Summary
私たちは、マトリックスゲルプラグ血管新生アッセイの変動を用いて、マウスにおけるヒト内皮 - 周皮細胞の相互作用を研究するためのプロトコルを提示します。
Introduction
血管新生は、新しい血管が既存の血管ネットワーク1から形成されるプロセスであり、正常な発達、疾患の範囲の多くの地域を横切って進行中の研究の焦点です。この動的なプロセスは、酸素や栄養素デリバリー2を必要とするサイトに向けられている血管の管を構築するために、内皮細胞（EC）および周皮細胞の動員の増殖および移動を伴います。このプロセスを研究するためには、管形成の3次元性を再現することができます1、最も重要なのは、同じように動的分析を必要とします。 in vitroでの3Dマトリックスアッセイは、この必要性に対処するために開発されており、研究者は、血管新生が生じ3、4、5、6をとる空間および時間における個別のステップを定義することができるように十分に取り組んできました。しかし、これらのインビトロ 3Dマトリックスモデルは、非灌流血管研究に限られていますdは、したがって、血管新生プロセスに関連する重要なコンポーネントが不足している（ 例えば、血管床を横切って成長と阻害因子、不自然なテンション/力を循環させる）と、生きている組織に存在する複雑な環境をシミュレートすることができません。この制限に対処するために、いくつかのin vivoでの血管新生アッセイは、当社の報告書8、9の焦点になるマトリックスゲルプラグアッセイを含む、7を開発されてきました。
マトリックスゲルプラグアッセイは、血管新生に異なる細胞や物質の役割をテストするための堅牢なプラットフォームを提供するので、研究者にアピールする十分に確立されたin vivoでの血管新生アッセイです。マトリックスゲルは、37℃でゲル状物質に固化エンゲル-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞株によって分泌される市販の基底膜溶液です。マトリックスゲルは、細胞および/またはそのような成長因子、および麟蹄などの物質と混合することができますマウスに皮下CTED。ホストのECは、14日間にわたってプラグに侵入血管網を形成し、宿主の血液で灌流になります。現在までに、マトリックスゲルプラグアッセイこのアッセイは、に共培養内皮細胞および周皮細胞を使用することができるかどうかを決定するために努力がまだ行われていない我々の知る限り、しかし、血管形成中の内皮細胞の挙動の研究にのみ焦点を当てていますこれら2つの細胞型は、血管新生の間にどのように相互作用するかを研究します。具体的には、ECおよび周皮細胞との間の関係を理解することは、血管の損失は微小血管虚血および末梢血管疾患10、11、12を含む、病理学的である疾患を研究するための貴重なものです。
ここでは、ヒトECおよび線維芽細胞成長因子（bFGF）と共にマトリックスゲル混合物にヒト由来周皮細胞を導入するプロトコルを記載しています。次いで、この混合物を皮下I注射することができますnはSCIDマウスの背は、完全に機能的な、周皮細胞被覆され、ハイブリッド血管の形成を可能にします。私たちのプロトコルが持つまたはSCIDマウスとどのように重要な血管新生エンドポイントの組織切片を分析するために人間の周皮細胞、配置があってもなくても、人間のECを含むマトリックスゲルプラグを準備する方法について説明します。
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Protocol
倫理文：動物を対象とする手順は、スタンフォード大学医学部での施設内動物管理使用委員会によって承認されています。
注：動物は、3％の気化イソフルランおよびO 2ガスの3％の供給と麻酔下にあります。目に獣医軟膏の使用は、麻酔下ながら乾燥を防ぐのに役立つかもしれません。
1.細胞の調製
- 適切なメディアの10ミリリットルと100ミリメートルプレートにヒト内皮および周皮細胞培養物を成長させます。細胞が80％コンフルエンスに達するまで3日間 - すべての2新鮮な培地10ミリリットルを交換してください。
- 会社を補充した完全な内皮細胞培地（ECM）における培養内皮細胞（EC）は、5％ウシ胎児血清（FBS）、10％ペニシリン/ストレプトマイシン及び10％の内皮細胞成長サプリメントを供給しました。
- 会社を補った完全な周皮メディア（PM）における培養周皮細胞は、2％FBS、10％のペニシリン/ストレプトマイシン及び10％周皮細胞成長サプリメントを供給しました。
