç hücreleri hafif (genlik% 10, nabız 5 sn) sonikasyon.
NOT: Sonication enerji ayrı biyofilm agrega yeterli olmalıdır. Ancak, çok sert sonication hücreleri lize olabilir. ışık mikroskobu sonication enerjisi önceden onaylayınhücrelerin lize Kullanılan ve agregalar çözündürülür olduğu. - 1 ml'lik bir son hacme kadar PBS 700 ul ekle. PBS (10 -7) seri bir seyreltme gerçekleştirmek ve steril cam boncuklar kullanılarak, bir LB-% 1.5 agar plakası üzerinde 3 dilüsyonları 100 ul yayıldı.
Not: Bu sterilizasyon ajana yanıt olarak ilgi ve hücrelerin hayatta kalma oranının biyofilm koloni hücre miktarına bağlıdır optimal seyreltileri kaplanacak bir ön deneyde tespit edilmelidir. - Gece boyunca 30 ° C'de inkübe CFU sayımı ve CFU / ml belirlemek. Her yarım biyofilm kolonilerin son CFU / ml, hayatta kalanların yüzdesi hesaplanır.
Not: gerçekleştirilen analiz tarif edildiği gibi, simetriye veya koloni direncini doğrulama kontrol biyofilm koloninin iki yarım ve canlı hücre sayısının% 10 altında farklılıkları vermelidir muamele edilmemiş biyofilm koloni etanol ile muamele edilmiş devre karşı muamele edilmemiş, , respectively. Seçenek olarak ise, sonuçlar, toplam CFU temsil edilebilir. Kontrol ve muamele edilmemiş biyofilm koloninin hücre sayımları aynı büyüklükte kalmalıdır. Buna karşılık, küçük bir molekül ile muamele biyofilm koloni etanol ile muamele edilmiş yarım hücre sayımları sterilizasyon maddesinin artan bir duyarlılık için İstem iki büyüklük en az düşmesi beklenmektedir.
Taramalı Elektron Mikroskobu için 3. Biyofilm Colony Numune Hazırlama
- adımlarda 1.1-1.7 ve 1,12-1,14 tarif edildiği gibi biyofilm koloniler büyütün.
- % 2 (hac / hac) glutaraldehit,% 3, 100 mM sodyum kakodilat içinde (hac / hac) paraformaldehit çözeltisi, 5 mM kalsiyum klorür tamponu, pH 7.3 yeni bir parti hazırlayın. 8.5 cm çapında her Petri çanağı için sabitleyici 5 ml hazırlayın.
DİKKAT: Glutaraldehyde ve paraformaldehit tehlikelidir. Bir kimyasal kaput içinde güvenlik donanımları ile anlaştım. haz çözümler ve kirlenmiş malzemeleri imhatehlikeli atık. - Dikkatle biyofilm üstünde doğrudan dağıtım olmadan, biyofilm koloniler fiksatif ekleyin.
NOT: biyofilm koloni hidrofobik karakteri nedeniyle, koloniler yavaş yavaş ağar ayırmak ve yüzer başlar. - Dikkatle Parafilm bir şerit ile plakaları mühür. Oda sıcaklığında 2 saat için bir döner sallayıcı üzerinde inkübe ve daha sonra, gece boyunca 4 ° C'de plakalar transfer.
- Bir sonraki gün, dikkatli bir şekilde bir vakum pompasına birleştirilmiş bir Pasteur cam pipet ile sıvıyı ayırın.
- Dikkatle biyofilm yıkama ve 5 dakika boyunca inkübasyona 10 mi, 100 mM sodyum kakodilat, 5 mM kalsiyum klorür tamponu ilave edin. Yavaşça biyofilm zarar görmesini önlemek ve nazik pipetleme taze yıkama solüsyonu eklemek için plaka köşesinden Pasteur cam pipet ile sıvı çıkarın. kez bu adımı yineleyin.
- Biyofilm kolonilerinin dehidrasyon için, aşağıdaki adımlarla devam edin: GKD 2 O 2x 5 dakika; 3 2 x 20 dakika0% etanol; 2 x 20 dakika% 50 etanol; 2 x 20 dakika% 70 etanol; 2 x 20 dakika% 96 etanol; 2x% 100 etanol içinde 30 dk.
- Her bir adımda 8.5 cm çapında her Petri çanağı için sıvı 15 ml ilave edilir ve dikkatli bir şekilde, her inkübasyondan sonra sıvıyı ayırın.
- Etanol örnekleri kurutma için iki farklı yöntemden birini kullanın.
- Etanol hava-kurutma için:
- dörtte bir selüloz filtre kağıdı (9 cm çapında) kesin. Kısaca% 100 etanol içinde dörtte biri daldırın ve sonra dikkatlice bunun üzerine bir yüzen biyofilm koloni aktarın. bir filtre kağıdı ile kaplı bir Petri kabındaki Islak filtre kağıdı koyun. Petri kabı Kapak ve biyofilm koloniler kimyasal kaputu kuru gecede izin verin.
