Summary
Vi præsenterer en protokol til at studere human endotel-pericyt interaktioner i mus ved anvendelse af en variation af matricen gel plug angiogenese assay.
Introduction
Angiogenese er den proces, hvor nye blodkar dannes ud fra en allerede eksisterende vaskulære netværk 1 og er fokus for igangværende forskning på tværs af mange områder, der spænder fra normal udvikling til sygdom. Denne dynamiske proces involverer proliferation og migration af endotelceller (ECS) og rekruttering af pericytter at konstruere en vaskulær rør, der er rettet mod det websted, der har brug for ilt og næringsstoffer levering 2. For at undersøge denne proces kræver en lige så dynamisk assay, vigtigst en, der kan rekapitulere den tredimensionale karakter dannelse rør. In vitro er blevet udviklet 3D matrix-analyser for at løse dette behov og har fungeret godt at give forskerne at definere de diskrete trin i tid og rum, hvor angiogenese finder sted 3, 4, 5, 6. Imidlertid er disse in vitro 3D matrix-modeller begrænset til at studere ikke-perfunderede fartøjer and mangler derfor kritiske komponenter er relevante for angiogenese processen (fx cirkulerende vækst og hæmmende faktorer, unaturlige spændinger / kræfter på tværs af vaskulære seng) og undlader at simulere komplekse miljø til stede i levende væv. For at løse denne begrænsning har flere in vivo angiogenese analyser er udviklet 7, herunder matrix gel plug assay, som vil være i fokus i vores rapport 8, 9.
Matricen gel plug-analysen er en veletableret in vivo angiogenese assay, der appellerer til forskere, da det giver en robust platform til at teste roller forskellige celler og stoffer i angiogenese. Matrixgel er en kommercielt tilgængelig basalmembran løsning, der udskilles af Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muse sarcoma-cellelinie som størkner til en gel-lignende materiale ved 37 ° C. Matrixgelen kan blandes med celler og / eller stoffer, såsom vækstfaktorer og InjeCTED subkutant i mus. Værten EC'er vil invadere proppen over 14 dage, danner en vaskulære netværk, og blive perfunderet med værtens blod. Til dato har matrix gel plug analyser udelukkende fokuseret på studiet af endotelceller opførsel under angiogenese dog til vores bedste overbevisning er der endnu ikke gjort noget for at afgøre, om denne analyse kan bruges til at co-kultur endotelceller og pericytter at undersøge, hvordan disse to celletyper interagerer under angiogenese. Specifikt forstå forholdet mellem EC'er og pericytes er værdifuld til undersøgelse af sygdomme, hvor tab blodkar er patologisk, herunder mikrovaskulære iskæmi og perifer karsygdom 10, 11, 12.
Her beskriver vi en protokol, der introducerer human-afledte pericytter til matricen gel blandingen sammen med human EC'er og fibroblastvækstfaktor (bFGF). Denne blanding kan derefter injiceres subkutant in dorsum af SCID-mus at tillade dannelse af fuldt funktionelle, pericyt overtrukket, hybride fartøjer. Vores protokol beskriver, hvordan man forbereder matrix gel propper indeholdende humane EC'er enten med eller uden menneskelige pericytter, placering i SCID-mus og hvordan man kan analysere de histologiske snit til kritiske angiogenese endepunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Procedurer, der involverer dyr fag er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved Stanford University School of Medicine.
BEMÆRK: Dyr er under bedøvelse med 3% vaporizer isofluran og 3% forsyning af O 2 gas. Anvendelse af dyrlæge salve på øjnene kan medvirke til at forebygge tørhed, mens under anæstesi.
1. Cell Fremstilling
- Grow menneskelige endotel og pericyt cellekulturer i 100 mm plader med 10 ml af den relevante medier. Erstat 10 ml frisk medium hver 2 - 3 dage, indtil cellerne når 80% sammenflydning.
- Kultur endotelceller (ECS) i komplet endotelcelle medier (ECM) suppleret med selskab leveret 5% føtalt bovint serum (FBS), 10% penicillin / streptomycin og 10% endothelial cellevækst supplement.