- 細胞混合物を準備します
- 実験群と対照群のためのセルの必要数を計算します。
注：実験群内の各プラグは百万（1×10 6）が含まれ、人間ECおよび20万（2×10 5）周皮。対照群については、各プラグは120万人の電気部品のみが含まれています。陰性対照群は、マトリックスゲルのみを有しています。各グループには、プラグは、マウスの腰の両側に注入することができるように、2つのマウスを必要とするであろう、少なくとも4つのプラグを含める必要があります。三つのプラグは1に障害が発生した場合に使用することができ、実験と第四のための三連として役立つであろう。ゲルの余分なボリュームを一致させるために25％余分な細胞を準備します。 - 収集し、培養プレートから細胞を数えます。
- 細胞を剥離するために、メディアを取り出し、室温の1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1回洗浄します。 PBSを削除し、1ミリリットル0.25％トリプシン/ 2.21 mMのEDTAを追加し、1分間インキュベートします。 2を追加することによって、プレートから細胞を洗浄mlの培地とを15mlチューブに収集します。
- 製造者の指示に従って血球計数器を用いて細胞を数えます。
- 5分間400×gでペレットに適切な数の細胞を遠心します。実験群、遠心分離機ECおよびダウン一緒に1ペレットへの周皮細胞の両方について。
- 実験群と対照群のためのセルの必要数を計算します。
2.マトリックスゲルの準備
- 均一な溶液を得るために4時間又は一晩4℃で完全にマトリックスゲルを解凍します。いいえ混合は必要ありません。
- 4°Cで1.5 mlチューブとストア内の一定分量マトリックスゲル。
- 事前チル滅菌1.5ミリリットルチューブ、4℃で28 G 1ccのインスリン注射器。注意：常に氷上マトリックスゲルを保管してください。
- 1の体積比でbFGFで冷マトリックスゲルミックス：100（bFGFの最終濃度を0.5μg/ mlに=; bFGFのストック溶液=50μg/ mlの）ダウンを数回ピペッティングによりマトリックスゲル溶液を混合した後、氷上でインキュベート60分B - 30ステップ3.1での細胞と混合EFORE。
注：混合前に在庫のbFGFを解凍します。注射のために必要なプラグの数を計算します。例えば、各プラグは200μlのマトリックスゲルが必要です。したがって、25％の余分なゲルを準備します。
細胞3.ミックスマトリックスジェル
- グループごとに、bFGFを含有マトリックスゲルの計算量で（適切な細胞数を含む）を細胞ペレットを再懸濁します。発泡回避し、マウスは注射用に調製されるまで、氷上で15 mlのチューブに残すように穏やかに混合。
4.マウスの準備
- 3％イソフルランプラス誘導室中の3％O 2で5分間1 SCIDマウスを麻酔。一度に、1つの実験群、または2匹のマウスに焦点を当てています。
- 誘導チャンバーからマウスを外しダウン加熱パッド腹側の場所と迅速麟蹄全体に麻酔を供給するために、非再呼吸システムを介してマウスの顔に鼻ノズルを取り付けますction手順。非再呼吸系に導入室からのガスの流れを切り替えて、1.5％イソフルランおよび1.5％O 2ガスの圧力を低下させます。
- シェーバーや脱毛クリームで（直径1cm前後）両側後肢領域から髪を削除します。
- 70％のアルコールパッドで皮膚領域を拭いてください。
- 誘導チャンバーにマウスを戻し、リピートは4.2手順 - 4.4を2番目のマウスで。
5.マトリックスゲル注入
- 非再呼吸システムに付着し、加熱パッド上腹側を下に置くことによって、注射用1マウスを準備します。
- 一度に予備冷却し28 G 1 ccのインスリン注射器1のマウスにマトリックスゲルをロードします。
- 注射器に2つのプラグ（200プラグあたりμlのプラス25％余分な）のためのマトリックスゲルの完全な500μlのボリュームをロードします。
- CEを防止するために、シリンジ内に細胞をロードする3分以内にマウスにマトリックスゲルを注入することを確認します注射器の側に沈降し、注射器の内側に固化からマトリックスゲルを防ぐためにからLLS。
- その後、胸郭の背面後部の皮下空間にゆっくりと均等にマトリックスゲルの200μLを注入し、皮下スペースを見つけるために背中の皮膚を持ち上げます。