- Geçiş sıvısı olarak (CO 2), karbon dioksit kullanılarak KURUTMA FIRINI kritik nokta (CP) için:
- % 100 etanol ile kritik nokta kurutma makinesi bölmesinin% 75'ini doldurun. Kendi c içine bir tutucunun içine her bir örnek örnekleri aktarınhamber. Gerekirse, küçük parçalar halinde makas ile biyofilm kesti. Tüm taşıma sırasında etanol içinde batık örnekleri bırakın. Daha sonra, bölme içine tutucu transferi ve sıkı bölme kapatın.
- 7 ° C'ye soğutun ve bölmeyi karıştırıldıktan başlar. Sıvı CO2 ile bölmeyi doldurmak. 7 dakikalık inkübasyon süresi içinde, CO2 ile etanol karışımı sağlar. Daha sonra, çözelti% 25 deşarj.
NOT: numunenin seviyesinin altında odasına sızmasına izin vermeyin. - Adımı yineleyin 3.8.2.2 dört kez.
- Adımı tekrar 3.8.2.2 sadece 5 dakikalık bir inkübasyon süresi ile beş kez. Son olarak, etanol tamamen CO 2 ile değiştirilmesi gerekir.
- Odanın son turda, boş sadece% 5 sırasında. karıştırma ve soğutma kapatın. 42 ° C'ye kadar bölme ısıtmaya başlayın. 31.1 ° C'lik bir sıcaklıkta ve 73.9 bar bir basınçta sıvı CO2 kritik noktaya, durumuna ulaştığı, gaz halindeki pHase Çözücü 27, sıvı faz ile aynı yoğunluğa sahiptir. Sıcaklık 42 ° C'ye ulaştığında, 10 dakika süre ile inkübe edilir. 42 ° C 'de, bölmenin CO2 süper kritik gaz olarak var olur.
NOT: Sürekli odasının basıncını kontrol edin. Basınç 42 ° C'de 120 bar aşmamalıdır. - yavaş yavaş sürekli ısıtma ile gazı boşaltmak için başlayın. Bu CO2-gaz fazında örnekleri tutar ve sıvı yüzey gerilimi vasıtasıyla Örnek morfolojisi deformasyonunu önler. ince ayar ile debimetreyi kontrol ölçüm valfi 5 L / saat debi ölçer ayarlayın. odasında tüm basınç serbest bırakılıncaya kadar bekleyin. Şimdi odasına açın ve sahibinden dikkatlice örnekleri çıkarın.
- Etanol hava-kurutma için:
- Coat karbon bant ile bir elektron mikroskobu saplama. cımbız yardımıyla dikkatlice saplama üzerine biyofilm koloniler aktarın. arabadan ince bir köprü ekleyerek saplama her koloni bağlayınelektron ışını altında ücret ortadan kaldırılması için çok önemlidir bon bant. Onlar çok kırılgan olduğu gibi bu aşamada, dikkatli biyofilm koloniler anlaştım. En az 24 saat süreyle ya da incelemeye kadar bir kurutucuda örnekleri saklayın.
- taramalı elektron mikroskobu ile inceleme gün, bir altın paladyum sıçramasına kaplayıcı bir 60 ° açı 2 dakika süreyle biyofilm koloni-sputter ceket. İki kez bu adımı yineleyin ve aralarında 120 ° örnekleri döndürün. Sonunda, sputter-ceket örnekleri kez üstten 3 dakika boyunca. altın paladyum 20 nm ince tabaka iletkenliği artırır ve SEM görüntüleme için örnek kontrastı artırır.