- Kultur pericytter i fuldstændig pericyt medier (PM) suppleret med selskab leverede 2% FBS, 10% penicillin / streptomycin og 10% pericyt vækst supplement.
- Forbered celleblandinger
- Beregn det nødvendige antal celle til forsøgs- og kontrolgrupper.
BEMÆRK: Hver prop i den eksperimentelle gruppe indeholder en million (1 x 10 6) humant EC'er og 200 tusind (2 x 10 5) pericytter. For kontrolgruppen, hver prop indeholder kun 1,2 millioner menneskelige EC'er. Den negative kontrolgruppe har kun matrixgel. Hver gruppe skal omfatte mindst fire stik, som kræver to mus som propper kan injiceres i hver side af en mus nedre rygparti. Tre stik ville tjene som triplo til eksperimentet og den fjerde kunne anvendes i tilfælde undlader. Forbered 25% ekstra celler til at matche den ekstra mængde gel. - Indsamle og tælle celler fra dyrkningsplader.
- For at frigøre celler, fjerne medier og vask en gang med rumtemperatur 1x phosphatpufret saltvand (PBS). Fjern PBS, tilsættes 1 ml 0,25% trypsin / 2,21 mM EDTA, og inkuberes i 1 min. Vask cellerne fra pladen ved tilsætning af 2ml medium og samles i en 15 ml rør.
- Tæl celle under anvendelse af et hæmocytometer ifølge producentens anvisninger.
- Centrifugeres passende antal celler i en pellet ved 400 xg i 5 min. I den eksperimentelle gruppe, centrifuge både EC'er og pericytes ned sammen til en pellet.
- Beregn det nødvendige antal celle til forsøgs- og kontrolgrupper.
2. Matrix Gel Fremstilling
- Tø matrixgel fuldstændigt ved 4 ° C i 4 timer eller natten over til opnåelse af en homogen opløsning. Ingen blanding er påkrævet.
- Alikvot matrix gel i 1,5 ml rør og opbevares ved 4 ° C.
- Pre-chill sterile 1,5 ml rør og 28 G 1 cc insulininjektionssprøjter ved 4 ° C. Advarsel: Hold matrix gel på is på alle tidspunkter.
- Bland kold matrixgel med bFGF i et volumenforhold på 1: 100 (slutkoncentration af bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF stamopløsning = 50 ug / ml) Efter blanding matrix gelopløsning ved pipettering op og ned flere gange, inkuberes på is i 30 - 60 min before blanding med cellerne i trin 3.1.
BEMÆRK: Optø bestanden bFGF før blanding. Beregne antallet af propper, der er nødvendige til injektion. For eksempel har hver prop kræver 200 pi matrixgel. Derfor forberede 25% ekstra gel.
3. Bland Matrix Gel med celler
- For hver gruppe, resuspender cellepelleten (indeholdende passende celleantal) med den beregnede mængde af matrix gel indeholdende bFGF. Bland forsigtigt for at undgå skumdannelse og lad i 15 ml rør på is, indtil mus er forberedt til injektion.
4. Mus Forberedelse
- Bedøver 1 SCID-mus i 5 minutter i 3% Isofluran plus 3% O2 i en induktion kammer. Fokus på én forsøgsgruppe, eller 2 mus, på et tidspunkt.
- Fjern musen fra induktion kammer, sted på en varmepude ventrale side ned og hurtigt vedhæfte en snude dyse til musen ansigt via en ikke-genåndingssystem at levere anæstesi hele InjeIndsatsen procedure. Switch gasstrømmen fra induktion kammer til det ikke-genåndingssystem og sænke gastrykket til 1,5% isofluran og 1,5% O2.
- Fjern hår fra begge laterale hind regioner (omkring 1 cm i diameter) med en barbermaskine eller hårfjerning creme.
- Tør huden med en 70% alkohol pad.
- Retur musen til induktion kammeret og gentag trin 4.2 - 4.4 Hvad den anden mus.