- 注射部位から漏れるマトリックスゲルを防ぐために注意しながら、ゆっくりと注射針を外します。バンプは、注射部位に形成されます。アルコールパッドで注射部位を拭きます。
- その後、熱パッド上にマトリックスゲルのゲル化を可能にするために1分間の背中の上でマウスを残して、マウスの背中の反対側に5.5 - を繰り返し注入が5.2を繰り返します。
- 14日後にバンプを識別するための恒久的なマーカーを使用して、両方のバンプの概要を説明します。いくつかの髪が戻って成長した後、バンプを見つけることが容易になります。
6.マトリックスゲルプラグの単離：注射後14日
- 動物を暴露することによって、人道的にマウスを安楽死させます死を確実にするために頸椎脱臼に続く二酸化炭素吸入> 5分秒。
- マウスの背中からマトリックスゲルプラグを取り外します。
- ゆっくりとプラグはステップ4.3を繰り返して配置されている注射部位の周りに再成長の髪を削除します。マーカーラインは、皮膚の下に、元のバンプの大きさを示しています。
- それぞれ、プラグの上側と下側に取り付け、周囲の皮膚と筋肉層と一緒にプラグを切り出します。
- 微細手術用はさみを使用して、皮膚に対して垂直であり、プラグの下の筋肉にカットスループラグのマークされた境界に切り込みを入れます。その後、慎重にマークされた境界線に沿ってプラグの周囲にカット。
- それは、皮膚と筋肉の層の間に挟ま保ち、プラグを取り外します。すぐに余分な血液を洗い流すために、1×PBSを入れた小さなビーカーにすすいでください。プラグは（次のステップ、6.3）修正する準備ができました。
- PLUを修正しました。4％パラホルムアルデヒドでグラム。
- 揺動せずに室温で24時間、4％パラホルムアルデヒド25mlで50mlチューブに、皮膚と筋肉の層を含む全体のプラグを置きます。次の日は、パラフィン包埋の前に別の24時間の70％エタノール25ミリリットルにプラグを移します。
注：慎重にパラホルムアルデヒドを処理します。手袋を着用してください。
- 揺動せずに室温で24時間、4％パラホルムアルデヒド25mlで50mlチューブに、皮膚と筋肉の層を含む全体のプラグを置きます。次の日は、パラフィン包埋の前に別の24時間の70％エタノール25ミリリットルにプラグを移します。
7.パラフィンプロセスマトリックスゲルプラグ
- パラフィン包埋のためにプラグを準備します。
- 図1aに示すように、プラグを方向付けます。プラグの側が上を向いているとの両方の皮膚や筋肉の層が切片の間に第1切断される組織ブロックの表面全体に表示されるように、組織カセットにプラグインを配置します。
- パラフィンは、標準的なパラフィン包埋プロトコール13に従ってプラグを埋め込みます。
- 顕微鏡は、アコーをスライド上に組織ブロックのオフに10μmの厚さの切片およびマウント - 8をカット標準的なパラフィン切片プロトコル13丁。
- 染色のための準備ができるまで室温で涼しく乾燥した場所にスライドを保管してください。
ヘマトキシリンおよびエオシン染色（H＆E）13 8.ステインセクション
- 二回、100％エタノール、95％エタノール、70％エタノールおよび最後に1×PBS 100％キシレンを介してスライドを通過させることによって、室温で5分間、各組織切片を脱パラフィンで処理します。次のステップになるまで1倍PBSでスライドを残します。
- ピペットで100μlのH＆Eセクションへのソリューションと1のためのインキュベート - 5分、または10倍の倍率で直立光顕微鏡下で観察されるような細胞内の青色の核とピンクの細胞質の間に明確なコントラストがあるまで。任意のH＆Eソリューションは、目的を触れないように注意してください。
- 水道水の大ビーカーでスライドを液体につけることによって、スライドのオフウォッシュH＆Eソリューションは、その後、ビーカー内のラックにスライドを配置し、2分間流水と面一に。
- モースライドをマウントする9.8ステップにVEの。
9.ヒトキャピラリと周皮細胞染色する他のスライド
- 二回、100％エタノール、95％エタノール、70％エタノールおよび最後に1×PBS 100％キシレンを介してスライドを通過させることによって、室温で5分間、各組織切片を脱パラフィンで処理します。次のステップになるまで1倍PBSでスライドを残します。
- 抗原回復溶液中のセクションをゆでます。
- 2Lのビーカーに、加熱ブロック上で95℃で1×クエン酸緩衝液（pH7.0）を使用して沸騰抗原回復溶液を調製します。