- Tarayıcı bir elektronik mikroskopla 29,30 görüntülemenin kadar örnek 28 rehidrasyon engellemek üzere bir desikatör içinde örnekleri saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zar tahlil B. derece düzenlenir ve dinamik süreçleri incelemek için bir yöntem olduğunu subtilis multicellularity. Bunun yanı sıra, ince tabaka deneyi bir deneyde, tek bir hücre kültürü çok kaplı plaka ön Başlangıç koşullarına veya küçük molekül konsantrasyonları, ya bir dizi test etmek için çok uygundur. Bununla birlikte, B. subtilis ince tabaka oluşumu ön kültür koşullarına duyarlıdır (örneğin, ön-kültür büyüme ortamı ve büyüme fazı), aşılama oranı ve ön-kültür ortamının uzaklaştırılması. Bu nedenle ilk olarak bize D-lösin ile zar inhibisyonunu üretmek için izin veren bir deney düzeneği açısından tarandı. Sonuçlarımız hücreleri çalkalanarak 4 saat 37 ° C de 3 ml LB bir orta, logaritmik büyüme fazının (tek koloni tanımsız zengin LB ortamı içinde ön-kültüre ise D-lösin ile tekrarlanabilir pelikül inhibisyonu elde edilebileceğini göstermektedir ), aşağı döndürülmüştür ve 1 önce tanımlandığı MSgg ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirildi: 1000 inoculatİyon (Şekil 3A). 200 ° C'de çalkalanarak 37 ° C'de, 100 3 mi MSgg etmek ve 5 saat için büyütülmüştür: hücreler 2 saat süre ile, 1 ml LB orta logaritmik büyüme fazının (tek bir koloni ile MSgg ortamında büyütülmüştür zaman, 1 yeniden seyreltildi ) rpm, ön-kültür ortamının uzaklaştırılması D-lösin aktivitesi üzerinde bir etkisi olmamıştır. Stasyoner büyüme fazında yetiştirilen hücreler (2 saat süre ile, 1 ml LB tek bir koloni, 1 yeniden sulandırılmış 100 mi MSgg 3, ve oda sıcaklığında bir silindir içerisine 20 saat için büyütülmüştür) ve öncesinde MSgg ortamı içinde yıkanmıştır aşılama daha az duyarlı idi. Bununla birlikte, D-lösin pelikül inhibisyonu etkisi doğru rezistans artışı aşılama oranı, artan ön kültür daha yüksek hücre yoğunluğuna bağlı olabilir. Yani MSgg ortam içinde, statik büyüme için ön kültür aşılama oranı, 1: 500 veya 1: 1000, D-lösin aktivite yelpazesi ve ince tabaka gelişim zamanı (Şekil 3B) etkilemiştir. D-lösin ile zar inhibisyonu oluştufarklı büyüme sıcaklıklarında (23 ° C ve 30 ° C, Şekil 3C) en. D-lösin ile hücrelerin duyarlılığı ön kültür şartlarına bağlı başka nokta da, farklı sıcaklıklarda fenomen tekrarlanabilirliği küçük moleküllü D-lösin ile zar inhibisyonu sağlam özelliklere sahip olduğunu göstermektedir.
. Ön kültür büyümeden kirleticilerin (A) çıkarılması: D-lösin ile zar inhibisyonu üzerinde çeşitli ön kültür koşullarının etkilerini göstermektedir Şekil 3. Örnek sonuçları bazı parametreler de dahil olmak üzere sağlam bir deney düzeneği, elde etmek için değerlendirilecek zorunda (yıkandı karşı yıkanmış olan) orta ön kültürünün büyüme ortamı (zengin tanımsız LB ortamı veya tanımlanmış biyofilm indükleyici MSgg ortam) ((sabit büyüme fazının karşı logaritmik) ve ön kültürünün büyüme durumunuNihai zar, büyüme ortamına ön kültür, 500), ve (C) bir büyüme sıcaklığı (30 ° C karşısında 23 ° C) B: B) aşılama oranı (1: 1,000 karşılık 1. subtilis NCIB 3610 hücreleri, 37 ° C'de ya da oda sıcaklığında gece boyunca (O / N) çalkalanarak 4 saat boyunca (Ib veya MSgg) gösterilen bir ortam içinde büyütüldü, ve belirtilen ise ön-kültür ortamı MSgg ile ikame edilmiştir (yıkandı ve ) değil yıkanmış. Son olarak, starter kültür 1 aşılandı aksi belirtilmedikçe ve zarlarına üç gün boyunca 23 ° C'de statik şartlar altında yetiştirilen 1.000 değilse. Yukarıdan aşağıya fotoğraflar bir kamera ile elde edildi. Peki çapı 22 mm dir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ön kültür koşullarının tanımlanması ve D tekrarlanabilir bir aktivite aralığı için izin verilen deneysel kurulum sonrasıetkisi, dayanıklılığı açısından test edildi: ince tabaka oluşumu üzerindeki -leusin (1000 ve üç gün boyunca 23 ° C'de büyütüldü MSgg yıkanmış orta logaritmik büyüme fazına LB içinde büyütülmüş ön kültür, 1 seyreltilmiş). Bu amaçla, ince tabaka oluşumu D-lösin aktivitesi, çeşitli modifiye MSgg ortamı (Şekil 4) 'de tayin edilmiştir. ince tabaka inhibisyonu D-lösin aktivite yelpazesi, test edilen beş ortamda tutarlı ve ince tabaka oluşumu, D-lösin etkisi sağlam olduğunu gösterir. Aynı durum, ince tabaka konsantrasyonunda inhibisyon kadar 2 uM birkaç modifiye MSgg ortam (düşük demir konsantrasyonu ve amonyum klorür veya glükoz ile karbon kaynağı, bir veri nitrojen kaynağının yerine tutarlı olduğunu aralığı D-tirosin, gözlenmiştir gösterilir).