5. Matrix Gel Injection
- Forbered en mus til injektion ved at knytte til den ikke-genåndingssystem og anbringelse på varmepude ventrale nedad.
- Indlæse matrix gelen i en forud afkølet 28 G 1 cc insulinsprøjte en mus ad gangen.
- Indlæse den komplette 500 pi volumen matrixgel for to stik (200 pi pr plug plus 25% ekstra) ind i sprøjten.
- Sørg for at indsprøjte matricen gel i musene indenfor 3 min på lastning cellerne ind i sprøjten for at forhindre ceLLS fra afregning til den side af sprøjten og forhindre matrixgel størkne inde i sprøjten.
- Løft rygskindet at lokalisere subkutane rum, derefter injicere 200 pi matrixgelen langsomt og jævnt ind i det subkutane rum af ryggen bagende over brystkassen.
- Fjern kanylen langsomt, være omhyggelig med at undgå matrixgel lække ud af injektionsstedet. En bule vil danne på injektionsstedet. Tør injektionsstedet med en alkohol pad.
- Gentag injektion trin 5.2 - 5.5 om den anden side af musens ryg, derefter forlade musen på ryggen i 1 minut for at tillade gelering af matrixen gel på varmepude.
- Skitsere begge bump bruger permanent markør for at identificere bump efter 14 dage. Efter nogle hår gror ud igen, vil det være nemmere at finde bump.
6. Matrix Gel Plug Isolation: 14 dage efter injektion
- Aflive musene humant ved at udsætte dyrets til> 5 min af kuldioxid inhalation efterfulgt af cervikal dislokation at sikre døden.
- Fjern matrixgelen stik fra musens ryg.
- Fjern forsigtigt regrown hår omkring injektionsstedet, hvor stikket er placeret ved at gentage trin 4.3. Markøren linje angiver størrelsen af oprindelige bule under huden.
- Udskære stikket sammen med den omgivende hud og muskellag fastgjort på de øverste og nederste sider af proppen, hhv.
- Brug af fine kirurgiske sakse, lave et snit på den markerede grænsen af proppen, der er vinkelret på huden og skære igennem til musklen under proppen. Derefter forsigtigt skåret omkring periferien af proppen langs den afmærkede grænse.
- Fjern proppen, holde det klemt inde mellem huden og musklen lag. Skyl straks i en lille bæger med 1x PBS til at vaske væk overskydende blod. Stikket er nu klar til at blive fast (næste trin, 6.3).
- Fix de plug i 4% paraformaldehyd.
- Placere hele proppen, herunder hud- og muskellag, i et 50 ml rør med 25 ml 4% paraformaldehyd i 24 timer ved stuetemperatur uden at rokke. Den næste dag, overføre stikket i 25 ml 70% ethanol i yderligere 24 timer før paraffinindlejring.
BEMÆRK: Håndter paraformaldehyd med forsigtighed. Brug handsker.
- Placere hele proppen, herunder hud- og muskellag, i et 50 ml rør med 25 ml 4% paraformaldehyd i 24 timer ved stuetemperatur uden at rokke. Den næste dag, overføre stikket i 25 ml 70% ethanol i yderligere 24 timer før paraffinindlejring.
7. Paraffin Process Matrix Gel Plug
- Forbered stik til paraffin indlejring.
- Vend stikket som vist i figur 1a; placere proppen i et væv kassette, således at den side af proppen vender opad, og både huden og musklen lag er synlige på tværs af overfladen af vævet blok, der vil blive skåret først ved skæring.
- Paraffin indlejre proppen ifølge standard paraffinindlejring protokoller 13.
- Skær 8 - 10 um tykke snit ud af vævet blok og montere på mikroskopobjektglas according til standard paraffin sektionering protokoller 13.
- dias i et køligt tørt sted ved stuetemperatur opbevares indtil den er klar til farvning.
