Summary
Vi presenterer en protokoll for å studere humane endotel-pericyte interaksjoner i mus ved anvendelse av en variasjon av matrisen gelen pluggen angiogenese assay.
Introduction
Angiogenese er prosessen der nye blodkar dannes fra en pre-eksisterende vaskulære nettverket 1 og er i fokus i pågående forskning på tvers av mange områder som spenner fra normal utvikling av sykdom. Denne dynamisk prosess involverer proliferasjon og migrering av endotelceller (ECS) og rekruttering av pericytes å konstruere en vaskulær rør som er rettet mot det området som trenger oksygen og næringsstoffer levering 2. For å undersøke denne prosessen krever en like dynamisk analyse, viktigst en som kan rekapitulere den tredimensjonale art av rør formasjonen. In vitro 3D-matriks-analyser er blitt utviklet for å møte dette behov, og har fungert godt for å tillate forskere å definere diskrete trinn i rom og tid i hvilken angiogenese finner sted 3, 4, 5, 6. Imidlertid er disse in vitro 3D matrix modeller begrenset til å studere ikke-dynket fartøy and mangler derfor kritiske komponenter av betydning for angiogenese prosessen (f.eks sirkulerende vekst og hemmende faktorer, unaturlig spenning / krefter på tvers av vaskulær seng) og ikke klarer å simulere komplekse miljøet til stede i levende vev. For å møte denne begrensningen, har flere in vivo angiogenese analyser er utviklet syv, inkludert matrisen gel plug-analyse som vil være fokus for vår rapport 8, 9.
Matrisen gel plug-analysen er en veletablert in vivo angiogenese analysen som appellerer til forskere som det gir en robust plattform for å teste rollene til ulike celler og stoffer i angiogenese. Matrix-gel er en kommersielt tilgjengelig basalmembran-løsning som er utskilt av Engelbreth-Holm-sverm (HMS) mus sarkom cellelinje som stivner til en gel-lignende materiale ved 37 ° C. Matrisen Gelen kan blandes med celler og / eller substanser, slik som vekstfaktorer og injected subkutant i mus. Verten ECS vil invadere pluggen i løpet av 14 dager, danner et vaskulært nettverk, og blir perfusert med vertens blod. Hittil har matrise gel plug analyser fokusert utelukkende på studier av endotelceller oppførsel under angiogenese, men til vår beste overbevisning ingen innsats har ennå ikke blitt gjort for å finne ut om denne analysen kan brukes til co-kultur endotelceller og pericytes for å studere hvordan disse to celletypene samvirke under angiogenese. Nærmere bestemt forstå forholdet mellom ECS og pericytes er verdifull for å studere sykdommer hvor blodkar tap er patologisk, inkludert mikrovaskulær ischemi og perifer vaskulær sykdom 10, 11, 12.
Her beskriver vi en protokoll som innfører human-deriverte pericytes til matrisen gelen blandingen sammen med menneskelig ECS og fibroblast vekstfaktor (bFGF). Denne blandingen kan deretter injiseres subkutant in ryggen SCID-mus for å tillate dannelsen av fullt funksjonelle, pericyte belagt, hybrid fartøy. Vår protokollen beskriver hvordan du kan forberede matrise gel plugger som inneholder menneskeegenkapitalbevis enten med eller uten menneskelige pericytes, plassering i SCID-mus og hvordan å analysere histologiske snitt for kritiske angiogenese endepunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Stanford University School of Medicine.
MERK: Dyr er under bedøvelsen med 3% vaporizer isofluran og 3% tilførsel av O 2 gass. Bruk av veterinær salve på øynene kan bidra til å hindre tørrhet mens under anestesi.
1. Cell Forberedelse
- Grow menneskelige endotelceller og pericyte cellekulturer i 100 mm plater med 10 ml av det aktuelle mediet. Bytt ut 10 ml friskt medium hver 2 - 3 dager til cellene nå 80% sammenflytning.
- Kultur endotelceller (ECS) i fullstendig endotelial cellemateriale (ECM) supplert med selskapet levert 5% føtalt bovint serum (FBS), 10% penicillin / streptomycin og 10% supplement endotelial cellevekst.