D-lösin Şekil 4. Duyarlılık oluşurÇeşitli büyüme ortamı. Gösterildi B. yukarıdan aşağıya bir fotoğraftır tanımlandığı gibidir, biyofilm uyaran MSgg ortamı içinde ya da farklı modifiye MSgg ortam (karbon kaynağı,% 0.5 Glukoz, 23 ° C'de statik koşullar altında yetiştirilen subtilis NCIB 3610 ince zarlar, azot kaynağı,% 0.5 (NH4) 2 SO4, yüksek demir 250 uM FeCl3; ince zarlar olmayan veya belirtilen konsantrasyonlarda D-lösin ile olsun) beş gün için büyütülmüştür alternatif azot kaynağı ortamı (hariç üç gün boyunca düşük gliserol 0.125% gliserol). Başlangıç kültürleri tanımlanmamış, zengin LB ortamında çalkalanarak 37 ° C'de 4 saat büyütülmüştür. Inokülasyondan önce, hücreler, santrifüjleme ile yıkanmış ve karşılık gelen zar büyüme ortamında yeniden süspansiyon haline getirildi. Starter kültür tamponu 1: 1000, kuyu çapı 22 mm dir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Alternatif bir yöntem, B çalışma subtilis multicellularity katı MSgg ortamı üzerinde biyofilm koloni testtir. ince zarlar gibi, bu deney, uzaysal işlemler çalışma sağlar. küçük molekül inhibitörleri aktif aralığı zar sistemine belirlendikten sonra, biyofilm koloni oluşumu üzerindeki etkisi incelenebilir. biyofilm koloniler daha az kırılgandır ve düz bir arka plan üzerinde, bunların manipüle edilmeleri daha kolaydır, çünkü bu çalışmada, biyofilm koloniler, sterilize edici maddeler, biyofilm kolonilerinin direnci D-lösin etkisini değerlendirmek için kullanıldı. D-lösin ile muamele biyofilm koloniler, 10 dakika boyunca% 50 etanol maruz kaldığında, hayatta kalan hücrelerin yüzdesi büyük ölçüde muamele edilmemiş fraksiyonu (Şekil 5) göre düşer. Bu yöntem, diğer küçük molekül inhibitörlerinin etkilerini ve bakterisidal ajanlara karşı direnç üzerindeki etkisini değerlendirmek için daha da geliştirilebilir (sterilizing maddeleri veya antibiyotikler).
Bir sterilizasyon ajanı karşı işlenmemiş veya işlenmiş biyofilm koloni direnci Şekil 5. Örnek sonuçları. B. biyofilm kolonileri subtilis NCIB 3610 ya da 0.5 mM, D-lösin olmadan 30 ° C'de 68 saat boyunca katı tanımlanan ortamı üzerinde yetiştirilmiştir. iki eşit parçaya koloniler kestikten sonra, bir yarım PBS (iç kontrol) ve% 50 etanol ya da PBS (kontrol) ile birlikte diğer yarı ile muamele edilmiştir. Hafif sonikasyon, seri seyreltme, kaplama ve koloni oluşturan birimlerin sayımının ardından, iç kontrol ile karşılaştırıldığında ölüm oranı hesaplandı. Iki (A) ya da üç (B, C) ve çoğaltılmış standart sapmalar ortalamaları ile üç bağımsız deneyin sonuçları gösterilmiştir. Burada tıklayın to bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntüleyin.
Taramalı elektron mikroskobu (SEM) biyofilm koloni kırışıklık, bolluk ve EPS lokalizasyonu ve tek hücre morfolojisi 31 mekânsal mimarisi üzerinde odaklanmak için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. SEM görüntüleme yüksek vakum altında görüntülü olabilir örnekleri gerektirir. yüksek vakum koşulları altında örnekleri incelemek için, her dökme su molekülleri kaldırılması gerekir ve bu nedenle, SEM görüntü görüntüleme öncesi numune dehidratasyon gerektirir. Seçenek olarak ise, numune hidratlanmış örneği yavaşça mikroskop odasında kurutulmaktadır taramalı elektron mikroskopisi (ESEM), ıslak modunda düşük vakum koşulları altında görüntülenebilir. biyofilm koloni mimarisi, EPS organizasyon ve hücre morfolojisi küçük molekül inhibitörleri etkilerini değerlendirmek, örnek dehidratasyon üç farklı türde karşılaştırıldı: Islak mo altında mikroskop kurutmade koşullar (ESEM), hava ile kurutuldu, bir çözücü veya kritik nokta (BF) geçiş akışkan olarak karbon dioksit kullanılarak Kurutulmuş. Muamele edilmemiş ve D-lösin ile tedavi edilen B. kullanılan yönteme göre subtilis biyofilm koloniler farklı hidratasyon aşamaları gözlenebilir. Esem ıslak modunda düşük vakum koşulları