8. Farv Sektioner med hæmatoxylin og Eosin Stain (H & E) 13
- De-paraffinize vævssnit ved at passere objektglassene gennem 100% xylen to gange, 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol og endelig 1x PBS, hver i 5 minutter ved stuetemperatur. Efterlad objektglassene i 1 x PBS, indtil det næste trin.
- Tilsæt 100 pi H & E opløsning på sektionen og inkuber i 1 - 5 min, eller indtil der er en klar kontrast mellem blå kerner og pink cytoplasma i en celle, som det ses under en opretstående lysmikroskop ved 10X forstørrelse. Pas på ikke at lade nogen H & E løsning røre målet.
- Wash H & E løsning ud af dias ved dunker dias i et stort bægerglas vandværksvand, derefter placere dias i et rack i bægeret og skyl med rindende vand i 2 min.
- Move til trin 9.8 at montere dias.
9. Stain Andre Slides for Menneskelige kapillærer og pericytter
- De-paraffinize vævssnit ved at passere objektglassene gennem 100% xylen to gange, 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol og endelig 1x PBS, hver i 5 minutter ved stuetemperatur. Efterlad objektglassene i 1 x PBS, indtil det næste trin.
- Kog de afsnit på antigen-genvinding opløsning.
- I et 2 liters bægerglas, forberede kogende antigen hentning løsning ved hjælp 1x citratpuffer (pH 7,0) ved 95 ° C på en varmeblok.
- Når kogning, placere dias i en metal rack og nedsænkes i kogende antigen hentning løsning i 20 min.
- Fjern forsigtigt bægeret fra varmeblokken med dias stadig neddykkede og lad opløsningen langsomt tilbage til stuetemperatur i ca. 30 min.
- Placer dias i 1x PBS til næste trin.
- Blokere sektionerne i blokerende buffer (1x PBS, 5% gedeserum, 0.3% Triton X-100).
- Tegn en hydrofob cirkel omkring kanterne af hvert afsnit med et PAP pen.
- Objektglassene anbringes i et fugtigt bakke med destilleret vand i bunden af bakken.
- Tilsæt 100 pi blokeringspuffer på afsnittene, så dens af vævet er dækket af væske (kan kræve mere end 100 pi).
- Inkuber sektioner med blokerende buffer i 1 time.
- Inkuber sektioner med primært antistof.
- Forbered en opløsning med to primære antistoffer til at probe hver sektion for CD31 (EC'er) og glatmuskelactin (pericytter) fortyndet i fortyndingsbuffer (1 x PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100).
BEMÆRK: Her anti-CD31 koncentration 1:50 og anti-glat muskel-actin koncentration er 1: 300. - Inkuber sektionerne natten over ved 4 ° C med 100 pi primære antistoffer i et fugtigt bakke indeholdende destilleret vand.
- Forbered en opløsning med to primære antistoffer til at probe hver sektion for CD31 (EC'er) og glatmuskelactin (pericytter) fortyndet i fortyndingsbuffer (1 x PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100).
- Vask slides tre gange i 1x PBST (1x PBS + 0,1% TWEEN20) i 5 minutter hver vask.
- Inkuber sektioner med sekundært antistof.
- Der fremstilles en opløsning med en fluorofor konjugeret gede-anti-kanin sekundært antistof til at genkende anti-CD31 kaninantistof fortyndet i fortyndingspuffer.
- BEMÆRK: glatmuskelactin primære antistof er allerede konjugeret med en CY3 fluorophor, så der ikke er brug sekundært antistof farvning. Gede-anti-kanin-koncentration sekundært antistof er 1: 250.
- Inkuber sektionerne i 1 time med 100 pi sekundært antistof i Luftfugtigheden bakke indeholdende destilleret vand.
- Der fremstilles en opløsning med en fluorofor konjugeret gede-anti-kanin sekundært antistof til at genkende anti-CD31 kaninantistof fortyndet i fortyndingspuffer.
- Vask slides tre gange i 1x PBST i 5 min hver vask.
- Monter dias.
- Afpipetteres 2 - 3 dråber (~ i 40 - 60 pi) af antifade monterings opløsning med DAPI kernefarvning på hver sektion.