- 沸騰したら、金属ラックにスライドを配置し、20分間沸騰抗原回復溶液中に浸します。
- 慎重にまだ沈めスライドと加熱ブロックからビーカーを取り除き、溶液をゆっくり約30分間室温に戻すことができます。
- 次のステップになるまで1倍PBSでスライドを置きます。
- ブロッキング緩衝液中のセクション（1×PBS、5％ヤギ血清、0をブロック.3％のTriton X-100）。
- PAPペンで各セクションのエッジの周りに疎水性の円を描きます。
- トレイの底に蒸留水で湿度トレイにスライドを配置します。
- 必ずすべての組織を作るのセクションの上にピペットで100μlのブロッキングバッファーを流体によって覆われている（以上100μlのが必要な場合があります）。
- 1時間、ブロッキングバッファーを持つセクションをインキュベートします。
- 一次抗体を持つセクションをインキュベートします。
- 各CD31（ECS）のためのセクションおよび希釈緩衝液（1×PBS、1％BSA、0.3％トリトンX-100）で希釈した平滑筋アクチン（周皮細胞）を精査するために、2つの一次抗体で1溶液を調製します。
注記：ここでは、抗CD31濃度1:50であり、抗平滑筋アクチン濃度は1：300。 - 蒸留水を含む湿度トレイに100μlの一次抗体と4℃で一晩のセクションをインキュベートします。
- 各CD31（ECS）のためのセクションおよび希釈緩衝液（1×PBS、1％BSA、0.3％トリトンX-100）で希釈した平滑筋アクチン（周皮細胞）を精査するために、2つの一次抗体で1溶液を調製します。
- 1×PBST（1×PBS + 0.1％TWEでスライドを3回洗浄各5分洗浄用EN20）。
- 二次抗体を持つセクションをインキュベートします。
- 希釈緩衝液中に希釈した抗CD31ウサギ抗体を認識し、フルオロフォアコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体を含む溶液を調製します。
- 注：平滑筋アクチン一次抗体は、すでにCY3フルオロフォアとコンジュゲートされているので、二次抗体染色は必要ありません。 250：ヤギ抗ウサギ二次抗体濃度は1です。
- 蒸留水を含む湿度トレイに100μlの二次抗体と1時間のセクションをインキュベートします。
- 希釈緩衝液中に希釈した抗CD31ウサギ抗体を認識し、フルオロフォアコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体を含む溶液を調製します。
- 各洗浄5分間、1×PBSTでスライドを3回洗浄します。
- スライドをマウントします。
- 各セクションへのDAPI核染色と退色防止マウントソリューションの - （60μL〜40） - ピペット2 3滴。
- 優しくなしを配置します。 1.5カバーセクションの上にスリップし、マウントソリューション、流体はセクションに広がるすることを可能にするとの縁へカバースリップ。ゆっくりセクションの上に配置することができる気泡を押し出すために指を使用しています。
- スライドを取り扱う前に、少なくとも1時間乾燥させます。
10.定量化毛細血管密度と構造14
- H＆E染色切片における毛細血管の数をカウントし、＃/ mm 2のように表します。
- 40Xの倍率で直立光顕微鏡上の4つの異なるフィールドの写真を取得します。
注：キャピラリーは赤血球で満たされた管として識別されます。 - あるいは、代わりに手動で計数キャピラリーの使用画像解析ソフトウェア（ 例えば、Wimasis画像解析）は、血管数、平均血管長及び直径、および分岐点のような種々の血管形成のパラメータを定量化します。
- 40Xの倍率で直立光顕微鏡上の4つの異なるフィールドの写真を取得します。
- 免疫蛍光染色した切片に毛細管構造を分析します。
- 倒立蛍光顕微鏡上の4つの異なるフィールドの写真を買収FITCとTxRedフィルターキューブを持ちます。
- 488 nmの波長で励起することにより、画像のECへのFITCキューブを使用し、594 nmの波長で励起することにより、画像の周皮細胞へのTxRedキューブを使用しています。
- 倒立蛍光顕微鏡上の4つの異なるフィールドの写真を買収FITCとTxRedフィルターキューブを持ちます。
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Representative Results