altında görüntüleme biyofilm koloni çok doğal bir devlet korudu. Ancak, tek hücre morfolojisi ve EPS bolluk ve mimarisi hakkında bilgi EPS hala tam olarak sulandırılmış olduğu gibi, kıt ve hücreler EPS gömüldü (veriler gösterilmemiştir). Dehidrasyon açısından CP-kurutma, en sıkı bir işlemdi. Bu dokuya 32 bağlı,% 30-70 bir hacim kaybı için muhasebe, dokudan en yapısal bağlı ve toplu su molekülleri kaldırıldı. Buna karşılık, hava kurumalı bağlı su molekülleri korudu. Örneğin, bir embriyonik doku uçucu çözücü etanolden Hava ile kurutmadan sonra, hacminin% 18 kayıp% 59 CP kurutulduktan 32. sonra (Şekil 6A) . Etanol ve dehidrate edildi biyofilm koloniler de CP-kurutulmuş onların üç boyutlu yapısını muhafaza ve EPS örümcek ağı (Şekil 6C) gibi göründü. Havayla kurutuldu ve CP kurutuldu örneklerde, biyofilm koloni mimarisinde küçük molekül inhibitörü, D-lösin etkileri, tek bir hücre morfolojisi ve EPS yapısı belirgin (Şekil 6B ve D) idi. D-lösin mevcudiyetinde büyütülen biyofilm kolonileri daha küçük ve kırışıklıklar az belirgindi. D-lösin ile muamele edilmiş hücreler, Obse bir fenotip uzadıHücre duvarı hedefleme molekülleri 33 ile muamele edilmiş hücrelerde SVEd. Ayrıca, hücreler açıkça daha az EPS ile kaplıydı ve sıkıca işlenmemiş biyofilm kolonilerinde görüldüğü gibi EPS aracılığıyla komşu hücrelere bağlı değil. Sunulan sonuçlar, geçiş sıvısı tek bir hücre morfolojisi, küçük moleküllerin etkisi hakkında değerli bilgiler vermek gibi biyofilm koloni dehidrasyon Her iki yöntem de, hava ile kurutulmuş, etanol ya da yanı sıra EPS bolluk, karbon dioksit ile CP-kurutuldu göstermektedir ve mimarisi.
Şekil 6. Küçük moleküller biyofilm koloni mimarisinin büyük ve küçük ölçekli değiştirebilirsiniz. B. biyofilm kolonileri subtilis NCIB 30 ° C'de 72 saat süre ile 0.5 mM, D-lösin mevcudiyetinde 3610 bulunmaması durumunda yetiştirilir (A ve D) ya da (B ve D)şu şekilde etanolden protokolde tarif ve kurutuldu katı MSgg ortamı üzerinde sabitlenmiş edilmiştir: (A ve B) hava ile kurutuldu ve (C ve D) CP-kurutuldu geçiş akışkan olarak karbon dioksit kullanılarak. öncesi (sol, alt paneller) altın paladyum kaplama, düşük ve yüksek büyütme elektron mikroskobu taslakları üzerine monte yukarıdan aşağı kurutulmuş biyofilm kolonilerinin fotoğraflarını, yukarıdan aşağıya biyofilm kolonilerin binoküler görüntüleri (sol, üst paneller) da gösterilmiştir SEM ile elde edilen görüntü biyofilm koloni kırışıklık veya tek hücre morfolojisi / EPS organizasyon 3D mimarisini göstermek için. Soldan sağa Ölçek çubukları:. 5 mm, 100 mm, 2 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| 1,925 mM | tencereassium fosfat monobazik |
| 3,075 mM | potasyum fosfat dibazik |
| 100 mM | 3- (N-morfolino) propansülfonik asit, pH 7.1 |
| 2 mM | magnezyum klorür heksahidrat |
| 700 uM | kalsiyum klorür, susuz |
| 50 uM bir | demir (III) klorür heksahidrat |
| 125 uM b | |
| 1 uM | çinko klorür, susuz |
| 2 uM | tiamin hidroklorür |
| 50 ug / ml | triptofan |
| 50 ug / ml | fenilalanin |
| 50 ug / ml | treonin |
| % 0.5 (h / h) | gliserol susuz |
| % 0.5 (ağırlık / hacim) | L-glutamik asit monosodyum tuz hidratı |
| Bir ince tabaka deneyi için, biyofilm deneyi için B | |
Tablo 1. Bu çalışmada kullanılan Nihai 1x MSgg terkip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bacillus subtilis formları sağlam ve son derece yapılandırılmış biyofilm hem sıvıda (zarlarına) ve katı ortamda (koloni). Bu nedenle, belirli biyofilm inhibitörlerinin etki moduna karakterize için ideal bir model organizma olarak hizmet vermektedir. Katı ortam üzerinde, hücreler merkezden kenara doğru yayılan kırışıklıkları gibi ince zarlar belirgin olmayan ayırt edici özellikleri ile çok hücreli yapılar oluşturur. Bu nedenle, ince zarlar ve koloniler B çalışma tamamlayıcı sistemlerdir subtilis multicellularity.