- Kultur pericytes i fullstendig pericyte media (PM) supplert med selskapet levert 2% FBS, 10% penicillin / streptomycin og 10% pericyte vekst supplement.
- Forbered celle blandinger
- Beregn det nødvendige antall celler for de eksperimentelle og kontrollgruppene.
MERK: Hver plugg i den eksperimentelle gruppen inneholder millioner (1 x 10 6) menneskelige egenkapitalbevis og tohundretusen (2 x 10 5) pericytes. For kontrollgruppen, inneholder hver plugg bare 1,2 millioner mennesker ECS. Den negative kontrollgruppe har bare matrise gel. Hver gruppe bør inneholde minst fire plugger, som ville kreve to mus som plugger kan injiseres inn i hver side av en mus korsryggen. Tre plugger ville tjene som triplikat for forsøket og det fjerde kunne brukes i tilfelle en svikter. Forbered 25% ekstra cellene for å matche den ekstra volum av gel. - Samle og telle celler fra kulturplater.
- For å løsne cellene, fjerne media og vaske en gang med romtemperatur 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Fjern PBS, tilsett 1 ml 0,25% Trypsin / 2,21 mM EDTA, og inkuberes i 1 min. Vask celler av platen ved å legge toml medium og samles i en 15 ml tube.
- Telle celle ved hjelp av en hemocytometer i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sentrifuger det passende antall av celler i en pellet ved 400 xg i 5 minutter. For den eksperimentelle gruppen, sentrifuger både egenkapitalbevis og pericytes ned sammen til en pellet.
- Beregn det nødvendige antall celler for de eksperimentelle og kontrollgruppene.
2. Matrix Gel Forberedelse
- Tine opp matrise gelen fullstendig ved 4 ° C i 4 timer eller over natten for å oppnå en homogen løsning. Ingen blanding er nødvendig.
- Delmengde matrise gel i 1,5 ml rør og oppbevar ved 4 ° C.
- Pre-kjøle- sterilt 1,5 ml rør og 28 G 1 cc insulinsprøyter ved 4 ° C. Forsiktig: Hold matrise gel på is til alle tider.
- Bland kald matrise gel med bFGF ved et volumforhold på 1: 100 (sluttkonsentrasjon av bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF stamløsning = 50 ug / ml) Etter blanding matrise gel-løsning ved å pipettere opp og ned flere ganger, inkubert på is i 30 - 60 min before blandes med cellene i trinn 3.1.
MERK: Tine aksje bFGF før blanding. Beregn antall plugger som trengs for injeksjon. For eksempel krever hver plugg 200 ul matrise gel. Derfor forbereder 25% ekstra gel.
3. Bland Matrix Gel med Cells
- For hver gruppe, cellepelleten suspenderes (inneholdende passende cellenummer) med det beregnede volumet av matriksen gel inneholdende bFGF. Bland forsiktig for å unngå skumming og la i 15 ml tube på is inntil mus er forberedt for injeksjon.
4. Mouse Forberedelse
- Bedøve 1 SCID-mus i 5 min i 3% isofluran pluss 3% O 2 i en induksjonskammeret. Fokus på en eksperimentell gruppe, eller 2 mus, på en gang.
- Fjern musen fra induksjonskammeret sted på en varmepute ventral side ned og raskt feste en snute dyse til musen ansikt via en ikke-gjenpusting system for å levere anestesi hele injeDette skjer prosedyre. Slå gasstrømmen fra induksjonskammeret til den ikke-gjenpustingssystem og senke gasstrykket til 1,5% isofluran og 1,5% O 2.
- Fjern hår fra begge side hind regioner (rundt 1 cm diameter) med en barbermaskin eller hårfjerningskrem.
- Tørk huden med en 70% alkohol pad.
- Returner musen til induksjon kammeret og gjenta trinn 04.02 til 04.04 med andre mus.
5. Matrix Gel Injection
- Forbered en mus for injeksjon ved å feste til den ikke-gjeninnånding system og plassere på varmeputen ventral side ned.