- Anbring forsigtigt et nej. 1.5 dækglas over sektioner og montering opløsning, hvilket tillader fluidet at spredes ud over sektionerne og til kanterne afdækglasset. Brug forsigtigt en finger til at trykke ud luftbobler, der kan være placeret over sektionen.
- Lad objektglassene tørre i mindst 1 time før håndtering.
10. Kvantificere Kapillær Density og struktur 14
- Tæl antallet af kapillærer i H & E farvede sektioner, udtrykt som # / mm 2.
- Erhverve billeder af fire forskellige områder på en opretstående lysmikroskop under 40X forstørrelse.
BEMÆRK: Kapillærer identificeres som rør fyldt med røde blodlegemer. - Alternativt, i stedet for manuelt at tælle kapillærer, bruge billedanalyse software (f.eks, Wimasis billedanalyse) at kvantificere forskellige angiogenese parametre som fartøjsnummer, gennemsnitlig fartøjets længde og diameter, og afdelingskontorer point.
- Erhverve billeder af fire forskellige områder på en opretstående lysmikroskop under 40X forstørrelse.
- Analyser kapillær struktur i immunfluorescerende farvede snit.
- Erhverve billeder af fire forskellige områder på en inverteret fluorescerende mikroskopmed FITC og TxRed filter terning.
- Brug en FITC terning til billedet EC'er ved excitation ved 488 nm bølgelængde og bruge en TxRed terning til billedet pericytter ved excitation ved 594 nm bølgelængde.
- Erhverve billeder af fire forskellige områder på en inverteret fluorescerende mikroskopmed FITC og TxRed filter terning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentant H & E og immunfluorescensfarvning af matrix gel plug sektioner er vist i figur 2. Sektioner fra EF kun stikpropper vise nogle fartøjer, der er for det meste ikke er perfunderet med blod (Figur 2 øverst til venstre, sorte pile), mens propper indeholder både ECS pericyter viser flere perfunderet fartøjer med større diametre og fulde pericyt dækning, som det fremgår af positiv SMA farvning umiddelbart op til CD31-positive EC'er. Disse resultater antyder, pericytter spille en væsentlig rolle i spirende blodkardannelse og at denne dynamiske proces kan blive gentaget og let analyseres i en in vivo-model.
Figur 1. Tissue Orientering når Indlagt i en Tissue kassette. Efter matrixgelen stik (gul) isoleres, er deti mellem musens muskel (lilla) og hud (grøn) lag. Proppen er placeret i vævet kassetten som vist, således at alle tre lag kan ses hen over overfladen, der skal skæres først ved skæring. A) View fra toppen af kassetten, B) Udsigt fra siden af kassetten. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentant H & E (øverste række) og immunofluorescens (nederste række) i Matrix Gel. Billeder viser udseendet af EC'er alene (venstre billeder) og ECS plus sunde pericytter (PC) (højre billeder). Menneskelig og murine EC'er er mærket i grønne (nederste billeder) og pericyter (α glatmuskelactin (αSMA)) er mærket med rødt (nederst til højre), og kerner erfarves blå med DAPI-farvet. Scale er 25 um. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation 8. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Matrixgelen plug assay har vist sig at være en bekvem og effektiv metode til at evaluere genregulering i angiogenese, angiogene og antiangiogene forbindelser in vivo, og at supplere in vitro-tests. Her beskriver vi detaljeret en hidtil ukendt matrix gel plug-assay af human angiogenese der undersøger interaktionen mellem endotelceller og pericytter under dannelsen fartøj.