Bu çalışmanın amacı, bir B geliştirmektir biyofilm (ince zarlar ve koloni) önlenmesi için subtilis model sistem. Birkaç adım biyofilm rahatsızlık denemenin tekrarlanabilirlik için kritik öneme sahiptir. Bir ilk kritik adım biyofilm oluşumu üzerindeki etkisi nedeniyle planktonik yaşam tarzı yetişen bakterilere genel toksisitesi olmadığını teyit etmektir. Bu, belirli bir konsantrasyonunun etkisini karşılaştırarak değerlendirilebilirplanktonik büyüme üzerindeki bu molekülün etkisiyle nispi biyofilm inhibisyonu alışveriş merkezi molekülü inhibitörü. biyofilm gelişimi üzerine bir dramatik güçlü etkisi biyofilm gelişmesi için özellikle önemli olan hedef mekanizmalarının belirlenmesini sağlayabilirsiniz. Bundan başka, burada tarif edilen çalışma ince zarlar geliştirilmesi ve küçük molekülleri duyarlılıklarına ön kültür koşullarında önemini ortaya koymaktadır. Etkilerini test etmek için küçük moleküller, tekrarlanabilir ve sağlam deneysel koşullar (örneğin, pelikül büyüme sıcaklık ve ortam bileşimine duyarlılık eksikliği) etkisini karakterize önce tanımlanmış olması gerekir. Bu koşulları bulmak için, ön-kültür durumun ortam, ön kültür, ön-kültür ortamı kaldırma, büyüme sıcaklığı ve büyüme ortamının büyüme fazı göz önüne alınmalıdır.
biyofilm oluşumu için özel bir inhibitör bulundu kez büyük bir meydan okuma, nicel bulmakve biyofilm gelişimi ve direnci bu küçük molekül inhibitörleri etkilerini karakterize kalitatif yöntemler. Burada, iki önemli yöntemleri bu inhibitörlerinin etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. İlk olarak, biz tekrarlanabilir etanol gibi bakterisit için işlenmemiş koloni biyofilm, karşı tedavi direncini soruşturma basit bir nicel yöntemi tanıtmak. Örnek sonuçlar% 50 etanol D-lösin ile muamele biyofilm kolonilerin duyarlılık için gösterilmiştir. Ancak, bu deneme kolayca farklı sterilizasyon maddeleri veya antibiyotik kullanılarak değiştirilebilir. İkinci olarak, bir SEM yöntem, yüksek çözünürlüklü birçok tamamlayıcı seviyelerde küçük bir molekül inhibitörü kaynaklanan biyofilm koloni değişikliklerin incelenmesine olanak tanır ayrıntılı olarak anlatılmıştır: Genel yapısı, organizasyonu ve EPS matrisin bolluğu ve bileşenlerini, ve biyofilm boyunca tek hücreli morfolojisi. Bu dehydrati bu iki yöntem dikkat(Geçiş akışkan olarak karbon dioksit kullanılarak% 100 etanol ya da CP-kurutma havayla-kurutma) bir biyofilm koloni SEM örnek hazırlama sırasında eşit kullanılabilir. Önemlisi biyofilm örnek başarılı sabitleme büyük ölçüde biyofilm koloni hidrofobisitesine dayanır. Bu hidrofobiklik B. özgü bir özelliktir Hidrofobik yüzey tabakası 10,34 nedeniyle subtilis biyofilm.
Çeşitli yaklaşımlar B. ile biyofilm montaj ve gelişimini incelemek için önceden kullanılan Bir model organizma 35 olarak subtilis. Bağımsız çalışmalar bir dizi biyofilm gelişimi 36-38 medya bileşimin etkilerini göstermiştir. Şimdiye kadar, ancak biyofilm inhibisyonu medya bileşiminin etkilerinin sistematik bir değerlendirme eksik, bizim bildiğimiz kadarıyla, oldu. Bu çalışma gösteriyor ki ise B. zar inhibisyonu küçük moleküller ile subtilis koşulları kültür öncesi duyarlıdır, bu una olansıcaklık ve ortam bileşiminin ve küçük molekül inhibitörleri sistematik ekranları için de yararlıdır etkileriyle ffected. Ayrıca, şu anda biyofilm model organizma B. eksik antibakteriyel maddelere karşı muamele edilmemiş ya da küçük moleküllü inhibitör ile tedavi edilen biyofilm koloniler direncini değerlendirmek için basit, tekrarlanabilir ve nicel bir yöntem kurulmuştur subtilis.
Floresan gazetecilere ile kombinasyon halinde, B. subtilis biyofilmler biyofilm belirli bir gelişimsel adımını veya biyofilm içinde belirli bir hücre alt-popülasyonu hedeflemek küçük molekül inhibitörleri için bir nokta için daha fazla alınabilir. Bu tarifnamede tarif edilen yöntemler, biyofilm içindeki gen ekspresyonu açısından tek bir hücre çözünürlüğü sağlamaz. B. olan EPS matrisi gen ekspresyon analizi için yöntemler tek hücre düzeyinde subtilis biyofilm başarıyla 39 kurulmuştur.