- Last matrisen gelen inn i en på forhånd avkjølt 28 G 1 cc insulinsprøyte en mus på en gang.
- Laster den komp 500 ul volum av matriksen gel for to plugger (200 ul pr plugg plus 25% ekstra) inn i sprøyten.
- Sørg for å injisere matrisen gel inn i mus innen 3 min av lasting cellene i sprøyten for å hindre at cells fra settling til siden av sprøyten og for å hindre at matrise gel fra å størkne inne i sprøyten.
- Løfte av huden for å lokalisere subkutan plass, og deretter injisere 200 ul av matrisen gelen langsomt og jevnt inn i det subkutane plass av baksiden bakre av brystkassen.
- Fjern kanylen sakte, er forsiktig med å hindre matrise gel lekker ut av injeksjonsstedet. En bump vil danne på injeksjonsstedet. Tørk injeksjonsstedet med en alkohol pad.
- Gjenta injeksjon trinn 5.2 til 5.5 på den andre siden av mus er tilbake, og deretter la musen på ryggen i 1 min for å tillate gelering av matrisen gel på varmeplaten.
- Skissere begge støt ved hjelp av en permanent markør for å identifisere kulen etter 14 dager. Etter noen hår vokser tilbake, vil det være lettere å finne brak.
6. Matrix Gel Plug Isolasjon: 14 dager etter injeksjon
- Avlive mus humant ved å utsette dyrets å> 5 min av karbondioksyd inhalering, etterfulgt av cervikal dislokasjon å sikre døden.
- Fjern matrisen gel pluggen fra musen rygg.
- fjerne regrown håret forsiktig rundt injeksjonsstedet der pluggen ligger ved å gjenta trinn 4.3. Markøren linjen angir størrelsen på original brak under huden.
- Skjære pluggen sammen med de omkringliggende hud og muskel lag festet på toppen og bunnen sider av pluggen, henholdsvis.
- Ved hjelp av fint kirurgiske sakser, gjøre et snitt på den markerte grensen av den plugg som er vinkelrett på huden og skjære gjennom til muskelen under pluggen. Deretter forsiktig skåret rundt omkretsen av pluggen langs den merkede grensen.
- Ta ut kontakten, holde den klemt mellom hud og muskel lag. Skyll straks i en liten kanne med 1x PBS å vaske bort overflødig blod. Pluggen er nå klar til å være fast (neste trinn, 6,3).
- Fest plug i 4% paraformaldehyde.
- Plasser hele pluggen, inkludert hud- og muskellagene, i et 50 ml rør med 25 ml av 4% paraformaldehyd i 24 timer ved romtemperatur uten gynge. Neste dag, overføre pluggen inn i 25 ml 70% etanol i ytterligere 24 timer før parafin innebygging.
MERK: Håndteres paraformaldehyde med forsiktighet. Bruk hansker.
- Plasser hele pluggen, inkludert hud- og muskellagene, i et 50 ml rør med 25 ml av 4% paraformaldehyd i 24 timer ved romtemperatur uten gynge. Neste dag, overføre pluggen inn i 25 ml 70% etanol i ytterligere 24 timer før parafin innebygging.
7. Parafin Process Matrix Gel Plug
- Forbered pluggen for parafin innebygging.
- Orienter pluggen som vist i Figur 1a; plassere pluggen i et vev kassett slik at den siden av pluggen vender opp og både huden og muskellagene er synlige over hele overflaten av vevet blokken som skal skjæres først under snitting.
- Parafin legge pluggen i henhold til standard parafin innebygging protokoller 13.
- Skjær 8 - 10 mikrometer tykke seksjoner ut av vevsblokk og montere på objektglass According til standard parafin seksjonering protokoller 13.
- Oppbevar lysbilder i et tørt og kjølig sted i romtemperatur før du er klar for farging.
8. Stain Seksjoner med Hematoxylin og eosin Stain (H & E) 13
- De-paraffinize vevssnittene ved å føre skinnene gjennom 100% xylen to ganger, 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol og til slutt 1 x PBS, hver i 5 min ved romtemperatur. La glir i 1 x PBS før neste trinn.