マトリックスゲルプラグ部は、図に示されているのECおよび周皮細胞の両方を含むプラグが、いくつかの灌流を表示するのに対し、代表的H＆Eおよび免疫蛍光染色は、ECからの2セクションは唯一のプラグは、主に血液で灌流されていないいくつかの船（左図2トップ、黒矢印）を表示しますCD31陽性のECのすぐ隣に正のSMA染色により証明されるように、より大きな直径および完全な周皮細胞被覆を持つ船、。これらの結果は、周皮細胞は、新生血管形成において重要な役割を果たし、この動的プロセスは再現し、容易にin vivoモデルで分析することができることを示唆しています。
組織カセットに埋め込まれたとき1.組織の向きを図。マトリックスゲルプラグ（黄色）が単離された後、それはマウスの筋肉（紫）と皮膚（緑）層の間インチ示されるように、すべての3層切片の間に第1の切断される表面を横切って見ることができるように、プラグを組織カセット内に配置されます。 A）カセットの上部からの眺め、B）カセットの側からの眺め。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.代表的H＆E（一番上の行）とマトリックスゲルの免疫蛍光（下段）。画像は、単独でのEC（左画像）とのECプラス健康周皮細胞（PC）（右画像）の外観を示しています。ヒトおよびマウスのECは、緑（下の画像）で標識し、周皮細胞（α平滑筋アクチン（αSMA）は）（右下）赤色で標識し、核がされていますDAPI染色で青色に染色。スケールは25μmです。この図は、以前の出版物8から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
マトリックスゲルプラグアッセイは、血管形成、in vivoでの血管新生および抗血管新生化合物における遺伝子調節を評価するため、およびインビトロ試験を補完するために便利で強力な方法であることが証明されています。ここでは、詳細には血管形成中の内皮細胞と周皮細胞との間の相互作用を調べ、ヒト血管新生の新規マトリックスゲルプラグアッセイを記述する。
このプロトコルにはいくつかの新規かつ重要なステップがあります。低継代（継代1から4）の細胞は若い細胞は、14日間の実験設定の際に、より実行可能になるので好ましいです。使用される内皮細胞の数が最小のもの百万および周皮細胞に対するECの比率が5：1です。しかしながら、増加した周皮細胞の数は、毛細管へのカバレッジを強化します。単独で内皮細胞の実験群については、注入した細胞の総数は120万である内皮細胞および周皮細胞の和、である必要があり、そのためのeは、プラグあたりの総細胞数は一貫しています。細胞数とマトリクスゲル体積の適切な量を計算することが重要です。基本式は、マトリックスゲルの200μlの1.2万個の細胞です。また、注入前に、常に氷上にピペットチップ、シリンジ、マトリックスゲル、細胞ペレットを保ちます。マトリックスゲルは、粘性であり、空気を避けるために、細胞懸濁液中に形成する気泡ので、より良好な流れを可能にするには、1 mlのピペットチップの先端から約1cmに切断します。マウスが注入される準備が整うまで、細胞とマトリックスゲルを混在させないでください。各プラグ注入は、1分未満を取る必要があります。一つのマウスは、2つのプラグ、その背中の両側に1つずつを運ぶことができます。抽出プラグは、筋肉と皮膚の層の間に挟まれたプラグインを維持することを確認した場合、その後、マトリックスゲルプラグはよく分離した後に収集されます。
マトリックスゲルプラグアッセイの欠点は、それは時間がかかることが高価であり、そのようなinjecなど、退屈で繊細な工程を伴いますションとプラグの分離。これらの手順が失敗した場合、結果が台無しにされるだろうとプロセスが新しいマウスや材料で再び繰り返さなければならないであろう。