Bakteriyel biyofilm crucia vardır, Tarım, sanayi ve klinik ortamlarda l önemi. Bir tarım bağlamda, biyofilm oluşturmak için kapasite sayısız bitki bitki konak kolonizasyon 40 patojenler ve bir klinik bağlamda, biyofilm antimikrobiyal ajanlara 21 doğal dirençli ve birçok kalıcı ve kronik bakteriyel enfeksiyonların özünde vardır artırır. Buna ek olarak, artık onlar kaldırmak için son derece zor olan ve 41 kontrol olarak biyofilm sektörüne büyük maliyet etkileri kabul edilmektedir. Böylece, mikrobiyal biyofilm inhibitörlerinin çalışma için deneysel bir çerçeve geliştirilmesi, tarım 42,43 önemli 21,44 klinik ve teknolojik 45-47 yenilikleri sağlayacaktır.
Mevcut yöntemler B. sınırlıdır subtilis. Biz de diğer türlerdeki biyofilm spesifik küçük molekül inhibitörleri, çalışma tarif niceliksel ve niteliksel kavramlar şu öneriyoruz. Ek olarak Bu çalışma, D-lösin ile biyofilm önlenmesi için belirli bir örnek ile ilgili olup, çok sayıda özel biyofilm önleyicileri arasından, daha önce 17 Nisan. Önemli olarak, D-lösin hali hazırda bitki kolonizasyonu ve biyofilm arasındaki olası benzerlik gösteren, bitki patojen Xanthomonas citri 48 bir anti-biyofilm molekülü olarak karakterize edilmiştir. Biyofilm oluşumu (pelikül ve buruşuk koloni oluşumu) de yaygın olan insan patojenleri (örneğin, Pseudomonas aeruginosa 49-51 ve üropatojenik Escherichia coli 52,53). Tarif edilen yöntemler, biyofilm oluşumunu inhibe eder ve klinik araştırmalarda antimikrobiyal ajanlara biyofilm aracılı direnci azaltmak, belirli ilaçların araştırılması için daha fazla geliştirilebilir. Genel olarak, burada tarif edilen yöntemleri ve diğer türlerdeki biyofilm spesifik küçük molekül inhibitörleri, çalışma için niceliksel ve niteliksel kavramları geliştirmek için bir temel olarak kullanılabilir.
nt "> Özetle, biz biyofilm inhibitörleri incelemek için B. subtilis kullanarak potansiyel güçlü ve tuzaklar gösteren basit ve kullanışlı bir araç-kutusu sağlar.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
| zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
| razor blade | Eddison | NA | |
| circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
| paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
| sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
| carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
| Shaker 37 °C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
| Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
| Incubator 30 °C | Binder | NA | |
| Incubator 23 °C | Binder | NA | |
| Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
| Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
| Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
References
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R.
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol. 56, 187-209 (2002).
- Miller, M. B., Bassler, B. L.
- Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr Opin Microbiol. 10, 638-643 (2007).
- Kolter, R., Greenberg, E. P. Microbial sciences: the superficial life of microbes. Nature. 441, 300-302 (2006).
- Kearns, D. B., Chu, F., Branda, S. S., Kolter, R., Losick, R. A master regulator for biofilm formation by Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 55, 739-749 (2005).
- Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
- Romero, D., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Amyloid fibers provide structural integrity to Bacillus subtilis biofilms. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 2230-2234 (2010).
- Kobayashi, K., Iwano, M. BslA(YuaB) forms a hydrophobic layer on the surface of Bacillus subtilis biofilms. Mol Microbiol. 85, 51-66 (2012).
- Hobley, L., et al. BslA is a self-assembling bacterial hydrophobin that coats the Bacillus subtilis biofilm. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 13600-13605 (2013).
- Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
- Kolodkin-Gal, I., et al. D-amino acids trigger biofilm disassembly. Science. 328, 627-629 (2010).
- Chan, Y. G., Kim, H. K., Schneewind, O., Missiakas, D. The capsular polysaccharide of Staphylococcus aureus is attached to peptidoglycan by the LytR-CpsA-Psr (LCP) family of enzymes. J Biol Chem. 289, 15680-15690 (2014).
- Mielich-Suss, B., Lopez, D. Molecular mechanisms involved in Bacillus subtilis biofilm formation. Environ Microbiol. 17, 555-565 (2014).
- Cairns, L. S., Hobley, L., Stanley-Wall, N. R. Biofilm formation by Bacillus subtilis: new insights into regulatory strategies and assembly mechanisms. Mol Microbiol. 93, 587-598 (2014).
- Chen, M., Yu, Q., Sun, H. Novel strategies for the prevention and treatment of biofilm related infections. Int J Mol Sci. 14, 18488-18501 (2013).
- Bucher, T., Oppenheimer-Shaanan, Y., Savidor, A., Bloom-Ackermann, Z., Kolodkin-Gal, I. Disturbance of the bacterial cell wall specifically interferes with biofilm formation. Environ Microbiol Rep. 7, 990-1004 (2015).
- Sarkar, S., Pires, M. M. D-Amino acids do not inhibit biofilm formation in Staphylococcus aureus. PLoS One. 10, e0117613 (2015).