- Pipetter 100 pl H & E-løsning på seksjonen og inkuberes i 1 - 5 minutter, eller inntil det er tydelig kontrast mellom blått og rosa kjerner cytoplasma i en celle som vist i henhold til en oppreist lysmikroskop ved 10X forstørrelse. Vær forsiktig med å la noen H & E løsning berøre målet.
- Vask H & E løsning ut av raset ved dunking raset i et stort beger med vann fra springen, og deretter plassere raset i et stativ i begeret og skyll under rennende vann i 2 min.
- Move til trinn 9.8 for å montere lysbildene.
9. Stain andre lysbilder for menneskekapillærene og pericytes
- De-paraffinize vevssnittene ved å føre skinnene gjennom 100% xylen to ganger, 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol og til slutt 1 x PBS, hver i 5 min ved romtemperatur. La glir i 1 x PBS før neste trinn.
- Kok delene i antigen gjenfinning løsning.
- I et 2 liters begerglass, forberede kokende antigen henting løsning ved hjelp av 1x citratbuffer (pH 7,0) ved 95 ° C på en varmeblokk.
- Når koking, plasserer lysbilder i en metall stativ og senk i koke antigen gjenfinning løsning for 20 min.
- Fjern forsiktig begeret fra varmeblokken med lysbildene fremdeles neddykket og la oppløsningen sakte vende tilbake til romtemperatur i ca. 30 min.
- Plasser lysbildene i 1x PBS til neste trinn.
- Blokker seksjonene i blokkeringsbuffer (1x PBS, 5% Goat Serum, 00,3% Triton X-100).
- Tegn en hydrofob sirkel rundt kantene på hver seksjon med en PAP penn.
- Plasser lysbildene i en luftfuktighet skuff med destillert vann i bunnen av skuffen.
- Pipetter 100 ul blokkeringsbuffer på seksjonene gjør at alle av vevet er dekket av væske (kan kreve mer enn 100 mL).
- Inkuber seksjoner med blokkeringsbuffer i 1 time.
- Inkuber seksjoner med primær antistoff.
- Fremstille en løsning med to primære antistoffer for å undersøke hver seksjon for CD31 (ECS) og glatt muskulatur aktin (pericytes) fortynnet i fortynningsbuffer (1 x PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100).
MERK: Her er anti-CD31 konsentrasjon 01:50 og anti-glatt muskulatur aktin konsentrasjon er 1: 300. - Inkuber seksjonene over natten ved 4 ° C med 100 ul primære antistoffer i en fuktighet brett inneholdende destillert vann.
- Fremstille en løsning med to primære antistoffer for å undersøke hver seksjon for CD31 (ECS) og glatt muskulatur aktin (pericytes) fortynnet i fortynningsbuffer (1 x PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100).
- Vask objektglassene tre ganger i 1 x PBST (1 x PBS + 0,1% TWeEN20) i 5 minutter hver vask.
- Inkuber seksjoner med sekundært antistoff.
- Fremstille en løsning med en fluorofor-konjugert geit anti-kanin sekundært antistoff for å gjenkjenne anti-CD31 kanin-antistoff fortynnet i fortynningsbuffer.
- MERK: glatt muskulatur aktin primære antistoffet er allerede konjugert med en Cy3 fluorophore, så ingen sekundær antistoff farging er nødvendig. Geit-anti kanin sekundært antistoff-konsentrasjon er 1: 250.
- Inkuber seksjonene i 1 time med 100 pl sekundært antistoff i fuktigheten magasinet som inneholder destillert vann.
- Fremstille en løsning med en fluorofor-konjugert geit anti-kanin sekundært antistoff for å gjenkjenne anti-CD31 kanin-antistoff fortynnet i fortynningsbuffer.
- Vask objektglassene tre ganger i 1 x PBST i 5 min hver vask.
- Monter skinnene.
- Pipette 2 - 3 dråper (~ 40 - 60 mL) av antifade monteringsløsning med DAPI atom flekker på hver seksjon.