Der er et par nye og kritiske skridt i denne protokol. Celler i lav passage (passage 1 - 4) er at foretrække, fordi de unge celler vil være mere rentabelt i løbet af 14-dages eksperimentel indstilling. Antallet af endotelceller, der anvendes, er mindst en million, og forholdet mellem EF til pericyt er 5: 1; dog vil øget pericyt celletal øge sin dækning på kapillærer. I den eksperimentelle gruppe af endotelceller alene, bør det samlede antal injicerede celler være summen af endotelceller og pericytter, hvilket er 1,2 millioner, hertile, det samlede celleantal pr stik er konsistent. Det er vigtigt at beregne de passende mængder af celleantal og matrixgel volumen. Den grundlæggende formel er 1,2 millioner celler i 200 pi matrixgel. Derudover før injektion, holde pipettespidser, sprøjter, matrixgel og cellepellets på is hele tiden. Da matrixgel er tyktflydende og for at undgå dannelse af luftbobler under cellesuspension, skære omkring 1 cm ved af spidsen af 1 ml pipettespidser at muliggøre bedre flow. Bland ikke matrixgel med celler, indtil mus er parat til injektion. Hver prop injektion bør tage mindre end et minut. En mus kan bære to stik, en på hver side af ryggen. Når udvinding stikkene sørg for at holde stikket klemt inde mellem musklen og hudlag, så matricen gel stik vil være godt indsamlet efter isolering.
Ulemperne ved matrixgelen plug-assay er, at det er tidskrævende, dyrt og indebærer kedelige og delikate trin, såsom injection og plug isolation. Hvis disse trin skulle svigte, ville resultaterne være ødelagt og processen skulle gentages igen med nye mus og materialer.
Men dataene er reproducerbare og giver fleksibilitet i form af eksperimentelle design. For eksempel kunne vækstfaktorer eller inhibitorer administreres til proppen på forskellige stadier af vaskulær udvikling, som kan anvendes til validering lægemiddel. Endvidere inkorporering af andre celletyper, såsom vækststandsede celler, transficerede cellelinier eller tumorcellelinier, ind matrixgelen stik er en anden mulighed for at manipulere endotelcelle fænotype under angiogenese. Vores protokol udnytter denne fleksibilitet og indfører human-afledte pericytter sammen med EC'er at tillade dannelse af fuldt funktionelle, pericyt dækket, hybride fartøjer i vivo. Vores protokol beskriver også, hvordan at analysere de histologiske snit fra disse stik til kritiske angiogenese endpoints, herunder rørantal og rørlængden, med disse to celletyper stede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Endothelial Cell Media (ECM) kit | Sciencell | 1001 | includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| Pericyte Media (PM) kit | Sciencell | 1201 | includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| primary human pulmonary microvascular endothelial cells | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4 | |
| primary human pulmonary pericytes | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is not available commercially, but brain paricytes are. Cells used at passage 1-4 | |
| bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) | Peprotech | 100-18B | stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD | 356237 | |
| 28 G 1 cc Insluin Syringe | BD | 329410 | |
| SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml screw top tubes, sterile | BD Biosciences | 352096 | |
| PAP pen | Life Technologies | 8899 | |
| hemocytometer | ThermoFisher Scientific | 02-671-6 | |
| Nair hair removal cream | Walmart | ||
| anti-human CD31 primary antibody | LifeSpan Biosciences | LS-B4737 | working solution is 1:50 |
| anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody | Sigma | C6198 | working solution is 1:300 |
| goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green | ThermoFisher Scientific | A-11008 | working solution is 1:250 |
| Prolong Gold DAPI solution | Cell Signaling | 8961S | |
| microscope slides | VWR | 48300-047 | |
| no. 1.5 cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-544-D | |
| citrate buffer 10x | Millipore | 21545 | |
| extra fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Formalin (paraformaldehyde) | Thermo Fisher Scientific | 245-685 | |
| Tissue cassettes | Simport | M492-12 | |
| goat serum | Dako | X0907 |
References
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).
- Liu, Y., Senger, D. R. Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells. FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).
- Grant, D. S., et al. Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo. J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).
- Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix. J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).
- Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis. Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).
- Yuan, K., et al. Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis. Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).
- Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).
- Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action. Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).
- Ricard, N., et al. Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension. Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).
- Buchwalow, I. B., Bocker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).
- Tata, D. A., Anderson, B. J. A new method for the investigation of capillary structure. J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).