- Wei, W., Bing, W., Ren, J., Qu, X. Near infrared-caged D-amino acids multifunctional assembly for simultaneously eradicating biofilms and bacteria. Chem Commun (Camb). 51, 12677-12679 (2015).
- Leiman, S. A., et al. D-amino acids indirectly inhibit biofilm formation in Bacillus subtilis by interfering with protein synthesis. J Bacteriol. 195, 5391-5395 (2013).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2, 114-122 (2003).
- Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 877-886 (2015).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15, 2865-2878 (2013).
- Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 11621-11626 (2001).
- Holscher, T., et al. Motility, Chemotaxis and Aerotaxis Contribute to Competitiveness during Bacterial Pellicle Biofilm Development. J Mol Biol. 427, 3695-3708 (2015).
- Bray, D. Methods in Biotechnology. 13, Humana Press Inc. 235-243 (2000).
- Ensikat, H. J., Ditsche-Kuru, P., Barthlott, W. Scanning electron microscopy of plant surfaces: simple but sophisticated methods for preparation and examination. 1, Formatex Research Center. 248-255 (2010).
- Hayat, M. A. Principles and techniques of scanning electron microscopy: Biological applications. 2, Van Nostrand Reinhold Company. (1976).
- Schatten, H. Scanning Electron Microscopy for the Life Sciences. , Cambridge University Press. (2013).
- Bridier, A., Meylheuc, T., Briandet, R. Realistic representation of Bacillus subtilis biofilms architecture using combined microscopy (CLSM, ESEM and FESEM). Micron. 48, 65-69 (2013).
- Boyde, A., MacOnnachie, E. Volume changes during preparation of mouse embryonic tissue for scanning electron microscopy. SCANNING. 2, 149-163 (1979).
- Yao, Z., Kahne, D., Kishony, R. Distinct single-cell morphological dynamics under beta-lactam antibiotics. Mol Cell. 48, 705-712 (2012).
- Epstein, A. K., Pokroy, B., Seminara, A., Aizenberg, J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 995-1000 (2011).
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11, 157-168 (2013).
- Shemesh, M., Chai, Y. A combination of glycerol and manganese promotes biofilm formation in Bacillus subtilis via histidine kinase KinD signaling. J Bacteriol. 195, 2747-2754 (2013).
- Kolodkin-Gal, I., et al. Respiration control of multicellularity in Bacillus subtilis by a complex of the cytochrome chain with a membrane-embedded histidine kinase. Genes Dev. 27, 887-899 (2013).
- Oppenheimer-Shaanan, Y., et al. Spatio-temporal assembly of functional mineral scaffolds within microbial biofilms. npj Biofilms and Microbiomes. 2, 15031 (2016).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. , e3796 (2012).
- Bogino, P. C., Oliva Mde, L., Sorroche, F. G., Giordano, W. The role of bacterial biofilms and surface components in plant-bacterial associations. Int J Mol Sci. 14, 15838-15859 (2013).
- Fratamico, P. M., Annous, B. A., Guenther, N. W. Biofilms in the Food and Beverage Industires. 1, Woodhead Publishing. (2009).
- Gao, G., et al. Effect of biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2P24 on soil fungal community in cucumber rhizosphere using T-RFLP and DGGE. PLoS One. 7, e31806 (2012).
- Chen, Y., et al. Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation. Environ Microbiol. 15, 848-864 (2013).
- Bryers, J. D.
- Logan, B. E. Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells. Nat Rev Microbiol. 7, 375-381 (2009).
- Nevin, K. P., Woodard, T. L., Franks, A. E., Summers, Z. M., Lovley, D. R. Microbial electrosynthesis: feeding microbes electricity to convert carbon dioxide and water to multicarbon extracellular organic compounds. MBio. 1, (2010).
- Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol Rev. 34, 3-17 (2010).
- Li, J., Wang, N. Foliar application of biofilm formation-inhibiting compounds enhances control of citrus canker caused by Xanthomonas citri subsp. citri. Phytopathology. 104, 134-142 (2014).
- Okegbe, C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. Redox-driven regulation of microbial community morphogenesis. Curr Opin Microbiol. 18, 39-45 (2014).
- Mann, E. E., Wozniak, D. J. Pseudomonas biofilm matrix composition and niche biology. FEMS Microbiol Rev. 36, 893-916 (2012).
- Bouffartigues, E., et al. Sucrose favors Pseudomonas aeruginosa pellicle production through the extracytoplasmic function sigma factor SigX. FEMS Microbiol Lett. 356, 193-200 (2014).
- Wu, C., Lim, J. Y., Fuller, G. G., Cegelski, L. Quantitative analysis of amyloid-integrated biofilms formed by uropathogenic Escherichia coli at the air-liquid interface. Biophys J. 103, 464-471 (2012).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an Architectural Element in Spatially Structured Escherichia coli Biofilms. J Bacteriol. 195, 5540-5554 (2013).