- plassere et nei forsiktig. 1,5 dekkglass over seksjonene og monteringsløsning, slik at væsken til å spre seg over seksjonene og til kantene avdekkglass. Forsiktig bruk en finger for å presse ut luftbobler som kan være plassert over seksjonen.
- La lysbilder tørke i minst en time før håndtering.
10. Quantify kapillær tetthet og struktur 14
- Tell antall kapillærer i H & E farget seksjoner, uttrykt som # / mm 2.
- Få tak i bilder av fire ulike felt på en oppreist lysmikroskop etter 40X forstørrelse.
MERK: Kapillærer er identifisert som rør fylt med røde blodceller. - Alternativt, i stedet for å telle manuelt kapillærene, bruker programvare for bildeanalyse (som Wimasis Image Analysis) for å kvantifisere forskjellige angiogenese parametere som antall kar, gjennomsnittlig kar lengde og diameter, og forgreningspunkter.
- Få tak i bilder av fire ulike felt på en oppreist lysmikroskop etter 40X forstørrelse.
- Analyser kapillær struktur i Immunofluorescent farget seksjoner.
- Få tak i bilder av fire ulike felt på en invertert fluorescerende mikroskopmed FITC og TxRed filter kube.
- Bruk en FITC kube til bilde egenkapitalbevis ved eksitasjon ved 488 nm bølgelengde og bruke en TxRed kube til bilde pericytes ved eksitasjon ved 594 nm bølgelengde.
- Få tak i bilder av fire ulike felt på en invertert fluorescerende mikroskopmed FITC og TxRed filter kube.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant H & E og immunfluorescens farging av matrise gel plug seksjoner er vist i Figur 2. avsnitt fra EC bare plugger vise noen fartøy som stort sett ikke perfused med blod (Figur 2 øverst til venstre, svarte piler), mens pluggene som inneholder både egenkapitalbevis og pericytes vise flere dynket fartøy med større diameter og komplett pericyte dekning, noe som gjenspeiles av positive SMA flekker i umiddelbar nærhet til CD31-positive egenkapitalbevis. Disse resultatene antyder at pericytes spille en betydelig rolle i begynnende blodkardannelse, og at den dynamiske prosessen kan rekapitulert og lett analyseres i en in vivo modell.
Figur 1. Tissue Orientering når plantet i et Tissue kassett. Etter at matrisen gelen pluggen (gul) er isolert, er deti mellom musens muskel (lilla) og hud (grønn) lag. Pluggen plasseres i vevet kassetten som vist, slik at alle de tre lagene kan bli sett på tvers av den overflate som skal skjæres først under snitting. A) Se fra toppen av kassetten, B) fra siden av kassetten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representant H & E (øverste rad) og immunfluorescens (nederste rad) av Matrix Gel. Bildene viser utseendet på egenkapitalbevis alene (venstre bilde) og egenkapitalbevis pluss sunne pericytes (PC) (høyre bilde). Menneskelige og murine egenkapitalbevis er merket i grønt (nederste bilde) og pericytes (α glatt muskel aktin (αSMA)) er merket i rødt (nederst til høyre), og kjerner erfarget blå med DAPI flekken. Scale er 25 mikrometer. Dette tallet har blitt forandret fra en tidligere publikasjon 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Matrisen gel plugg analysen har vist seg å være en praktisk og effektiv metode for å evaluere genregulering i angiogenese, angiogene og anti-angiogene forbindelser in vivo, og for å supplere in vitro tester. Her beskriver vi i detalj en roman matrise gel plugg analyse av menneskelig angiogenese som undersøker samspillet mellom endotelceller og pericytes under fartøyet formasjon.