しかし、データが再現可能であり、実験設計の面で柔軟性を提供します。例えば、成長因子または阻害剤は、薬物の検証のために使用することができる、血管発生の異なる段階でプラグに投与することができます。また、マトリックスゲルプラグ中へのこのような増殖停止細胞のような他の細胞型、トランスフェクトされた細胞株または腫瘍細胞株の取り込みは、血管形成中の内皮細胞表現型を操作するための別の可能性です。私たちのプロトコルは、この柔軟性を利用し、in vivoで完全に機能する、周皮覆われた、ハイブリッド血管の形成を可能にするためのECと一緒にヒト由来周皮細胞を紹介します。我々のプロトコルは、チューブを含め、重要な血管新生エンドポイント用にこれらのプラグからの組織切片を分析する方法について説明します本これらの2つの細胞タイプの数および管の長さ、。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Endothelial Cell Media (ECM) kit | Sciencell | 1001 | includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| Pericyte Media (PM) kit | Sciencell | 1201 | includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| primary human pulmonary microvascular endothelial cells | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4 | |
| primary human pulmonary pericytes | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is not available commercially, but brain paricytes are. Cells used at passage 1-4 | |
| bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) | Peprotech | 100-18B | stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD | 356237 | |
| 28 G 1 cc Insluin Syringe | BD | 329410 | |
| SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml screw top tubes, sterile | BD Biosciences | 352096 | |
| PAP pen | Life Technologies | 8899 | |
| hemocytometer | ThermoFisher Scientific | 02-671-6 | |
| Nair hair removal cream | Walmart | ||
| anti-human CD31 primary antibody | LifeSpan Biosciences | LS-B4737 | working solution is 1:50 |
| anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody | Sigma | C6198 | working solution is 1:300 |
| goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green | ThermoFisher Scientific | A-11008 | working solution is 1:250 |
| Prolong Gold DAPI solution | Cell Signaling | 8961S | |
| microscope slides | VWR | 48300-047 | |
| no. 1.5 cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-544-D | |
| citrate buffer 10x | Millipore | 21545 | |
| extra fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Formalin (paraformaldehyde) | Thermo Fisher Scientific | 245-685 | |
| Tissue cassettes | Simport | M492-12 | |
| goat serum | Dako | X0907 |
References
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