Det er noen nye og viktige skritt i denne protokollen. Celler i lav passasje (passasje 1 - 4) er å foretrekke fordi unge celler vil være mer levedyktig i løpet av den 14 dager lange eksperimentelle omgivelser. Antallet av endotelceller som benyttes er minst en million og forholdet av EC til pericyte er 5: 1; vil imidlertid økt pericyte celle nummer forbedre sin dekning på kapillærer. For den eksperimentelle gruppen av endoteliale celler alene, bør det totale antall celler injisert være summen av endotelceller og pericytes, som er 1,2 millioner, dermede, er det totale celletallet pr plugg konsekvent. Det er viktig å beregne passende mengder av celletall og matrise gelvolumet. Den grunnleggende formel er 1,2 millioner celler i 200 ul matrise gel. I tillegg, før injeksjon, holde pipettespisser, sprøyter, matrise gel, og cellepelletene på is hele tiden. Siden matrisen gel er viskøs og for å unngå luftbobler dannes i løpet av cellesuspensjonen, kuttet ca 1 cm av av tuppen på 1 ml pipettespisser for å gi bedre strømning. Ikke bland matrise gel med celler til mus er klar til å bli injisert. Hver plugg injeksjon bør ta mindre enn ett minutt. En mus kan bære to plugger, en på hver side av ryggen. Når utpakking pluggene sørg for å holde kontakten klemt mellom muskel og hud lag, deretter matrisen gel pluggen vil bli godt samlet etter isolasjon.
Ulempene med matrisen gelen pluggen analysen er at det er tidkrevende, kostbart, og medfører tidskrevende og følsomme fremgangsmåten for eksempel injecsjon og plugg isolasjon. Hvis denne fremgangsmåten skulle svikte, ville resultatet bli ødelagt og fremgangsmåten ville måtte bli gjentatt på nytt med nye mus og materialer.
Imidlertid er dataene reproduserbar og gir fleksibilitet i form av eksperimentell design. For eksempel, kan bli administrert vekstfaktorer eller inhibitorer mot pluggen på ulike stadier av vaskulær utvikling, som kan anvendes for medikament validering. Videre inkorporering av andre celletyper, så som vekst-stansede celler, transfekterte cellelinjer eller tumorcellelinjer, inn i matrisen gelen pluggen er en annen mulighet for å manipulere endotelcelle-fenotype under angiogenese. Vår protokollen benytter denne fleksibiliteten og introduserer menneske avledet pericytes sammen med egenkapitalbevis for å tillate dannelsen av fullt funksjonelle, pericyte dekket, hybride skip i vivo. Vår protokollen beskriver også hvordan å analysere histologiske seksjoner fra disse pluggene for kritiske angiogenese endepunkter, inkludert tubeantall og lengde rør, med disse to celletypene som er tilstede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Endothelial Cell Media (ECM) kit | Sciencell | 1001 | includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| Pericyte Media (PM) kit | Sciencell | 1201 | includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| primary human pulmonary microvascular endothelial cells | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4 | |
| primary human pulmonary pericytes | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is not available commercially, but brain paricytes are. Cells used at passage 1-4 | |
| bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) | Peprotech | 100-18B | stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD | 356237 | |
| 28 G 1 cc Insluin Syringe | BD | 329410 | |
| SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml screw top tubes, sterile | BD Biosciences | 352096 | |
| PAP pen | Life Technologies | 8899 | |
| hemocytometer | ThermoFisher Scientific | 02-671-6 | |
| Nair hair removal cream | Walmart | ||
| anti-human CD31 primary antibody | LifeSpan Biosciences | LS-B4737 | working solution is 1:50 |
| anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody | Sigma | C6198 | working solution is 1:300 |
| goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green | ThermoFisher Scientific | A-11008 | working solution is 1:250 |
| Prolong Gold DAPI solution | Cell Signaling | 8961S | |
| microscope slides | VWR | 48300-047 | |
| no. 1.5 cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-544-D | |
| citrate buffer 10x | Millipore | 21545 | |
| extra fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Formalin (paraformaldehyde) | Thermo Fisher Scientific | 245-685 | |
| Tissue cassettes | Simport | M492-12 | |
| goat serum | Dako | X0907 |
References
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).
- Liu, Y., Senger, D. R. Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells. FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).
- Grant, D. S., et al. Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo. J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).
- Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix. J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).
- Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis. Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).
- Yuan, K., et al. Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis. Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).
- Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).
- Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action. Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).
- Ricard, N., et al. Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension. Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).
- Buchwalow, I. B., Bocker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).
- Tata, D. A., Anderson, B. J. A new method for the investigation of capillary structure. J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).
